血叶兰组织培养快速繁殖方法
阅读：6发布：2021-04-11
专利汇可以提供血叶兰组织培养快速繁殖方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种繁殖血叶兰的方法，特别涉及一种血叶兰组织培养快速繁殖方法，属于 植物 组织培养技术领域。一种血叶兰组织培养快速繁殖方法，所述的方法是采用 腋芽 增殖的途径进行快速繁殖，包括以下依序进行的步骤：(1)外植体的准备阶段，(2)消毒阶段，(3)诱导培养阶段，(4)增殖培养阶段，(5)生根培养阶段，(6)移栽种植阶段。本发明所提供的方法不仅能有效缩短血叶兰培养时间，提高增殖倍数达4.67，提高有效芽数达100％，获得足量试管植株；还能提高血叶兰种苗 稳定性 ，降低培养成本，为其规模化生产应用奠定 基础 。，下面是血叶兰组织培养快速繁殖方法专利的具体信息内容。
1.一种血叶兰组织培养快速繁殖方法，其特征在于：包括以下依序进行的步骤：
(1)外植体的准备阶段
采集野生血叶兰植株，种植于具有遮阳网的网室内干净的河沙中15天以上，从中选取叶片硬挺、无病虫害的植株作为组织培养的材料，用清水冲洗干净，置于室内放置2-4天，剪取带顶芽的茎段和/或带茎节的茎段，除去叶片，作为外植体备用；
(2)消毒阶段
将步骤(1)中所准备的外植体在800-1000mg/L的二氧化氯溶液中进行表面消毒，浸泡消毒期间不断搅拌，所述浸泡消毒时间为20-25min；消毒后，用无菌滤纸或吸水纸将外植体表面的水吸干，备用；
(3)诱导培养阶段，包括以下依序进行的步骤：
①建立外植体无菌培养体系
将步骤(2)中消毒好的外植体取出置于无菌的器皿中进行修剪，修剪后插入诱导培养基A中；
培养环境温度为23±2℃，环境湿度为40-50％，进行无光照黑暗培养，培养周期为10-15天；所述诱导培养基A为：MS基本培养基+0.3-0.5mg/L NAA+6.5-7.2g/L琼脂+2.0-2.5g/L活性炭，pH值为5.2-5.6；
②诱导茎节萌发腋芽和顶芽伸长
将步骤①中诱导培养基A诱导培养后的，无污染和无褐变的外植体转移到诱导培养基B中进行光照培养，培养环境温度为23±2℃，环境湿度为40-50％，光照强度为
1000-2000lux，光照周期为8-10h/d，培养周期为20-30天；所述诱导培养基B为：MS基本培养基+0.2-0.3mg/L 6-BA+0.5-0.8mg/L NAA+8.0-8.5g/L琼脂+15-25g/L白糖，pH值为
5.2-5.6；
(4)增殖培养阶段
将诱导培养后带有萌发的腋芽、顶芽的外植体切成带一个茎节的茎段，转接到增殖培养基中进行光照培养，培养环境温度为23±2℃，环境湿度为40-50％，光照强度为
2000-3000lux，光照周期为8-10h/d，培养周期为80-90天；
所述增殖培养基为：MS基本培养基+0.5-1.0mg/L 6-BA+0.3-0.5mg/L NAA+1.0-2.5g/L蛋白胨+6.0-7.0g/L琼脂+15-25g/L白糖，pH值调整为5.2-5.6；
(5)生根培养阶段
将步骤(4)增殖培养获得的带2.0cm以上芽的小苗，转接至生根培养基中进行生根培养；培养环境温度为23±2℃，环境湿度为45-55％，光照强度为3000-4500Lux，光照周期为
10-12h/d，培养周期为30-40天；
所述生根培养基为：MS培养基+0.5-1.0mg/L NAA+0.07-0.09mg/L芸苔素+40-60g/L香蕉泥+1.5-2.5mg/L活性炭+18-22g/L白糖+7.5-8.0g/L琼脂，pH值为5.2-5.6；
(6)移栽种植阶段
将步骤(5)中生根培养后获得的种苗，连同培养瓶转移至温室大棚内炼苗10-20天，炼苗的大棚环境条件要求温度为20-30℃，光照强度为4000-5000lux，湿度为45-60％；炼苗后将种苗取出洗净根部培养基，种植在栽培基质中，所述栽培基质为草炭土、沼渣和分化黄壤土以2.0-2.5︰1-1.5︰1的体积比例混合的混合物，之后置于生态林下或可控温湿度的设施大棚内，栽培环境温度15-32℃，湿度要求60-90％，光照强度为4000-7000lux；
试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第4-5天开始，每10-14天浇施一次质量百分比浓度为0.004-0.006％磷酸二氢钾溶液，共浇施2次；
试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第20-30天开始，浇施质量百分比浓度为
0.004-0.006％的氯化铵溶液或质量百分比浓度为0.004-0.006％的硝酸铵溶液，每14-18天浇施一次所述氯化铵溶液或硝酸铵溶液，所述氯化铵溶液和硝酸铵溶液为交替使用，总共浇施2-8次，于采收前50-60天停止施肥；
试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第120-200天后采收。
2.根据权利要求1所述的血叶兰组织培养快速繁殖方法，其特征在于：
步骤(2)消毒处理阶段中，进行表面消毒时，用900mg/L二氧化氯溶液浸没外植体。
3.根据权利要求1或2所述的血叶兰组织培养快速繁殖方法，其特征在于：
步骤(3)诱导培养阶段在建立外植体无菌培养体系时，对外植体的修剪方法如下：对于带茎节的茎段，沿茎节呈40-50°角斜切去基部的组织，切成上短下长的带节的茎段，
75-85°角插入诱导培养基A中；
对于带顶芽的茎段，剥去顶芽外面包裹的叶片，呈40-50°角斜切去基部的组织，切成上短下长的带顶芽的茎段，75-85°角插入诱导培养基A中。
4.根据权利要求3所述的血叶兰组织培养快速繁殖方法，其特征在于：
步骤(3)诱导培养阶段的两个步骤中：
①建立外植体无菌培养体系
所述诱导培养基A为：MS基本培养基+0.4mg/L NAA+6.8g/L琼脂+2.25g/L活性炭，pH值为5.4；
②诱导茎节萌发腋芽和顶芽伸长
