用于调控表达的诱导型启动子序列及使用方法
阅读：842发布：2022-10-06
专利汇可以提供用于调控表达的诱导型启动子序列及使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 描述了编码甘露醇脱氢酶的CBSU花药消减文库(CAS1)基因的 植物 启动子及其功能 片段 ，以及其在植物中以诱导性方式促进一种或多种异源核酸片段表达中的用途。这些启动子片段还可用于创建重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至此类启动子片段的编码所需基因产物的核酸序列，所述重组DNA构建体可用于转化植物，并在外部化学品和/或热控制下实现在单子叶植物和双子叶植物中的基因产物表达。，下面是用于调控表达的诱导型启动子序列及使用方法专利的具体信息内容。
1.一种分离的多核苷酸，包含：
a)包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10中所示的序列的核苷酸序列或其全长互补序列；
b)包含SEQ ID NO：10的功能片段的核苷酸序列或其全长互补序列；
c)包含基于BLASTN比对方法，在与(a)或(b)的核苷酸序列进行比较时具有至少85％序列同一性的序列的核苷酸序列；
d)在65℃下0.1SSC、0.1％(w/v)SDS洗涤的高度严格条件下与SEQID NO：9杂交的核苷酸序列；
e)包含甘露醇脱氢酶的1.7kb 5′非编码序列的全部或片段的核苷酸序列；或，f)通过一个或多个核苷酸的替换、添加和/或缺失而获得的(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中指示的核苷酸序列之一的衍生物；并且，
其中所述核苷酸序列是诱导型启动子。
2.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中基于BLASTN比对方法，c)的核苷酸序列在与SEQ ID NO：1中所示的序列进行比较时具有至少90％同一性。
3.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中基于BLASTN比对方法，c)的核苷酸序列在与SEQ ID NO：1中所示的序列进行比较时具有至少95％同一性。
4.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中基于BLASTN比对方法，c)的核苷酸序列在与SEQ ID NO：1中所示的序列进行比较时具有至少98％同一性。
5.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中所述诱导型启动子通过化学品或胁迫处理进行诱导。
6.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中所述诱导型启动子通过安全剂或热处理进行诱导。
7.根据权利要求6所述的分离的多核苷酸，其中所述安全剂是N-(氨基羰基)-2-氯苯磺酰胺。
8.根据权利要求6所述的分离的多核苷酸，其中所述热处理包括大于26℃的温度。
9.一种重组DNA构建体，包含可操作地连接至少一种异源核酸序列的权利要求1所述的分离的多核苷酸。
10.根据权利要求9所述的重组DNA构建体，其中所述异源核酸序列编码选自下列的基因：双链断裂诱导基因、重组酶基因、报道基因、选择标记、疾病抗性赋予基因、除草剂抗性赋予基因、昆虫抗性赋予基因；涉及碳水化合物代谢的基因、涉及脂肪酸代谢的基因、涉及氨基酸代谢的基因、涉及植物发育的基因、涉及植物生长调控的基因、涉及产量改善的基因、涉及干旱抗性的基因、涉及寒冷抗性的基因、涉及植物中的热和盐抗性的基因。
11.根据权利要求9所述的重组DNA构建体，其中所述异源核酸序列编码选自下列的蛋白质：双链断裂诱导蛋白质、重组酶蛋白质、报道蛋白质、选择标记、赋予疾病抗性的蛋白质、赋予除草剂抗性的蛋白质、赋予昆虫抗性的蛋白质；涉及碳水化合物代谢的蛋白质、涉及脂肪酸代谢的蛋白质、涉及氨基酸代谢的蛋白质、涉及植物发育的蛋白质、涉及植物生长调控的蛋白质、涉及产量改善的蛋白质、涉及干旱抗性的蛋白质、涉及寒冷抗性的蛋白质、涉及植物中的热抗性和盐抗性的蛋白质。
12.一种载体，包含权利要求9所述的重组DNA构建体。
13.一种细胞，包含权利要求9所述的重组DNA构建体。
14.根据权利要求13所述的细胞，其中所述细胞是植物细胞。
15.根据权利要求14所述的植物细胞，所述植物细胞具有稳定掺入其基因组内的权利要求9所述的重组DNA构建体。
16.一种转基因植物，所述转基因植物具有稳定掺入其基因组内的权利要求9所述的重组DNA构建体。
17.根据权利要求16所述的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物。
18.根据权利要求17所述的转基因植物，其中所述单子叶植物选自：玉米、小麦、稻、大麦、高粱、粟、甘蔗和黑麦。
19.根据权利要求16所述的转基因植物，其中所述植物是双子叶植物。
20.根据权利要求19所述的转基因植物，其中所述双子叶植物选自：大豆、芸苔属物种、棉花、红花、烟草、苜蓿和向日葵。
21.由权利要求16所述的转基因植物产生的转基因种子。
22.一种用重组表达构建体稳定转化的植物，包含植物启动子和可操作地连接至所述启动子的异源核酸片段，其中所述启动子是诱导型启动子且能够控制所述异源核酸片段在植物细胞中的表达，并且进一步地，其中所述启动子包含SEQ ID NO：10的片段。
23.一种在植物细胞中表达编码序列或功能RNA的方法，包括：
a)将权利要求9所述的重组DNA构建体导入植物细胞内，其中所述至少一种异源序列包含编码序列或功能RNA；
b)使步骤a)的植物细胞生长；
c)通过对b)的植物细胞的化学品或胁迫处理来诱导所述诱导型启动子；以及，d)选择展示所述重组DNA构建体的编码序列或功能RNA表达的植物细胞。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述化学品是安全剂。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述胁迫处理是热处理。
26.根据权利要求23所述的方法，还包括使d)的植物细胞生长成植物。
27.一种在花药细胞中表达编码序列或功能RNA的方法，所述方法包括：
a)将权利要求9所述的重组DNA构建体导入植物细胞内，其中所述至少一种异源序列包含编码序列或功能RNA；
b)使步骤a)的植物细胞生长；
c)通过对b)的植物细胞的化学品或胁迫处理来诱导所述诱导型启动子；以及，d)鉴定展示所述重组DNA构建体的编码序列或功能RNA表达的花药细胞。
