一种番茄Ty-2基因和ty-5基因的多重PCR检测方法
阅读：0发布：2021-09-01
专利汇可以提供一种番茄Ty-2基因和ty-5基因的多重PCR检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种番茄Ty‑2基因和ty‑5基因的多重PCR检测方法，其包括：1)从番茄叶中提取待检测番茄 叶片 DNA；2)以上述番茄叶片提取获得的DNA为模板，利用Ty‑2和ty‑5的引物，通过建立的多重PCR反应体系，对待测样品进行多重PCR扩增；3)PCR产物 电泳 检测；4)对待测番茄样品中是否含有Ty‑2基因和ty‑5基因进行鉴定等步骤。本发明用于快速鉴定番茄材料中是否含有番茄黄化曲叶病抗性基因Ty‑2和ty‑5，有利于对这两个基因进行聚合育种时，对抗病基因材料的筛选。，下面是一种番茄Ty-2基因和ty-5基因的多重PCR检测方法专利的具体信息内容。
1.一种番茄Ty-2基因和ty-5基因的多重PCR检测方法，其特征在于，其包括以下步骤：
1)从番茄叶中提取待检测番茄叶片DNA；
2)以上述番茄叶片提取获得的DNA为模板，利用Ty-2和ty-5的引物，通过建立的多重 PCR反应体系，对待测样品进行多重PCR扩增；
3)PCR产物电泳检测；
4)对待测番茄样品中是否含有Ty-2基因和ty-5基因进行鉴定，具体的方法为，在多态性条带中找出950bp和 172bp条带，即分别对应Ty-2基因和ty-5基因；
步骤2)中，Ty-2引物为：
T0302R：AGTGTACATCCTTGCCATTGACT
T0302F：TGGCTCATCCTGAAGCTGATAGCGC；
ty-5引物为：
ty5-17R：TAACAAAGCCCTCAAAGC
ty5-17F：GTCTCCGAAACGTAATCC。
2.根据权利要求1所述的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤1)中的番茄叶取自育种、野生、分离群体番茄品种的番茄叶。
3.根据权利要求1所述的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤2)中，多重PCR反应体系为：
10ng/μL模板DNA2μL，
4pmmol/L的引物对T0302R/F与ty5-17R/F各0.5μL，
mix酶10μL，
双蒸水或三蒸水加至20μL；
多重PCR反应条件为：95℃预变性3min；每个循环95℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸
45s，共38个循环，最后72℃延伸10min。
4.根据权利要求1所述的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤3)电泳采用8％的聚丙烯酰胺凝胶，电泳的具体步骤包括：
a)制备聚丙烯酰胺凝胶：KOH溶液浸泡玻璃板一定时间，用去污剂和清水清洗干净，最后用双蒸水冲洗，晾干后用乙醇擦拭长短板；然后将长板处理面向上，短板处理面向下盖到长板上，用橡胶条固定两个板，插入垂直电泳仪支架，短板向里固定，即凹口板面向电泳液方向，用1％的琼脂糖密封橡胶条与玻璃板之间的缝隙；在30％的丙烯酰胺溶液加入10× TBE、双蒸水、TEMED以及10％的APS配置成8％的聚丙烯酰胺溶液；然后将电泳槽倾斜30度，缓缓地使聚丙烯酰胺溶液倒入两板间，等胶溶液快要溢出时，把玻璃板放平，用薄塑料板赶气泡，倒插梳子；灌完胶后，放于室温让其自然凝固，观察胶边沿出现折射线就表明胶已凝固；
b)聚丙烯酰胺凝胶电泳：向电泳仪下端槽内倒1×TB，向上槽倒1×TBE，使液面高于短板上沿，拔出梳子，并用注射器吸取适量电泳液把点样孔洗干净；取PCR产物上样；调节电压
160V，电泳1.5-2.0h，电泳完毕；
c)聚丙烯酰胺凝胶电泳的显色：把经冷却的胶板置于盛有固定液的塑料盘中，摇床震荡3-8min；然后将胶板置于盛有染色液的塑料盘中，摇床震荡10-15min；经染色的胶板用双蒸水清洗，然后用添加了浓度为10％的Na2S2O3的双蒸水清洗；将清洗干净的胶板置于显色液中显色，至DNA条带清晰后将显色完毕的胶板放回固定液中反应，反应完成后用双蒸水清 洗，然后用保鲜膜密封，置于室温自然干燥，条带统计、拍照留存。
