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椰子胚诱导培养基和基于椰子合子胚细胞薄层培养获得离体再生植株的方法

阅读：1发布：2020-09-03

专利汇可以提供椰子胚诱导培养基和基于椰子合子胚细胞薄层培养获得离体再生植株的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了椰子胚诱导培养基和基于椰子合子胚细胞薄层培养获得离体再生植株的方法，属于椰子组织培养技术领域。椰子胚诱导培养基，以改良的Y3培养基为基本培养基，基本培养基中还包含2,4-D，麦草畏，NAA，蔗糖，琼脂和活性炭；所述椰子胚诱导培养基的pH值为5.5～5.8。本发明以椰子合子胚为外植体，经过外植体消毒、细胞薄层培养、胚的诱导、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等过程从而建立了椰子组织培养快速繁殖体系，为椰子产业持续提供优质椰子组培苗，促进椰子产业升级换代具有重要的意义。，下面是椰子胚诱导培养基和基于椰子合子胚细胞薄层培养获得离体再生植株的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种椰子胚诱导培养基，其特征在于，以改良的Y3培养基为基本培养基，基本培养基中还包含0～1mg/L 2,4-D，0～1mg/L麦草畏，0～1mg/L NAA，质量浓度为3％～7％蔗糖，质量浓度为0.35％～0.5％琼脂和质量浓度为0.1％～0.25％活性炭；所述椰子胚诱导培养基的pH值为5.5～5.8；
所述2,4-D、麦草畏和NAA的浓度不同时为0；
所述改良的Y3培养基是在Y3培养基基础上对如下组分含量进行调整得到：0.025～
0.25mg/L CuSO4·5H2O，25～56mg/LNa2·EDTA和12～45mg/L FeSO4·7H2O。
2.根据权利要求1所述的椰子胚诱导培养基，其特征在于，所述基本培养基中包含0.3～0.8mg/L 2,4-D、0.3～0.8mg/L麦草畏、0.3～0.8mg/L NAA、质量浓度为4％～6％蔗糖、质量浓度为0.4％～0.45％琼脂和质量浓度为0.18％～0.23％活性炭。
3.一种基于椰子合子胚细胞薄层培养获得离体再生植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从消毒的固体胚乳块中分离出胚，将所述胚切片接种到初代诱导培养基上初代培养，得到初代胚薄片；
所述初代诱导培养基以改良的Y3培养基为基本培养基，基本培养基还包含0～4mg/L
2,4-D、0～10mg/L麦草畏、0～1mg/L NAA、质量浓度为3％～7％蔗糖、质量浓度为0.35％～
0.5％琼脂和0.1％～0.25％活性炭；所述初代诱导培养基的pH值为5.5～5.8；所述2,4D、麦草畏和NAA的浓度不同时为0；
所述初代培养的温度25～28℃；所述初代培养为全暗培养；所述初代培养的时间为15～20d；
(2)将所述步骤(1)中初代胚薄片接种到权利要求1或2所述的胚诱导培养基上进行诱导培养，得到芽；
所述诱导培养为光照培养，光照的时长10～12h/d；光照强度为1000～1500lx；所述诱导培养的温度为25～28℃；
(3)将所述步骤(2)中的芽切片接种至增殖培养基上增殖培养，再转接到权利要求1或2所述的胚诱导培养基上再次诱导培养，得到胚芽；
所述增殖培养基以改良的Y3培养基为基本培养基，基本培养基中还包含0～4mg/L 2,
4-D、0.1～0.5mg/L麦草畏、0～1mg/L NAA、质量浓度为3％～7％蔗糖、质量浓度为0.35％～
0.5％琼脂和质量浓度为0.1％～0.25％活性炭；所述增殖培养基的pH值为5.5～5.8；
所述增殖培养的温度为25～28℃；所述增殖培养为全暗培养；所述增殖培养的时间为
15～20d；
所述再次诱导培养为光照培养；光照的时长为12～15h/d，光照强度为1000～1500lx，所述再次诱导培养的温度为25～28℃；
(4)将所述步骤(3)中的胚芽接种到生根培养基上进行生根培养，得到椰子组培苗；
所述生根培养基以改良的Y3培养基为基本培养基，基本培养基中还包含0.1～0.5mg/L GA3、0～1mg/L NAA、质量浓度为3％～10％蔗糖、质量浓度为0.35％～0.5％琼脂和质量浓度为0.1％～0.25％活性炭；所述生根培养基的pH值为5.5～5.8；
所述生根培养是先进行全暗培养3～7d，然后进行光暗交替培养38～45h；光照的时长为10～12h/d，光照强度为2000～2500lx；
所述生根培养的温度为25～28℃；
(5)将所述步骤(4)中的椰子组培苗置于自然光照下炼苗10～15d后，洗净根部培养基，移栽至再生基质中培养，得到椰子再生植株；
所述再生基质包括体积比为2～4：1的红土和河沙；
所述改良的Y3培养基是在通用培养基Y3培养基基础上对如下组分含量进行调整得到：
0.025～0.25mg/L CuSO4·5H2O，25～56mg/L Na2·EDTA和12～45mg/L FeSO4·7H2O。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中消毒的方法如下：将所述固体胚乳块在1号消毒液中浸泡5～10s，然后用体积浓度为2号消毒液中消毒8～20min，再用无菌水清洗3～5次；
所述1号消毒液为体积浓度70％～80％乙醇水溶液；
所述2号消毒液为体积浓度0.1％升汞溶液。
5.根据权利要求3所述的的方法，其特征在于，所述步骤(1)中胚切片的厚度和步骤(3)芽切片的厚度独立为0.5～1.2mm。
6.根据权利要求3或5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述初代诱导培养基为基本培养基中还包含2mg/L 2,4-D、5mg/L麦草畏、0.5mg/L NAA、质量浓度为5％蔗糖、质量浓度为0.4％琼脂和质量浓度为0.20％活性炭；所述初代诱导培养基的pH值为5.6；
所述初代培养的温度26℃；所述初代培养的时间为18d。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中接种至胚诱导培养基上的接种量为16～30个/皿。
8.根据权利要求3或7所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中增殖培养基为基本培养基中还包含2mg/L 2,4-D、0.3mg/L麦草畏、0.5mg/L NAA，质量浓度为5％蔗糖、质量浓度为
0.4％琼脂和质量浓度为0.2％活性炭；所述增殖培养基的pH值为5.6；
所述增殖培养的温度为26℃；所述所述增殖培养的时间为18d；
所述再次诱导培养中，光照的时长为14h/d，光照强度为1200lx，所述再次诱导培养培养的温度为26℃。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中生根培养基为基本培养基中还包含0.3mg/L GA3、0.5mg/L NAA、质量浓度为7％蔗糖、质量浓度为0.45％琼脂和质量浓度为0.2％活性炭；所述生根培养基的pH值为5.6；
所述生根培养是先进行全暗培养5d，然后进行光暗交替培养42h；光照的时长为11h/d，光照强度为2200lx；
所述生根培养的温度为26℃。
10.根据权利要求3或9所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中固体胚乳块采集自授粉10～14个月的成熟椰子果实。