28.根据权利要求23或权利要求27所述的方法，其中所述至少一种异源序列是瞬时表达的。
29.根据权利要求23或权利要求27所述的方法，其中所述至少一种异源序列稳定掺入所述植物细胞中。
30.一种用于改变植物中至少一种异源核酸片段的表达的方法，包括：
(a)用权利要求9所述的重组表达构建体转化植物细胞；
(b)通过对(a)的细胞的化学品或胁迫处理来诱导所述诱导型启动子；
(c)由步骤(a)的转化的植物细胞生长能繁殖的成熟植物；以及，
(d)选择含有所述转化的植物细胞的植物，其中所述异源核酸片段的表达是提高的或降低的。
31.一种转基因改变可销售的植物性状的方法，包括：
a)将权利要求9所述的重组DNA构建体导入植物内；
b)通过对(a)的植物的化学品或胁迫处理来诱导所述诱导型启动子；
c)使得自步骤b)的能繁殖的、成熟植物生长；以及
d)基于所述改变的可销售的性状，选择在至少一种植物组织中表达所述至少一种异源核苷酸序列的植物。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述可销售的性状选自：疾病抗性、除草剂抗性、昆虫抗性、碳水化合物代谢、脂肪酸代谢、氨基酸代谢、植物发育、植物生长调控、产量改善、干旱抗性、寒冷抗性、热抗性和盐抗性。
33.一种分离的多核苷酸，包含：
a)包含SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：22的全部或功能片段的核苷酸序列；
b)包含所述核苷酸序列(a)的全长互补序列的核苷酸序列；或，
c)包含基于BLASTN比对方法，在与(a)或(b)的核苷酸序列进行比较时具有至少90％序列同一性的序列的核苷酸序列；并且，其中所述核苷酸序列是启动子。
用于调控表达的诱导型启动子序列及使用方法
技术领域
[0002] 本发明涉及植物启动子及其片段，以及其以诱导性方式改变植物中的至少一种异源核酸序列表达的用途。这些启动子片段还可用于创建重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至此类启动子片段的编码所需基因产物的核酸序列，所述重组DNA构建体可用于转化植物，并在外部化学品和/或胁迫控制下实现在单子叶植物和双子叶植物中的基因产物表达。
背景技术
[0003] 植物基因工程中的近期进展已打开了改造植物以具有改善的特征或性状的新大门，所述改善的特征或性状例如植物疾病抗性、昆虫抗性、除草剂抗性、产量改善、植物可食用部分的营养质量的改善、以及得自植物的最终消费品的稳定性或储存寿命增强。因此，具有赋予不同或改善的特征或性质的分子功能的所需一种或多种基因，可适当掺入植物的基因组内。新整合的一种或多种基因编码序列随后可在植物细胞中表达，以显示出所需新性状或特征。重要的是适当的调控信号必须以适当构型存在，以便获得新插入的基因编码序列在植物细胞中的表达。这些调控信号通常包括启动子区、5′非翻译前导序列和3′翻译终止/多聚腺苷酸化序列。
[0004] 启动子是非编码基因组DNA序列，通常在相关编码序列上游(5’)，RNA聚合酶在起始转录前与所述启动子结合。该结合对齐RNA聚合酶，使得转录在特定转录起始位点处起始。启动子的核苷酸序列决定与之附着的酶和其他相关蛋白质因子的性质以及RNA合成速率。将RNA加工以产生信使RNA(mRNA)，所述信使RNA充当RNA序列翻译成所编码多肽的氨基酸序列的模板。5′非翻译前导序列是编码区的mRNA上游区域，它可以在mRNA起始和翻译中起作用。3′转录终止/多聚腺苷酸化信号是位于编码区下游的非翻译区，其在植物细胞中起作用，以导致RNA合成的终止和多聚腺苷酸核苷酸对3′端的添加。
[0005] 已显示某些启动子能够以比其他启动子更高的速率指导RNA合成。这些被称为“强启动子”。某些其他启动子已显示仅在特定类型的细胞或组织中以更高水平指导RNA合成，并且如果启动子在某些组织中优选指导RNA合成，但在其他组织在也以减少水平指导RNA合成，则通常被称为“组织特异性启动子”或“组织优选的启动子”。某些启动子能够跨越所有植物组织以相对相似的水平指导RNA合成。这些被称为“组成型启动子”或“组织不依赖性”启动子。组成型启动子可根据其指导RNA合成的有效性而分成强、中等和弱的。在一些情况下，当启动子通过外部刺激例如化学品、胁迫或生物刺激进行诱导时，它们能够指导RNA合成。这些被称为“诱导型启动子”。
[0006] 外部控制所选基因和由此其基因产物在植物细胞和/或田间生长植物中表达的能力可提供重要的农业和粮食益处。该控制对于基因调控是期望的，所述基因可置于转基因植物内并具有许多应用，包括但不限于(1)延长或延伸期望的营养食物储量在种子、根中的累积，(2)在发育周期的限定时间在植物组织中产生并累积产物，使得这些产物对于收获和/或分离是方便的，和(3)在病原体攻击部位处起始害虫特异性毒素的表达。在新型诱导型启动子的分离中存在持续关注，当暴露于外部刺激时，所述诱导型启动子能够控制一种或多种嵌合基因在植物细胞中以某些水平的表达。
发明内容
[0007] 本发明涉及编码甘露醇脱氢酶的CBSU花药消减文库(CBSU-Anther_Subtraction library)(CAS1)基因的植物启动子及其功能片段，以及其在植物中以诱导性方式促进一种或多种异源核酸片段表达中的用途。这些启动子片段还可用于创建重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至此类启动子片段的编码所需基因产物的核酸序列，所述重组DNA构建体可用于转化植物，并在外部化学品和/或热控制下实现在单子叶植物和双子叶植物中的基因产物表达。本发明的一个实施例涉及包含诱导型ZmCAS1启动子的分离的核酸片段，其中所述启动子基本上由SEQ ID NO：9或10中所示的核苷酸序列组成，或所述启动子基本上由基本上类似于并在功能上等价于SEQ ID NO：9或10中所示的核苷酸序列的片段组成。ZmCAS1启动子可通过化学品或胁迫处理进行诱导。化学品可以是安全剂例如但不限于N-(氨基羰基)-2-氯苯磺酰胺(2-CBSU)。胁迫处理可以是处理，例如但不限于温度超过26℃的热休克处理。
[0008] 本发明还涉及重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与本发明的启动子可操作地连接的至少一种异源核酸片段。
[0009] 在另一个实施例中，本发明涉及包含本公开的重组表达构建体的细胞、植物或种子。
[0010] 在另一个实施例中，本发明涉及用重组表达构建体稳定转化的植物，所述重组表达构建体包含植物启动子和可操作地连接至所述启动子的异源核酸片段，其中所述启动子是诱导型启动子且能够控制所述异源核酸片段在植物细胞中的表达，并且进一步地，其中所述启动子包含SEQ ID NO：9或10的片段。
