技术领域
[0001] 本
发明涉及一种制备治疗风湿性关节炎的功能型饮品的方法,属于
生物技术领域。
背景技术
[0002] 风湿性关节炎是一种常见的慢性自身免疫性
疾病,其病理表现是炎性滑膜增生以及关节软骨和骨骼的破坏,中医将其归入“痹证”的范畴。传统中医对防治风湿性关节炎疾病具有悠久的历史,蜂针治疗痹证在临床运用广泛。蜂针中的蜂针液即为
蜂毒,蜂毒中的
蜂毒肽、蜂毒明肽、细胞肥大脱粒肽具有抗菌消炎、
镇痛等功效,蜂胶中的黄
酮具有抗炎、镇痛等功效,由于蜂胶具有多重药理活性,蜂胶产品在市场上受到广大消费者的青睐,现已广泛应用于医药、保健品、
化妆品等领域。
[0003] 蜂胶黄酮是从蜂胶原胶中提取得来的,具有易制备、周期短等特点,蜂毒活性肽是从蜂毒中经分离得来的,具有低量高效、无污染等特点,两者结合可以研制开发出
机体镇痛消炎等产品,具有很大的市场开发前景,因而引起了医学领域广泛的关注。
[0004] 细胞毒药物、肾上腺皮质
激素、非甾体类抗炎药等作为临床治疗风湿性关节炎的主要药物,以上药物对人体重要的脏器和组织各有不同的毒性作用。Favalli (Favalli, E.G., et al., Methotrexate for the treatment of rheumatoid arthritis in the biologic era: still an "anchor" drug [J]. Autoimmunity Reviews, 2014, 13(11): 1102.)报道了甲
氨蝶呤作为一种细胞毒药物治疗风湿性关节炎,但甲氨蝶呤对肝、
肺等脏器功能都有损害。Bilasy(Bilasy, S.E., et al., Myelosuppressive and hepatotoxic potential of leflunomide and methotrexate combination in a rat model of rheumatoid arthritis[J]. Pharmacological Reports Pr, 2015, 67(1): 102.)报道了来氟米特治疗风湿性关节炎,疗效与甲氨蝶呤相似,耐受性优于甲氨蝶呤,但接受来氟米特治疗的风湿患者出现了间质性肺炎、肺
纤维化的症状。Katchamart(Katchamart, W., et al., Methotrexate monotherapy versus methotrexate combination therapy with non-biologic disease modifying antirheumatic drugs for rheumatoid arthritis[J]. Cochrane Database of Systematic Reviews, 2010, 4(4): CD008495.)报道了甲氨蝶呤
单药治疗与
联合治疗的疗效和毒性,但联合用药需要考虑药物的疗效和毒性。董中国(董中国等, 针药并用治疗血管神经性头痛临床观察[J]. 黑龙江医药科学, 2008, 31(4): 44-44.)报道了蜂针加中药治疗风湿性关节炎,总有效率90.023%,但治疗时间至少为一个月,治疗时间较长。杨亚旭(杨亚旭等, 蜂毒素联合杜仲黄酮外用治疗类风湿关节炎的实验研究[J]. 时珍国医国药, 2016, 27(8): 1833-1836.)报道了蜂毒素联合杜仲黄酮外用治疗类风湿关节炎,蜂毒肽联合杜仲黄酮浓度均为1μg/μL,1:1混合使用可以有效的治疗类风湿性关节炎,但蜂毒肽与杜仲黄酮用量大,增加了成本。
[0005] 上述方法应用西药甲氨蝶呤、来氟米特作为临床治疗风湿性关节炎的主要药物,这些药物在治疗过程中存在对身体脏器
副作用大的
缺陷;蜂针、蜂毒肽、黄酮等组分治疗风湿性关节炎,在治疗过程中存在治疗时间长,存在用量大的问题。
发明内容
[0006] 本发明的目的是为了解决风湿性关节炎药物副作用大、疗效低的问题,提供一种治疗风湿性关节炎的饮品。
[0007] 本发明获得的浓度为0.05mg/mL蜂毒活性肽溶液与浓度为0.326mg/mL蜂胶黄酮溶液按照体积比V(蜂毒活性肽):V(蜂胶)=1:7进行复配,正常小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β和血尿氮值分别为99.29±5.89 pg/mL、100.81±8.72 pg/mL、101.29±7.39 pg/mL 、126.64±32.06 mmol/L,不饮用复配饮品小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β和血尿氮值分别为110.54±5.64 pg/mL、216.22±12.86 pg/mL、110.35±5.49 pg/mL 、187.17±8.54 mmol/L,饮用复配饮品小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β和血尿氮值分别为100.25±5.82pg/mL、106.04±9.76pg/mL、
