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一种过 氧化氢酶的共交联固定化方法

阅读：1022发布：2020-06-16

专利汇可以提供一种过氧化氢酶的共交联固定化方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明是关于一种过氧化氢酶的共交联固定化方法。使用油溶性的双季戊四醇六丙烯酸酯作为交联剂，水相中的反应物为含有氨基的过氧化氢酶以及胺化环氧树脂与β-环糊精形成的超分子复合物，利用双键与氨基的迈克尔加成反应，在较低的温度下发生共交联聚合反应，制备出不同负载量的固定化过氧化氢酶。通过控制交联程度，提高分散性，改善其内部的传质微环境，该固定化酶具有较高的催化活性，负载量在88mg酶/g载体时具有最高的活性，达到游离酶的90％。，下面是一种过氧化氢酶的共交联固定化方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种过氧化氢酶共交联固定化方法，其特征在于使用水/油两相反应体系，油相是作为交联剂的双季戊四醇六丙烯酸酯，其结构如下：
水相中的反应物为过氧化氢酶及结构如下的分子复合物：
所述的过氧化氢酶共交联固定化方法，按以下步骤操作：
1)将数均分子量为513的双酚A环氧树脂、甲醇和三乙烯四胺三种组分按照2∶2∶1.2的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；
2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～
6wt.％范围；
3)将过氧化氢酶溶解在pH＝8.0的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围，将不同浓度的过氧化氢酶溶液与上述分子复合物水溶液按照55mL∶20mL的比例混合；
4)在搅拌下将1.2g双季戊四醇六丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在
25～30℃范围，10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，停止搅拌使反应体系放置4～5小时，过滤后即得到不同负载量的过氧化氢酶固定化产物。

说明书全文

一种过氧化氢酶的共交联固定化方法

技术领域

[0001] 本发明涉及固定化酶生物催化技术领域，尤其是一种过氧化氢酶的共交联固定化方法，该新型固定化过氧化氢酶可专门用于处理工业废水。

背景技术

[0002] 过氧化氢酶(EC 4.2.1.84)，又称触酶(等电点为6.5)，是一种广泛存在于动、植物以及微生物体内的氧化还原酶。作为一种单一酶类，过氧化氢酶是在1811年被过氧化氧的发现者首次发现。过氧化氢酶的活性中心为铁卟啉环，每一蛋白分子中含有四个铁原子，相对分子量一般为200～340kDa。过氧化氢酶以H2O2为专一底物，通过催化转移一对电子使之分解为H2O和O2。过氧化氢酶是生物防御系统的关键酶之一，作为生物体内的重要物质，其主要的作用就是参与活性氧的代谢。

[0003] 根据过氧化氢酶分解H2O2放出O2的性质，人们将过氧化氢与过氧化氢酶作为疏松剂用于食品的烘烤过程。除此之外，过氧化氢酶在食品工业中更多的是应用于乳制品的消毒，即在牛奶保存和奶酪制造前用过氧化氢对牛乳和干酪原料乳进行杀菌消毒，牛乳和原料乳中残留的过氧化氢则通过过氧化氢酶去除。这种消毒工艺可以在低温下进行，避免了高温处理时蛋白质变性及营养物质的流失。在造纸工业中，由于传统含氯漂白剂与残留木素反应会形成有毒污染物，近年来双氧水漂白技术逐渐取代了传统漂白剂，而残留过氧化氢的去除也成了一个重要问题。过氧化氢酶对漂白后的双氧水有着高效的降解作用。在环保行业中，经常利用双氧水配合过氧化氢酶来处理工业废水，可迅速降解芳环及脂肪族的化合物；而将双氧水配合过氧化氢酶应用于生物过滤器时还可在一定程度上改善过滤器对废水的脱臭效果。

[0004] 固定化酶就是通过化学手段将水溶性的游离酶变成不溶性的固体酶，固定化有很多优点：例如固定化的过氧化氢酶可重复使用，使酶的使用效率提高、使用成本降低；固定化的过氧化氢酶极易与反应体系分离，简化了操作工艺；固定化的过氧化氢酶其储存稳定性和热稳定性都得到了提高；固定化酶的催化反应过程更易控制；固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅拌或装柱的方式作用于底物溶液，便于酶催化反应的连续化和自动化操作。酶的交联是一种非常有效的固定化方法，其所形成的产物称为交联酶聚集体。最常用的交联剂为水溶性的戊二醛，它反应活性高，用量难以控制，很容易造成酶的过度交联，使酶的活性有很大的损失，此外，传统的交联法往往须要在交联之前使酶分子沉淀聚集，这样既会造成酶的浪费，又会阻断传质通道，无法充分发挥酶的催化效率。