[0011] 在另一个实施例中，本发明涉及在植物细胞中表达编码序列或功能RNA的方法，所述方法包括：a)将本公开的重组DNA构建体导入植物细胞内，其中至少一种异源序列包含编码序列或功能RNA，b)使步骤a)的植物细胞生长；c)通过对b)的植物细胞的化学品或胁迫处理来诱导该诱导型启动子；以及，d)选择展示重组DNA构建体的编码序列或功能RNA表达的植物细胞。在另一个实施例中，本发明涉及在花药、愈伤组织、叶或根细胞中表达通过本发明的启动子驱动的编码序列或功能RNA的方法。
[0013] 根据形成本申请的一部分的下列详细描述以及附图和序列表，可更全面地理解本发明。
[0014] 图1：由ZmCAS1cDNA(SEQ ID NO：5)编码的氨基酸序列与玉米甘露醇脱氢酶(GI：226528549；SEQ ID NO：6)的比对(A)和百分比同一性(B)。
[0015] 图2：野生型能繁殖的(F)和不育(S)玉米对照植物(-)以及玉米CBSU处理的植物(+)的玉米花药RNA的RNA印迹。玉米花药RNA用对于ZmCAS1、IN2-2、5126、MS45、ACTIN和UBI基因表达特异性的探针进行分析。
[0016] 图3：来自野生型玉米组织和CBSU处理(+)的组织的玉米愈伤组织(C)、叶(L)和花药(A)RNA的RNA印迹。玉米RNA用对于IN2-2和ZmCAS1特异性的探针进行分析。
[0017] 图4显示了A)对于三个不同事件(1、2、3)，用包含1.7kb ZmCAS1启动子的PHP16975转化的玉米愈伤组织，C＝对照维持培养基；10＝10mg/l CBSU，100＝100mg/l CBSU；B)用包含截短的1.0kb ZmCAS1启动子的PHP16974转化，并用CBSU或热(37℃)诱导的玉米愈伤组织；26C＝在26℃下的对照愈伤组织；26C+CBSU＝在26℃下的CBSU处理的愈伤组织；37C＝通过37℃的热处理诱导的愈伤组织。显示了来自七个事件(1-7)的结果。
[0018] 图5显示了来自用PHP16975转化并用CBSU诱导的三个(1、2、3)玉米植物的玉米叶穿孔。在浇水前(C)和浇水后(S)收集来自由3个双丙氨磷(bialaphos)抗性事件再生的植物的叶穿孔。
[0019] 图6显示了来自用PHP16972转化并用(+)或不用(-)CBSU处理的五个(1、2、3、4和5)事件的玉米愈伤组织RNA的RNA印迹。
[0020] 图7显示了使用针对玉米MS45蛋白质的抗体，来自用PHP16973转化的ms45/ms45玉米植物的叶的蛋白质分析。C＝来自未经诱导的对照植物的叶，+＝来自CBSU诱导的植物的叶。来自野生型MS45植物的全细胞花药提取物显示于泳道1中，并且用于鉴定如通过箭头指示的免疫反应性MS45蛋白质的移动性。
[0021] 图8显示了使用针对玉米MS45蛋白质的抗体，来自用PHP16973转化的ms45/ms45玉米植物的花药的蛋白质分析。C＝来自未经诱导的对照植物的叶，+＝来自CBSU诱导的植物的叶。
[0022] 图9：用PHP16974转化的稻事件显示了当通过1.0kb ZmCAS1启动子驱动并通过CBSU诱导时的GUS表达。
[0023] 图10：用PHP16974转化的稻幼苗显示了当通过1.0kb ZmCAS1启动子驱动并通过CBSU诱导时的GUS表达。
[0025] 序列描述概括了与之附着的序列表。该序列表含有用于核苷酸序列字符的单字母代码以及用于氨基酸的单字母和三字母代码，如Nucleic Acids Research 13：3021-3030(1985)和Biochemical Journal 219(2)：345-373(1984)中描述的IUPAC-IUB标准中限定的。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循37C.F.R.§1.822所示的规定。
[0026] SEQ ID NO：1包含ZmCAS1c-1cDNA的DNA插入片段。
[0027] SEQ ID NO：2包含ZmCAS1c-2cDNA的DNA插入片段。
[0028] SEQ ID NO：3包含玉米ZmCAS1全长cDNA的1354bp(碱基对)SalI-NotI DNA插入片段。
[0029] SEQ ID NO：41338bp玉米ZmCAS1全长cDNA。
[0030] SEQ ID NO：5由SEQ ID NO：4编码的氨基酸序列。
[0031] SEQ ID NO：6玉米甘露醇脱氢酶(GI编号226528549，NP_001147757.1)的氨基酸序列。
[0032] SEQ ID NO：7包含玉米B73ZmCAS1启动子的4069bp DNA片段。
[0033] SEQ ID NO：8是用于诱变以导入RCAI DNA限制位点的寡核苷酸的DNA序列。
[0034] SEQ ID NO：9是1049bp截短形式的玉米ZmCAS1启动子(SEQ ID NO：9的bp698-1746)，也称为1.0kb ZmCAS1启动子。
[0035] SEQ ID NO：10是1746bp玉米ZmCAS1启动子，也称为1.7kb ZmCAS1启动子。
[0036] SEQ ID NO：11是包含1.0kb ZmCAS1启动子的PHP16974的核苷酸序列。
[0037] SEQ ID NO：12是包含1.7kb ZmCAS1启动子的PHP16975的核苷酸序列。
[0038] SEQ ID NO：13是包含1.0kb ZmCAS1启动子的PHP16972的核苷酸序列。
[0039] SEQ ID NO：14是包含1.7kb ZmCAS1启动子的PHP16973的核苷酸序列。
[0040] SEQ ID NO：15是包含SEQ ID NO：9的1.0kb ZmCAS1启动子的HindIII-Rca1片段(ZMCAS1HINDIIIPRO)。
[0041] SEQ ID NO：16是包含SEQ ID NO：10的1.7kb ZmCAS1启动子的BamH1-Rca1片段(ZMCAS1BAMPRO)。
[0042] SEQ ID NO：17是来自稻(水稻(Oryza sativa))的甘露醇脱氢酶(AAP52597)的氨基酸序列。
[0043] SEQ ID NO：18是来自稻(水稻)的甘露醇脱氢酶基因区(DP000086)的核苷酸序列。
[0044] SEQ ID NO：19是来自稻(水稻)的甘露醇脱氢酶基因(DP000086)的假定5’UTR-启动子区的核苷酸序列。
[0045] SEQ ID NO：20是来自高粱的甘露醇脱氢酶(XP-002436634)的氨基酸序列。
[0046] SEQ ID NO：21是来自高粱的甘露醇脱氢酶基因区(NC-012879)的核苷酸序列。