培养环境的光照强度为1500lux，光照周期为9h/d，培养周期为25天；所述诱导培养基B为：MS基本培养基+0.25mg/L 6-BA+0.65mg/L NAA+8.25g/L琼脂+20g/L白糖，pH值为
5.4；
步骤(4)增殖培养阶段中，培养环境的光照强度为2500lux，培养周期为85天；所述增殖培养基为：MS基本培养基+0.75mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA+蛋白胨1.75g/L+6.5g/L琼脂+20g/L白糖，pH值调整为5.4；
步骤(5)生根培养阶段中，光照强度为3750Lux，光照周期为11h/d，培养周期为35天；
所述生根培养基为：MS培养基+0.75mg/L NAA+0.08mg/L芸苔素+50g/L香蕉泥+1.25mg/L活性炭+20g/L白糖+7.75g/L琼脂，pH值为5.4；
步骤(6)移栽种植阶段中，连同培养瓶转移至温室大棚内炼苗的时间为15天，炼苗的大棚环境条件要求温度为23±2℃，光照度为4500lux，湿度为45-55％；所述栽培基质为草炭土、沼渣和分化黄壤土以2.25︰1.25︰1的体积比例混合的混合物，将炼苗后的种苗置于可控温湿度的设施大棚内栽培种植，栽培环境温度23±2℃，湿度要求45-55％，光照强度为5000-6000lux；
试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第4天开始，每13天浇施一次质量百分比浓度为
0.005％磷酸二氢钾溶液，共浇施2次；
试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第28天开始，浇施质量百分比浓度为0.005％的氯化铵溶液或质量百分比浓度为0.005％的硝酸铵溶液，每16天浇施一次所述氯化铵溶液或硝酸铵溶液，所述氯化铵溶液和硝酸铵溶液为交替使用，总共浇施5次，于采收前55天停止施肥；
试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第160天后采收。
血叶兰组织培养快速繁殖方法
技术领域
背景技术
[0002] 血叶兰是兰科血叶兰属植物。全属4种，我国仅1种，即血叶兰。生于海拔900-1300米山坡或沟谷常绿阔叶林下阴湿处。血叶兰兼备观赏和药用。根茎匍匐状，形似蚕，茎节生根，叶呈紫黑色，上有细小的绒毛，有金红色或银白色脉纹，似丝绒状，十分美丽，具有较高的观赏价值。它又是民间传统的中草药，全草入药，有滋阴润肺、清热凉血之功效，治疗肺结核咯血、神经衰弱、食欲不振等症的疗效甚佳。由于人类过度挖掘利用，野生资源越来越稀少，现已濒临灭绝的危险，属珍稀的物种之一。
[0004] 目前，血叶兰种苗的繁殖方法有分株繁殖和扦插繁殖，繁殖系数低，难以满足规模化种植需求；血叶兰的组织培养快繁已有报道，一种是采用人工授粉获得蒴果，进行种子无菌播种繁殖，但未见详细报道；茎段和顶芽组织培养快繁主要是通过“诱导产生类原球茎、类原球茎增殖、类原球茎分化及壮苗和生根培养”的途径来生产，直接导致后代产生变异，且培养时间长、程序繁琐、成本高，因此，如何缩短培养时间、提高种苗遗传稳定性、降低培养成本已成为血叶兰规模化、商品化生产急需解决的问题，同时还利于保护与合理利用血叶兰资源。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种血叶兰组织培养快速繁殖方法，以解决现有技术中存在的上述问题，本发明所提供的方法不仅能有效缩短血叶兰培养时间，提高增殖倍数达4.67，提高有效芽数达100％，获得足量试管植株；还能提高血叶兰种苗稳定性，降低培养成本，为其规模化生产应用奠定基础。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] 一种血叶兰组织培养快速繁殖方法，所述的方法是采用腋芽增殖的途径进行快速繁殖，包括以下依序进行的步骤：
[0008] (1)外植体的准备阶段
[0009] 采集野生血叶兰植株，种植于具有遮阳网的网室内干净的河沙中15天以上，从中选取叶片硬挺、无病虫害的茎段的植株作为组织培养的材料，用清水冲洗干净，置于室内放置2-4天，剪取带顶芽的茎段和/或带茎节的茎段，除去叶片，作为外植体备用；
[0010] 先在网室内用河沙种植短暂的时间，是为了减少野外杂菌和使野生植株恢复生长，提高外植体消毒灭菌效率。
[0011] (2)消毒阶段
[0012] 将步骤(1)中所准备的外植体在800-1000mg/L的二氧化氯溶液中进行表面消毒，浸泡消毒期间不断搅拌，所述浸泡消毒时间为20-25min；消毒后，用无菌滤纸或吸水纸将外植体表面的水吸干，备用；
[0013] (3)诱导培养阶段，包括以下依序进行的步骤：
[0014] ①建立外植体无菌培养体系
[0015] 将步骤(2)中消毒好的外植体取出置于无菌的器皿中进行修剪，修剪后插入诱导培养基A中；
[0016] 培养环境温度为23±2℃，环境湿度为40-50％，进行无光照黑暗培养，培养周期为10-15天；所述诱导培养基A为：MS基本培养基+0.3-0.5mg/L NAA+6.5-7.2g/L琼脂+2.0-2.5g/L活性炭，pH值为5.2-5.6；
[0017] ②诱导茎节萌发腋芽和顶芽伸长
[0018] 将步骤①中诱导培养基A诱导培养后的，无污染和无褐变的外植体转移到诱导培养基B中进行光照培养，培养环境温度为23±2℃，环境湿度为40-50％，光照强度为1000-2000lux，光照周期为8-10h/d，培养周期为20-30天；所述诱导培养基B为：MS基本培养基+0.2-0.3mg/L 6-BA+0.5-0.8mg/L NAA+8.0-8.5g/L琼脂+15-25g/L白糖，pH值为
5.2-5.6；
5.2-5.6；
[0019] 经诱导培养后，顶芽伸长带2-5个茎节，茎段腋芽萌发伸长具2-4个茎节；
[0020] (4)增殖培养阶段