说明书全文

椰子胚诱导培养基和基于椰子合子胚细胞薄层培养获得离体

再生植株的方法

技术领域

[0001] 本发明属于椰子组织培养技术领域，具体涉及椰子胚诱导培养基和基于椰子合子胚细胞薄层培养获得离体再生植株的方法。

背景技术

[0002] 椰子(Cocos nucifera L.)是棕榈科椰子属多年生乔木，是典型的热带木本油料作物和食品作物，是世界热带地区重要的经济作物。目前我国椰子的产量只能满足总需求量的10％左右，供需矛盾突出，因此急需要加快椰子种植产业的发展。

[0003] 然而椰子多为异花授粉植物，生长周期长，繁殖系数低，杂种后代性状分离严重，个体间差异较大，很难获得同一性状的后代群体，同时椰子只有一个独立的茎干而不产生分枝，因而常规的营养繁殖手段如扦插、嫁接、高空压条等无法用于椰子的无性繁殖，因此有必要通过建立完整、高效、实用的椰子组培快繁技术体系，实现椰子优良无性品系培育，为推广优质椰子组织培养苗大规模繁育提供技术支撑。

[0004] 目前，对于椰子组织培养技术而言，尚无成功的植株再生案例，只能借鉴其他物种的植株再生技术进行摸索和研究，但是不同物种遗传背景和生活环境差异巨大，对椰子的组织培养技术的研发帮助甚微。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供椰子胚诱导培养基和基于椰子合子胚细胞薄层培养获得离体再生植株的方法，具有高效的胚芽诱导率，从而建立了椰子组织培养快速繁殖体系。

[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0007] 本发明提供了一种椰子胚诱导培养基，以改良的Y3培养基为基本培养基，基本培养基中还包含0～1mg/L 2,4D，0～1mg/L麦草畏，0～1mg/L NAA，质量浓度为3％～7％蔗糖，质量浓度为0.35％～0.5％琼脂和质量浓度为 0.1％～0.25％活性炭；所述椰子胚诱导培养基的pH值为5.5～5.8；

[0008] 所述2,4D、麦草畏和NAA的浓度不同时为0；

[0009] 所述改良的Y3培养基是在Y3培养基基础上对如下组分含量进行调整得到：0.025～0.25mg/L CuSO4·5H2O，25～56mg/L Na2·EDTA和12～45mg/L FeSO4·7H2O。

[0010] 优选的，基本培养基中还包含0.3～0.8mg/L 2,4D、0.3～0.8mg/L麦草畏、 0.3～0.8mg/L NAA、质量浓度为4％～6％蔗糖、质量浓度为0.4％～0.45％琼脂和质量浓度为
0.18％～0.23％活性炭。

