一种剑叶龙血树疏松愈伤组织诱导的方法
阅读：1016发布：2020-12-08
专利汇可以提供一种剑叶龙血树疏松愈伤组织诱导的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种剑叶龙血树疏松愈伤组织诱导的方法，包括如下步骤：(1)分别取剑叶龙血树 种子 或芽作为外植体进行消毒；(2)将消毒后的外植体置于MS基本培养基中诱导出芽或芽丛；(3)将无菌芽分别置于MS、B5、N6添加6‑苄基腺嘌呤6‑BA和 萘 乙酸NAA的培养基中进行培养获得愈伤组织；(4)将愈伤组织置于添加不同 激素 的诱导培养基中进行培养得到较多质地疏松的愈伤组织。采用本 发明 所述方法得到的愈伤组织嫩绿色或者乳白色、疏松、增殖能 力 强，能够短时间诱导出大量生长良好的疏松愈伤组织，为进行细胞悬浮培养生产剑叶龙血树总 生物 碱 提供材料。，下面是一种剑叶龙血树疏松愈伤组织诱导的方法专利的具体信息内容。
1.一种剑叶龙血树的疏松愈伤组织诱导的方法，其特征在于：该方法由以下步骤组成：
(1)外植体的消毒：先用洗洁精水溶液清洗外植体表面污垢，置于烧杯中进行流水冲洗
5～8min，然后移至超净工作台上，用75％v/v酒精将种子和芽浸泡30s，无菌水冲洗1遍，再用0.1％v/v HgC12浸泡，时间分别为8、12、15min，无菌水浸泡3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；所述外植体为饱满种子或种子播种于河沙里萌发的芽；
(2)无菌苗的获得：将步骤(1)得到的外植体接种于MS诱导培养基中，在培养温度为25
2
±2℃，光照强度20～30μmol/m·s，光照时间为12h/d的条件下培养8～15d便开始出芽，随后长出无菌苗，所述MS诱导培养基中添加0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(3)培养基对愈伤组织的诱导效果：将步骤(2)中得到的无菌芽接种于MS基本培养基
2
中，在培养温度为25±2℃，光照强度20～30μmol/m·s，光照时间为12h/d的条件下培养25～30d，逐渐产生疏松愈伤组织，所述MS基本培养基中添加0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、
0.2mg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(4)培养基对愈伤组织的继代效果：将步骤(3)中得到的愈伤组织置于MS继代培养基中，在培养温度25±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为10h/d的条件下培养10d，切口端逐渐膨大，形成较多疏松的愈伤组织，所述MS继代培养基中添加0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、1.5～2.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
一种剑叶龙血树疏松愈伤组织诱导的方法
技术领域
背景技术
[0002] 剑叶龙血树(Dracaena cochinchinensis(Lour)S.C.Chen)又名千年木、血竭树、交趾龙血树，是渐危种，属国家二级保护植物。剑叶龙血树具有很高的药用价值，从其树脂提取的血竭被称为麒麟竭，为我国传统名贵中药材，在我国已有1500年以上的使用历史。据《本草纲目》记载，龙血竭性温、平，味甘、咸，无毒，入血分，归肺、脾、肾三经，具有活血化瘀、消肿止痛、收敛止血，软坚散结，生肌敛疮等显著功效，有“活血圣药”的美誉，主要分布云南、广西、海南等地。
[0003] 近年来，由于其需求量大再加上高昂的价格致使人们对剑叶龙血树野生资源实施了不合理的掠夺性采伐，剑叶龙血树野生资源日趋枯竭，濒临灭绝，已经被国际上很多国家列为珍稀濒危保护植物。因此利用生物技术对其进行组培快繁尤为重要。对剑叶龙血树的研究主要在药物化学成分、组织培养等方面的研究，目前尚未有细胞悬浮培养方面研究的报道。疏松愈伤组织容易散碎，增殖能力旺盛，经过长期继代保存而不丧失胚性，有利于愈伤组织建立优良的悬浮系，并且在需要时能从中分离出全能性的原生质体。通过探究不同激素对剑叶龙血树愈伤组织的影响，筛选出快速生长、疏松型愈伤组织的最佳激素配比，为进行细胞悬浮培养生产剑叶龙血树总生物碱提供材料，为保护和合理开发剑叶龙血树提供技术方法。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种剑叶龙血树的疏松愈伤组织诱导的方法，它能够短时间产生增殖能力旺盛的疏松愈伤组织、为进行细胞悬浮培养生产剑叶龙血树总生物碱提供材料。
[0005] 本发明通过以下技术方案达到上述目的：一种剑叶龙血树的疏松愈伤组织诱导的方法，包括以下步骤：
[0006] (1)外植体的消毒：先用洗洁精水溶液清洗外植体表面污垢，置于烧杯中进行流水冲洗5～8min，然后移至超净工作台上，用75v/v％酒精将种子和芽浸泡30s，无菌水冲洗1 遍，再用0.1v/v％HgC12浸泡，时间分别为8、12、15min，无菌水浸泡3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；所述外植体为饱满种子或种子播种于河沙里萌发的芽；
[0007] (2)无菌苗的获得：将步骤(1)得到的外植体接种于MS诱导培养基中，在培养温度为25±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下培养8～15d便开始出芽，随后长出无菌苗，所述MS诱导培养基中添加0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
