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一种TIL细胞的制备方法、试剂盒和试剂套装

阅读：474发布：2020-05-08

专利汇可以提供一种TIL细胞的制备方法、试剂盒和试剂套装专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本说明书实施例公开了一种TIL细胞的制备方法、试剂盒和试剂套装，该方案包括：采用CD3和RN对用于培养TIL细胞的培养瓶进行预处理；基于新鲜的肝素抗凝的患者腹水对淋巴细胞进行分离处理；将分离得到的细胞用配置的培养液进行重悬，转移至预处理后的培养瓶中，并在培养瓶中加入干扰素-γ，将培养瓶置于恒温培养箱中培养；基于设定时长和/或细胞生长情况，向培养瓶中补加新配置的所述培养液并加入白细胞介素-2和白细胞介素-23进行培养；培养预设天数后，收集增殖的TIL细胞。从而，利用CD3和RN联合IL-2和IL-23扩增培养，增强了TIL细胞的增殖能力，同时，促进TIL细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，显著提高腹水来源体外TIL 细胞增殖的效率及其靶向杀伤肿瘤细胞的活性。，下面是一种TIL细胞的制备方法、试剂盒和试剂套装专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种腹水来源TIL细胞的制备方法，其特征在于，包括：
采用单克隆抗体CD3和重组人纤维连接蛋白RN，对用于培养TIL细胞的培养瓶进行预处理；
基于新鲜的肝素抗凝的患者腹水对淋巴细胞进行分离处理；
将分离得到的细胞用配置的培养液进行重悬，转移至预处理后的培养瓶中，并在所述培养瓶中加入干扰素-γ，将所述培养瓶置于恒温培养箱中培养；
基于设定时长和/或细胞生长情况，向所述培养瓶中补加新配置的所述培养液并加入白细胞介素-2和白细胞介素-23进行培养；
培养预设天数后，收集增殖的TIL细胞。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，采用单克隆抗体CD3和重组人纤维连接蛋白RN，对用于培养TIL细胞的培养瓶进行预处理，具体包括：
将CD3与RN溶于DPBS中制成预处理试剂，并将所述预处理试剂转移至用于培养TIL细胞的培养瓶中；
将盛有预处理试剂的培养瓶于第一预设温度下避光放置第一预设时长。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，基于新鲜的肝素抗凝的患者腹水对淋巴细胞进行分离处理，具体包括：
将冷藏保存的淋巴细胞分离液取出置于室温环境；
将新鲜的肝素抗凝的患者腹水置于离心管内，配平并离心后，收集上层液体，灭活处理后，于第二预设温度下放置第二预设时长，再次离心后吸取上层液体备用；
腹水离心后的下层加入DPBS混匀，各取一半沿管壁缓慢加至两管达到室温的淋巴细胞分离液面上，其中，每一管的不同液体界面清晰；将加入腹水混合液的两管淋巴细胞分离液离心处理，得到四层液体，由上至下分别为：第一层为DPBS层，第二层为环状乳白色淋巴细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层；
收集离心处理后两管中的第二层环状乳白色淋巴细胞，并加入离心管中，补加生理盐水，离心处理后弃上清液，补加生理盐水重悬细胞，再次离心处理后弃去上清液。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，将新鲜的肝素抗凝的患者腹水置于离心管内，配平并离心时，所采用的离心降速最慢；
将加入腹水混合液的两管淋巴细胞分离液离心处理时，所采用的离心速度缓升缓降。
5.如权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，收集增殖的TIL细胞，具体包括：
收集TIL细胞悬液，离心后弃去上清液，采用生理盐水洗涤后，再次用生理盐水重悬细胞，并封装。
6.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在收集增殖的TIL细胞时，重悬细胞所使用生理盐水中含有浓度为20%的人血白蛋白。
7.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述培养液通过以下方式配置：
向基础无血清培养基加入白细胞介素-2和白细胞介素-23以及灭活的血浆，配置得到培养液。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在配置培养液时，基础无血清培养基与所述灭活的血浆的配比为：200:1。
9.一种试剂盒，其特征在于，包括：盒体，以及盛装有采用如权利要求1-8任一项所述的方法制备得到的TIL细胞。
10.一种试剂套装，其特征在于，包括：权利要求9所述的试剂盒，以及用于解释所述试剂盒使用方式的说明书。