[0011] 本发明提供了一种基于椰子合子胚细胞薄层培养获得离体再生植株的方法，包括以下步骤：

[0012] (1)从消毒的固体胚乳块中分离出胚，将得到的胚切片接种到初代诱导培养基上初代培养，得到初代胚薄片；

[0013] 所述初代诱导培养基以改良的Y3培养基为基本培养基，基本培养基中还包含0～4mg/L 2,4D、0～10mg/L麦草畏、0～1mg/L NAA、质量浓度为3％～7％蔗糖、质量浓度为
0.35％～0.5％琼脂和0.1％～0.25％活性炭；所述初代诱导培养基的pH值为5.5～5.8；所述2,4D、麦草畏和NAA的浓度不同时为0；

[0014] 所述初代培养的温度25～28℃；所述初代培养为全暗培养；所述初代培养的时间为15～20d；

[0015] (2)将所述步骤(1)中初代胚薄片接种到权利要求1或2所述的胚诱导培养基上进行诱导培养，得到芽；

[0016] 所述诱导培养为光照培养，光照的时长10～12h/d；光照强度为 1000～1500lx；所述诱导培养的温度为25～28℃；

[0017] (3)将所述步骤(2)中的芽切片接种至增殖培养基上增殖培养，再转接到所述的胚诱导培养基上再次诱导培养，得到胚芽；

[0018] 所述增殖培养基以改良的Y3培养基为基本培养基，基本培养基中还包含 0～4mg/L 2,4D、0.1～0.5mg/L麦草畏、0～1mg/L NAA、质量浓度为3％～7％蔗糖、质量浓度为0.35％～0.5％琼脂和质量浓度为0.1％～0.25％活性炭；所述增殖培养基的pH值为5.5～
5.8；

[0019] 所述增殖培养的温度为25～28℃；所述增殖培养为全暗培养；所述增殖培养的时间为15～20d；

[0020] 所述再次诱导培养为光照培养；光照的时长为12～15h/d，光照强度为 1000～1500lx，所述再次诱导培养培养的温度为25～28℃；

[0021] (4)将所述步骤(3)中的胚芽接种到生根培养基上进行生根培养，得到椰子组培苗；

[0022] 所述生根培养基以改良的Y3培养基为基本培养基，基本培养基中还包含0.1～0.5mg/L GA3、0～1mg/L NAA、质量浓度为3％～10％蔗糖、质量浓度为 0.35％～0.5％琼脂和质量浓度为0.1％～0.25％活性炭；所述生根培养基的pH值为5.5～5.8；

[0023] 所述生根培养是先进行全暗培养3～7d，然后进行光暗交替培养38～45h；光照的时长为10～12h/d，光照强度为2000～2500lx；

[0024] 所述生根培养的温度为25～28℃；

[0025] (5)将所述步骤(4)中的椰子组培苗置于自然光照下炼苗10～15d后，洗净根部培养基，移栽至再生基质中培养，得到椰子再生植株；

[0026] 所述再生基质包括体积比为2～4：1的红土和河沙；

[0027] 所述改良的Y3培养基是在国际通用培养基Y3培养基基础上对如下组分含量进行调整得到：0.025～0.25mg/L CuSO4·5H2O，25～56mg/L Na2·EDTA和 12～45mg/L FeSO4·7H2O。

[0028] 优选的，所述步骤(1)中消毒的方法如下：将所述固体胚乳块在1号消毒液中浸泡5～10s，然后用体积浓度为2号消毒液中消毒8～20min，再用无菌水清洗3～5次；

[0029] 所述1号消毒液为体积浓度为70％～80％乙醇；

[0030] 所述2号消毒液为体积浓度为0.1％溶液。

[0031] 优选的，所述步骤(1)的胚切片的厚度和步骤(3)芽切片的厚度为独立为0.5～1.2mm。

[0032] 优选的，所述步骤(1)中所述初代诱导培养基为基本培养基中包含2mg/L 2,4D、5mg/L麦草畏、0.5mg/L NAA、质量浓度为5％蔗糖、质量浓度为0.4％琼脂和质量浓度为
0.20％活性炭；所述初代诱导培养基的pH值为5.6；

[0033] 所述初代培养的温度26℃；所述初代培养的时间为18d。

[0034] 优选的，所述步骤(2)中接种至胚诱导培养基上的接种量为16～30个/ 皿。

[0035] 优选的，所述步骤(3)中增殖培养基为基本培养基中还包含2mg/L 2,4D、 0.3mg/L麦草畏、0.5mg/L NAA，质量浓度为5％蔗糖、质量浓度为0.4％琼脂和质量浓度为0.2％活性炭；所述增殖培养基的pH值为5.6；

[0036] 所述增殖培养的温度为26℃；所述所述增殖培养的时间为18d；

[0037] 所述光照的时长为14h/d，光照强度为1200lx，所述再次诱导培养培养的温度为26℃。

[0038] 优选的，所述步骤(4)中所述生根培养基为基本培养基中包含0.3mg/L GA3、0.5mg/L NAA、质量浓度为7％蔗糖、质量浓度为0.45％琼脂和质量浓度为0.2％活性炭；所述生根培养基的pH值为5.6；