5.根据权利要求4所述的多重PCR检测方法，其特征在于，所述固定液由0.5％乙酸
2.5mL、10％ 乙醇50mL、双蒸水450mL组成；所述染色液由硝酸银与双蒸水组成，其中硝酸银与双蒸水的质量比为1:500。
6.根据权利要求4所述的多重PCR检测方法，其特征在于，所述显色液由7.5gNaOH、
37％-40％的甲醛1.5mL、双蒸水500mL组成。
一种番茄Ty-2基因和ty-5基因的多重PCR检测方法
技术领域
背景技术
[0002] 番茄是一种重要的蔬菜作物，近年来受到番茄黄化曲叶病毒(Tomato yello w leaf curl virus，TYLCV)病的危害，使我国番茄产业的发展受到了严重的影响。该病害由携带番茄黄化叶病毒的烟粉虱进行传播，由于栽培番茄中起初都不含有抗病基因，植株被TYLCV侵染后，生长受到严重抑制，易落花落果。如果苗期感病，危害严重时，甚至造成绝产绝收，对番茄生产造成了巨大的影响。而在野生番茄中发现的抗TYLCV基因，经过鉴定发现，对该病具有很好的抗性。
[0003] 已知的番茄抗TYLCV基因有，Ty-1，Ty-2，Ty-3，Ty-3a，Ty-4，Ty-5和Ty -6。在我国的番茄品种中应用较多的抗病基因是Ty-1，Ty-2，Ty-3，Ty-3a。由于 TYLCV变异性强，长期使用现有抗原容易使病毒突破抗病基因的抗性。通过对含有ty-5材料1227的引进和抗性鉴定，确定该基因对TYLCV具有很高的抗性，选育含有ty-5基因的番茄材料，并用于番茄品种中，可以丰富现有品种中抗原的种类，增强番茄对TYLCV的长久抗性。目前在番茄抗TYLCV育种过程中，选育含有多个抗TYLCV基因的品种，可以显著的增强品种的抗性水平。基于上述原因，选育同时含有Ty-2和ty-5的番茄材料具有重要的意义。在对这两个基因进行聚合育种的过程中，对分离群体进行抗性鉴定后，所获得的抗TYLCV植株无法确定其中含有Ty-2还是ty-5。利用分子标记的手段，可以不通过抗性鉴定，就可以判断植株中所含的是哪个抗病基因，加快了对育种材料的选择，缩短了育种的进程。目前，Ty-2基因被定位在番茄11号染色体长臂端，与SCAR 标记T0302连锁。ty-5基因被定位在番茄4号染色体上，与CAPS标记SlNAC1 连锁，该标记也是目前已知的唯一与ty-5连锁的分子标记。
[0004] 虽然利用Ty-2和ty-5的分子标记进行辅助选择可以加快对含有基因材料的筛选，但是如果可以建立这两个基因的多重PCR体系，可以在原来的基础上将工作效率提高一倍，鉴定成本减少一半，更加有利于对抗病基因的筛选。但目前的ty-5基因连锁标记为CAPS标记，所用的内切酶为TaqI，在于Ty-2基因的连锁标记构建多重PCR体系时，由于标记类型和内切酶的差异，无法实现。至今，仍无这两个基因的多重PCR体系。
发明内容
[0005] 为克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种番茄Ty-2基因和ty-5 基因的多重PCR检测方法，用于快速鉴定番茄材料中是否含有番茄黄化曲叶病抗性基因Ty-2和ty-5，有利于对这两个基因进行聚合育种时，对抗病基因材料的筛选。
[0006] 为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
[0007] 一种番茄Ty-2基因和ty-5基因的多重PCR检测方法，其包括以下步骤：
[0008] 1)从番茄叶中提取待检测番茄叶片DNA；
[0009] 2)以上述番茄叶片提取获得的DNA为模板，利用Ty-2和ty-5的引物，通过建立的多重PCR反应体系，对待测样品进行多重PCR扩增；
[0010] 3)PCR产物电泳检测；
[0011] 4)对待测番茄样品中是否含有Ty-2基因和ty-5基因进行鉴定。
[0012] 进一步的方案，本发明所述的步骤1)中的番茄叶取自育种、野生、分离群体番茄品种的番茄叶。