[0005] 本发明专利提供一种共交联的方法用于过氧化氢酶的固定，利用过氧化氢酶分子上的氨基与丙烯酸酯类交联剂发生迈克尔加成反应，同时还引入含有β-环糊精的结构单元，这样既能为催化反应提供空间，降低传质阻力，同时还能增加亲水性，提高酶的活性。使用这种共交联方法，酶的负载量和催化活性高，稳定性好，固定化酶呈颗粒状，催化反应容易操作。

发明内容

[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种过氧化氢酶的固定化方法，这种方法是基于过氧化氢酶与另一种含有机胺的分子复合物的共交联反应，交联反应的基础是丙烯酸酯与氨基的迈克尔加成，该反应在常温下就能快速发生，因而不会对酶的整体结构造成破坏，共交联法负载效率高，稳定性好，同时还能调节固定化酶的微环境，使其保持高的催化活性。

[0007] 1、本发明解决技术问题所采用的技术方案为：一种水/油两相的交联反应，油相为交联剂双季戊四醇六丙烯酸酯，其结构如图1所示，水相中的反应物为过氧化氢酶及β-环糊精与胺化环氧树脂的超分子复合物，固定化酶的负载量是通过过氧化氢酶的浓度来调节。

[0008] 非常有益的是，通过多相反应可以控制交联程度，避免酶的过度交联，同时交联剂含有多个双键，使交联产物形成支化结构，更大限度地阻止酶的聚集，增强酶的活力；

[0009] 非常有益的是，β-环糊精与胺化环氧树脂的分子复合物与酶分子产生强的亲和力，导致交联反应能使过氧化氢酶能以接近100％的利用率被固定化，交联反应发生后，液相中几乎没有残留的过氧化氢酶；

[0010] 非常有益的是，β-环糊精与胺化环氧树脂的分子复合物具有弯曲的刚性结构，它带来了充足的自由体积，为生物大分子与底物相互作用提供传质通道，同时为生物大分子的构象提供稳定性，从而提高了固定化酶的催化活性。

[0011] 2、本发明解决另一个技术问题所采用的技术方案为：一种上述固定化酶的制备方法，其特征步骤为：1)将双酚A环氧树脂(牌号为D-39，环氧值为0.39，数均分子量为513)、甲醇和三乙烯四胺三种组分按照2∶2∶1.2的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；3)将过氧化氢酶溶解在pH＝8.0的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；4)分别将浓度为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL的过氧化氢酶溶液与上述分子复合物水溶液按照
55mL∶20mL的比例混合，通过改变酶溶液的浓度来调节固定化酶的负载量；5)在搅拌下将
1.2g双季戊四醇六丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围，10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，停止搅拌使反应体系放置4～5小时，过滤后即得到不同负载量的固定化过氧化氢酶的产物。

[0012] 非常有益的是，交联剂中的一个双键首先与分子复合物上的氨基发生反应，形成具有乳化作用的产物，油相在反应启动后会很快分散直至消失，过氧化氢酶首先通过吸附方式进入聚合物中，然后交联剂上的双键与酶上的氨基进行缓慢的反应，最终变成共交联的固定化酶产物；

[0013] 非常有益的是，利用β-环糊精与疏水苯环的相互作用引入亲水基团，避免使用化学键，并通过交联反应使β-环糊精无法脱离聚合物，使固定化酶的制备简化；

[0014] 非常有益的是，整个聚合过程中不加入其它有机溶剂，不需要更高的温度。

[0015] 本发明的优点在于：1)利用水/油双相反应实现酶的交联，控制了交联程度；2)引入β-环糊精分子复合物改善了固定化过氧化氢酶的微环境，提高了酶的催化反应活性；3)共交联固定法能使过氧化氢酶以极高的效率被固定化；4)采用多官能度的交联剂能使固定化产物形成支化结构，阻止酶的聚集，提高酶的催化性能。

具体实施方式

[0016] 酶的固定化

[0017] 1)将双酚A环氧树脂(牌号为D-39，环氧值为0.39，数均分子量为513)、甲醇和三乙烯四胺三种组分按照2∶2∶1.2的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；