[0039] 所述生根培养是先进行全暗培养5d，然后进行光照培养42h；光照的时长为11h/d，光照强度为2200lx；

[0040] 所述生根培养的温度为26℃。

[0041] 优选的，所述步骤(1)中固体胚乳块采集自10～14月的成熟椰子果实。

[0042] 本发明提供了一种椰子胚诱导培养基，是以改良的Y3培养基为基本培养基，所述改良的Y3培养基是在常规Y3培养基的基础上对CuSO4·5H2O、 Na2.EDTA和FeSO4.7H2O的浓度进行了调整，同时还额外添加了2,4D、麦草畏和NAA 3种植物激素，有助于高效诱导椰子胚的诱导成功率。本发明提供的椰子胚诱导培养基对椰子胚成功诱导胚芽的发生率高达80.7％以上，相比常规Y3培养基为基础培养基提高了5～18.5％，相比与现有技术中以MS 培养基为基础培养基的诱导成功率提高了35.6～63.3％。

[0043] 本发明提供了一种基于椰子合子胚细胞薄层培养获得离体再生植株的方法，具体采用细胞薄层培养技术，将外植体材料处理为切片进行培养，使外植体中的形成层细胞对于激素的响应快，而且可控性好，更容易培养获得目标培养物。较于常规组培技术多是接种整个胚或者芽，或将外植体纵切分成2～4份的方法，本发明提供的方法不仅有效，而且克服了1个种胚只能培养1～2个椰子的局限，同时打破了常规方法利用培养不定芽进行增殖对椰子无法实现组织培养的困境。

[0044] 同时本发明提供的方法，从外植体培养到再生植株的获得具有繁殖周期短的特点，繁殖周期为7～12个月。同时本发明提供的方法具有稳定性高的特点，对3个椰子品种进行150个重复处理中实施，胚芽诱导率高和再生植株个数超过100株，即本发明的实施效果是可以稳定重复再现的。此外，由于本发明提供的方法是直接胚发育的途径获得再生植株，而不经过脱分化为愈伤组织的过程，而植株发生变异的最主要的阶段，就是在愈伤组织再分化形成胚的过程，因此变异风险较小。附图说明

[0045] 图1为诱导获得椰子芽形态图；

[0046] 图2为培养获得椰子再生植株。

具体实施方式

[0047] 本发明提供了一种椰子胚诱导培养基，以改良的Y3培养基为基本培养基，基本培养基中还包含0～1mg/L 2,4D，0～1mg/L麦草畏，0～1mg/L NAA，质量浓度为3％～7％蔗糖，质量浓度为0.35％～0.5％琼脂和质量浓度为 0.1％～0.25％活性炭；所述椰子胚诱导培养基的pH值为5.5～5.8；

[0048] 所述2,4D、麦草畏和NAA的浓度不同时为0；

[0049] 所述改良的Y3培养基是在Y3培养基基础上对如下组分含量调整得到： 0.025～0.25mg/L CuSO4·5H2O，25～56mg/L Na2·EDTA和12～45mg/L FeSO4·7H2O。

[0050] 本发明提供的椰子胚诱导培养基以改良的Y3培养基为基本培养基。所述改良的Y3培养基是在Y3培养基基础上对如下组分含量调整得到： 0.025～0.25mg/L CuSO4·5H2O，25～56mg/L Na2·EDTA和12～45mg/L FeSO4·7H2O；更优选调整为0.05～0.15mg/L CuSO4·5H2O，30～50mg/L Na2·EDTA和15～38mg/L FeSO4·7H2O，最优选调整为0.1mg/L CuSO4·
5H2O， 40mg/L Na2·EDTA和24mg/L FeSO4·7H2O。所述Y3培养基的配方和配制方法见Eeuwens CJ(1976)(Mineral requirements for growth and callus initiation of tissue explants excised from mature coconut palms and cultured in vitro.Physiol Plant)。

[0051] 本发明提供的椰子胚诱导培养基还包括0～1mg/L 2,4-D。所述2,4-D的浓度优选为0.3～0.8mg/L，更优选为0.4～0.7mg/L，最优选为0.5mg/L。所述2,4-D 的功能有利于椰子合子胚中原形成层细胞的增殖和分化。

[0052] 本发明提供的椰子胚诱导培养基还包括0～1mg/L麦草畏。所述麦草畏的浓度优选为0.3～0.8mg/L，更优选为0.4～0.7mg/L，更优选为0.5mg/L。所述麦草畏有利于加速椰子合子胚中原形成层细胞分化，发育成胚。

[0053] 本发明提供的椰子胚诱导培养基还包括0～1mg/L NAA。所述NAA的浓度优选为0.3～0.8mg/L，更优选为0.4～0.7mg/L，最优选为0.5mg/L。所述NAA有利于椰子合子胚中原形成层细胞个体膨大，利于进一步分化成胚。