说明书全文

一种TIL细胞的制备方法、试剂盒和试剂套装

技术领域

[0001] 本说明书涉及细胞培养领域，尤其涉及一种TIL细胞的制备方法、试剂盒和试剂套装。

背景技术

[0002] 世界癌症报告估计，2012年中国癌症发病人数为306.5万，约占全球发病的五分之一；癌症死亡人数为220.5万，约占全球癌症死亡人数的四分之一。我国肿瘤发病率多年持续上升，已成为一个必须高度重视的公共卫生问题乃至社会问题，中国亟须向肿瘤宣战。

[0003] 当前我国癌症发病率、死亡率呈持续增长趋势。更为严峻的是，这种势头并未得到有效的遏制。国家癌症中心肿瘤流行病学研究员代敏介绍，今后20年，我国癌症的发病数和死亡数还将持续上升：根据国际癌症研究署预测，如不采取有效措施，我国癌症发病数和死亡数到2020年将上升至400万人和300万人；2030年将上升至500万人和350万人。

[0004] 我国癌症发病率接近世界水平，但死亡率高于世界水平。欧美白种人最常见的是前列腺癌和乳腺癌等生存率超过80％以上的癌症，而我们国家常见的是肺癌、肝癌、消化道癌症这些生存率不到30％的癌症。第三次全国居民死亡原因调查结果显示，我国城乡居民的肿瘤死亡构成正在发生变化，与环境、生活方式有关的肺癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、膀胱癌死亡率呈明显上升趋势。国家癌症中心发布的《2012中国肿瘤登记年报》显示，全国肿瘤登记地区恶性肿瘤发病第一位的是肺癌，其次为胃癌、结直肠癌、肝癌和食管癌；死亡第一位的是肺癌，其次为肝癌、胃癌、食管癌和结直肠癌。

[0005] 肿瘤的治疗方法除了手术、放疗、化疗和靶向治疗以外，还有一种原理独特的方法－肿瘤免疫治疗。手术、放疗和化疗能在短时间内有效减轻肿瘤负荷，但因其不能有效清除肿瘤细胞，手术后微小残存病灶、对化疗产生耐药及对放疗不敏感的患者肿瘤易发生转移，且副作用大等弊端，使得肿瘤的临床疗效低。肿瘤免疫治疗主要通过调控机体免疫系统来实现抗肿瘤作用，能系统杀灭肿瘤细胞，有效抑制肿瘤细胞的转移、扩散和复发，副反应小等良好的临床治疗效果。早在19世纪就有对免疫与肿瘤关系的研究和治疗尝试，然而直到近5年，肿瘤免疫治疗才得以正名，其确实能够提高肿瘤患者的生存期，从而有了“神药”的称号。肿瘤免疫治疗已登上癌症治疗的历史舞台，并逐渐大放异彩。肿瘤免疫治疗的实质，是借助现代科技手段，助力人体已有的进化了的免疫系统去对抗癌症，从而在体内可以激活对肿瘤细胞的防御。

[0006] 目前，肿瘤细胞免疫治疗应用于临床的细胞有DC细胞、CIK细胞、CTL细胞、TIL细胞、CAR-T细胞等，其中TIL细胞是一种新型的抗肿瘤效应细胞，而TIL细胞免疫疗法属于一种新型细胞免疫疗法，具有高效、特异、副作用小等优点。由于TIL细胞是浸润在肿瘤中的T细胞，对肿瘤有天然的识别性，而且理论上是识别非特定的多种癌细胞的T细胞组合，故TIL 细胞疗法理论上在对抗实体瘤异质性方面优于CAR-T/TCR-T。TIL细胞免疫疗法从80年代就已经用在患者身上，主要治疗黑色素瘤，到目前为止，有效率达56％，包括22％的晚期病人被“临床治愈”。

[0007] TIL细胞疗法流程大致为：从患者体内取出癌性腹水，在符合GMP标准的车间进行扩增，数量达到几十亿到上百亿个细胞，一次性回输到患者体内以诱导自身免疫的抗肿瘤作用。然而，传统TIL细胞疗法存在一定的局限性，如TIL细胞大多数是耗竭性T细胞，杀伤功能相对较弱；而且，TIL细胞会被微环境抑制，其大规模扩增也存在技术难点。发明内容