[0047] SEQ ID NO：22是来自高粱的甘露醇脱氢酶基因(NC-012879)的假定5’UTR-启动子区的核苷酸序列。
具体实施方式
[0048] 本文所引用的所有专利、专利申请和出版物的公开内容均全文以引用的方式并入。
[0049] 除非另行定义，否则本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一样。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是本领域普通技术人员众所周知的标准方法。材料、方法和实例仅是举例说明性的而不是限制性的。
[0050] 如本文所用的并在所附的权利要求书中的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，提及“植物”包括多株此类植物，提及“细胞”包括一个或多个细胞以及本领域的技术人员已知的其等价物等等。
[0051] 在本公开的上下文中将用到许多术语。
[0052] 如本文所用，“ZmCAS1启动子”指一类诱导型启动子。天然ZmCAS1启动子是从CBSU-花药消减文库中分离的玉米基因的启动子，所述启动子与在多种作物物种包括玉米中鉴定的甘露醇脱氢酶基因具有显著同源性，所述甘露醇脱氢酶基因在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中保藏。如本文所用，“ZmCAS1启动子”还指保留显著启动子活性的全长天然启动子的片段。例如，ZmCAS1启动子长度可以是1.7kb(SEQ ID NO：10)或其启动子功能片段，所述功能片段尤其包括SEQ ID NO：9的多核苷酸。ZmCAS1启动子还包括这样的变体，所述变体基本上类似于并在功能上等价于核苷酸序列的任何部分，以一个碱基对的增量，在1.0kb(SQE ID NO：9)和1.7kb(SEQ ID NO：10)片段和序列之间。
[0053] 术语“启动子”指能够调控编码序列或功能RNA表达的核苷酸序列。功能RNA包括但不限于转移RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)。启动子序列由近侧和较远端上游元件组成，后者经常指增强子。启动子通常包含能够指导RNA聚合酶II在对于特定编码序列适当的转录起始位点处起始RNA合成的TATA盒。启动子可另外包含一般位于TATA盒上游或5’的其他识别序列，称为上游启动子元件，其影响转录起始速率。已经认识到已鉴定本文公开的启动子区的核苷酸序列，分离并鉴定来自本文鉴定的特定启动子区的TATA盒上游的区域中的进一步调控元件在本领域技术内。因此，“增强子”是可刺激启动子活性的DNA序列，并且可以是启动子的固有元件，或插入以增强启动子水平或组织特异性的异源元件。启动子可整个源于天然基因，或由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或甚至包含合成的DNA片段。本领域技术人员应当理解，不同的启动子可在不同的组织或细胞类型中，或在不同的发育阶段，或响应不同的环境条件或无生命条件而指导基因的表达。
[0054] 允许所需组织中的诱导性表达的启动子元件可得到鉴定，分离并与其他核心启动子一起使用，以证实诱导性表达。核心启动子意指起始转录所需的最低限度序列，例如称为TATA盒的序列，所述TATA盒是编码蛋白质的基因中的启动子共有的。因此，ZmCAS1启动子可任选与来自其他来源的其自身启动子或核心启动子结合使用。启动子对于它在其中发现的细胞可以是天然的或非天然的。
[0055] 在大多数时间引起基因在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。目前不断发现可用于植物细胞中的不同类型的新启动子；在通过Okamuro和Goldberg的汇编(Biochemistry of Plants 15：1-82(1989))中可找到大量例子。还应认识到因为在大多数情况下还不能完全确定调控序列的确切范围，一些变型的DNA片段可能具有相同的启动子活性。
[0056] 虽然候选基因当通过组成型启动子驱动表达时可预测其效应，但候选基因在35S或UBI启动子控制下的高水平、组成型表达可具有多重效应。使用诱导型启动子或胁迫特异性启动子可消除不需要的效应但保留增强耐旱性的能力。在拟南芥属(Arabidopsis)中已观察到该效应(Kasuga等人(1999)Nature Biotechnol.17：287-91)。
[0057] 术语“诱导型启动子”指响应内源或外源刺激的存在例如通过化学化合物(化学诱导剂)，或响应环境、激素、化学和/或发育信号，选择性表达编码序列或功能RNA的启动子。诱导型或调控型启动子包括例如通过光、热、胁迫、水淹或干旱、盐胁迫、渗透胁迫、植物激素、伤口或化学品例如乙醇、脱落酸(ABA)、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂诱导或调控的启动子。
[0058] 胁迫诱导性的例子是RD29A启动子(Kasuga等人(1999)Nature Biotechnol.17：287-91)。本领域的普通技术人员熟悉模拟干旱条件以及对已经受了模拟的或天然存在的干旱条件的植物的耐旱性进行评价的方案。例如，技术人员可通过向植物提供比正常需求较少的水或在一定时期内不提供水来模拟干旱条件，并且技术人员可通过寻找在生理和/或物理条件上的差异来评价耐旱性，包括但不限于活力、生长、大小、或根长、或具体地讲叶片颜色或叶片面积大小。用于评价耐旱性的其他技术包括测量叶绿素荧光、光合作用速率和换气速率。此外，本领域普通技术人员熟悉用于模拟胁迫条件例如渗透胁迫、盐胁迫和温度胁迫的方案，以及用于评估已实施模拟或天然存在的胁迫条件的植物的胁迫耐受性的方案。
[0059] 本发明的序列可从任何植物中分离，包括但不限于玉米(玉蜀黍(Zea mays))、低芥酸菜子(甘蓝型油菜(Brassica napus))、大白菜(Brassica rapa ssp).)、苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativa))、稻(水稻)、黑麦(黑麦(Secale cereale))、高粱(二色高粱(Sorghum bicolor)、高粱(Sorghum vulgare))、向日葵(向日葵(Helianthus annuus))、小麦(小麦(Triticum aestivum))、大豆(大豆(Glycine max))、烟草(烟草(Nicotiana tabacum))、粟(黍属(Panicum spp.))