[0054] 本发明提供的椰子胚诱导培养基还包括质量浓度为3％～7％蔗糖。所述蔗糖的浓度优选为4％～6％，更优选为5％。所述蔗糖为椰子胚诱导成胚芽提供碳源。

[0055] 本发明提供的椰子胚诱导培养基还包括质量浓度0.35％～0.5％琼脂。所述琼脂的质量浓度优选为0.4％～0.45％，更优选为0.42％。所述琼脂使培养基形成固态。

[0056] 本发明提供的椰子胚诱导培养基还包括质量浓度为0.1％～0.25％活性炭。所述活性炭的质量浓度优选为0.18％～0.23％，更优选为0.20％。所述活性炭有利于避免胚切片发生褐化。

[0057] 本发明对所述2,4-D、麦草畏、NAA、蔗糖、琼脂和活性炭的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的常规来源即可。

[0058] 在本发明中，所述椰子胚诱导培养基的制备方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的培养基的配制方法即可。本发明对调整培养基的pH 值的方法和溶液没有特殊限制，采用本领域熟知的调整培养基的pH值的方法和溶液即可。

[0059] 本发明提供了一种基于椰子合子胚细胞薄层培养获得离体再生植株的方法，包括以下步骤：

[0060] (1)从消毒的固体胚乳块中分离出胚，将得到的胚切片接种到初代诱导培养基上初代培养，得到初代胚薄片；

[0061] 所述初代诱导培养基以改良的Y3培养基为基本培养基，基本培养基中还包含0～4mg/L 2,4D、0～10mg/L麦草畏、0～1mg/L NAA、质量浓度为3％～7％蔗糖、质量浓度为
0.35％～0.5％琼脂和0.1％～0.25％活性炭；所述初代诱导培养基的pH值为5.5～5.8；所述2,4D、麦草畏和NAA的浓度不同时为0；

[0062] 所述初代培养的温度25～28℃；所述初代培养为全暗培养；所述初代培养的时间为15～20d；

[0063] (2)将所述步骤(1)中初代胚薄片接种到权利要求1或2所述的胚诱导培养基上进行诱导培养，得到芽；

[0064] 所述诱导培养为光照培养，光照的时长10～12h/d；光照强度为 1000～1500lx；所述诱导培养的温度为25～28℃；

[0065] (3)将所述步骤(2)中的芽切片接种至增殖培养基上增殖培养，再转接到所述的胚诱导培养基上再次诱导培养，得到胚芽；

[0066] 所述增殖培养基以改良的Y3培养基为基本培养基，基本培养基中还包含 0～4mg/L 2,4D、0.1～0.5mg/L麦草畏、0～1mg/L NAA、质量浓度为3％～7％蔗糖、质量浓度为0.35％～0.5％琼脂和质量浓度为0.1％～0.25％活性炭；所述增殖培养基的pH值为5.5～
5.8；

[0067] 所述增殖培养的温度为25～28℃；所述增殖培养为全暗培养；所述增殖培养的时间为15～20d；

[0068] 所述再次诱导培养为光照培养；光照的时长为12～15h/d，光照强度为 1000～1500lx，所述再次诱导培养培养的温度为25～28℃；

[0069] (4)将所述步骤(3)中的胚芽接种到生根培养基上进行生根培养，得到椰子组培苗；

[0070] 所述生根培养基以改良的Y3培养基为基本培养基，基本培养基中还包含 0.1～0.5mg/L GA3、0～1mg/L NAA、质量浓度为3％～10％蔗糖、质量浓度为 0.35％～0.5％琼脂和质量浓度为0.1％～0.25％活性炭；所述生根培养基的pH值为5.5～5.8；

[0071] 所述生根培养是先进行全暗培养3～7d，然后进行光暗交替培养38～45h；光照的时长为10～12h/d，光照强度为2000～2500lx；

[0072] 所述生根培养的温度为25～28℃；

[0073] (5)将所述步骤(4)中的椰子组培苗置于自然光照下炼苗10～15d后，洗净根部培养基，移栽至再生基质中培养，得到椰子再生植株；

[0074] 所述再生基质是体积比为2～4：1的红土和河沙；

[0075] 所述改良的Y3培养基是在国际通用培养基Y3培养基基础上对如下组分含量进行调整得到：0.025～0.25mg/L CuSO4·5H2O，25～56mg/L Na2·EDTA和 12～45mg/L FeSO4·7H2O。

[0076] 本发明从消毒的固体胚乳块中分离出胚，将得到的胚切片接种到初代诱导培养基上初代培养，得到初代胚薄片；所述初代诱导培养基以改良的Y3 培养基为基本培养基，基本培养基中还包含0～4mg/L 2,4-D、0～10mg/L麦草畏、0～1mg/L NAA、质量浓度为3％～7％蔗糖、质量浓度为0.35％～0.5％琼脂和0.1％～0.25％活性炭；所述初代诱导培养基的pH值为5.5～5.8；所述2,4-D、麦草畏和NAA的浓度不同时为0；所述初代培养的温度25～28℃；所述初代培养为全暗培养；所述初代培养的时间为15～20d。