[0013] 进一步的方案，本发明所述的步骤2)中，
[0014] Ty-2引物为：
[0015] Ty1-F:CAACAGCAATGTACCTGGTCAG
[0016] Ty1-R:CTGTGGCATACGTTGGTGACAC；
[0017] ty-5引物为：
[0018] ty5-17R：TAACAAAGCCCTCAAAGC
[0019] ty5-17F：GTCTCCGAAACGTAATCC。
[0020] 进一步的方案，本发明所述的步骤2)中，多重PCR反应体系为：
[0021] 10ng/μL模板DNA 2μL，
[0022] 4pmmol/L的引物对T0302R/F与ty5-17R/F各0.5μL，
[0023] mix酶10μL，
[0024] 双蒸水或三蒸水加至20μL；
[0026] 进一步的方案，本发明所述的步骤3)中，电泳采用8％的聚丙烯酰胺凝胶，电泳的具体步骤包括：
[0027] a)制备聚丙烯酰胺凝胶：KOH溶液浸泡玻璃板一定时间，用去污剂和清水清洗干净，最后用双蒸水冲洗，晾干后用乙醇擦拭长短板；然后将长板处理面向上，短板处理面向下盖到长板上，用橡胶条固定两个板，插入垂直电泳仪支架，短板向里固定，即凹口板面向电泳液方向，用1％的琼脂糖密封橡胶条与玻璃板之间的缝隙；在30％的丙烯酰胺溶液加入10×TBE、双蒸水、TEMED以及10％的APS配置成8％的聚丙烯酰胺溶液；然后将电泳槽倾斜30度，缓缓地使聚丙烯酰胺溶液倒入两板间，等胶溶液快要溢出时，把玻璃板放平，用薄塑料板赶气泡，倒插梳子；灌完胶后，放于室温让其自然凝固，观察胶边沿出现折射线就表明胶已凝固；
[0028] b)聚丙烯酰胺凝胶电泳：向电泳仪下端槽内倒1xTB，向上槽倒1×TBE，使液面高于短板上沿，拔出梳子，并用注射器吸取适量电泳液把点样孔洗干净；取PCR产物上样；调节电压160V，电泳1.5-2.0h，电泳完毕；
[0029] c)聚丙烯酰胺凝胶电泳的显色：把经冷却的胶板置于盛有固定液的塑料盘中，摇床震荡3-8min；然后将胶板置于盛有染色液的塑料盘中，摇床震荡 10-15min；经染色的胶板用双蒸水清洗，然后用添加了浓度为10％的Na2S2O3的双蒸水清洗；将清洗干净的胶板置于显色液中显色，至DNA条带清晰后将显色完毕的胶板放回固定液中反应，反应完成后用双蒸水清洗，然后用保鲜膜密封，置于室温自然干燥，条带统计、拍照留存。
[0031] 进一步的方案，本发明所述的所述显色液由7.5g NaOH、37％-40％的甲醛 1.5mL、双蒸水500mL组成。
[0032] 进一步的方案，本发明所述的步骤4)中，对待测样品中Ty-2基因和ty-5基因进行鉴定方法具体步骤为：在步骤3)酶切后的多态性条带中大找出750bp和 172bp条带，即分别对应Ty-2基因和ty-5基因。
[0033] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0034] 1 本发明所述的番茄Ty-2基因和ty-5基因的多重PCR检测方法可以用于对番茄材料和群体中是否含有Ty-2基因和ty-5基因这两个基因进行快速鉴定，加快了对分子标记辅助选择的进程，缩短了育种周期，降低了育种成本；
[0035] 2 本发明所述的番茄Ty-2基因和ty-5基因的多重PCR检测方法克服了对两个基因分离群体进行抗性鉴定后无法确定含有哪个抗病基因的困扰；
[0038] 图1 Ty-2和ty-5检测电泳图谱；其中M：100bp Marker；1、2、3分别代表T0302以为CLN2777A-0、moneymaker和F1(CLN2777A-0×moneymaker)模板扩增结果；4、5、6分别代表ty5-17以1227、moneymaker和F1(1227×mone ymaker)为模板扩增结果；7代表多重PCR体系以F1(1227×CLN2777A-0)为模板扩增结果；
[0039] 图2 F2(1227×CLN2777A-0)分离后代多重PCR检测电泳图谱；其中M： 100bp Marker；1-20代表20株随机的F2(1227×CLN2777A-0)分离单株经多重 PCR扩增后电泳结果。