、马铃薯(马铃薯(Solanum tuberosum))、花生(落花生(Arachis hypogaea))、棉花(陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(甘薯(Ipomoea batatus))、木薯(木薯(Manihot esculenta))、咖啡(咖啡属(Cafea spp.))、椰子(椰子(Cocos nucifera))、菠萝(凤梨(Ananas comosus))、柑橘树(柑橘属(Citrus spp.))、可可(可可树(Theobroma cacao))、茶(茶树(Camellia sinensis))、香蕉(香蕉属(Musa spp.))、鳄梨(鳄梨(Persea americana))、无花果(无花果(Ficus casica))、番石榴(番石榴(Psidium guajava))、芒果(芒果(Mangifera indica))、橄榄(橄榄(Olea europaea))、燕麦(燕麦(Avena sativa))、大麦(大麦(Hordeum vulgare))、蔬菜、观赏植物和球果植物。优选地，植物包括玉米、大豆、红花、向日葵、低芥酸菜子、小麦、大麦、黑麦、苜蓿、稻、棉花和高粱。
[0060] 本发明涉及包含诱导型ZmCAS1启动子的分离的核酸片段。本发明还涉及包含启动子的分离的核酸片段，其中所述启动子基本上由SEQ ID NO：9中所示的核苷酸序列组成，或所述启动子基本上由基本上类似于并在功能上等价于SEQ ID NO：10中所示的核苷酸序列的片段组成。在功能上等价于本发明的ZmCAS1启动子的核酸片段是任何核酸片段，其能够以与ZmCAS1启动子类似的方式控制编码序列或功能RNA的表达。ZmCAS1基因及其启动子的表达模式在实例1-3中阐述。
[0061] ZmCAS1启动子编码序列上游的玉米基因座DNA片段SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的启动子活性通过下列进行评价：将该片段与GUS基因或MS45基因连接，将启动子：
GUS(或MS45)表达盒转化到玉米内，并且在转基因植物的多种细胞类型中分析GUS(或MS45)表达(实例1-3)。这些结果指示核酸片段包含诱导型启动子。
GUS(或MS45)表达盒转化到玉米内，并且在转基因植物的多种细胞类型中分析GUS(或MS45)表达(实例1-3)。这些结果指示核酸片段包含诱导型启动子。
[0062] 在一个实施例中，本发明是包含下列、或基本上由下列组成或由下列组成的分离的多核苷酸：
[0063] a)包含SEQ ID NO：9中所示的序列的核苷酸序列或其全长互补序列；
[0064] b)包含SEQ ID NO：10中所示的片段的核苷酸序列或其全长互补序列
[0065] c)包含基于BLASTN比对方法，在与(a)或(b)的核苷酸序列进行比较时具有至少90％序列同一性的序列的核苷酸序列；
[0066] d)包含甘露醇脱氢酶的1.7kb 5‘非编码序列的全部或片段的核苷酸序列；或，[0067] e)通过一个或多个核苷酸的替换、添加和/或缺失而获得的(a)、(b)或(c)中指示的核苷酸序列之一的衍生物；并且，
[0068] 其中所述核苷酸序列是诱导型启动子。
[0069] 在本发明的另一个实施例中，ZmCAS1启动子通过N-(氨基羰基)-2-氯苯磺酰胺(2-CBSU)的安全剂处理进行诱导。在本发明的另一个实施例中，ZmCAS1启动子通过大于26℃并且直到且包括37℃的温度的热处理进行诱导。
[0070] 术语“N-(氨基羰基)-2-氯苯磺酰胺”、2-CBSU”和“CBSU”在本文中可互换使用。
[0071] 本文公开的启动子核苷酸序列和方法可用于调控任何异源核苷酸序列在宿主植物中的诱导性表达，以便改变植物的表型。
[0072] 表型中的多种变化是所关注的，包括但不限于修饰植物中的脂肪酸组成、改变植物的氨基酸含量、改变植物的病原体防御机制等等。这些结果可通过提供在植物中异源产物的表达或内源产物的提高表达而实现。作为另外一种选择，结果可通过提供植物中一种或多种内源产物特别是酶或辅因子的表达减少而实现。这些变化导致转化的植物的表型变化。
[0073] 所关注基因是涉及作物发育的基因的商业市场和关注的反映。作物和市场关注改变，并且随着发展中国家打开国际市场，新作物和技术也将出现。此外，随着我们的农业特征和性状例如产量和杂种优势的理解提高，用于转化的基因选择相应地改变。所关注基因的一般分类包括但不限于涉及信息的那些基因例如锌指，涉及通信的基因例如激酶，和涉及看家的基因例如热休克蛋白。其他所关注基因是允许位点特异性基因整合和基因堆叠的基因，包括但不限于双链断裂诱导基因和重组酶基因。更具体的转基因分类例如包括但不限于编码农业重要性状、昆虫抗性、疾病抗性、除草剂抗性、不育、谷粒或种子特征和商业产品的基因。所关注基因一般包括涉及油、淀粉、碳水化合物或营养素代谢的基因，以及影响种子大小、植物发育、植物生长调控和产量改善的基因。植物发育和生长调控还指植物的各个部分例如花、种子、根、叶和芽的发育和生长调控。
[0074] 其他商业期望性状是赋予寒冷、热、盐和干旱抗性的基因和蛋白质。
[0075] 本发明的一个实施例涉及重组DNA，所述重组DNA包含与至少一种异源核酸序列可操作地连接的本发明的分离的多核苷酸，其中所述异源核酸序列编码选自下列的基因：双链断裂诱导基因、重组酶基因、报道基因、选择标记、疾病抗性赋予基因、除草剂抗性赋予基因、昆虫抗性赋予基因；涉及碳水化合物代谢的基因、涉及脂肪酸代谢的基因、涉及氨基酸代谢的基因、涉及植物发育的基因、涉及植物生长调控的基因、涉及产量改善的基因、涉及干旱抗性的基因、涉及寒冷抗性的基因、涉及植物中的热和盐抗性的基因。
[0076] 本发明的另一个实施例涉及重组DNA，所述重组DNA包含可操作地连接至少一种异源核酸序列的本发明的分离的多核苷酸，其中所述异源核酸序列编码选自下列的蛋白质：双链断裂诱导蛋白质、重组酶蛋白质、报道蛋白质、选择标记、赋予疾病抗性的蛋白质、赋予除草剂抗性的蛋白质、赋予昆虫抗性的蛋白质；涉及碳水化合物代谢的蛋白质、涉及脂肪酸代谢的蛋白质、涉及氨基酸代谢的蛋白质、涉及植物发育的蛋白质、涉及植物生长调控的蛋白质、涉及产量改善的蛋白质、涉及干旱抗性的蛋白质、涉及寒冷抗性的蛋白质、涉及植物中的热抗性和盐抗性的蛋白质。
[0077] 本发明的一个实施例包括在其基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米或大豆植物)，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至本发明的启动子片段的多核苷酸，其中所述启动子片段基于Clustal V比对方法，在与SEQ ID NO：9或10进行比较时包含至少40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，所述植物显示出至少一种农业特征的改变。