[0077] 在本发明中，固体胚乳块优选采集自授粉后10～14个月的成熟椰子果实。所述采集的方法优选将成熟椰子果实切开，用直径2cm的打孔器取出包埋有胚的固体胚乳块。所述消毒的方法优选如下：将所述固体胚乳块在1号消毒液中浸泡5～10s，然后用体积浓度为2号消毒液中消毒8～20min，再用无菌水清洗3～5次；所述1号消毒液为体积浓度为70％～80％乙醇水溶液；所述2号消毒液为体积浓度为0.1％升汞溶液。所述1号消毒液的体积浓度优选为75％。所述1号消毒液浸泡的时间优选为6～8s。所述2号消毒液的消毒时间优选为
10～15min，更优选为12min。

[0078] 在本发明中，所述分离胚的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的分离胚的方法即可。所述胚切片的厚度优选为0.5～1.2mm，更优选为0.6～1.0mm，更优选为0.8mm。所述胚切片接种量优选为16～30个/皿，更优选为25个/皿。

[0079] 在本发明中，所述初代诱导培养基为改良Y3基本培养基优选还包含 2mg/L 2,4-D、5mg/L麦草畏、0.5mg/L NAA、质量浓度为5％蔗糖、质量浓度为0.4％琼脂和质量浓度为0.20％活性炭；所述初代诱导培养基的pH值为5.6。所述初代培养的温度优选为26℃；所述初代培养的时间优选为18d。

[0080] 得到初代胚薄片后，本发明将所述初代胚薄片接种到上述方案所述的胚诱导培养基上进行诱导培养，得到芽；所述诱导培养为光照培养，光照的时长10～12h/d；光照强度为1000～1500lx；所述诱导培养的温度为25～28℃。

[0081] 在本发明中，所述接种至胚诱导培养基上的接种量优选为16～30个/皿。

[0082] 在本发明中，光照的时长优选为11h/d；光照强度为1200～1400lx，更优选为1300lx；所述诱导培养的温度为26℃。

[0083] 得到芽后，本发明将所述芽切片接种至增殖培养基上增殖培养，再转接到上述方案所述的胚诱导培养基上再次诱导培养，得到胚芽；所述增殖培养基以改良的Y3培养基为基本培养基，基本培养基中还包含0～4mg/L 2,4D、 0.1～0.5mg/L麦草畏、0～1mg/L NAA、质量浓度为3％～7％蔗糖、质量浓度为 0.35％～0.5％琼脂和质量浓度为0.1％～0.25％活性炭；所述增殖培养基的pH值为5.5～5.8；所述增殖培养的温度为25～28℃；所述增殖培养为全暗培养；所述增殖培养的时间为15～20d；所述再次诱导培养为光照培养；光照的时长为12～15h/d，光照强度为1000～1500lx，所述再次诱导培养培养的温度为 25～28℃。

[0084] 在本发明中，所述芽切片接种至增殖培养基上的接种量优选为16～30个/ 皿，更优选为25个/皿。

[0085] 在本发明中，所述增殖培养基优选为基本培养基中包含2mg/L 2,4D、 0.3mg/L麦草畏、0.5mg/L NAA，质量浓度为5％蔗糖、质量浓度为0.4％琼脂和质量浓度为0.2％活性炭；所述增殖培养基的pH值为5.6。所述增殖培养的温度为26℃；所述增殖培养的时间为18d。所述再次诱导培养的光照时长为 14h/d，光照强度为1200lx，所述再次诱导培养的温度为26℃。

[0086] 得到胚芽后，本发明将所述胚芽接种到生根培养基上进行生根培养，得到椰子组培苗；所述生根培养基以改良的Y3培养基为基本培养基，基本培养基中还包含0.1～0.5mg/L GA3、0～1mg/L NAA、质量浓度为3％～10％蔗糖、质量浓度为0.35％～0.5％琼脂和质量浓度为0.1％～0.25％活性炭；所述培养基的 pH值为5.5～5.8；所述生根培养是先进行全暗培养3～7d，然后进行光暗交替培养38～45h；光照的时长为10～12h/d，光照强度为2000～2500lx；所述生根培养的温度为25～28℃。

[0087] 在本发明中，所述芽切片接种至生根培养基上的接种量优选为4～9个/ 瓶，更优选为5个/瓶。

[0088] 得到椰子组培苗后，本发明将所述椰子组培苗置于自然光照下炼苗 10～15d后，洗净根部培养基，移栽至再生基质中培养，得到椰子再生植株；所述再生基质是体积比为2～4：1的红土和河沙。

[0089] 在本发明中，所述生根培养基优选为基本培养基中包含0.3mg/L GA3、 0.5mg/L NAA、质量浓度为7％蔗糖、质量浓度为0.45％琼脂和质量浓度为 0.2％活性炭；所述椰子胚诱导培养基的pH值为5.6。所述生根培养是先进行全暗培养5d，然后进行光照培养42h；光照的时长为11h/d，光照强度为2200lx。所述生根培养的温度为26℃。