[0008] (3)培养基对愈伤组织的诱导效果：将步骤(2)中得到的无菌苗接种于MS、B5、N6三种基本培养基中，在培养温度为25±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下培养25～30d，逐渐产生疏松愈伤组织，所述MS、B5、N6三种基本培养基中分别添加0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
[0009] (4)培养基对愈伤组织的继代效果：将步骤(3)中得到的愈伤组织置于MS继代培养基中，在培养温度25±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为10h/d的条件下培养10d，切口端逐渐膨大，形成较多疏松的愈伤组织，所述MS继代培养基中添加0.1～2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5～3.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
[0010] 本发明的突出优点在于：
[0011] (1)通过取剑叶龙血树种子或芽进行愈伤组织诱导，能够在短时间内培育出大量长势良好的剑叶龙血树疏松愈伤组织，为剑叶龙血树建立悬浮系提供优良材料。
[0012] (2)本发明涉及升汞、酒精，MS、B5、N6基本培养基和6-苄基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D。MS具有较高的无机盐浓度，能够提供组织生长所需的矿质营养，从而加速愈伤组织的生长。B5培养基的主要特点是含有较低的铵，铵这一营养成分对培养基有抑制生长的作用。N6培养基特点是KNO3和(NH4)2SO4含量高。
[0013] (3)所用消毒剂、激素等化学药品价格低廉，试验成本低。
[0014] (4)采用本发明所述的培养方法得到的剑叶龙血树愈伤组织培养40d诱导率达85％以上，产生的愈伤组织生长快，大部分为嫩绿色、乳白色颗粒状的疏松型愈伤组织。
具体实施方式
[0015] 下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。
[0016] 实施例1
[0017] 本发明所述的剑叶龙血树的疏松愈伤组织诱导的方法的一个实例，包括如下步骤：
[0018] (1)外植体的消毒：先用洗洁精水溶液清洗外植体表面污垢，置于烧杯中进行流水冲洗5～8min，然后移至超净工作台上，用75v/v％酒精将种子和芽浸泡30s，无菌水冲洗1遍，再用0.1v/v％HgC12浸泡，时间分别为8、12、15min，无菌水浸泡3次。用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；所述外植体为饱满种子或种子播种于河沙里萌发的芽；
[0019] (2)无菌苗的获得：将步骤(1)得到的外植体分别接种于MS诱导培养基中，在培养2
温度为25±2℃，光照强度20～30μmol/m·s，光照时间为12h/d的条件下培养8～15d，便开始出芽，随后长出无菌苗。所述MS诱导培养基中还加入0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、
0.1mg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
温度为25±2℃，光照强度20～30μmol/m·s，光照时间为12h/d的条件下培养8～15d，便开始出芽，随后长出无菌苗。所述MS诱导培养基中还加入0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、
0.1mg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
[0020] (3)培养基对愈伤组织的诱导效果：将步骤(2)中得到的无菌苗分别接种于MS、B5、2
N6三种基本培养基中，在培养温度为25±2℃，光照强度20～30μmol/m ·s，光照时间为
12h/d的条件下培养25～30d，逐渐产生疏松愈伤组织。所述MS、B5、N6基本培养基中还加入
0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；MS、B5、N6三种基本培养基愈伤组织诱导率分别为为62.9％、57.1％、51.4％，MS基本培养基中培养产生的愈伤组织生长旺盛、结构疏松，其次为B5培养基，以N6为培养基愈伤组织诱导率最低，颜色浅黄、愈伤组织质地紧密，褐化率最高；
N6三种基本培养基中，在培养温度为25±2℃，光照强度20～30μmol/m ·s，光照时间为
12h/d的条件下培养25～30d，逐渐产生疏松愈伤组织。所述MS、B5、N6基本培养基中还加入
0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；MS、B5、N6三种基本培养基愈伤组织诱导率分别为为62.9％、57.1％、51.4％，MS基本培养基中培养产生的愈伤组织生长旺盛、结构疏松，其次为B5培养基，以N6为培养基愈伤组织诱导率最低，颜色浅黄、愈伤组织质地紧密，褐化率最高；
[0021] (4)培养基对愈伤组织的继代效果：将步骤(3)中得到的愈伤组织置于MS继代培养基中，在培养温度为25±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下培养10d后，切口端逐渐膨大，形成较多疏松的愈伤组织，所述MS继代培养基中还加入0.1～
2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，愈伤组织诱导率最高为77.1％，颜色淡黄或浅绿色，结构疏松。
2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，愈伤组织诱导率最高为77.1％，颜色淡黄或浅绿色，结构疏松。
[0022] 实施例2
