미생물에 의한 5'-크산틸산의 제조방법
专利汇可以提供미생물에 의한 5'-크산틸산의 제조방법专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且5'-Xanthylic acid was prepd. by the fermn. of Brevibacterium ammoniagenes MW 4768-8. Thus, 100ml culture broth of the 2nd stage of the Brevi. ammoniagenes MW 4768-8 was inoculated into 5L of bioreactor contg. 2L of the medium contg. glucose(15 wt.%), KH2PO4 and K2HPO4 (1.2), MgSO4 7H2O (1.2), meat extract (0.3), (NH4)2SO4 (0.3), urea (0.2), FeSO2 7H2O (10), MgCl2 2H2O (10), ZnSO4 4H2O (1), MnSO4 (5), Ca-pantophenate (10), adenine (50), guanine (100), alanine (10), histidine (20), thiamine HCl (5mg) and biotin (50ug/L of distd. water). Cultivation was carried out for 50hrs. at 32≦̸C with agitatio (800 rpm) and aeratio (1vvm). The productivity was 69.5mg 5'- xanthylic acid per ml.，下面是미생물에 의한 5'-크산틸산의 제조방법专利的具体信息内容。
미생물에 의한 5'-크산틸산의 제조방법
본 발명은 브레비 박데리움 암모니아 게네스의 특수한 변이주에 의해서 당질, 질소원, 기타 미생물에 유용한 유기 및 무기 영양원을 함유하는 배지에서 호기적인 배양을 하므로 5'-크산틸산을 공업적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
5'-크산틸산은 핵산 생합성 대사과정의 중간물질로 정미성을 가지고 있으며, 특히 핵산 조미료로 많이 사용되는 5'-구아닐산의 공업적인 제조원료로 사용되는 물질이다.
종래 5'-크산틸산의 미생물에 의한 제조방법으로는 미국특허 3,211,629, 일본특허 소 49-39839, 45-7302, 42-30403, 42-3835 등이 알려져 있다. 그러나, 이들 종래 방법에서는 대부분의 미생물 변이주들이 5'-크산틸산 이외의 핵산물질인 5'-이노신산, 히포크산틴, 구아노신, 크산틴, 크산토신 등을 다량 부생시키거나 생산능이 약하다.
또한, 5'-크산틸산의 축적량을 증가시키기 위해 계면활성제 혹은 항생물질등을 사용하는 등 실제 산업적으로 사용하기에는 많은 문제점이 있다.
본 발명자들은 이러한 점이 개선된 5'-크산틸산의 생산능이 우수한 균주를 발명하기 위해 연구하여 오던 중 브레비 박테리움 암모니아 게네스 ADCC 6872 균주로부터 5'-크산틸산 생산능을 가지는 아데닌 및 구아닌 동시요구성 변이주(MW-4768)을 분리하였다.
이 변이주의 생리학적 특성이 아데닐로 썩씨네이트 합성효소와 5'-크산틸산 아미나제의 확성과 뉴클레오타이드 분해능이 거의 없어 5'-크산틸산 생산균주의 특성으로는 대단히 우수하고 안정된 변이주임에도 불구하고 5'-크산틸산 생산능이 낮아 실제 공업적으로 사용하기에는 부적당하여 다시 이 변이주를 재변이처리(자외선처리 혹은 N-메칠-N'-니트로소-구아니닌등 변이유기제를 사용하는 일반미생물 변이 처리법)하여 세포막 조성에 변이를 확인할 수 있는 각종 약제에 대한 감수성균주를 분리하기 위해 연구한 결과 라이소자임(lysozyme)에 특별한 감수성을 가지는 한 변이주가 5'-크산틸산 생산능이 특히 우수하다는 것을 알고 본 발명을 완성하게 되었다. 본 발명의 특이한 변이주의 선별방법은 다음과 같다.
친주 MW-4768 변이주를 미생물 변이처리법에 의해 변이를 유기시킨 후 코로니가 잘 분리되도록 한천배지(포도당 1%, 비프엑키스 1%, 펩톤 1%, 효모에키스 1%, 식염 0.3%, 아데닌, 구아닌 각 50mg/ml)상에 평판 배양한후 레프리카법((eplica)을 사용하여 라이소자임 10ug/ml 첨가 혹은 무첨가 배지에 각각 이식하여 30℃에서 48시간 배양한 후 라이소자임 첨가배지에서 생육하지 않고 무첨가 배지에서 생육하는 라이소자임 감수성균주를 분리하여 이중 5'-크산틸산 생산능이 가장 우수한 본 발명의 변이주 MW 4768-8(KAIST 850214-15712)를 분리하였다.