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，所述植物显示出至少一种农业特征的改变。
[0078] 本发明的另一个实施例包括在其基因组中包含抑制DNA构建体的植物(例如玉米或大豆植物)，所述抑制DNA构建体包含本发明的启动子片段，其中基于Clustal V比对方法，所述启动子片段在与SEQ ID NO：9或10进行比较时包含至少40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、
67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％序列同一性，并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，所述植物显示出至少一种农业特征的改变。
67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％序列同一性，并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，所述植物显示出至少一种农业特征的改变。
[0079] 在前述实施例中的任一个或本发明的任何其他实施例中，至少一种农业特征可选自绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植物高度、穗高、穗长、早期幼苗活力和在低温胁迫下的出苗。例如，至少一种农学特性的改变可为产量、绿度或生物量的提高。
[0080] 疾病和/或昆虫抗性基因可编码对害虫的抗性，所述害虫具有极大的产量阻力例如炭疽病、大豆花叶病毒、大豆孢囊线虫、根结线虫、褐斑病、霜霉病、紫斑病、种子腐烂和幼苗疾病，通常通过真菌-腐霉菌属物种(Pythium sp.)、疫霉属物种(Phytophthora sp.)、丝核菌属物种(Rhizoctonia sp.)、间座壳属物种(Diaporthe sp.)引起。白叶枯病通过细菌丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.Glycinea)引起。赋予昆虫抗性的基因包括例如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白质基因(美国专利5,366,892；5,747,450；5,737,514；5,723,756；5,593,881；和Geiser等人(1986)Gene48：109)；凝集素(Van Damme等人(1994)Plant Mol.Biol.24：825)；等等。
[0081] 除草剂抗性性状可包括编码对除草剂的抗性的基因，所述除草剂作用于抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用，特别是磺酰脲型除草剂(例如含有导致此类抗性的突变特别是S4和/或HRA突变的乙酰乳酸合酶ALS基因)。ALS-基因突变体编码对除草剂氯磺隆的抗性。草甘膦乙酰基转移酶(GAT)是来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的N-乙酰转移酶，其通过基因改组对于广谱除草剂草甘膦的乙酰化进行优化，形成转基因植物中的草甘膦抗性的新机制基础(Castle等人(2004)Science 304，1151-1154)。
[0082] 抗生素抗性基因包括例如新霉素磷酸转移酶(npt)和潮霉素磷酸转移酶(hpt)。两种新霉素磷酸转移酶基因用于选择转化的生物体：新霉素磷酸转移酶I(nptI)基因和新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因。第二种是更广泛使用的。它起初从转座子Tn5中分离，所述转座子Tn5存在于细菌菌株大肠杆菌(Escherichia coli)K12中。该基因编码氨基糖苷3′-磷酸转移酶(指定为aph(3′)-II或NPTII)酶，其通过磷酸化使一系列氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素、遗传霉素和巴龙霉素失活。NPTII广泛用作植物转化的选择标记。它还用于不同生物体中的基因表达和调控研究中，部分是因为可构建保留酶活性的N末端融合物。NPTII蛋白质活性可通过酶促测定法进行检测。在其他检测方法中，经修饰的底物，磷酸化的抗生素，通过薄层色谱法、斑点印迹分析或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。植物例如玉米、棉花、烟草、拟南芥属、亚麻、大豆及许多其他植物已成功地用nptII基因进行转化。
[0083] 潮霉素磷酸转移酶(指定为hpt、hph或aphIV)基因最初衍生自大肠杆菌。该基因编码潮霉素磷酸转移酶(HPT)，其使氨基环多醇抗生素潮霉素B解毒。大量植物已用hpt基因转化，并且潮霉素B已证明在广泛范围的植物包括单子叶植物的选择中非常有效。大多数植物，例如谷类植物，显示出对潮霉素B比卡那霉素更高的敏感性。同样地，hpt基因广泛用于选择经转化的哺乳动物细胞。hpt基因的序列已就其中植物转化中的使用进行修饰。接近于该酶的羧基(C)末端的氨基酸残基的缺失和替换已提高在某些植物例如烟草中的抗性水平。同时，该酶的亲水C末端已得到维持，并且对于HPT的强活性可以是必需的。HPT活性已使用酶促测定法进行检查。非破坏性愈伤组织诱导测试可用于验证潮霉素抗性。
[0084] 涉及植物生长和发育的基因已在植物中得到鉴定。涉及细胞分裂素生物合成的一种此类基因是异戊烯基转移酶(IPT)。细胞分裂素通过刺激细胞分裂和细胞分化在植物生长和发育中起关键作用(Sun等人(2003)，Plant Physiol.131：167-176)。
[0085] 钙依赖性蛋白质激酶(CDPK)，主要在植物界中发现的丝氨酸-苏氨酸激酶家族，可能充当钙介导的信号传导途径中的传感器分子。钙离子是在植物生长和发育期间重要的第二信使(Harper等人Science 252，951-954(1993)；Roberts等人Curr Opin Cell Biol5，242-246(1993)；Roberts等人Annu Rev Plant Mol Biol 43，375-414(1992))。
[0086] 线虫应答蛋白质(NRP)在感染大豆孢囊线虫后由大豆产生。NRP与味道修饰糖蛋白奇异果素以及涉及肿瘤形成和过度应答诱导的NF34蛋白质具有同源性。NRP被认为充当响应线虫感染的防御诱导剂(Tenhaken等人BMC Bioinformatics 6：169(2005))。