[0021] 将诱导培养后带有萌发的腋芽、顶芽的外植体切成带一个茎节的茎段，转接到增殖培养基中进行光照培养，培养环境温度为23±2℃，环境湿度为40-50％，光照强度为2000-3000lux，光照周期为8-10h/d，培养周期为80-90天；
[0022] 所 述 增 殖 培 养 基 为：MS 基 本 培 养 基 +0.5-1.0mg/L 6-BA+0.3-0.5mg/L NAA+1.0-2.5g/L蛋白胨+6.0-7.0g/L琼脂+15-25g/L白糖，pH值调整为5.2-5.6；
[0023] 经增殖培养后，茎节腋芽萌发伸长、叶片伸展、芽健壮，可用于继续切割茎节增殖培养，增殖倍数达3.87-5.46倍，可继代增殖8-12次；
[0024] (5)生根培养阶段
[0025] 将步骤(4)增殖培养获得的带2.0cm以上芽的小苗，转接至生根培养基中进行生根培养；培养环境温度为23±2℃，环境湿度为45-55％，光照强度为3000-4500Lux，光照周期为10-12h/d，培养周期为30-40天；
[0026] 所述生根培养基为：MS培养基+0.5-1.0mg/L NAA+0.07-0.09mg/L芸苔素+40-60g/L香蕉泥+1.5-2.5mg/L活性炭+18-22g/L白糖+7.5-8.0g/L琼脂，pH值为5.2-5.6；低浓度芸苔素能促根壮苗、叶片展开、增加叶绿素含量提高光合效率以及提高植株抗逆性，试管苗移栽时能较快恢复生长，提高移栽成活率。
[0027] 经生根培养后，小苗生根率可达100％；
[0028] (6)移栽种植阶段
[0029] 将步骤(5)中生根培养后获得的种苗，连同培养瓶转移至温室大棚内炼苗10-20天，炼苗的大棚环境条件要求温度为20-30℃，光照强度为4000-5000lux，湿度为45-60％；炼苗后将种苗取出洗净根部培养基，种植在栽培基质中，所述栽培基质为草炭土、沼渣和分化黄壤土以2.0-2.5︰1-1.5︰1的体积比例混合的混合物；之后置于生态林下或可控温湿度的设施大棚内，栽培环境温度15-32℃，湿度要求60-90％，光照强度为4000-7000lux；
[0031] 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第20-30天开始，浇施质量百分比浓度为0.004-0.006％氯化铵溶液或硝酸铵溶液，每14-18天交替浇施一次所述氯化铵溶液或硝酸铵溶液，总共浇施2-8次，于采收前50-60天停止施肥；
[0032] 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第120-200天后采收。
[0033] 在65-70℃下恒温干燥加工后所获得的血叶兰干品有效成分含量如下：
[0035] 在上述培养基中，各物质的浓度均指其在最终配制获得的营养液中所占浓度，香蕉泥、活性炭、蛋白胨、白糖和琼脂的浓度均指质量百分比浓度。
[0037]
[0038] 进一步的，
[0039] 步骤(1)种植于具有遮阳网的网室内干净的河沙中15天以上后，从中选取叶片硬挺、无病虫害的茎段的植株作为组织培养的材料，先用清水冲洗干净，再置于室内放置2-4天；
[0040] 步骤(2)消毒处理阶段中，进行表面消毒时，用900mg/L二氧化氯溶液浸没外植体。
[0041] 更进一步的，
[0042] 步骤(3)诱导培养阶段在建立外植体无菌培养体系时，对外植体的修剪方法如下：对于带茎节的茎段，沿茎节呈40-50°角斜切去基部的组织，切成上短下长的带节的茎段，75-85°角插入诱导培养基A中；
[0043] 对于带顶芽的茎段，剥去顶芽外面包裹的叶片，呈40-50°角斜切去基部的组织，切成上短下长的带顶芽的茎段，75-85°角插入诱导培养基A中。
[0044] 经过修剪处理，使植物组织与培养基的接触面大些，利于更好地吸收和利用培养基。
[0045] 本发明所提供的血叶兰组织培养快速繁殖方法对比现有技术有如下优点：
[0046] 1)本发明的血叶兰组织培养快速繁殖方法，能周年生产种苗，在一年内培养的增殖系数较扦插繁殖法大大提高，增殖倍数达到3.87-5.46倍，极大地提高了血叶兰的种苗数量，为工厂化规模化育苗和血叶兰产业化发展奠定基础。
[0047] 2)能保存血叶兰野生种质资源，提高血叶兰种苗稳定性，通过顶芽或茎段腋芽无性繁殖的种苗能够完全保持亲本的遗传信息，母本的优良品质得以稳定遗传。增殖的种苗具有苗壮、生长一致的优点，便于统一管理，节省生产成本。
[0048] 3)通过诱导和增殖培养，大大提高了血叶兰的繁殖系数；生根培养获得叶片伸展、根系发达的壮苗，增强了种苗的抗逆性，提高了栽培成活率。
[0049] 4)本发明的血叶兰组织培养快速繁殖方法简便易行,能够有效降低培养成本，提高生产效率。
具体实施方式
[0050] 下面结合具体实施方式和具体实施例来对本发明进行详细的说明。
[0051] 具体实施方式如下：
[0052] 一种血叶兰组织培养快速繁殖方法，所述的方法是采用腋芽增殖的途径进行快速繁殖，包括以下依序进行的步骤：
[0053] (1)外植体的准备阶段
[0054] 采集野生血叶兰植株，种植于具有遮阳网的网室内干净的河沙中15天以上，再从中选取叶片硬挺、无病虫害的茎段的植株作为组织培养的材料，用清水冲洗干净，置于室内放置2-4天，剪取带顶芽的茎段和/或带茎节的茎段，除去叶片，作为外植体备用；
[0055] (2)消毒阶段
[0056] 将步骤(1)中所准备的外植体在800-1000mg/L的二氧化氯溶液中进行表面消毒，浸泡消毒期间不断搅拌，所述浸泡消毒时间为20-25min；消毒后，用无菌滤纸或吸水纸将外植体表面的水吸干，备用；
[0057] (3)诱导培养阶段，包括以下依序进行的步骤：
[0058] ①建立外植体无菌培养体系
[0059] 将步骤(2)中消毒好的外植体取出置于无菌的器皿中进行修剪，修剪后插入诱导培养基A中；
[0060] 培养环境温度为23±2℃，环境湿度为40-50％，进行无光照黑暗培养，培养周期为10-15天；所述诱导培养基A为：MS基本培养基+0.3-0.5mg/L NAA+6.5-7.2g/L琼脂+2.0-2.5g/L活性炭，pH值为5.2-5.6；