[0008] 本说明书实施例的目的是提供一种TIL细胞的制备方法、试剂盒和试剂套装，以提高腹水来源体外TIL细胞增殖的效率及靶向杀伤肿瘤细胞的活性。

[0009] 为解决上述技术问题，本说明书实施例是这样实现的：

[0010] 第一方面，提出了一种腹水来源TIL细胞的制备方法，包括：

[0011] 采用单克隆抗体CD3和重组人纤维连接蛋白RN，对用于培养TIL细胞的培养瓶进行预处理；

[0012] 基于新鲜的肝素抗凝的患者腹水对淋巴细胞进行分离处理；

[0013] 将分离得到的细胞用配置的培养液进行重悬，转移至预处理后的培养瓶中，并在所述培养瓶中加入干扰素-γ，将所述培养瓶置于恒温培养箱中培养；

[0014] 基于设定时长和/或细胞生长情况，向所述培养瓶中补加新配置的所述培养液并加入白细胞介素-2和白细胞介素-23进行培养；

[0015] 培养预设天数后，收集增殖的TIL细胞。

[0016] 第二方面，提出了一种试剂盒，包括：盒体，以及盛装有采用如第一方面所述的方法制备得到的TIL细胞。

[0017] 第三方面，提出了一种试剂套装，包括：第二方面所述的试剂盒，以及用于解释所述试剂盒使用方式的说明书。

[0018] 由以上本说明书实施例提供的技术方案可见，利用CD3和RN联合IL-2和IL-23扩增培养，增强了TIL细胞的增殖能力，其中，IL-2和IL-23作为培养液中的成分，一方面可以借助IL-2提升TIL细胞的增殖，另一方面可以借助IL-23促进TIL细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，并与IL-2联合具有协同作用，可进一步增强杀伤活性。从而，显著提高腹水来源体外TIL细胞增殖的效率及其靶向杀伤肿瘤细胞的活性。附图说明

[0019] 为了更清楚地说明本说明书实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本说明书中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0020] 图1是本说明书的一个实施例提供的腹水来源TIL细胞的制备方法的步骤示意图。

[0021] 图2a是本说明书的一个实施例提供的以本说明书实施例所涉及的制备方案实施的实验操作步骤示意图。

[0022] 图2b是本说明书的一个实施例提供的

[0023] 图3是本说明书的一个实施例提供的对比实例的实验操作步骤示意图。

[0024] 图4a是实验1完成后通过显微镜观察到的TIL细胞示意图。

[0025] 图4b是实验1中TIL细胞生长曲线图。

[0026] 图4c是实验2完成后通过显微镜观察到的TIL细胞示意图。

[0027] 图4d是实验2中TIL细胞生长曲线图。

[0028] 图5a是实验3完成后通过显微镜观察到的TIL细胞示意图。

[0029] 图5b是实验3中TIL细胞生长曲线图。

[0030] 图5c是实验4完成后通过显微镜观察到的TIL细胞示意图。

[0031] 图5d是实验4中TIL细胞生长曲线图。

具体实施方式

[0032] 为了使本技术领域的人员更好地理解本说明书中的技术方案，下面将结合本说明书实施例中的附图，对本说明书实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本说明书一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本说明书中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本说明书保护的范围。

[0033] TIL细胞是一种淋巴细胞称为肿瘤浸润淋巴细胞，它是一种新型的抗肿瘤效应细胞，具有高效、特异、副作用小等优点。

[0034] 参照图1所示，为本说明书实施例提供的腹水来源TIL细胞的制备方法的步骤示意图，该制备方法可以包括以下步骤：

[0035] 步骤102：采用单克隆抗体CD3和重组人纤维连接蛋白RN，对用于培养TIL细胞的培养瓶进行预处理。

[0036] 具体地，步骤102可实现为：将CD3与RN溶于DPBS中制成预处理试剂，并将所述预处理试剂转移至用于培养TIL细胞的培养瓶中；将盛有预处理试剂的培养瓶于第一预设温度下避光放置第一预设时长。这样，使用RN处理后的培养瓶培养，细胞增值能力更强，活性更好。