본 발명의 변이주가 친주(MW 4768)와 라이소자임에 대한 감수성 차이는 표 1과 같다.
[표 1]
주) +,+++ : 생육 - : 생육않음.
상기 분리배지에 각 농도의 라이소자임을 첨가하여 30℃에서 48시간 배양한 결과임.
이와 같이 라이소자임 10ug/ml 농도에서 감수성을 표시함은 AKIRA FURUYA 등이 연구한 5'-이노신산 생산균주의 막투과성 변이주에서 보여준 농도보다 낮은 것이며, 대부분의 부레비 박데리움 암모니아게네스의 변이주는 감수성을 나타내지 않는 농도로 특히 감수성이 강한 변이주임을 잘 알 수 있다.
본 발명의 변이주의 유전학적 성질을 좀더 자사히 조사해 본 결과 친주와 다른 특성으로 친주는 아데닌 구아닌 동시요구성이나 특수한 변이주는 구아닌 요구성 아데닌 생육촉진으로 변하였음을 알 수 있었다(표 2 참조).
[표 2]
친주와 MW 4768-8(KAIST 850214-15712)변이주의 영양요구성 조사
주) 1. Ade-: 아데닌요구성, Gua- : 구아닌요구성, Ade└ : 아데닌 생육촉진, +, +++ : 생육, - : 생육불.
2. 최소배지에 아데닌, 구아닌, 아데닌, 구아닌 동시 첨가한 한천 배지상의 생육도를 조사.
최소배지 : 포도당 20g, 이산제 1 칼륨 1g, 인산제 2 칼륨 3g, 황산마그네슘 7수화물 1g, 황산아연 4수화물 1mg, 황산망간 1mg, 비오틴 30ug, 치아민염산염 5mg, 판트덴산칼슘 10mg, 황산암모늄 3g, 요소 2g, 순수 1ℓ, pH 7.2, 염화칼슘 2수화물 10mg, 황산철 7수화물 10mg.
그의 여러가지 약제에 대한 감수성을 조사해 본 결과 친주보다 데옥시콜린산(Deoxycholic acid)에 대하여 감수성이 증가하였다(표 3 참조).
[표 3]
* 데옥시 콜린산에 대한 감수성은 최소배지에 아데닌 구아닌을 첨가(표 2 배지와 동일)하고 동시에 데옥시콜린산 1000g/ml을 첨가한 액체배지에서 30℃, 48시간 배양한 후 610μm에서의 흡광도를 비교한 결과임.
이와 같은 본 발명의 특이한 변이주 MW-4768-8-(KAIST 850214-15712)가 종래 균주와 특별히 다른점은, 구아닌요구성이면서 아데닌에 생육이 촉진되고 저농도의 라이소자임 및 데옥시콜린산에 감수성을 가지며 5'-크산틸산의 생산능이 특히 우수하다는 점이다.
특히 친주에 비해서 생산성이 약 3배나 향상되었으며 배양액중에느 5'-크산틸산 이외의 핵산물질을 거의 부생시키지 않았다(표 4 참조).
[표 4]
* 1. 기타 핵산물질 : 코산틴, 히포크산틴.
2. 생산배양방법은 실시예 1과 동일.
기타 본 발명 변이주의 균학적 성질은 다음과 같다.
1. 복원조건
가. 복원제
(1) 조성 : 굴루코스 1%, 플리펩톤 1%, 효모엑키스 0.5%, 식염 0.25%, 아데닌 100mg/ℓ, 구아닌 100mg/ℓ.
(2) pH : 7.0
(3) 살균조건 : 120℃, 20분
2. 배 지
가. 조성 : 상기 (1) 조성
나. pH : 7.0
다. 살균조건 : 120℃, 20분
3. 배양조건
가. 호기성 나. 온도 : 30℃ 다. 진탕
4. 동결 건건 조건
가. 분산제
(1) 조성 : 상기 (1) 조성 2배의 희석액+10% 스킴밀크
(2) pH : 70.