具体实施方式
[0040] 下面结合具体的实施方式对本发明作进一步详细说明。
[0041] 一种番茄Ty-2基因和ty-5基因的多重PCR检测方法，其包括以下步骤：
[0042] 1)提取待检测番茄叶片DNA；
[0043] 2)以上述番茄叶片提取获得的DNA为模板，利用Ty-2和ty-5的引物，通过建立的多重PCR反应体系，对待测样品进行多重PCR扩增；
[0044] 其中多重PCR的反应体系为：
[0045] 10ng/μL模板DNA 2μL，
[0046] 4pmmol/L的引物对T0302R/F与ty5-17R/F各0.5μL，
[0047] mix酶10μL，
[0048] 双蒸水或三蒸水加至20μL；
[0049] PCR反应体系中所用引物为：
[0050] T0302R：AGTGTACATCCTTGCCATTGACT
[0051] T0302F：TGGCTCATCCTGAAGCTGATAGCGC
[0052] ty5-17R：TAACAAAGCCCTCAAAGC
[0053] ty5-17F：GTCTCCGAAACGTAATCC；
[0054] 多重PCR的反应条件为：95℃预变性3min；每个循环95℃变性45sec， 54℃退火45sec，72℃延伸45sec，共38个循环，最后72℃延伸10min；
[0055] (3)PCR产物电泳检测；
[0056] a)制备聚丙烯酰胺凝胶，步骤如下:
[0057] 玻璃板处理：KOH溶液浸泡玻璃板一定时间，用去污剂和清水清洗干净，最后用双蒸水冲洗两遍；自然晾干；用95％乙醇擦拭长短板；
[0058] 固定玻璃板：长板处理面向上，短板处理面向下盖到长板上，用橡胶条固定两个板，插入垂直电泳仪支架，短板向里固定，即凹口板面向电泳液方向，用1％的琼脂糖密封橡胶条与玻璃板之间的缝隙；
[0059] 配制8％丙烯酰胺胶溶液：30％丙烯酰胺溶液：5.3mL；10×TBE：2mL；双蒸水：12.7mL；TEMED：20μL；10％APS：200μL；
[0060] 灌胶：将电泳槽倾斜30度，缓缓地使胶溶液倒入两板间，等胶溶液快要溢出时，把玻璃板放平，用薄塑料板赶气泡，倒插梳子。
[0061] 凝固：灌完胶后，放于室温让其自然凝固，观察胶边沿出现折射线就表明胶已凝固。凝胶可立即使用，或保存于室温24小时，4℃48小时；
[0062] b)聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤如下：
[0063] 倒液：向电泳仪下端槽内倒1xTBE约500mL，向上槽倒1×TBE，使液面高于短板上沿。拔出梳子，并用注射器吸取适量电泳液把点样孔洗干净 (因为梳子取出后，梳子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则)；
[0064] 上样：取1.6μLPCR产物上样；调节电压160V，电泳1.5-2.0h；电泳完毕，关掉电泳仪，取下玻璃板；
[0065] c)聚丙烯酰胺凝胶电泳的显色，步骤如下：
[0066] 固定：固定液由0.5％乙酸2.5mL、双蒸水450mL、10％乙醇50mL组成；把经冷却的胶板置于盛上述有固定液的1.5L的塑料盘中，摇床震荡6 min左右；
[0067] 染色：染色液由硝酸银1g、双蒸水500mL组成；把清洗干净的胶板置于盛有染色液的塑料盘中，摇床震荡12min左右；
[0068] 洗胶：把经染色的胶板置于盛有500mL双蒸水的塑料盘中清洗30s；倒掉清洗液，加入500mL双蒸水，双蒸水中加入120μL 10％的Na2S2O3，清洗30s；
[0069] 显色：显色液由7.5gNaOH、37％-40％甲醛1.5mL、双蒸水500mL组成；把清洗干净的胶板置于盛有显色液的塑料盘中显色；显色时间根据条带和背景颜色深浅调整，达到DNA条带清晰的目的(一般5-6min)；显色液用前可以先预冷至4-10℃，防止背景加深；
[0070] 终止显色：把染色完毕的胶板放回盛有固定液的塑料盘中，反应3min；用双蒸水清洗两次，每次2min；