[0037] 其中，所述第一预设温度可以是37℃或4℃；当第一预设温度是37℃时，第一预设时长可以为3小时，当第一预设温度是4℃时，所述第一预设时长可以是从转移开始的一整夜。

[0038] 步骤104：基于新鲜的肝素抗凝的患者腹水对淋巴细胞进行分离处理。

[0039] 具体地，步骤104可实现为以下步骤：

[0040] 第一步，将冷藏保存的淋巴细胞分离液取出置于室温环境。

[0041] 第二步，将新鲜的肝素抗凝的患者腹水置于离心管内，配平并离心后，收集上层液体，灭活处理后，于第二预设温度下放置第二预设时长，再次离心后吸取上层液体备用。

[0042] 其中，所述第二预设温度可以是4℃，所述第二预设时长可以是15分钟。

[0043] 应理解，第二步中将新鲜的肝素抗凝的患者腹水置于离心管内，配平并离心时，所采用的离心降速最慢。

[0044] 第三步，腹水离心后的下层加入DPBS混匀，各取一半沿管壁缓慢加至两管达到室温的淋巴细胞分离液面上，其中，每一管的不同液体界面清晰；将加入腹水混合液的两管淋巴细胞分离液离心处理，得到四层液体，由上至下分别为：第一层为DPBS层，第二层为环状乳白色淋巴细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。

[0045] 进一步，第三步中将加入腹水混合液的两管淋巴细胞分离液离心处理时，所采用的离心速度缓升缓降，也就是说在离心加速时，匀速缓慢加速；在离心减速时，匀速缓慢减速，以保持离心平稳状态。

[0046] 第四步，收集离心处理后两管中的第二层环状乳白色淋巴细胞，并加入离心管中，补加生理盐水，离心处理后弃上清液，补加生理盐水重悬细胞，再次离心处理后弃去上清液。

[0047] 步骤106：将分离得到的细胞用配置的培养液进行重悬，转移至预处理后的培养瓶中，并在所述培养瓶中加入干扰素-γ，将所述培养瓶置于恒温培养箱中培养。

[0048] 在本书明书实施例中，所述培养液通过以下方式配置：向基础无血清培养基加入白细胞介素-2和白细胞介素-23以及灭活的血浆，配置得到培养液。其中，基础无血清培养基与所述灭活的血浆的配比为：200:1。例如，向1000ml基础无血清培养基加入白细胞介素-2和白细胞介素-23以及5ml灭活的血浆

[0049] 步骤108：基于设定时长和/或细胞生长情况，向所述培养瓶中补加新配置的所述培养液并加入白细胞介素-2和白细胞介素-23进行培养。

[0050] 应理解，IL-2是白细胞介素家族中的重要成员之一，它能促进T细胞增殖，刺激细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)的增殖与分化，增强自然杀伤(natural killer，NK)细胞的细胞毒活性。而且，IL-2在生物体内具有显著的抗肿瘤作用。

[0051] IL-23是一个新的异二聚体细胞因子，由p19和IL-12p40两个亚基组成。IL-23可促进记忆性T细胞增殖，诱导活化的T细胞和树突状细胞(dendritic cell，DC)产生干扰素-γ(interferon-7，IFN-γ)和白细胞介素12(interleukin-12，IL-12)等细胞因子，与自身免疫及炎症反应性疾病密切相关，且具有抗肿瘤和抑制肿瘤转移的作用。IL-23可诱导T细胞产生IFN-γ比较少，而不会在临床应用时产生严重的毒副反应。IL-23作用于TIL细胞后穿孔素、颗粒酶B的表达均明显增加，且与IL-2具有协同作用。因此，IL-23是肿瘤治疗中更为安全的选择。

[0052] 步骤110：培养预设天数后，收集增殖的TIL细胞。

[0053] 具体地，步骤110在可实现为：收集TIL细胞悬液，离心后弃去上清液，采用生理盐水洗涤后，再次用生理盐水重悬细胞，并封装。此外，还可以对增殖后的TIL细胞进行留样封存。其中，在收集增殖的TIL细胞时，重悬细胞所使用生理盐水中含有浓度为20％的人血白蛋白。其中，所述预设天数可以是14天，或是其它可收集的培养周期。