[0023] (1)外植体的消毒：先用洗洁精水溶液清洗外植体表面污垢，置于烧杯中进行流水冲洗5～8min，然后移至超净工作台上，用75v/v％酒精将种子和芽浸泡30s，无菌水冲洗1遍，再用0.1v/v％HgC12浸泡，时间分别为8、12、15min，无菌水浸泡3次。用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；所述外植体为饱满种子或种子播种于河沙里萌发的芽；
[0024] (2)无菌苗的获得：将步骤(1)得到的外植体分别接种于MS诱导培养基中，在培养2
温度为25±2℃，光照强度20～30μmol/m·s，光照时间为12h/d的条件下培养，培养8～15d便开始出芽，随后长出无菌苗。所述外植体诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，还加入
0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
温度为25±2℃，光照强度20～30μmol/m·s，光照时间为12h/d的条件下培养，培养8～15d便开始出芽，随后长出无菌苗。所述外植体诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，还加入
0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
[0025] (3)培养基对愈伤组织的诱导效果：将步骤(2)中得到的无菌芽为外植体接种于MS基本培养基中，在培养温度为25±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下培养，25～30d逐渐产生疏松愈伤组织。所述愈伤组织诱导培养基分别为MS基本培养基，还加入0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
[0026] (4)培养基对愈伤组织的继代效果：将步骤(3)中得到的愈伤组织置于MS继代培养基中，在培养温度25±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为10h/d的条件下培养，接种10d后，切口端逐渐膨大，形成较多疏松的愈伤组织，所述愈伤组织继代培养基是以MS培养基为基本培养基，还加入0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，愈伤组织诱导率为65.7％，颜色浅绿色，结构紧密。
[0027] 实施例3
[0028] (1)外植体的消毒：先用洗洁精水溶液清洗外植体表面污垢，置于烧杯中进行流水冲洗5～8min，然后移至超净工作台上，用75v/v％酒精将种子和芽浸泡30s，无菌水冲洗1遍，再用0.1v/v％HgC12浸泡，时间分别为8、12、15min，无菌水浸泡3次。用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；所述外植体为饱满种子或种子播种于河沙里萌发的芽；
[0029] (2)无菌苗的获得：将步骤(1)得到的外植体分别接种于MS诱导培养基中，在培养温度为25±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下培养，培养8～15d便开始出芽，随后长出无菌苗。所述外植体诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，还加入0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
[0030] (3)培养基对愈伤组织的诱导效果：将步骤(2)中得到的无菌芽为外植体接种于MS基本培养基中，在培养温度为25±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下培养，25～30d逐渐产生疏松愈伤组织。所述愈伤组织诱导培养基分别为MS基本培养 基，还加入0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
[0031] (4)培养基对愈伤组织的继代效果：将步骤(3)中得到的愈伤组织置于MS继代培养基中，在培养温度25±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为10h/d的条件下培养，接种10d后，切口端逐渐膨大，形成较多疏松的愈伤组织，所述愈伤组织继代培养基是以MS培养基为基本培养基，还加入0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、1.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，愈伤组织诱导率为80.0％，颜色绿色，结构疏松。
[0032] 实施例4
[0033] (1)外植体的消毒：先用洗洁精水溶液清洗外植体表面污垢，置于烧杯中进行流水冲洗5～8min，然后移至超净工作台上，用75v/v％酒精将种子和芽浸泡30s，无菌水冲洗1遍，再用0.1v/v％HgC12浸泡，时间分别为8、12、15min，无菌水浸泡3次。用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；所述外植体为饱满种子或种子播种于河沙里萌发的芽；
[0034] (2)无菌苗的获得：将步骤(1)得到的外植体分别接种于MS诱导培养基中，在培养温度为25±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下培养，培养8～15d便开始出芽，随后长出无菌苗。所述外植体诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，还加入0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