[0090] 在本发明中，所述炼苗的时间优选为11～14d，更优选为13d。

[0091] 在本发明中，所述再生基质优选包括体积比为3：1的红土和河沙。

[0092] 下面结合实施例对本发明提供的椰子胚诱导培养基和基于椰子合子胚细胞薄层培养获得离体再生植株的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0093] 实施例1

[0094] 一种椰子胚诱导培养基，以改良的Y3培养基(Y3*)为基本培养基，所述改良的Y3培养基是在国际通用的Y3培养基基础上对如下组分含量进行调整得到：0.025mg/L CuSO4·5H2O，56mg/L Na2·EDTA和12mg/L FeSO4·7H2O；同时基本培养基中还包含1mg/L麦草畏，
1mg/L NAA，质量浓度为3％蔗糖，质量浓度为0.35％琼脂和质量浓度为0.1％活性炭；所述椰子胚诱导培养基的 pH值为5.5。配制、灭菌，得到椰子胚诱导培养基。

[0095] 实施例2

[0096] 一种椰子胚诱导培养基，以改良的Y3培养基(Y3*)为基本培养基，所述改良的Y3培养基是在国际通用的Y3培养基基础上对如下组分含量进行调整得到：0.25mg/L CuSO4·5H2O，25mg/L Na2·EDTA和45mg/L FeSO4·7H2O；同时基本培养基中包含0.3mg/L 2,4D、
0.8mg/L麦草畏、0.3mg/L NAA、质量浓度为6％蔗糖、质量浓度为0.4％琼脂和质量浓度为
0.18％～0.23％活性炭， pH值为5.4。配制、灭菌，得到椰子胚诱导培养基。

[0097] 实施例3

[0098] 一种椰子胚诱导培养基，以改良的Y3培养基(Y3*)为基本培养基，所述改良的Y3培养基是在国际通用的Y3培养基基础上对如下组分含量进行调整得到：0.1mg/L CuSO4·5H2O，40mg/L Na2·EDTA和30mg/L FeSO4·7H2O；同时基本培养基中还包含0.5mg/L 2,4D，
0.5mg/L麦草畏，0.5mg/L NAA，质量浓度为4.2％蔗糖，质量浓度为0.4％琼脂和质量浓度为
0.18％活性炭；所述椰子胚诱导培养基的pH值为5.6。配制、灭菌，得到椰子胚诱导培养基。

[0099] 对比例1

[0100] 按照实施例3的方案，用国际通用的Y3培养基替换改良的Y3培养基，其他组分不变，制备得到椰子胚诱导培养基。

[0101] 对比例2

[0102] 按照实施例3的方案，用通用的MS培养基替换改良的Y3培养基，其他组分不变，制备得到椰子胚诱导培养基。

[0103] 对比例3

[0104] 按照实施例3的方案，以改良的Y3培养基为基本培养基，同时基本培养基中还包含1.5mg/L 2,4-D，1.5mg/L麦草畏，1.5mg/L NAA，质量浓度为3.5％蔗糖，质量浓度为0.35％琼脂和质量浓度为0.2％活性炭；所述椰子胚诱导培养基的pH值为5.6。配制、灭菌，得到椰子胚诱导培养基。

[0105] 实施例4

[0106] (1)外植体消毒：选取授粉后12个月的成熟椰子果实作为外植体,切开椰果后，用直径2cm的打孔器取出包埋有胚的固体胚乳块，在超净工作台中以70％乙醇溶液浸泡10s，然后用质量浓度为0.1％升汞溶液消毒10min，再用无菌水清洗3次，擦干后待用。

[0107] (2)细胞薄层培养：在超净工作台上，用镊子和解剖刀将胚从胚乳中取出，用刀片将胚乳切成约1mm厚的薄片接种到初代诱导培养基上，培养基的成分为Y3*+4mg/L 2,4D+1.5mg/L NAA+3％蔗糖+0.5％琼脂+0.1％活性炭，pH值为5.8。在28℃条件下全暗培养15天。

[0108] (3)胚的诱导：将培养的椰子胚薄片150片分别接种到实施例1～3制备的胚诱导培养基上，然后置于每天光照10小时，光照强度为1500lx，培养温度为28℃条件下培养，直至诱导形成芽。以对比例1～3制备的胚诱导培养基作为对照组。

[0109] 统计不同实验组和对照组诱导成功的芽的数量，并计算诱导成功率。结果见表1。

[0110] 表1不同实验组和对照组诱导成功椰子胚芽的诱导情况

[0111]不同处理形成芽的数量(个) 诱导率(％)
实施例1 121 80.7
实施例2 115 76.7
实施例3 107 71.3
对比例1 95 63.3
对比例2 26 17.3
对比例3 89 59.3