[0071] 干胶：胶板用保鲜膜密封，置于室温自然干燥；条带统计、拍照留存；
[0072] 4)对待测番茄样品中是否含有Ty-2和ty-5进行鉴定；
[0073] 多重PCR后的多态性条带大小由小至大依次为：172bp和187bp(ty-5多态性条带)及850bp和950bp(Ty-2多态性条带)。若电泳结果中有950bp和/或 172bp条带时，说明待测样品中含有Ty-2和/或ty-5；若电泳结果中只有950bp和 172bp条带，无850bp和187bp条带时，说明待测样品同时含有纯合的Ty-2和 ty-5。若电泳结果中有950bp和/或172bp条带，同时含有850bp和/或187bp条带时，说明待测样品含有杂合的Ty-2和/或ty-5；若电泳结果中只有850bp和187bp 条带，无950bp和172bp条带时，说明待测样品不含有Ty-2和ty-5。
[0075] 实施例1
[0076] 本实施例为了检测构建的多重PCR体系电泳后条带是否存在重叠、覆盖，具体实施步骤如下：
[0077] 1)提取番茄叶片DNA
[0078] 待测材料：1227(含有纯合ty-5，不含有Ty-2)、moneymaker(不含有ty-5 和Ty-2)、F1(1227×moneymaker)(含有杂合ty-5，不含有Ty-2)、CLN2777A-0 (含有纯合Ty-2，不含有ty-5)、F1(CLN2777A-0×moneymaker)(含有杂合Ty-2，不含有ty-5)、F1(1227×CLN2777A-0)(含有杂合Ty-2和杂合ty-5)；
[0079] 2)以上述番茄叶片提取获得的DNA为模板，利用Ty-2和ty-5的引物，通过建立的多重PCR反应体系和各基因单独扩增的PCR反应体系，对待测样品进行扩增；
[0080] 其中样品F1(1227×TY52)利用多重PCR的反应体系进行扩增，
[0081] 反应体系为：
[0082] 10ng/μL模板DNA 2μL，
[0083] 4pmmol/L的引物对T0302R/F与ty5-17R/F各0.5μL，
[0084] mix酶10μL，
[0085] 双蒸水或三蒸水加至20μL；
[0086] PCR反应体系中所用引物为：
[0087] T0302R:AGTGTACATCCTTGCCATTGACT
[0088] T0302F:TGGCTCATCCTGAAGCTGATAGCGC；
[0089] ty5-17R：TAACAAAGCCCTCAAAGC
[0090] ty5-17F：GTCTCCGAAACGTAATCC；
[0091] 反应条件为：95℃预变性3min；每个循环95℃变性45sec，54℃退火45sec， 72℃延伸45sec，共38个循环，最后72℃延伸10min；
[0092] 利用ty5-17标记对1227、moneymaker和F1(1227×moneymaker)进行扩增，利用Ty1标记对TY52、moneymaker和F1(TY52×moneymaker)进行扩增，
[0093] 扩增体系为：10ng/μL模板DNA 2μL，
[0094] 4pmmol/L的引物对T0302R/F与ty5-17R/F各0.2μL，
[0095] mix酶10μL，
[0096] 双蒸水或三蒸水加至20μL；
[0097] 反应条件为94℃预变性3min；每个循环内94℃变性45sec，48℃退火45sec， 72℃延伸45sec，共38个循环，最后72℃延伸10min；
[0098] 3)PCR产物电泳检测，包括
[0099] a)制备聚丙烯酰胺凝胶，步骤如下:
[0100] 玻璃板处理：KOH溶液浸泡玻璃板一定时间，用去污剂和清水清洗干净，最后用双蒸水冲洗两遍；自然晾干；用95％乙醇擦拭长短板；
[0101] 固定玻璃板：长板处理面向上，短板处理面向下盖到长板上，用橡胶条固定两个板，插入垂直电泳仪支架，短板向里固定，即凹口板面向电泳液方向，用1％的琼脂糖密封橡胶条与玻璃板之间的缝隙。
[0102] 配制8％丙烯酰胺胶溶液：30％丙烯酰胺溶液：5.3mL；10×TBE：2mL；双蒸水：12.7mL；TEMED：20μL；10％APS：200μL；