[0054] 通过上述技术方案，利用CD3和RN联合IL-2和IL-23扩增培养，增强了TIL细胞的增殖能力，其中，IL-2和IL-23作为培养液中的成分，一方面可以借助IL-2提升TIL细胞的增殖，另一方面可以借助IL-23促进TIL细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，并与IL-2联合具有协同作用，可进一步增强杀伤活性。从而，显著提高腹水来源体外TIL细胞增殖的效率及其靶向杀伤肿瘤细胞的活性。

[0055] 下面通过具体的实验数据对本说明书的制备方案进行详述。

[0056] 参照图2a所示，为以本说明书实施例所涉及的制备方案实施的实验操作，可以包括以下步骤：

[0057] 步骤202：TIL细胞培养瓶预处理：将CD3与RN溶于20ml DPBS中，转移至T175培养瓶中，37℃避光放置3h，或4℃放置过夜。

[0058] 步骤204：淋巴细胞分离。

[0059] 其中，步骤204在对淋巴细胞分离时，参照图2b所示，可具体包括以下子步骤：

[0060] 子步骤2042：提前30min将淋巴细胞分离液从4℃冰箱中取出置于室温，待温度升至室温后使用。

[0061] 子步骤2044：将新鲜的肝素抗凝的患者腹水倒入225ml离心管内，配平，2000r/min离心10min(降速最慢)，收集上层液体，56℃灭活30min，然后4℃放置15min，最后2000g离心15min后吸取上层液体备用。

[0062] 子步骤2046：上述腹水离心后的下层加入DPBS至20ml混匀，各取10ml沿管壁缓慢加至两管淋巴细胞分离液面上，并保持清楚的界面，以800g离心15min(缓升缓降)后，离心管中由上至下分为四层。

[0063] 其中，第一层为DPBS层，第二层为环状乳白色淋巴细胞，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。

[0064] 子步骤2048：收集两管中的第二层环状乳白色淋巴细胞加入到一个50ml离心管中，补加生理盐水至50ml，600g离心10min，弃上清液，再用50ml生理盐水重悬细胞，500g离心10min，弃上清液。

[0065] 步骤206：TIL细胞培养液的配制：基础无血清培养基1000ml加入IL-2与IL-23及5ml上述灭活的血浆。

[0066] 步骤208：TIL细胞培养：取出预处理的T175培养瓶，弃去瓶中预处理试剂，将步骤204得到的细胞用TIL细胞培养液重悬，转移至T175培养瓶中，同时加入IFN-γ，置于恒温培养箱(37℃、5.0％CO2、饱和湿度)中培养。

[0067] 步骤210：培养后的第2天，补加新鲜的TIL细胞培养液并加入IL-2和IL-23进行培养。

[0068] 步骤212：视生长情况，适量的补充新鲜的TIL培养液及IL-2和IL-23。

[0069] 步骤214：TIL细胞收集：培养14天后，收集TIL细胞悬液，2000rpm×10min离心后用负压吸引器弃去上清液，生理盐水洗涤(2000rpm×8min)2次后，用含有5ml浓度为20％的人血白蛋白的200ml生理盐水重悬细胞，封装好，同时留样封存。

[0070] 为了更好的说明本申请方案的效果，同时进行了对比实验，对比实验的步骤与图2a所示的步骤基本相同，具体参照图3所示，可以包括：

[0071] 步骤302：TIL细胞培养瓶预处理：将CD3与RN溶于20ml DPBS中，转移至T175培养瓶中，37℃避光放置3h，或4℃放置过夜。

[0072] 步骤304：淋巴细胞分离。

[0073] 其中，步骤304在对淋巴细胞分离时，可具体参照图2b所示的子步骤。在此不做赘述。

[0074] 步骤306：TIL细胞培养液的配制：基础无血清培养基1000ml加入IL-2及5ml上述灭活的血浆。

[0075] 步骤308：TIL细胞培养：取出预处理的T175培养瓶，弃去瓶中预处理试剂，将步骤304得到的细胞用TIL细胞培养液重悬，转移至T175培养瓶中，同时加入IFN-γ，置于恒温培养箱(37℃、5.0％CO2、饱和湿度)中培养。