107.23±9.55 pg/mL 、151.53±54.99 mmol/L,服用阿司匹林小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β和血尿氮值分别为106.37±2.38 pg/mL、116.87±13.34 pg/mL、102.55±4.88 pg/mL 、156.63±33.89 mmol/L。本发明的一种制备治疗痛风性关节炎功能饮品的方法,步骤如下:
①蜂胶黄酮溶液的制备
将蜂胶放入酒
精度为45-75°的白酒中,70-90℃
水浴提取1.5-4.5h,共提取1-3次,以
2500-5500r/min离心4-8min进行固液分离,除去固体蜂胶残渣,用酒精度为45-75°的白酒将蜂胶黄酮提取液配置成浓度为0.1-0.5mg/mL的蜂胶黄酮溶液;
所述酒精度为食品级白酒中所含
乙醇的体积百分比。
[0008] ②蜂毒活性肽溶液的制备将蜂毒经葡聚糖凝胶G-25用蒸馏水洗脱,流速控制在25-30mL/h,测定各分离组分的分子量,在葡聚糖凝胶柱下收集分子量为2035Da、2587Da、2840Da的层析组分并
冷冻干燥,所得固体样品为蜂毒活性肽,将蜂毒活性肽用纯净水配置成浓度为0.015-0.055mg/mL的蜂毒活性肽溶液;
所述葡聚糖凝胶G-25为葡聚糖用英文字母G表示,G反映凝胶的交联程度、膨胀程度及分布范围,25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克;
所述洗脱为以蒸馏水作为流动相连续通过色谱柱固定相,流动相与固定相作用
力比样品弱,样品各组分按先后顺序从固定相
洗出;
所述Da为蜂毒活性肽分子量的单位;
所述分子量的测定为根据标准品洗脱保留时间T(min)与其相对分子
质量对数值(lgMr)标准曲线回归方程,标准品为抗菌肽标准品(Mr =1422Da)、
氧化性谷胱甘肽标准品(Mr =612Da)、还原性谷胱甘肽标准品(Mr =307.32Da)。
[0009] 所述冷冻干燥为将所得组分冷冻至水的
冰点以下,并置于高
真空(10-40Pa)的容器中,通过供热使物料中的水分直接从固态冰
升华为水汽的一种干燥方法;所述蜂毒活性肽包括蜂毒肽、蜂毒明肽、细胞肥大脱粒肽;
③治疗风湿性关节炎饮品的制备
将①中浓度为0.015-0.055mg/mL的蜂毒活性肽溶液与②中浓度为0.1-0.5mg/mL蜂胶黄酮溶液的按照体积比V(蜂毒活性肽):V(蜂胶)=1:4-10进行复配,所得即为具有治疗风湿性关节炎功能饮品。
[0010] 所述体积比为蜂毒活性肽溶液与蜂胶黄酮溶液体积的比值;所述复配为蜂毒活性肽溶液与蜂胶黄酮溶液的混合。
[0011] 采用本方法生产的治疗风湿性关节炎的功能饮品,饮用复配饮品组与不饮用复配饮品组相比TNF-α、IL-6、IL-1β和血尿氮值分别降低了10.29 pg/mL、110.18 pg/mL、3012 pg/mL、35.64 mmol/L与
现有技术相比较,本发明制备治疗风湿性关节炎的功能饮品的方法,具有以下显著特点:(1)本发明获得的饮品治疗风湿性关节炎的效果与阿司匹林相似,但不造成肾脏的损伤;
(2)本发明获得的治疗风湿性关节炎的饮品相对于董中国(董中国等, 针药并用治疗血管神经性头痛临床观察[J]. 黑龙江医药科学, 2008, 31(4): 44-44.),治疗时间缩短
20天;
(3)本发明获得的治疗风湿性关节炎的饮品相对于杨亚旭(杨亚旭等, 蜂毒素联合杜仲黄酮外用治疗类风湿关节炎的实验研究[J]. 时珍国医国药, 2016, 27(8): 1833-
1836.),每毫升节省蜂毒0.95mg,黄酮0.674mg。
[0012]
实施例1:① 蜂胶黄酮溶液的制备
将蜂胶放入酒精度为60°的白酒中,80℃水浴提取3h,共提取1次,以5000r/min离心
5min进行固液分离,除去固体蜂胶残渣,用酒精度为60°的白酒将蜂胶黄酮提取液配置成浓度为0.326mg/mL的蜂胶黄酮溶液;所述酒精度为食品级白酒中所含乙醇的体积百分比。
[0013] ② 蜂毒活性肽溶液的制备将蜂毒经葡聚糖凝胶G-25用蒸馏水洗脱,流速控制在28mL/h,测定各分离组分的分子量,在葡聚糖凝胶柱下收集分子量为2035Da、2587Da、2840Da的层析组分并冷冻干燥,所得固体样品为蜂毒活性肽,将蜂毒活性肽用纯净水配置成浓度为0.05mg/mL的蜂毒活性肽溶液;