(3) 살균조건 : 115℃, 15분
나. 진공도 : 5×10 -3 mmHg∼1×10 -2 mmHg
5. 보존조건 : 온도 4℃
상술한 바와 같이 본 발명의 변이주가 5'-크리틸산 생산능이 크게 향상된 주된 이유는 라이소자임, 데옥시콜린산등 세포막 조성에 관계하는 약제에 대한 감수성을 가지므로 세포막 조성의 변화에 기인된 5'-크산틸산의 세포막 투과성이 개선되므로 생체내에서 합성된 5'-크산틸산이 용이하게 세포외로 분비되기 때문으로 보여진다.
본 발명에 사용하는 배지로서는 탄소원으로 포도당, 과당 혹은 이를 포함하는 다당류의 가수분해물, 황산암모늄, 암모니아, 요소, 펩톤, 대두분해물 등 유무기 질소원, 황산마그네슘, 인산카리등 각종 무기원, 아데닌, 구아닌, 아미노산류 등 천연유기물을 사용하는 일반 미생물 배양배지로 호기적 조건하에서 배양온도 26-42℃, pH 6.0-8.0에서 배양한다.
배양종료후 이미 알려진 이온교환수지 처리 혹은 활성탄소에 흡착용이하므로 배양액에서 5'-크산틸산을 회수할 수 있다.
본 발명의 제세한 방법을 실시예에 따라 설명하면 다음과 같다.
[실시예 1]
5'-크산틸산 생산균주로서는 본 발명의 특수한 변이주 MW 4768-8(KAIST 850214-15712)를 사용했다.
종배지로서는 포도당 4%, 플리펩톤 0.5%, 효모엑키스 1%, 식염 0.3%, 아데닌,구아닌 각 50mg/ℓ, 배지 조성(pH 7.2)을 이용하고, 발효배지로서는 포도당 15%, 인산제 1 및 제2칼륨 각 1.2%, 황산마그네슘 7수화물 1.2%, 황산철 7수화물 10mg/ℓ, 염화칼슘 2수화물 10mg/ℓ, 황산아연 4수화물1mg/ℓ, 황산망간 5mg/ℓ, 비오틴 50ug/ℓ, 치아민염산염 5mg/ℓ, 판트덴산칼슘 10mg/ℓ, 황산암모늄 3g/ℓ, 요소 2g/ℓ, 미트엑기스 0.3%, 아데닌 50mg/ℓ, 구아닌 100mg/ℓ, 10mg/ℓ, 알라닌 10mg/ℓ, 히스티딘 20mg/ℓ,의 배지조성을 멸균전 5N-NaOH호 pH 8.4 조절하여 500ml 진탕배지에 20ml씩 분주하여 120℃에서 15분간 가압살균후 사용했다.
종배지에 식균하고 30℃, 24시간 진탕배양한 후 종배양액을 발효배지에 5% 되게 식균하고 30℃에서 120시간 진탕배양하면서 요소수용액으로 pH 6-8로 유지되도록 조절하면서 72시간만에 50% 포도당 2ml를 추가하였다.
배양종료액의 5'-크산틸산 생성량은 65.4mg/ml이었다.
[실시예 2]
사용균주 및 배양배지는 실시예 1과 동일.
5ℓ소형 발효조에 2ℓ사입한 후 120℃에서 20분멸균한 후 종균 5%를 접종한후 교반기 회전수 800에서 배양온도 32℃, 통기량 1vvm, pH 7.0으로 조절(암모니아수)하면서 50시간 배양하였다.
발효중 잔당이 2-3% 유지되도록 70% 포도당수용액 제1,2인산칼륨 각 0.4% 첨가액을 1회 추가하였다.
배양완료액중 5'-크산틸산 축적량은 69.5mg/ml이었다.
[실시예 3]
발효배지 조성중 포도당 대신 전분가수분해물을 포도당량으로 10% 되게 첨가하고, 배양중 추가당을 사용하지 않았으며 그의 조건은 실시예 1과 동일하다.
65시간 배양한 후 배양액중 5'-크산틸산 축적량은 36.7mg/ml이었다.
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