[0076] 步骤310：培养后的第2天，补加新鲜的TIL细胞培养液并加入IL-2进行培养。

[0077] 步骤312：视生长情况，适量的补充新鲜的TIL培养液及IL-2。

[0078] 步骤314：TIL细胞收集：培养14天后，收集TIL细胞悬液，2000rpm×10min离心后用负压吸引器弃去上清液，生理盐水洗涤(2000rpm×8min)2次后，用含有5ml浓度为20％的人血白蛋白的200ml生理盐水重悬细胞，封装好，同时留样封存。

[0079] 实验数据分析如下：

[0080] 第一组实验数据

[0081] 基于图2和图3所示的实验操作，制备TIL细胞，得到第一组实验数据，分别包含一份基于图2所示实验操作(实验1)制备的TIL细胞数据，记为A1数据(IL-2、IL-23)，一份基于图3所示实验操作(实验2)制备的TIL细胞数据，记为B1数据(IL-2)。其中：

[0082] A1数据(IL-2、IL-23)对应的TIL细胞的生物学特性表现为：

[0083] 1、TIL细胞数量、细胞活率及免疫表型的检测

[0084] 培养14天后，收集前通过显微镜观察TIL细胞的示意图，参照图4a所示，采用血球计数板法计算细胞数量，TIL细胞数量为1.14×1010。参照图4b所示的TIL细胞生长曲线图。取培养14天100μl浓度为106/ml的细胞，加入100μl质量百分数为0.4％台盼蓝染色液，显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞染成蓝色，本发明制备的细胞活率可达到99％。另取培养
6
14天100μl浓度为10/ml的细胞，加入检测用的分别是APC-CD3，FITC-CD8，PE-CD4抗体10μl，室温避光孵育30分钟，用生理盐水洗涤2次，流式细胞仪检测，其中CD3+CD8+细胞毒性T细胞比例为86％。

[0085] 2、TIL细胞与相对应的肿瘤细胞特异性杀伤作用的检测

[0086] TIL细胞按效靶比例10：1与相对应的肿瘤细胞接种培养了24小时的96孔板内，共同培养24小时后加入0.5mg/ml的MTT20μl，置于37℃、体积百分数为5％CO2的培养箱中，共同孵育3-4小时，250g离心4分钟，吸弃上清液，每孔加DMSO150μl振荡溶解10分钟，用酶标检测仪在570nm处测定吸光度A值。同时设空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照。每孔数值减去空白对照孔，求出3个复孔的平均A值，以杀伤率计算TIL细胞对肿瘤细胞杀伤活性，杀伤活性(％)＝[靶细胞对照A值-(实验孔A值-效应细胞对照A值)]/靶细胞对照A值×100％。

[0087] 按照上述方法进行测试，结果显示本实施例制备的TIL细胞与相对应的肿瘤细胞效靶比10：1时，TIL肿瘤细胞杀伤活性为78.4％。

[0088] 3、TIL细胞对穿孔素mRNA表达水平的检测

[0089] RQ-PCR检测结果显示，穿孔素的RQ值为：2.584。

[0090] 4、TIL细胞对颗粒酶B mRNA表达水平的检测

[0091] RQ-PCR检测结果显示，颗粒酶B的RQ值为：2.475。

[0092] B1数据(IL-2)对应的TIL细胞的生物学特性表现为：

[0093] 1、TIL细胞数量、细胞活率及免疫表型的检测

[0094] 培养14天后，收集前通过显微镜观察TIL细胞的示意图，参照图4c所示，采用血球计数板法计算细胞数量，TIL细胞数量为9.83×109。参照图4d所示的TIL细胞生长曲线图。取培养14天100μl浓度为106/ml的细胞，加入100μl质量百分数为0.4％台盼蓝染色液，显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞染成蓝色，本发明制备的细胞活率可达到90％。另取培养
14天100μl浓度为106/ml的细胞，加入检测用的分别是APC-CD3，FITC-CD8，PE-CD4抗体10μl，室温避光孵育30分钟，用生理盐水洗涤2次，流式细胞仪检测，其中CD3+CD8+细胞毒性T细胞比例为74％。