[0061] ②诱导茎节萌发腋芽和顶芽伸长
[0062] 将步骤①中诱导培养基A诱导培养后的，无污染和无褐变的外植体转移到诱导培养基B中进行光照培养，培养环境温度为23±2℃，环境湿度为40-50％，光照强度为1000-2000lux，光照周期为8-10h/d，培养周期为20-30天；所述诱导培养基B为：MS基本培养基+0.2-0.3mg/L 6-BA+0.5-0.8mg/L NAA+8.0-8.5g/L琼脂+15-25g/L白糖，pH值为
5.2-5.6；
5.2-5.6；
[0063] (4)增殖培养阶段
[0064] 将诱导培养后带有萌发的腋芽、顶芽的外植体切成带一个茎节的茎段，转接到增殖培养基中进行光照培养，培养环境温度为23±2℃，环境湿度为40-50％，光照强度为2000-3000lux，光照周期为8-10h/d，培养周期为80-90天；
[0065] 所 述 增 殖 培 养 基 为：MS 基 本 培 养 基 +0.5-1.0mg/L 6-BA+0.3-0.5mg/L NAA+1.0-2.5g/L蛋白胨+6.0-7.0g/L琼脂+15-25g/L白糖，pH值调整为5.2-5.6；
[0066] (5)生根培养阶段
[0067] 将步骤(4)增殖培养获得的带2.0cm以上芽的小苗，转接至生根培养基中进行生根培养；培养环境温度为23±2℃，环境湿度为45-55％，光照强度为3000-4500Lux，光照周期为10-12h/d，培养周期为30-40天；
[0068] 所述生根培养基为：MS培养基+0.5-1.0mg/L NAA+0.07-0.09mg/L芸苔素+40-60g/L香蕉泥+1.5-2.5mg/L活性炭+18-22g/L白糖+7.5-8.0g/L琼脂，pH值为5.2-5.6；
[0069] (6)移栽种植阶段
[0070] 将步骤(5)中生根培养后获得的种苗，连同培养瓶转移至温室大棚内炼苗10-20天，炼苗的大棚环境条件要求温度为20-30℃，光照强度为4000-5000lux，湿度为45-60％；炼苗后将种苗取出洗净根部培养基，种植在栽培基质中，所述栽培基质为草炭土、沼渣和分化黄壤土以2.0-2.5︰1-1.5︰1的体积比例混合的混合物，之后置于生态林下或可控温湿度的设施大棚内，栽培环境温度15-32℃，湿度要求60-90％，光照强度为4000-7000lux；
[0071] 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第4-5天开始，每10-14天浇施一次质量百分比浓度为0.004-0.006％磷酸二氢钾溶液，共浇施2次；
[0072] 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第20-30天开始，浇施质量百分比浓度为0.004-0.006％氯化铵溶液或硝酸铵溶液，每14-18天交替浇施一次所述氯化铵溶液或硝酸铵溶液，总共浇施2-8次，于采收前50-60天停止施肥；
[0073] 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第120-200天后采收。
[0074] 具体实施例如下：
[0075] 下面通过各实施例进一步说明本发明：
[0076] 实施例1(最佳实施例)
[0077] 一种血叶兰组织培养快速繁殖方法，所述的方法是采用腋芽增殖的途径进行快速繁殖，包括以下依序进行的步骤：
[0078] (1)外植体的准备阶段
[0079] 采集野生血叶兰植株，种植于具有遮阳网的网室内干净的河沙中15天以上，再从中选择茎节伸展、叶片硬挺、无病虫害的植株作为组织培养的材料，用清水冲洗干净，置于室内放置2-4天，剪取带顶芽的茎段和/或带茎节的茎段，除去叶片，作为外植体备用；
[0080] (2)消毒阶段
[0081] 将步骤(1)中所准备的外植体浸没在900mg/L的二氧化氯溶液中进行表面消毒，浸泡消毒期间不断搅拌，所述浸泡消毒时间为22.5min；消毒后，用无菌滤纸或吸水纸将外植体表面的水吸干，备用；
[0082] (3)诱导培养阶段，包括以下依序进行的步骤：
[0083] ①建立外植体无菌培养体系
[0084] 将步骤(2)中消毒好的外植体取出置于无菌的器皿中进行修剪，[0085] 对于带茎节的茎段，沿茎节呈45°角斜切去基部的组织，切成上短下长的带节的茎段，80°角插入诱导培养基A中；
[0086] 对于带顶芽的茎段，剥去顶芽外面包裹的叶片，呈45°角斜切去基部的组织，切成上短下长的带顶芽的茎段，80°角插入诱导培养基A中；
[0087] 培养环境温度为23±2℃，环境湿度为45％，进行无光照黑暗培养，培养周期为10-15天；所述诱导培养基A为：MS基本培养基+0.4mg/L NAA，并添加6.85g/L琼脂和
2.25g/L活性炭，pH值为5.4；
2.25g/L活性炭，pH值为5.4；
[0088] ②诱导茎节萌发腋芽和顶芽生长
[0089] 将步骤①中诱导培养基A诱导培养后的，无污染和无褐变的外植体转移到诱导培养基B中进行光照培养，培养环境温度为23±2℃，环境湿度为45％，光照强度为1500lux，光照周期为8-10h/d，培养周期为30天；所述诱导培养基B为：MS基本培养基+0.25mg/L6-BA+0.65mg/L NAA+8.25g/L琼脂+20g/L白糖，pH值为5.4；
[0090] (4)增殖培养阶段
[0091] 将诱导培养后带有萌发的腋芽、顶芽的外植体切成带一个茎节的茎段，转接到增殖培养基中进行光照培养，培养环境温度为23±2℃，环境湿度为45％，光照强度为2500-3000lux，光照周期为8-10h/d，培养周期为80-90天；
[0092] 所述增殖培养基为：MS基本培养基+0.75mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA+蛋白胨1.75g/L+6.5g/L琼脂+20g/L白糖，pH值调整为5.4；