[0087] 种子和谷粒的质量在性状例如饱和以及不饱和的脂肪酸或油水平和类型、必需氨基酸的质与量以及碳水化合物的水平中反映。因此，商业性状还可在一种或多种基因上编码，所述基因可提高例如甲硫氨酸和半胱氨酸，以少量存在于大豆中的两种含硫氨基酸。胱硫醚γ合酶(CGS)和丝氨酸乙酰基转移酶(SAT)是分别涉及甲硫氨酸和半胱氨酸合成的蛋白质。
[0088] 其他商业性状可编码提高油种子中的例如单不饱和脂肪酸例如油酸的基因。大豆油例如含有高水平的多不饱和脂肪酸，并且比具有更高水平的单不饱和以及饱和脂肪酸的油更易于氧化。高油酸大豆种子可通过油酰基12-去饱和酶(Fad2)活性的重组操纵进行制备。高油酸大豆油可用于需要高度氧化稳定性的应用中，例如在高温下的长时间段烹饪。
[0089] 棉子糖在许多商业上有意义的作物物种的可食用部分中以显著数量累积，所述作物物种例如大豆(栽培大豆(Glycine maxL.Merrill))、甜菜(甜菜(Beta vulgaris))、棉花(陆地棉(Gossypium hirsutum L.))、低芥酸菜子(芸苔属物种(Brassica sp.))以及所有主要可食用豆类作物，包括豆类(菜豆属物种(Phaseolus sp.))、鹰嘴豆(鹰嘴豆(Cicer arietinum))、豇豆(豇豆(Vigna unguiculata))、绿豆(绿豆(Vigna radiata))、豌豆(豌豆(Pisum sativum))、小扁豆(兵豆(Lens culinaris))和羽扇豆(羽扇豆属物种(Lupinus sp.))。尽管在许多物种中丰富，但棉子糖是一些经济上重要的作物物种的有效利用的障碍。
[0090] 涉及棉子糖合成的酶例如肌醇半乳糖苷合成酶表达的下调将是期望性状。
[0091] 在某些实施例中，本发明考虑具有超过一种有利的转基因的受体细胞的转化。两种或更多种转基因可在单一转化事件中提供，使用不同的转基因编码载体，或掺入两种或更多种基因编码序列的单一载体。根据需要可采用任何描述的任何两种或更多种转基因，例如赋予除草剂、昆虫、疾病(病毒、细菌、真菌和线虫)或干旱抗性、油量与质的转基因，或提高产量或营养素质量的转基因。
[0092] 术语“花药”或“花药组织”指包含细胞、细胞层和细胞类型的雄性植物组织，所述细胞、细胞层和细胞类型产生能够实现受精的花粉粒。这些细胞包括但不限于孢子细胞、花粉母细胞、性母细胞、小孢子、绒毡层、支持细胞层、花粉和衍生自这些细胞类型的细胞。
[0093] “分离的核酸片段”指核糖核苷酸(RNA)或脱氧核糖核苷酸(DNA)的聚合物，它是单链或双链的，任选包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA形式的分离的核酸片段可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个区段组成。
[0094] 术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸序列”和“核酸片段”/“分离的核酸片段”在本文中可互换使用。这些术语涵盖核苷酸序及类似的范围。多核苷酸可以是RNA或DNA的聚合物，它们可以是单链或双链，任选地包含合成的、非天然的或改性的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的多核苷酸可由cDNA、基因组DNA、合成DNA或它们的混合物的一个或多个片段构成。核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)可以用如下的单字母名称指代：
“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任意核苷酸。
“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任意核苷酸。
[0095] “异源核酸片段”指对于本发明的植物启动子序列并非天然存在的序列。虽然该核苷酸序列对于启动子序列是异源的，但它对于植物宿主可以是同源的、或天然的或异源的。然而，已经认识到本发明的启动子可与其天然编码序列一起使用，以提高或降低表达，导致经转化的种子中的表型变化。
[0096] 术语“其为功能上等价的片段(或变体)”和“功能上等价的片段(或变体)”在本文中可互换使用。这些术语指本发明的启动子序列的一部分或子序列或变体，其中起始转录或驱动基因表达(例如产生某一表型)的能力被保留。片段和变体可经由例如定点诱变和合成构建的方法获得。与提供本文描述的启动子序列一样，考虑的片段和变体作用于促进可操作地连接的异源核酸序列的诱导性表达，形成重组DNA构建体(以及嵌合基因)。例如，该片段或变体可用于设计重组DNA构建体，以在经转化的植物中产生所需表型。通过在相对于异源核苷酸序列的适当定向中连接启动子片段或其变体，重组DNA构建体可设计用于共抑制或反义。
[0097] 调控序列的功能片段可通过来自更大序列的一个或多个缺失形成。例如，启动子直到转录起始位点附近的TATA盒的5′部分可缺失，而不取消启动子活性，如通过Opsahl-Sorteberg，H-G.等人，“Identification of a 49-bp fragment of the HvLTP2 promoter directing aleruone cell specific expression”Gene 341：49-58(2004)描述的。此类变体应保留启动子活性。活性可通过RNA印迹分析、报道基因活性测量(当使用转录融合物时)等等进行测量。参见例如以引用的方式并入本文的Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)。
[0098] 与本发明的调控序列杂交的序列在本发明的范围内。对应于本发明的启动子序列并与本文公开的启动子序列杂交的序列将与所公开序列至少40％同源，50％同源，70％同源，并且甚至85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同源。
[0099] 更小的片段也可保留启动子的调控特性，因此鉴定和缺失分析是鉴定必需区的一种方法。缺失分析可从调控区的5’和3’端两者发生。片段可通过定点诱变、使用聚合酶链反应的诱变等等来获得。(参见，Directed Mutagenesis：A Practical Approach IRL Press(1991))。
[0100] 在本发明的一些方面，启动子片段可包含SEQ ID NO：8的至少约20个邻接核苷酸，或至少约50个邻接核苷酸，或至少约75个邻接核苷酸，或至少约100、150、200、250、300、350、400、450、500个邻接核苷酸，或直到本文公开的全长核苷酸序列中存在的核苷酸数目(例如1746个，SEQ ID NO：10)。