[0095] 2、TIL细胞与相对应的肿瘤细胞特异性杀伤作用的检测

[0096] TIL细胞按效靶比例10：1与相对应的肿瘤细胞接种培养了24小时的96孔板内，共同培养24小时后加入0.5mg/ml的MTT20μl，置于37℃、体积百分数为5％CO2的培养箱中，共同孵育3-4小时，250g离心4分钟，吸弃上清液，每孔加DMSO150μl振荡溶解10分钟，用酶标检测仪在570nm处测定吸光度A值。同时设空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照。每孔数值减去空白对照孔，求出3个复孔的平均A值，以杀伤率计算TIL细胞对肿瘤细胞杀伤活性，杀伤活性(％)＝[靶细胞对照A值-(实验孔A值-效应细胞对照A值)]/靶细胞对照A值×100％。

[0097] 按照上述方法进行测试，结果显示本实施例制备的TIL细胞与相对应的肿瘤细胞效靶比10：1时，TIL肿瘤细胞杀伤活性为67％。

[0098] 3、TIL细胞对穿孔素mRNA表达水平的检测

[0099] RQ-PCR检测结果显示，穿孔素的RQ值为：1.47。

[0100] 4、TIL细胞对颗粒酶B mRNA表达水平的检测

[0101] RQ-PCR检测结果显示，颗粒酶B的RQ值为：1.68。

[0102] 两份数据对比，可以看出：A1数据中TIL细胞的扩增数量是B1数据中TIL细胞的扩增数量的1.15倍以上，A1数据中TIL细胞活率是B1数据中TIL细胞活率的1.1倍，A1数据中CD3+CD8+细胞毒性T细胞比例是B1数据中CD3+CD8+细胞毒性T细胞比例的1.16倍以上，A1数据中TIL肿瘤细胞杀伤活性是B1数据中TIL肿瘤细胞杀伤活性的1.16倍以上，A1数据中TIL细胞对穿孔素mRNA表达水平是B1数据中的1.75倍以上，A1数据中TIL细胞对颗粒酶B mRNA表达水平是B1数据中的1.47倍以上。如上所述，通过本说明书实施例中的制备方案得到的TIL细胞的数量以及活性明显较好。

[0103] 第二组实验数据

[0104] 基于图2和图3所示的实验操作，再次制备TIL细胞，得到第二组实验数据，分别包含一份基于图2所示实验操作(实验3)制备的TIL细胞数据，记为A2数据(IL-2、IL-23)，一份基于图3所示实验操作(实验4)制备的TIL细胞数据，记为B2数据(IL-2)。其中：

[0105] A2数据(IL-2、IL-23)对应的TIL细胞的生物学特性表现为：

[0106] 1、TIL细胞数量、细胞活率及免疫表型的检测

[0107] 培养14天后，收集前通过显微镜观察TIL细胞的示意图，参照图5a所示，采用血球计数板法计算细胞数量，TIL细胞数量为1.24×1010。参照图5b所示的TIL细胞生长曲线图。取培养14天100μl浓度为106/ml的细胞，加入100μl质量百分数为0.4％台盼蓝染色液，显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞染成蓝色，本发明制备的细胞活率可达到99％。另取培养
14天100μl浓度为106/ml的细胞，加入检测用的分别是APC-CD3，FITC-CD8，PE-CD4抗体10μl，室温避光孵育30分钟，用生理盐水洗涤2次，流式细胞仪检测，其中CD3+CD8+细胞毒性T细胞比例为89％。

[0108] 2、TIL细胞与相对应的肿瘤细胞特异性杀伤作用的检测

[0109] TIL细胞按效靶比例10：1与相对应的肿瘤细胞接种培养了24小时的96孔板内，共同培养24小时后加入0.5mg/ml的MTT20μl，置于37℃、体积百分数为5％CO2的培养箱中，共同孵育3-4小时，250g离心4分钟，吸弃上清液，每孔加DMSO150μl振荡溶解10分钟，用酶标检测仪在570nm处测定吸光度A值。同时设空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照。每孔数值减去空白对照孔，求出3个复孔的平均A值，以杀伤率计算TIL细胞对肿瘤细胞杀伤活性，杀伤活性(％)＝[靶细胞对照A值-(实验孔A值-效应细胞对照A值)]/靶细胞对照A值×100％。