[0093] (5)生根培养阶段
[0094] 将步骤(4)增殖培养获得的带2.0cm以上芽的小苗，转接至生根培养基中进行生根培养；培养环境温度为23±2℃，环境湿度为45-55％，光照强度为3000Lux，光照周期为11h/d，培养周期为35天；所述生根培养基为：MS培养基+0.75mg/L NAA+芸苔素0.08mg/L+50g/L香蕉泥+1.25mg/L活性炭+20g/L白糖+7.75g/L琼脂，pH值为5.4；
[0095] (6)移栽种植阶段
[0096] 将步骤(5)中生根培养后获得的种苗，连同培养瓶转移至温室大棚内炼苗的时间为15天，炼苗的大棚环境条件要求温度为23±2℃，光照度为4500lux，湿度为45-55％；炼苗后将种苗取出洗净根部培养基，种植在栽培基质中，所述栽培基质为草炭土、沼渣和分化黄壤土以2.25︰1.25︰1的体积比例混合的混合物，将炼苗后的种苗置于可控温湿度的设施大棚内栽培种植，栽培环境温度23±2℃，湿度要求45-55％，光照强度为
5000-6000lux；
5000-6000lux；
[0097] 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第4天开始，每13天浇施一次质量百分比浓度为0.005％磷酸二氢钾溶液，共浇施2次；
[0098] 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第28天开始，浇施质量百分比浓度为0.005％氯化铵溶液或硝酸铵溶液，每16天交替浇施一次所述氯化铵溶液或硝酸铵溶液，总共浇施5次，于采收前55天停止施肥；
[0099] 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第160天后采收。
[0100] 实施例2
[0101] 一种血叶兰组织培养快速繁殖方法，所述的方法是采用腋芽增殖的途径进行快速繁殖，包括以下依序进行的步骤：
[0102] (1)外植体的准备阶段
[0103] 采集野生血叶兰植株，种植于具有遮阳网的网室内干净的河沙中15天，再从中选择茎节伸展、叶片硬挺、无病虫害的植株作为组织培养的材料，用清水冲洗干净，置于室内放置3天，剪取带顶芽的茎段和/或带茎节的茎段，除去叶片，作为外植体备用；
[0104] (2)消毒阶段
[0105] 将步骤(1)中所准备的外植体浸没在800mg/L的二氧化氯溶液中进行表面消毒，浸泡消毒期间不断搅拌，所述浸泡消毒时间为20min；消毒后，用无菌滤纸或吸水纸将外植体表面的水吸干，备用；
[0106] (3)诱导培养阶段，包括以下依序进行的步骤：
[0107] ①建立外植体无菌培养体系
[0108] 将步骤(2)中消毒好的外植体取出置于无菌的器皿中进行修剪，[0109] 对于带茎节的茎段，沿茎节呈40°角斜切去基部的组织，切成上短下长的带节的茎段，75°角插入诱导培养基A中；
[0110] 对于带顶芽的茎段，剥去顶芽外面包裹的叶片，呈40°角斜切去基部的组织，切成上短下长的带顶芽的茎段，75°角插入诱导培养基A中；
[0111] 培养环境温度为23±2℃，环境湿度为50％，进行无光照黑暗培养，培养周期为10天；所述诱导培养基A为：MS基本培养基+0.3mg/L NAA，并添加6.5g/L琼脂和2.0g/L活性炭，pH值为5.2；
[0112] ②诱导茎节萌发腋芽和顶芽生长
[0113] 将步骤①中诱导培养基A诱导培养后的，无污染和无褐变的外植体转移到诱导培养基B中进行光照培养，培养环境温度为23±2℃，环境湿度为50％，光照强度为1000lux，光照周期为8h/d，培养周期为25天；所述诱导培养基B为：MS基本培养基+0.2mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+8.0g/L琼脂+15g/L白糖，pH值为5.2；
[0114] (4)增殖培养阶段
[0115] 将诱导培养后带有萌发的腋芽、顶芽的外植体切成带一个茎节的茎段，转接到增殖培养基中进行光照培养，培养环境温度为23±2℃，环境湿度为50％，光照强度为2500lux，光照周期为8h/d，培养周期为80天；
[0116] 所述增殖培养基为：MS基本培养基+0.5mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+1.0g/L蛋白胨+6.0g/L琼脂+15g/L白糖，pH值调整为5.2；
[0117] (5)生根培养阶段
[0118] 将步骤(4)增殖培养获得的带长度为2.0cm的芽的小苗，转接至生根培养基中进行生根培养；培养环境温度为23±2℃，环境湿度为45％，光照强度为2500Lux，光照周期为10h/d，培养周期为30天；
[0119] 所述生根培养基为：MS培养基+0.5mg/L NAA+芸苔素0.07mg/L+40g/L香蕉泥+1.5mg/L活性炭+18g/L白糖+7.5g/L琼脂，pH值为5.2；
[0120] (6)移栽种植阶段
[0121] 将步骤(5)中生根培养后获得的种苗，连同培养瓶转移至温室大棚内炼苗15天，炼苗的大棚环境条件要求温度为20℃，光照度为4000lux，湿度为45％；炼苗后将种苗取出洗净根部培养基，种植在栽培基质中，所述栽培基质为草炭土、沼渣和分化黄壤土以2.0︰1︰1的体积比例混合的混合物；置于生态林下或可控温湿度的设施大棚内，栽培环境温度
18±2℃，湿度要求60％，光照强度为4000-5000lux；
18±2℃，湿度要求60％，光照强度为4000-5000lux；
[0122] 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第4天开始，每10天浇施一次质量百分比浓度为0.004％磷酸二氢钾溶液，共浇施2次；
[0123] 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第20天开始，浇施质量百分比浓度为0.004％氯化铵溶液或硝酸铵溶液，每14天交替浇施一次所述氯化铵溶液或硝酸铵溶液，总共浇施2次，于采收前50天停止施肥；