[0035] (3)培养基对愈伤组织的诱导效果：将步骤(2)中得到的无菌芽为外植体接种于MS基本培养基中，在培养温度为25±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下培养，25～30d逐渐产生疏松愈伤组织。所述愈伤组织诱导培养基分别为MS基本培养基，还加入0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
[0036] (4)培养基对愈伤组织的继代效果：将步骤(3)中得到的愈伤组织置于MS继代培养基中，在培养温度25±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为10h/d的条件下培养，接种10d后，切口端逐渐膨大，形成较多疏松的愈伤组织，所述愈伤组织继代培养基是以MS培养基为基本培养基，还加入0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、1.5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，愈伤组织诱导率为88.6％，颜色乳白色或嫩绿色，结构较疏松。
[0037] 实施例5
[0038] (1)外植体的消毒：先用洗洁精水溶液清洗外植体表面污垢，置于烧杯中进行流水冲洗5～8min，然后移至超净工作台上，用75v/v％酒精将种子和芽浸泡30s，无菌水冲洗1遍，再用0.1v/v％HgC12浸泡，时间分别为8、12、15min，无菌水浸泡3次。用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；所述外植体为饱满种子或种子播种于河沙里萌发的芽；
[0039] (2)无菌苗的获得：将步骤(1)得到的外植体分别接种于MS诱导培养基中，在培养温度为25±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下培养，培养8～15d便开始出芽，随后长出无菌苗。所述外植体诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，还加入0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
[0040] (3)培养基对愈伤组织的诱导效果：将步骤(2)中得到的无菌芽为外植体接种于MS基本培养基中，在培养温度为25±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下培养，25～30d逐渐产生疏松愈伤组织。所述愈伤组织诱导培养基分别为MS基本培养基，还加入0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
[0041] (4)培养基对愈伤组织的继代效果：将步骤(3)中得到的愈伤组织置于MS继代培养基中，在培养温度25±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为10h/d的条件下培养，接种10d后，切口端逐渐膨大，形成较多疏松的愈伤组织，所述愈伤组织继代培养基是以MS培养基为基本培养基，还加入0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、2.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，愈伤组织诱导率为85.7％，颜色浅绿色或乳白色，结构最疏松。
[0042] 实施例6
[0043] (1)外植体的消毒：先用洗洁精水溶液清洗外植体表面污垢，置于烧杯中进行流水冲洗5～8min，然后移至超净工作台上，用75v/v％酒精将种子和芽浸泡30s，无菌水冲洗1遍，再用0.1v/v％HgC12浸泡，时间分别为8、12、15min，无菌水浸泡3次。用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；所述外植体为饱满种子或种子播种于河沙里萌发的芽；
[0044] (2)无菌苗的获得：将步骤(1)得到的外植体分别接种于MS诱导培养基中，在培养 温度为25±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下培养，培养8～15d便开始出芽，随后长出无菌苗。所述外植体诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，还加入0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
[0045] (3)培养基对愈伤组织的诱导效果：将步骤(2)中得到的无菌芽为外植体接种于MS基本培养基中，在培养温度为25±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下培养，25～30d逐渐产生疏松愈伤组织。所述愈伤组织诱导培养基分别为MS基本培养基，还加入0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
[0046] (4)培养基对愈伤组织的继代效果：将步骤(3)中得到的愈伤组织置于MS继代培养基中，在培养温度25±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为10h/d的条件下培养，接种10d后，切口端逐渐膨大，形成较多疏松的愈伤组织，所述愈伤组织继代培养基是以MS培养基为基本培养基，还加入0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、3.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，愈伤组织诱导率为82.9％，颜色绿色或淡黄色，结构疏松。
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