[0103] 灌胶：将电泳槽倾斜30度，缓缓地使胶溶液倒入两板间，等胶溶液快要溢出时，把玻璃板放平，用薄塑料板赶气泡，倒插梳子；
[0104] 凝固：灌完胶后，放于室温让其自然凝固，观察胶边沿出现折射线就表明胶已凝固；凝胶可立即使用，或保存于室温24小时，4℃48小时；
[0105] b)聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤如下：
[0106] 倒液：向电泳仪下端槽内倒1×TBE约500mL，向上槽倒1×TBE，使液面高于短板上沿；拔出梳子，并用注射器吸取适量电泳液把点样孔洗干净 (因为梳子取出后，梳子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则)；
[0107] 上样：取1.6μLPCR产物上样；调节电压160V，电泳1.5h，电泳完毕，关掉电泳仪，取下玻璃板；
[0108] c)聚丙烯酰胺凝胶电泳的显色，步骤如下：
[0109] 固定：固定液由0.5％乙酸2.5mL、双蒸水450mL、10％乙醇50mL组成；把经冷却的胶板置于盛上述有固定液的1.5L的塑料盘中，摇床震荡6 min左右；
[0110] 染色：染色液由硝酸银1g、双蒸水500mL组成；把清洗干净的胶板置于盛有染色液的塑料盘中，摇床震荡12min左右；
[0111] 洗胶：把经染色的胶板置于盛有500mL双蒸水的塑料盘中清洗30s；倒掉清洗液，加入500mL双蒸水，双蒸水中加入120μL 10％Na2S2O3，清洗 30s。
[0112] 显色：显色液由7.5gNaOH、37％-40％甲醛1.5mL、双蒸水500mL组成；把清洗干净的胶板置于盛有显色液的塑料盘中显色。显色时间根据条带和背景颜色深浅调整，达到DNA条带清晰的目的(5-6min)。显色液用前可以先预冷至4-10℃，防止背景加深；
[0113] 终止显色：把染色完毕的胶板放回盛有固定液的塑料盘中，反应3min。用双蒸水清洗两次，每次2min；
[0114] 干胶：胶板用保鲜膜密封，置于室温自然干燥；条带统计、拍照留存；
[0115] 4)对照电泳结果进行结果分析：
[0116] 单独用T0302标记对CLN2777A-0、moneymaker和F1(CLN2777A-0× moneymaker)进行扩增，分别得到多态性条带大小为：lane1，950bp；lane2，850bp； lane3，950bp和850bp；利用ty5-17标记对1227、moneymaker和F1(1227× moneymaker)进行扩增得到多态性条带大小分别为：lane4，172bp；lane5，187bp； lane6，172bp和187bp；利用多重PCR体系对F1(1227×CLN2777A-0)进行扩增得到多态性条带大小为：lane7，172bp、187bp、850bp和
950bp，电泳结果参见图1。
950bp，电泳结果参见图1。
[0117] 实施例2
[0118] 本实施例为了检测构建的多重PCR体系在分离后代中的结果，具体实施步骤如下：
[0119] (1)提取番茄叶片DNA
[0120] 待测材料：F2(1227×CLN2777A-0)，对所有待测植株进行单株取样；
[0121] (2)以上述番茄叶片提取获得的DNA为模板，利用Ty-2和ty-5的引物，通过建立的多重PCR反应体系，对待测样品进行扩增；
[0122] PCR扩增体系为：
[0123] 10ng/μL模板DNA 2μL，
[0124] 4pmmol/L的引物对T0302R/F与ty5-17R/F各0.5μL，
[0125] mix酶10μL，
[0126] 双蒸水或三蒸水加至20μL；
[0127] PCR反应体系中所用引物为：
[0128] T0302R:AGTGTACATCCTTGCCATTGACT
[0129] T0302F:TGGCTCATCCTGAAGCTGATAGCGC；
[0130] ty5-17R：TAACAAAGCCCTCAAAGC
[0131] ty5-17F：GTCTCCGAAACGTAATCC；