[0124] 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第120天后采收。
[0125] 实施例3
[0126] 一种血叶兰组织培养快速繁殖方法，所述的方法是采用腋芽增殖的途径进行快速繁殖，包括以下依序进行的步骤：
[0127] (1)外植体的准备阶段
[0128] 采集野生血叶兰植株，种植于具有遮阳网的网室内干净的河沙中25天，再从中选择茎节伸展、叶片硬挺、无病虫害的植株作为组织培养的材料，用清水冲洗干净，置于室内放置2天，剪取带顶芽的茎段和/或带茎节的茎段，除去叶片，作为外植体备用；
[0129] (2)消毒阶段
[0130] 将步骤(1)中所准备的外植体浸没在1000mg/L的二氧化氯溶液中进行表面消毒，浸泡消毒期间不断搅拌，所述浸泡消毒时间为25min；消毒后，用无菌滤纸或吸水纸将外植体表面的水吸干，备用；
[0131] (3)诱导培养阶段，包括以下依序进行的步骤：
[0132] ①建立外植体无菌培养体系
[0133] 将步骤(2)中消毒好的外植体取出置于无菌的器皿中进行修剪，[0134] 对于带茎节的茎段，沿茎节呈50°角斜切去基部的组织，切成上短下长的带节的茎段，85°角插入诱导培养基A中；
[0135] 对于带顶芽的茎段，剥去顶芽外面包裹的叶片，呈50°角斜切去基部的组织，切成上短下长的带顶芽的茎段，85°角插入诱导培养基A中；
[0136] 培养环境温度为23±2℃，环境湿度为40％，进行无光照黑暗培养，培养周期为15天；所述诱导培养基A为：MS基本培养基+0.5mg/L NAA，并添加7.2g/L琼脂和2.5g/L活性炭，pH值为5.6；
[0137] ②诱导茎节萌发腋芽和顶芽生长
[0138] 将步骤①中诱导培养基A诱导培养后的，无污染和无褐变的外植体转移到诱导培养基B中进行光照培养，培养环境温度为23±2℃，环境湿度为40％，光照强度为2000lux，光照周期为10h/d，培养周期为30天；所述诱导培养基B为：MS基本培养基+0.3mg/L6-BA+0.8mg/L NAA+8.5g/L琼脂+25g/L白糖，pH值为5.6；
[0139] (4)增殖培养阶段
[0140] 将诱导培养后带有萌发的腋芽、顶芽的外植体切成带一个茎节的茎段，转接到增殖培养基中进行光照培养，培养环境温度为23±2℃，环境湿度为40％，光照强度为3000lux，光照周期为10h/d，培养周期为90天；
[0141] 所述增殖培养基为：MS基本培养基+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+2.5g/L蛋白胨+7.0g/L琼脂+25g/L白糖，pH值调整为5.6；
[0142] (5)生根培养阶段
[0143] 将步骤(4)增殖培养获得的带长度为3.0cm的芽的小苗，转接至生根培养基中进行生根培养；培养环境温度为23±2℃，环境湿度为55％，光照强度为3500Lux，光照周期为12h/d，培养周期为40天；
[0144] 所述生根培养基为：MS培养基+1.0mg/L NAA+芸苔素0.09mg/L+60g/L香蕉泥+2.5mg/L活性炭+22g/L白糖+8.0g/L琼脂，pH值为5.6；
[0145] (6)移栽种植阶段
[0146] 将步骤(5)中生根培养后获得的种苗，连同培养瓶转移至温室大棚内炼苗10天，炼苗的大棚环境条件要求温度为30℃，光照度为5000lux，湿度为60％；炼苗后将种苗取出洗净根部培养基，种植在栽培基质中，所述栽培基质为草炭土、沼渣和分化黄壤土以2.5︰1.5︰1的体积比例混合的混合物；置于生态林下或可控温湿度的设施大棚内，栽培环境温度32℃，湿度要求90％，光照强度为6000-7000lux；
[0147] 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第5天开始，每14天浇施一次质量百分比浓度为0.006％磷酸二氢钾溶液，共浇施2次；
[0148] 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第30天开始，浇施质量百分比浓度为0.006％氯化铵溶液或硝酸铵溶液，每18天交替浇施一次所述氯化铵溶液或硝酸铵溶液，总共浇施8次，于采收前60天停止施肥；
[0149] 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第200天后采收。
[0150] 实施例4
[0151] 一种血叶兰组织培养快速繁殖方法，所述的方法是采用腋芽增殖的途径进行快速繁殖，包括以下依序进行的步骤：
[0152] (1)外植体的准备阶段
[0153] 采集野生血叶兰植株，种植于具有遮阳网的网室内干净的河沙中15天，再从中选择茎节伸展、叶片硬挺、无病虫害的植株作为组织培养的材料，用清水冲洗干净，置于室内放置4天，剪取带顶芽的茎段和/或带茎节的茎段，除去叶片，作为外植体备用；
[0154] (2)消毒阶段
[0155] 将步骤(1)中所准备的外植体浸没在800mg/L的二氧化氯溶液中进行表面消毒，浸泡消毒期间不断搅拌，所述浸泡消毒时间为25min；消毒后，用无菌滤纸或吸水纸将外植体表面的水吸干，备用；
[0156] (3)诱导培养阶段，包括以下依序进行的步骤：
[0157] ①建立外植体无菌培养体系
[0158] 将步骤(2)中消毒好的外植体取出置于无菌的器皿中进行修剪，[0159] 对于带茎节的茎段，沿茎节呈40°角斜切去基部的组织，切成上短下长的带节的茎段，85°角插入诱导培养基A中；
[0160] 对于带顶芽的茎段，剥去顶芽外面包裹的叶片，呈40°角斜切去基部的组织，切成上短下长的带顶芽的茎段，85°角插入诱导培养基A中；
[0161] 培养环境温度为23±2℃，环境湿度为50％，进行无光照黑暗培养，培养周期为15天；所述诱导培养基A为：MS基本培养基+0.3mg/L NAA，并添加7.2g/L琼脂和2.0g/L活性炭，pH值为5.6；