所述葡聚糖凝胶G-25为葡聚糖用英文字母G表示,G反映凝胶的交联程度、膨胀程度及分布范围,25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克;
所述洗脱为以蒸馏水作为流动相连续通过色谱柱固定相,流动相与固定相作用力比样品弱,样品各组分按先后顺序从固定相洗出;
所述Da为蜂毒活性肽分子量的单位;
所述分子量的测定为根据标准品洗脱保留时间T(min)与其相对分子质量对数值(lgMr)标准曲线回归方程,标准品为抗菌肽标准品(Mr =1422Da)、氧化性谷胱甘肽标准品(Mr =612Da)、还原性谷胱甘肽标准品(Mr =307.32Da)。
[0014] 所述冷冻干燥为将所得组分冷冻至水的冰点以下,并置于高真空(10-40Pa)的容器中,通过供热使物料中的水分直接从固态冰升华为水汽的一种干燥方法;所述蜂毒活性肽包括蜂毒肽、蜂毒明肽、细胞肥大脱粒肽;
③治疗风湿性关节炎饮品的制备
将①中浓度为0.05mg/mL蜂毒活性肽溶液的与②中浓度为0.326mg/mL的蜂胶黄酮溶液按照体积比V(蜂毒活性肽):V(蜂胶)=1:7进行复配,所得即为具有治疗风湿性关节炎功能饮品。
[0015] 所述体积比为蜂毒活性肽溶液与蜂胶黄酮溶液体积的比值;所述复配为蜂毒活性肽溶液与蜂胶黄酮溶液的混合。
[0016] 正常小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β和血尿氮值分别为99.29±5.89 pg/mL、100.81±8.72 pg/mL、101.29±7.39 pg/mL 、126.64±32.06 mmol/L,不饮用复配饮品小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β和血尿氮值分别为110.54±5.64 pg/mL、216.22±12.86 pg/mL、110.35±5.49 pg/mL 、187.17±8.54 mmol/L,饮用复配饮品小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β和血尿氮值分别为
100.25±5.82pg/mL、106.04±9.76pg/mL、107.23±9.55 pg/mL 、151.53±54.99 mmol/L,服用阿司匹林小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β和血尿氮值分别为106.37±2.38 pg/mL、116.87±
13.34 pg/mL、102.55±4.88 pg/mL 、156.63±33.89 mmol/L。
[0017] 实施例2:①蜂胶黄酮溶液的制备
将蜂胶放入酒精度为70°的白酒中, 90℃水浴提取4h,共提取2次,以4000r/min离心
6min进行固液分离,除去固体蜂胶残渣,用酒精度为70°的白酒将蜂胶黄酮提取液配置成浓度为0.217mg/mL的蜂胶黄酮溶液;
所述酒精度为食品级白酒中所含乙醇的体积百分比。
[0018] ②蜂毒活性肽溶液的制备将蜂毒经葡聚糖凝胶G-25用蒸馏水洗脱,流速控制在30mL/h,测定各分离组分的分子量,在葡聚糖凝胶柱下收集分子量为2035Da、2587Da、2840Da的层析组分并冷冻干燥,所得固体样品为蜂毒活性肽,将蜂毒活性肽用纯净水配置成浓度为0.03mg/mL的蜂毒活性肽溶液;
所述葡聚糖凝胶G-25为葡聚糖用英文字母G表示,G反映凝胶的交联程度、膨胀程度及分布范围,25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克;
所述洗脱为以蒸馏水作为流动相连续通过色谱柱固定相,流动相与固定相作用力比样品弱,样品各组分按先后顺序从固定相洗出;
所述Da为蜂毒活性肽分子量的单位;
所述分子量的测定为根据标准品洗脱保留时间T(min)与其相对分子质量对数值(lgMr)标准曲线回归方程,标准品为抗菌肽标准品(Mr =1422Da)、氧化性谷胱甘肽标准品(Mr =612Da)、还原性谷胱甘肽标准品(Mr =307.32Da)。
[0019] 所述冷冻干燥为将所得组分冷冻至水的冰点以下,并置于高真空(10-40Pa)的容器中,通过供热使物料中的水分直接从固态冰升华为水汽的一种干燥方法;所述蜂毒活性肽包括蜂毒肽、蜂毒明肽、细胞肥大脱粒肽;
③治疗风湿性关节炎饮品的制备
将①中浓度为0.03mg/mL的蜂毒活性肽溶液与②中浓度为0.217mg/mL的蜂胶黄酮溶液按照体积比V(蜂毒活性肽):V(蜂胶)=1:9进行复配,所得即为具有治疗风湿性关节炎功能饮品。
[0020] 所述体积比为蜂毒活性肽溶液与蜂胶黄酮溶液体积的比值;所述复配为蜂毒活性肽溶液与蜂胶黄酮溶液的混合。