[0110] 按照上述方法进行测试，结果显示本实施例制备的TIL细胞与相对应的肿瘤细胞效靶比10：1时，TIL肿瘤细胞杀伤活性为81.3％。

[0111] 3、TIL细胞对穿孔素mRNA表达水平的检测

[0112] RQ-PCR检测结果显示，，穿孔素的RQ值为：2.883。

[0113] 4、TIL细胞对颗粒酶B mRNA表达水平的检测

[0114] RQ-PCR检测结果显示，颗粒酶B的RQ值为：2.791。

[0115] B2数据(IL-2)对应的TIL细胞的生物学特性表现为：

[0116] 1、TIL细胞数量、细胞活率及免疫表型的检测

[0117] 培养14天后，收集前通过显微镜观察TIL细胞的示意图，参照图5c所示，采用血球9
计数板法计算细胞数量，TIL细胞数量为9.03×10。参照图5d所示的TIL细胞生长曲线图。
取培养14天100μl浓度为106/ml的细胞，加入100μl质量百分数为0.4％台盼蓝染色液，显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞染成蓝色，本发明制备的细胞活率可达到89％。另取培养
14天100μl浓度为106/ml的细胞，加入检测用的分别是APC-CD3，FITC-CD8，PE-CD4抗体10μl，室温避光孵育30分钟，用生理盐水洗涤2次，流式细胞仪检测，其中CD3+CD8+细胞毒性T细胞比例为73％。

[0118] 2、TIL细胞与相对应的肿瘤细胞特异性杀伤作用的检测

[0119] TIL细胞按效靶比例10：1与相对应的肿瘤细胞接种培养了24小时的96孔板内，共同培养24小时后加入0.5mg/ml的MTT20μl，置于37℃、体积百分数为5％CO2的培养箱中，共同孵育3-4小时，250g，离心4分钟，吸弃上清液，每孔加DMSO150μl振荡溶解10分钟，用酶标检测仪在570nm处测定吸光度A值。同时设空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照。每孔数值减去空白对照孔，求出3个复孔的平均A值，以杀伤率计算TIL细胞对肿瘤细胞杀伤活性，杀伤活性(％)＝[靶细胞对照A值-(实验孔A值-效应细胞对照A值)]/靶细胞对照A值×100％。

[0120] 按照上述方法进行测试，结果显示本实施例制备的TIL细胞与相对应的肿瘤细胞效靶比10：1时，TIL肿瘤细胞杀伤活性为66％。

[0121] 3、TIL细胞对穿孔素mRNA表达水平的检测

[0122] RQ-PCR检测结果显示，穿孔素的RQ值为：1.36。

[0123] 4、TIL细胞对颗粒酶B mRNA表达水平的检测

[0124] RQ-PCR检测结果显示，颗粒酶B的RQ值为：1.67。

[0125] 两份数据对比，可以看出：A2数据中TIL细胞的扩增数量是B2数据中TIL细胞的扩增数量的1.37倍以上，A2数据中TIL活率是B2数据中中TIL活率的1.11倍以上，A2数据中CD3+CD8+细胞毒性T细胞比例是B2数据中CD3+CD8+细胞毒性T细胞比例的1.21倍以上，A2数据中TIL肿瘤细胞杀伤活性是B2数据中TIL肿瘤细胞杀伤活性的1.23倍以上，A2数据中TIL细胞对穿孔素mRNA表达水平是B2数据中的2.11倍以上，A2数据中TIL细胞对颗粒酶B mRNA表达水平是B2数据中的1.67倍以上。如上所述，通过本说明书实施例中的制备方案得到的TIL细胞的数量以及活性明显较好。

[0126] 同时，本说明书实施例还提供了一种试剂盒，该试剂盒包括：盒体，以及盛装有采用上述所述的腹水来源TIL细胞培养方法制备得到的TIL细胞。应理解，所述盒体的具体构造并不做限定，可以是在医药领域使用的用于盛装TIL细胞等细胞试剂的盒体。

[0127] 另外，本说明书实施例还提供了一种试剂套装，包括：上述所涉及的试剂盒，以及用于解释所述试剂盒使用方式的说明书。

[0128] 本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。

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