技术领域
[0001] 本
发明属于分子
生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段检测致病菌的方法，具体为一种用于检测草莓炭疽病菌的分子标记及其应用。
背景技术
[0002] 草莓炭疽病由
真菌半知菌亚
门毛盘孢属草莓炭疽菌侵染所致，草莓炭疽病的有性阶段为子囊菌亚门小丛壳属。病菌以分生孢子在发病组织或落地病残体中越冬，同时，在田间能够分生孢子借助雨
水及带菌的操作工具、病叶、病果等进行传播。
[0003] 草莓炭疽菌的侵染最适条件为：气温为28～32℃，
相对湿度在90％以上，是典型的高温高湿型病菌。5月下旬后，当气温上升到25℃以上，草莓匍匐茎或近地面的幼嫩组织易受病菌侵染；7～9月间在高温高湿条件下，病菌传播蔓延迅速，特别是连续阴雨或阵雨2～5天或台
风过后的草莓连作田、老残叶多、氮肥过量、植株幼嫩及
通风透光差的苗地发病严重，可在短时间内造成草莓毁灭性的损失。近几年来，该病的发生有上升趋势，尤其是在草莓连作地，给培育壮苗带来了严重障碍。
[0004] 现有草莓炭疽病的防治方法均是采用药剂进行喷洒，如嘧菌酯和嘧酰胺等。这种
治疗方式不仅效果较差；同时多频次、多剂量施用后易造成草莓炭疽病菌产生较高程度的耐药性，从而导致草莓炭疽病的防治失败。因此，草莓炭疽病的防治还需尽早在
幼苗期发现，避免其传播为主。
发明内容
[0005] 本发明的目的是：为了克服
现有技术的
缺陷，获得一种能够准确检测幼苗期草莓炭疽病的方法，有效防治草莓炭疽病的传播和蔓延，降低草莓耐药性，本发明提供了一种一种用于检测草莓炭疽病菌的分子标记及其应用。
[0006] 技术方案：一种用于检测草莓炭疽病菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ IDNO.5～6。
[0007] 优选的，所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5’端进行
氨基化修饰。
[0008] 表1分子标记序列
[0009]
[0010]
[0011] 所述的分子标记在制备检测草莓炭疽病菌
试剂盒中的应用。
[0012] 优选的，所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
[0013] 优选的，所述试剂盒检测草莓炭疽病菌的步骤包括：
[0014] (1)取样：提取草莓
叶片样品的基因组DNA；
[0015] (2)以步骤(1)提取的DNA作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0016] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释200～500倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0017] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释20～50倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0018] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶
电泳检测。
[0019] 优选的，所述
甘蔗叶片样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0020] 优选的，所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LATaq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
[0021] 优选的，所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0022] 优选的，所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
[0023] 优选的，所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
[0024] 有益效果：(1)本发明所述分子标记能够针对幼苗期的草莓，准确检测幼苗炭疽病菌的感染情况；(2)本发明所述分子标记具有检测时间短、检测成本低和高通量的优点；(3)本发明所述分子标记特异性好、灵敏度高、结果重现性好。
附图说明
[0026] 其中，M为分子量为2000bp的Maker；1为实施例1PCR产物电泳结果；2为实施例2PCR产物电泳结果；3为实施例3PCR产物电泳结果。
具体实施方式
[0027] 实施例1
[0028] 一种用于检测草莓炭疽病菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0029] 所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5’端进行氨基化修饰。
[0030] 所述的分子标记在制备检测草莓炭疽病菌试剂盒中的应用。
[0031] 所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
[0032] 所述试剂盒检测草莓炭疽病菌的步骤包括：
[0033] (1)取样：提取草莓叶片样品的基因组DNA；
[0034] (2)以步骤(1)提取的DNA作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0035] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释200倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0036] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释50倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0037] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0038] 所述甘蔗叶片样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0039] 所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LATaq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
[0040] 所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0041] 所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
[0042] 所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
[0043] 实施例2
[0044] 一种用于检测草莓炭疽病菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0045] 所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5’端进行氨基化修饰。
[0046] 所述的分子标记在制备检测草莓炭疽病菌试剂盒中的应用。
[0047] 所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
[0048] 所述试剂盒检测草莓炭疽病菌的步骤包括：
[0049] (1)取样：提取草莓叶片样品的基因组DNA；
[0050] (2)以步骤(1)提取的DNA作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0051] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释300倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0052] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释30倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0053] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0054] 所述甘蔗叶片样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0055] 所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LATaq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
[0056] 所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0057] 所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
[0058] 所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
[0059] 实施例3
[0060] 一种用于检测草莓炭疽病菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
[0061] 所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5’端进行氨基化修饰。
[0062] 所述的分子标记在制备检测草莓炭疽病菌试剂盒中的应用。
[0063] 所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。
[0064] 所述试剂盒检测草莓炭疽病菌的步骤包括：
[0065] (1)取样：提取草莓叶片样品的基因组DNA；
[0066] (2)以步骤(1)提取的DNA作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
[0067] (3)取步骤(2)的扩增产物，稀释500倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
[0068] (4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释20倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
[0069] (5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0070] 所述甘蔗叶片样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
[0071] 所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、LATaq 2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。
[0072] 所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
[0073] 所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
[0074] 所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