[0162] ②诱导茎节萌发腋芽和顶芽生长
[0163] 将步骤①中诱导培养基A诱导培养后的，无污染和无褐变的外植体转移到诱导培养基B中进行光照培养，培养环境温度为23±2℃，环境湿度为50％，光照强度为2000lux，光照周期为8h/d，培养周期为20天；所述诱导培养基B为：MS基本培养基+0.2mg/L6-BA+0.8mg/L NAA+8.0g/L琼脂+25g/L白糖，pH值为5.2；
[0164] (4)增殖培养阶段
[0165] 将诱导培养后带有萌发的腋芽、顶芽的外植体切成带一个茎节的茎段，转接到增殖培养基中进行光照培养，培养环境温度为23±2℃，环境湿度为50％，光照强度为3000lux，光照周期为8h/d，培养周期为90天；
[0166] 所述增殖培养基为：MS基本培养基+0.5mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA+1.0g/L蛋白胨+7.0g/L琼脂+15g/L白糖，pH值调整为5.6；
[0167] (5)生根培养阶段
[0168] 将步骤(4)增殖培养获得的带2.0cm以上芽的小苗，转接至生根培养基中进行生根培养；培养环境温度为23±2℃，环境湿度为45％，光照强度为3500Lux，光照周期为10h/d，培养周期为30-40天；
[0169] 所述生根培养基为：MS培养基+0.5mg/L NAA+芸苔素0.09mg/L+40g/L香蕉泥+2.5mg/L活性炭+18g/L白糖+8.0g/L琼脂，pH值为5.2；
[0170] (6)移栽种植阶段
[0171] 将步骤(5)中生根培养后获得的种苗，连同培养瓶转移至温室大棚内炼苗20天，炼苗的大棚环境条件要求温度为20℃，光照度为4000lux，湿度为60％；炼苗后将种苗取出洗净根部培养基，种植在栽培基质中，所述栽培基质为草炭土、沼渣和分化黄壤土以2.05︰1.5︰1的体积比例混合的混合物；置于生态林下或可控温湿度的设施大棚内，栽培环境温度20℃，湿度要求90％，光照强度为5000-6000lux；
[0172] 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第4天开始，每14天浇施一次质量百分比浓度为0.004％磷酸二氢钾溶液，共浇施2次；
[0173] 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第20天开始，浇施质量百分比浓度为0.006％氯化铵溶液或硝酸铵溶液，每18天交替浇施一次所述氯化铵溶液或硝酸铵溶液，总共浇施2次，于采收前60天停止施肥；
[0174] 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第120天后采收。
[0175] 实施例5
[0176] 一种血叶兰组织培养快速繁殖方法，所述的方法是采用腋芽增殖的途径进行快速繁殖，包括以下依序进行的步骤：
[0177] (1)外植体的准备阶段
[0178] 采集野生血叶兰植株，种植于具有遮阳网的网室内干净的河沙中25天，从中选择茎节伸展、叶片硬挺、无病虫害的植株作为组织培养的材料，用清水冲洗干净，置于室内放置3天，剪取带顶芽的茎段和/或带茎节的茎段，除去叶片，作为外植体备用；
[0179] (2)消毒阶段
[0180] 将步骤(1)中所准备的外植体浸没在800mg/L的二氧化氯溶液中进行表面消毒，浸泡消毒期间不断搅拌，所述浸泡消毒时间为25min；消毒后，用无菌滤纸或吸水纸将外植体表面的水吸干，备用；
[0181] (3)诱导培养阶段，包括以下依序进行的步骤：
[0182] ①建立外植体无菌培养体系
[0183] 将步骤(2)中消毒好的外植体取出置于无菌的器皿中进行修剪，[0184] 对于带茎节的茎段，沿茎节呈50°角斜切去基部的组织，切成上短下长的带节的茎段，75°角插入诱导培养基A中；
[0185] 对于带顶芽的茎段，剥去顶芽外面包裹的叶片，呈50°角斜切去基部的组织，切成上短下长的带顶芽的茎段，75°角插入诱导培养基A中；
[0186] 培养环境温度为23±2℃，环境湿度为45％，培养周期为10天；所述诱导培养基A为：MS基本培养基+0.5mg/L NAA，并添加6.5g/L琼脂和2.5g/L活性炭，pH值为5.2；
[0187] ②诱导茎节萌发腋芽和顶芽生长
[0188] 将步骤①中诱导培养基A诱导培养后的，无污染和无褐变的外植体转移到诱导培养基B中进行光照培养，培养环境温度为23±2℃，环境湿度为45％，光照强度为1000lux，光照周期为10h/d，培养周期为22天；所述诱导培养基B为：MS基本培养基+0.3mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+8.5g/L琼脂+15g/L白糖，pH值为5.2；
[0189] (4)增殖培养阶段
[0190] 将诱导培养后带有萌发的腋芽、顶芽的外植体切成带一个茎节的茎段，转接到增殖培养基中进行光照培养，培养环境温度为23±2℃，环境湿度为45％，光照强度为2500lux，光照周期为10h/d，培养周期为90天；
[0191] 所述增殖培养基为：MS基本培养基+1.0mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+2.5g/L蛋白胨+6.0g/L琼脂+25g/L白糖，pH值调整为5.2；
[0192] (5)生根培养阶段
[0193] 将步骤(4)增殖培养获得的带2.0-2.5cm芽的小苗，转接至生根培养基中进行生根培养；培养环境温度为23±2℃，环境湿度为55％，光照强度为2500Lux，光照周期为12h/d，培养周期为30天；
[0194] 所述生根培养基为：MS培养基+1.0mg/L NAA+芸苔素0.07mg/L+60g/L香蕉泥+1.5mg/L活性炭+22g/L白糖+7.5g/L琼脂，pH值为5.6；