[0132] 反应程序为95℃预变性3min；每个循环95℃变性45sec，54℃退火45sec，72℃延伸45sec，共38个循环，最后72℃延伸10min；
[0133] (3)PCR产物电泳检测；包括
[0134] a)制备聚丙烯酰胺凝胶，步骤如下:
[0135] 玻璃板处理：KOH溶液浸泡玻璃板一定时间，用去污剂和清水清洗干净，最后用双蒸水冲洗两遍；自然晾干；用95％乙醇擦拭长短板；
[0136] 固定玻璃板：长板处理面向上，短板处理面向下盖到长板上，用橡胶条固定两个板，插入垂直电泳仪支架，短板向里固定，即凹口板面向电泳液方向，用1％的琼脂糖密封橡胶条与玻璃板之间的缝隙；
[0137] 配制8％丙烯酰胺胶溶液：30％丙烯酰胺溶液：5.3mL；10×TBE：2mL；双蒸水：12.7mL；TEMED：20μL；10％APS：200μL；
[0138] 灌胶：将电泳槽倾斜30度，缓缓地使胶溶液倒入两板间，等胶溶液快要溢出时，把玻璃板放平，用薄塑料板赶气泡，倒插梳子；
[0139] 凝固：灌完胶后，放于室温让其自然凝固，观察胶边沿出现折射线就表明胶已凝固；凝胶可立即使用，或保存于室温24小时，4℃48小时；
[0140] b)聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤如下：
[0141] 倒液：向电泳仪下端槽内倒1×TBE约500mL，向上槽倒1×TBE，使液面高于短板上沿。拔出梳子，并用注射器吸取适量电泳液把点样孔洗干净 (因为梳子取出后，梳子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则)；
[0142] 上样：取1.6μLPCR产物上样；调节电压160V，电泳2.0，电泳完毕，关掉电泳仪，取下玻璃板；
[0143] c)聚丙烯酰胺凝胶电泳的显色，步骤如下：
[0144] 固定：固定液由0.5％乙酸2.5mL、双蒸水450mL、10％乙醇50mL组成；把经冷却的胶板置于盛上述有固定液的1.5L的塑料盘中，摇床震荡6 min左右；
[0145] 染色：染色液由硝酸银1g、双蒸水500mL组成；把清洗干净的胶板置于盛有染色液的塑料盘中，摇床震荡12min左右；
[0146] 洗胶：把经染色的胶板置于盛有500mL双蒸水的塑料盘中清洗30s；倒掉清洗液，加入500mL双蒸水，双蒸水中加入120μL 10％的Na2S2O3，清洗30s。
[0147] 显色：显色液由7.5gNaOH、37％-40％甲醛1.5mL、双蒸水500mL组成；把清洗干净的胶板置于盛有显色液的塑料盘中显色。显色时间根据条带和背景颜色深浅调整，达到DNA条带清晰的目的(一般5-6min)；显色液用前可以先预冷至4-10℃，防止背景加深；
[0148] 终止显色：把染色完毕的胶板放回盛有固定液的塑料盘中，反应3min。用双蒸水清洗两次，每次2min；
[0149] 干胶：胶板用保鲜膜密封，置于室温自然干燥；条带统计、拍照留存；
[0150] (4)对照电泳结果进行结果分析；
[0151] 电泳结果如图2所示，其中1、4、6、10分别代表单株中Ty-2和ty-5均为杂合基因型；2、12代表单株中不含有Ty-2和ty-5；3代表单株中含有纯合的ty-5，杂合的Ty-2；5、11、14、
15、19代表单株中含有纯合的ty-5，不含有Ty-2；7、 16、17、20代表单株中含有杂合ty-5，不含有Ty-2；8、18代表含有杂合Ty-2，不含有ty-5；9、13代表单株中含有纯合的Ty-2，杂合的ty-5。
15、19代表单株中含有纯合的ty-5，不含有Ty-2；7、 16、17、20代表单株中含有杂合ty-5，不含有Ty-2；8、18代表含有杂合Ty-2，不含有ty-5；9、13代表单株中含有纯合的Ty-2，杂合的ty-5。
[0152] 上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
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