[0112] 由表1可以看出，不同基本培养基对芽诱导率存在显著差异，而植物激素麦草畏、NAA、2,4D的最适宜浓度在实例1的浓度附近，高于或低于该浓度，都导致发芽诱导率下降。

[0113] 实施例5

[0114] (1)外植体消毒：选取授粉后12个月的成熟椰子果实作为外植体,切开椰果后，用直径2cm的打孔器取出包埋有胚的固体胚乳块，在超净工作台中以体积浓度70％乙醇溶液浸泡10s，然后用0.1％升汞溶液消毒10min，再用无菌水清洗3次，擦干后待用。

[0115] (2)细胞薄层培养：在超净工作台上，用镊子和解剖刀将胚从胚乳中取出，用刀片将胚乳切成约1mm厚的薄片接种到初代诱导培养基上,培养基的成分为Y3*+4mg/L 2,4D+1.5mg/L NAA+3％蔗糖+0.5％琼脂+0.1％活性炭，pH值为5.8。在25℃条件下全暗培养15-20天。

[0116] (3)胚的诱导：将培养的椰子胚薄片接种到胚诱导培养基上，然后置于每天光照10小时，光照强度为1000lx，培养温度为25℃条件下培养，直至诱导形成芽(图1)。胚诱导培养基的成分为：Y3*+1mg/L 2,4D+0.2mg/L NAA+3％蔗糖+0.5％琼脂+0.1％活性炭，pH值为5.8。

[0117] (4)增殖培养：将步骤(3)所得的芽用刀片切成约1mm厚的薄片接种到增殖培养基上，在25℃条件下全暗培养15天后，再转接到胚诱导培养基中，然后置于每天光照12小时，光照强度为1000lx，培养温度为25℃的条件下培养直至长芽。增殖培养基成分为：Y3*+1.5mg/L 2,4D+0.2mg/L NAA+3％蔗糖+0.5％琼脂+0.1％活性炭，pH值为5.8。

[0118] (5)生根培养：将步骤(3)或(4)所获得的高度约为1cm的芽接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在25℃条件下全暗培养3-7天，然后置于每天光照10小时，光照强度为2000lx，培养温度为25℃的条件下培养至生根(图2)；生根培养基成分为：Y3*+0.05mg/L NAA+5％蔗糖+0.5％琼脂 +0.1％活性炭，pH值为5.8。

[0119] (6)炼苗移栽：椰子组培苗瓶内生根30天后，置于自然光照下炼苗10 天后，洗净根部培养基，移栽由红土：河沙＝3：1混合成的基质中。

[0120] 统计最后移栽成活率，移栽成活率为75％。

[0121] 实施例6

[0122] (1)外植体消毒：选取授粉后12个月的成熟椰子果实作为外植体,切开椰果后，用直径2cm的打孔器取出包埋有胚的固体胚乳块，在超净工作台中以体积浓度70％乙醇溶液浸泡10s，然后用质量浓度0.1％升汞溶液消毒10min，再用无菌水清洗5次，擦干后待用。

[0123] (2)细胞薄层培养：在超净工作台上，用镊子和解剖刀将胚从胚乳中取出，用刀片将胚乳切成约1mm厚的薄片接种到初代诱导培养基上,培养基的成分为Y3*+8mg/L麦草畏+1mg/L NAA+3％蔗糖+0.5％琼脂+0.1％活性炭，pH值为5.5。在26℃条件下全暗培养20天。

[0124] (3)胚的诱导：将培养的椰子胚薄片接种到胚诱导培养基上，然后置于每天光照11小时，光照强度为1500lx，培养温度为26℃条件下培养，直至诱导形成芽。胚诱导培养基的成分为：Y3*+1mg/L麦草畏+0.2mg/L NAA+3％蔗糖+0.5％琼脂+0.1％活性炭，pH值为5.5。

[0125] (4)增殖培养：将步骤(3)所得的芽用刀片切成约1mm厚的薄片接种到增殖培养基上，在26℃条件下全暗培养18天后，再转接到胚诱导培养基中，然后置于每天光照12小时，光照强度为1200lx，培养温度为26℃的条件下培养直至长芽。增殖培养基成分为：Y3*+5mg/L麦草畏+0.2mg/L NAA+3％蔗糖+0.5％琼脂+0.1％活性炭，pH值为5.5。

[0126] (5)生根培养：将步骤(3)或(4)所获得的高度约为2cm的芽接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在26℃条件下全暗培养5天，然后置于每天光照11小时，光照强度为2000-2500lx，培养温度为26℃的条件下培养至生根；生根培养基成分为：Y3*+0.2mg/L GA3+6％蔗糖+0.5％琼脂 +0.1％活性炭，pH值为5.8。

[0127] (6)炼苗移栽：椰子组培苗瓶内生根30天后，置于自然光照下炼苗10-15 天后，洗净根部培养基，移栽由红土：河沙＝3：1混合成的基质中。

[0128] 统计移栽成活率，移栽成活率为80％。

[0129] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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