[0195] (6)移栽种植阶段
[0196] 将步骤(5)中生根培养后获得的种苗，连同培养瓶转移至温室大棚内炼苗20天，炼苗的大棚环境条件要求温度为30℃，光照度为4000lux，湿度为60％；炼苗后将种苗取出洗净根部培养基，种植在栽培基质中，所述栽培基质为草炭土、沼渣和分化黄壤土以2.5︰1︰1的体积比例混合的混合物；置于生态林下或可控温湿度的设施大棚内，栽培环境温度
32℃，湿度要求60％，光照强度为6000-7000lux；
32℃，湿度要求60％，光照强度为6000-7000lux；
[0197] 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第5天开始，每10天浇施一次质量百分比浓度为0.006％磷酸二氢钾溶液，共浇施2次；
[0198] 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第30天开始，浇施质量百分比浓度为0.004％氯化铵溶液或硝酸铵溶液，每14天交替浇施一次所述氯化铵溶液或硝酸铵溶液，总共浇施8次，于采收前50天停止施肥；
[0199] 试管苗移出培养瓶种植在栽培基质中第200天后采收。
[0200] 经过对各实施例的各步骤的测试，
[0201] 该方法中各步骤的实验数据分别如以下内容所示：
[0202] (一)诱导培养阶段顶芽和茎段腋芽伸长茎节的实验数据
[0203] 实验设计如下：
[0204] ①建立外植体无菌培养体系
[0205] 将各实施例的步骤(2)中消毒好的外植体取出置于无菌的器皿中进行修剪，修整后插入诱导培养基A中；
[0206] ②诱导茎节萌发腋芽和顶芽伸长
[0207] 将步骤①中诱导培养基A诱导培养后的，无污染和无褐变的外植体转移到诱导培养基B中进行光照培养，每个处理接种50瓶，从无污染的瓶中随机挑选20瓶，分别统计带顶芽的茎段和带茎节的茎段，三次重复。
[0208] 表一——诱导培养阶段各实施例的顶芽和茎段腋芽平均伸长茎节数[0209]
[0210] 从表一的实验数据可以明显看出：在经过建立外植体无菌培养体系以及诱导茎节萌发腋芽和顶芽伸长后，各实施例的外植体经诱导培养后，顶芽伸长带2-6个茎节，茎段腋芽萌发伸长具2-4个茎节。
[0211] (二)增殖培养阶段增殖倍数和继代增殖次数的实验数据
[0212] 实验设计如下：
[0213] 将诱导培养后带有萌发的腋芽、顶芽的外植体切成带一个茎节的茎段，转接到增殖培养基中进行光照培养，每个处理接种50瓶，随机挑选20瓶，分别统计增殖倍数，三次重复。
[0214] 将增殖培养后的外植体，继续切成带一个茎节的茎段，转接到增殖培养基中进行光照培养，重复处理，到不适宜进行继代培养为止，分别统计各实施例的继代增殖次数。
[0215] 表二——增殖培养阶段各实施例的增殖倍数和继代增殖次数
[0216]实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
增殖倍数 5.1 4.9 5.6 3.9 5.4
继代增殖次数 12 11 15 13 8
增殖倍数 5.1 4.9 5.6 3.9 5.4
继代增殖次数 12 11 15 13 8
[0217] 从表二的实验数据可以明显看出：经增殖培养后，各实施例的茎节腋芽萌发伸长、叶片伸展、芽健壮，可用于继续切割茎节增殖培养，增殖倍数达4-5倍，继代增殖8-15次。
[0218] (三)生根培养阶段小苗生根率的实验数据
[0219] 实验设计如下：
[0220] 将步骤(4)增殖培养获得的带2.0cm以上芽的小苗，转接至生根培养基中进行生根培养；每个处理接种50瓶，从无污染的瓶中随机挑选20瓶，分别统计小苗生根率，三次重复。
[0221] 表三——生根培养阶段各实施例的小苗生根率
[0222]实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
[0223]小苗生根率 100％ 100％ 100％ 100％ 100％
[0224] 从表三的实验数据可以明显看出：经生根培养后，各实施例的小苗生根率均可达100％。
[0225] (四)种苗生产周期的增殖系数的实验数据
[0226] 表四——种苗生产周期各实施例的种苗增殖系数
[0227]实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
增殖系数 5.46 5.20 5.12 4.24 3.87
增殖系数 5.46 5.20 5.12 4.24 3.87
[0228] 从表四的实验数据可以明显看出：本发明的各实施例的血叶兰组织培养快速繁殖方法，能周年生产种苗，在一年内培养的增殖系数可以达到3.87-5.46，极大地提高了血叶兰的种苗数量，为工厂化规模化育苗和血叶兰产业化发展奠定基础。
[0229] (五)血叶兰干品有效成分含量的实验数据
[0230] 表五——各实施例的血叶兰干品有效成分含量
[0231]实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
总多糖(以葡萄糖计) 2.47％ 2.43％ 2.37％ 2.44％ 2.39％
总黄酮(以芦丁计) 0.81％ 0.77％ 0.80％ 0.79％ 0.81％
总多糖(以葡萄糖计) 2.47％ 2.43％ 2.37％ 2.44％ 2.39％
总黄酮(以芦丁计) 0.81％ 0.77％ 0.80％ 0.79％ 0.81％
[0232] 从表五的实验数据可以明显看出：本发明的各实施例的血叶兰经恒温干燥后可获得较高的血叶兰干品有效成分，其中总多糖(以葡萄糖计)最高可达2.47％，总黄酮(以芦丁计)最高可达0.7％，与野生血叶兰总多糖和总黄酮含量相近，总多糖平均值(2.42％)略高于3份野生血叶兰总多糖的平均值(2.37％)，总黄酮平均值(0.796％)与3份野生血叶兰总黄酮平均值(0.80％)相近。
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