[0018] 2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；

[0019] 3)将过氧化氢酶溶解在pH＝8.0的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；

[0020] 4)分别将浓度为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL的过氧化氢酶溶液与上述分子复合物水溶液按照55mL∶20mL的比例混合，通过改变酶溶液的浓度来调节固定化酶的负载量；

[0021] 5)在搅拌下将1.2g双季戊四醇六丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，同时油相消失，停止搅拌使反应体系放置4～5小时，过滤后即得到不同负载量的固定化过氧化氢酶的产物。

[0022] 固定化酶的负载量测定：

[0023] 由于共交联法固定过氧化氢酶后，反应残留液中测不到过氧化氢酶的活性，说明经过交联后过氧化氢酶全部进入到固体颗粒中，所以负载量的计算用以下公式：

[0024]

[0025] 其中：C为共交联酶溶液的浓度(mg/mL)；V为共交联酶溶液的体积(mL)；m为固定化酶干态质量(g)。

[0026] 酶活力测定：

[0027] (1)游离酶活力测定：在规定条件下，于温度25℃，pH＝7.0的磷酸盐缓冲液中，每分钟分解的过氧化氢μmol数。游离酶的活性单位用U/mL来表示。用pH＝7.0的0.05M的磷酸盐缓冲液将0.255mL的H2O2(30％)稀释并定容至100mL，得到10mM的过氧化氢溶液。将0.05mL过氧化氢酶溶液(0.1mg/mL)滴入10mL的过氧化氢底物溶液中，于25℃下，以180rpm的转速，水浴震荡10min，反应完后，用紫外分光光度计测量过氧化氢在240nm处的吸光值由于过氧化氢酶分解所产生的降低值。

[0028]

[0029] 式中：为底物中H2O2浓度的降低；10mL为底物总体积；0.05mL为游离酶体积；10min为反应总时间。

[0030] (2)固定化酶活力测定：固定化酶的活性力单位用U/g来表示。使用0.5g固定化酶代替上述步骤中的0.05mL的过氧化氢酶酶溶液，最后使用滤网将固定化酶从底物中分离，终止反应。其余步骤与游离酶活性的测定过程相同。

[0031]

[0032] 式中：为底物中H2O2浓度的降低；10mL为底物总体积；0.05g为固定化酶质量；10min为反应总时间。

[0033] 相对活性：

[0034] 将固定化酶的活性与游离酶的活性之比定义为相对活性。

[0035] 实验结果：

[0036] 实验一共得到7个不同负载量的固定化过氧化氢酶的样品，分别测定它们的活力，计算得到它们的相对活性。图2是相对活性与负载量的关系，当负载量为88mg酶/g载体时其相对活性达到最大值，其比活力是游离酶的90％，这个结果说明过氧化氢酶在这个范围处于非常适合催化的状态。当负载量小于88mg酶/g载体时，固定化酶的活性逐渐随负载量的增加而增大，这主要是因为，酶的含量较低时，聚合物结构比较紧密，酶的催化活性不容易发挥出来，随着酶含量增加，聚合物的结构变的松散，酶与底物的接触机会增大，其相对活性也随之提高。当负载量大于88mg酶/g载体时，固定化酶的活性逐渐随负载量的增加而变小。一般来说交联固定法都会使酶的构象变得僵硬，从而活性降低，本发明专利的共交联固定法能使酶的微环境得到改善，这与引入环糊精超分子结构单元有关，它使固定化酶的结构变的松散，同时还改善了内部的亲水性，此外支化程度高的交联剂还能提高酶的分散性，避免了酶的聚集，从而提高其催化活性。但是当负载量过大时，酶的聚集变得不可避免，所以其活性又会下降。

[0037] 我们以负载量为88mg酶/g载体的样品为研究对象，测定固定化酶与游离酶溶液的储存稳定性，其结果如图3所示，以时间为零的起始状态的活性为100％，在4℃，pH＝7.0条件下经过28天的储存，游离酶溶液只残留39％的活性，固定化酶能残留77％的活性，所以在储存稳定性方面，固定化酶要明显优于游离酶。附图说明

[0038] 图1交联剂的化学结构。

[0039] 图2固定化的过氧化氢酶催化活性与其负载量的依赖关系。

[0040] 图3固定化与游离的过氧化氢酶储存稳定性比较。

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