[0021] 正常小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β和血尿氮值分别为99.29±5.89 pg/mL、100.81±8.72 pg/mL、101.29±7.39 pg/mL 、126.64±32.06 mmol/L,不饮用复配饮品小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β和血尿氮值分别为110.54±5.64 pg/mL、216.22±12.86 pg/mL、110.35±5.49 pg/mL 、187.17±8.54 mmol/L,饮用复配饮品小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β和血尿氮值分别为
100.91±7.89pg/mL、109.87±3.22pg/mL、103.64±4.95pg/mL 、189.94±27.17mmol/L,服用阿司匹林小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β和血尿氮值分别为106.37±2.38 pg/mL、116.87±
13.34 pg/mL、102.55±4.88 pg/mL 、156.63±33.89 mmol/L。
[0022] 实施例3:①蜂胶黄酮溶液的制备
将蜂胶放入酒精度为50°的白酒中,70℃水浴提取2h,共提取3次,以3000r/min离心
4min进行固液分离,除去固体蜂胶残渣,用酒精度为50°的白酒将蜂胶黄酮提取液配置成浓度为0.109mg/mL的蜂胶液;
所述酒精度为食品级白酒中所含乙醇的体积百分比。
[0023] ②蜂毒活性肽溶液的制备将蜂毒经葡聚糖凝胶G-25用蒸馏水洗脱,流速控制在26mL/h,测定各分离组分的分子量,在葡聚糖凝胶柱下收集分子量为2035Da、2587Da、2840Da的层析组分并冷冻干燥,所得固体样品为蜂毒活性肽,将蜂毒活性肽用纯净水配置成浓度为0.0182mg/mL的蜂毒活性肽溶液;
所述葡聚糖凝胶G-25为葡聚糖用英文字母G表示,G反映凝胶的交联程度、膨胀程度及分布范围,25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克;
所述洗脱为以蒸馏水作为流动相连续通过色谱柱固定相,流动相与固定相作用力比样品弱,样品各组分按先后顺序从固定相洗出;
所述Da为蜂毒活性肽分子量的单位;
所述分子量的测定为根据标准品洗脱保留时间T(min)与其相对分子质量对数值(lgMr)标准曲线回归方程,标准品为抗菌肽标准品(Mr =1422Da)、氧化性谷胱甘肽标准品(Mr =612Da)、还原性谷胱甘肽标准品(Mr =307.32Da)。
[0024] 所述冷冻干燥为将所得组分冷冻至水的冰点以下,并置于高真空(10-40Pa)的容器中,通过供热使物料中的水分直接从固态冰升华为水汽的一种干燥方法;所述蜂毒活性肽包括蜂毒肽、蜂毒明肽、细胞肥大脱粒肽;
③治疗风湿性关节炎饮品的制备
将①中浓度为0.0182mg/mL的蜂毒活性肽溶液与②中浓度为0.109mg/mL的蜂胶黄酮溶液按照体积比V(蜂毒活性肽):V(蜂胶)=1:5进行复配,所得即为具有治疗风湿性关节炎功能饮品。
[0025] 所述体积比为蜂毒活性肽溶液与蜂胶黄酮溶液体积的比值;所述复配为蜂毒活性肽溶液与蜂胶黄酮溶液的混合。
[0026] 正常小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β和血尿氮值分别为99.29±5.89 pg/mL、100.81±8.72 pg/mL、101.29±7.39 pg/mL 、126.64±32.06 mmol/L,不饮用复配饮品小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β和血尿氮值分别为110.54±5.64 pg/mL、216.22±12.86 pg/mL、110.35±5.49 pg/mL 、187.17±8.54 mmol/L,饮用复配饮品小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β和血尿氮值分别为
100.70±18.46pg/mL、107.89±5.39pg/mL、109.21±2.46pg/mL 、209.99±12.28mmol/L,服用阿司匹林小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β和血尿氮值分别为106.37±2.38 pg/mL、116.87±
13.34 pg/mL、102.55±4.88 pg/mL 、156.63±33.89 mmol/L。