[0101] 在另一个方面，启动子片段是SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10中所示的核苷酸序列。此类片段的核苷酸通常包含特定启动子序列的TATA识别序列。此类片段可通过使用限制性酶切割本文公开的天然存在的启动子核苷酸序列，通过由天然存在的启动子DNA序列合成核苷酸序列而获得，或可通过使用PCR技术而获得。特别参见Mullis等人，Methods Enzymol.155：335-350(1987)和Higuchi，R.于PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplifications；Erlich，H.A.编辑；Stockton Press Inc.：New York，1989。
[0102] 本发明的分离的启动子序列可进行修饰，以提供一系列异源核苷酸序列的诱导性表达水平。因此，可利用小于整个启动子区，并且保留驱动编码序列表达的能力。如实例1-3中所述，当通过化学品或胁迫处理诱导时，1.0kb ZmCAS1启动子片段以及更长的1.7kb ZmCAS1启动子片段能够驱动基因表达。
[0103] 本发明的分离的启动子序列的修饰可提供一系列异源核苷酸序列的诱导性表达。因此，它们可修饰为弱诱导型启动子或强诱导型启动子。一般地，“弱启动子”意指驱动编码序列以低水平表达的启动子。“低水平”意指约1/10,000转录物至约1/100,000转录物至约1/500,000转录物的水平。相反，强启动子驱动编码序列以高水平，或以约1/10转录物至约1/100转录物至约1/1,000转录物表达。
[0104] 如本文所用的术语“基本上相似的”和“基本上对应的”指其中一个或多个核苷酸碱基的变化不影响核酸片段介导基因表达或产生某一表型的能力的核酸片段。这些术语也是指本发明的核酸片段的修饰(例如缺失或插入一个或多个核苷酸)，相对于初始的未经修饰的核酸片段，该修饰基本上不会改变所得核酸片段的功能特性。因此，正如本领域的技术人员应当理解的，本发明涵盖的不仅仅是具体的示例性序列。
[0105] 此外，技术人员认识到，本发明所涵盖的基本上类似的核酸序列也通过它们在中等严格条件(例如0.5X SSC，0.1％SDS，60℃)下与本文例示的序列杂交，或与本文报告并在功能上等价于本发明的启动子的核苷酸序列的任何部分杂交的能力限定。此类同源性的估计通过在严格条件下的DNA-DNA或DNA-RNA杂交提供，所述严格条件如本领域技术人员充分理解的(Hames和Higgins，编辑；于Nucleic Acid Hybridisation；IRL Press：Oxford，U.K.，1985)。可以调节严格性条件以筛选中度相似的片段例如来自远缘生物的同源序列，到筛选高度相似的片段例如从近缘生物复制功能性酶的基因。杂交后洗涤部分决定严格条件。一组条件使用一系列洗涤，开始是6X SSC、0.5％SDS在室温下15分钟，然后用2X SSC、0.5％SDS在45℃下重复30分钟，再用0.2X SSC、0.5％SDS在50℃下重复两次，每次30分钟。另一组严格条件使用更高的温度，其中洗涤等同于上文的那些，除了在0.2X SSC、0.5％SDS中的最后两次30分钟洗涤的温度增至60℃之外。另一组高度严格条件使用在0.1X SSC、0.1％SDS中在65℃下的两次最终洗涤。
[0106] 一般而言，对应于本发明的核苷酸序列并与本文公开的核苷酸序列杂交的序列将与所公开序列至少40％同源，50％同源，70％同源，并且甚至85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同源。即，在探针和靶之间的序列相似性可改变(range)，共享至少约40％、约50％、约70％以及甚至约85％或更多序列相似性。
[0107] 由本发明所涵盖的优选的基本上类似的核酸序列是80％等同于本文报告的核酸片段或80％等同于本文报告的核苷酸序列的任何部分的那些序列。更优选的是90％等同于本文报告的核酸序列或90％等同于本文报告的核苷酸序列的任何部分的核酸片段。最优选的是95％等同于本文报告的核酸序列或95％等同于本文报告的核苷酸序列的任何部分的核酸片段。本领域技术人员充分理解许多序列同一性水平可用于鉴定相关多核苷酸序列。有用的百分比同一性的例子是上文列出的那些，还优选的是从80％到100％的任何整数百分比，例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98和99％。
[0108] “基本上同源的序列”指所公开序列的变体，例如得自定点诱变的变体以及合成衍生的序列。本发明的基本上同源的序列还指本文公开的特定启动子核苷酸序列的那些片段，其操作为促进可操作地连接的异源核酸片段的诱导性表达。这些启动子片段将包含本文公开的特定启动子核苷酸序列的至少约20个邻接核苷酸，优选至少约50个邻接核苷酸，更优选至少约75个邻接核苷酸，甚至更优选至少约100个邻接核苷酸。此类片段的核苷酸通常包含特定启动子序列的TATA识别序列。此类片段可通过使用限制性酶切割本文公开的天然存在的启动子核苷酸序列；通过由天然存在的启动子DNA序列合成核苷酸序列而获得；或通过使用PCR技术而获得。特别参见Mullis等人，Methods Enzymol.155：335-350(1987)和Higuchi，R.于PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplifications；Erlich，H.A.编辑；Stockton Press Inc.：New York，1989。再次，这些启动子片段的变体，例如得自定点诱变的变体，由本发明的组合物涵盖。
[0109] “密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的趋异度。因此，本发明涉及包含核苷酸序列的任何核酸片段，所述核苷酸序列编码本文所示的氨基酸序列的全部或主要部分。技术人员非常了解特定宿主细胞在使用核苷酸密码子来确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏好性”。因此，当合成核酸片段用于宿主细胞中的改善表达时，期望设计该核酸片段，使得其密码子使用频率接近宿主细胞的优选密码子使用频率。
[0110] 可使用LASARGENE生物信息学计算套件(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的Megalign程序，或使用Vector NTI生物信息学计算套件(Invitrogen)的AlignX程序，来测定序列比对和相似性百分比计算。用带默认参数(GAP PENALTY＝10，GAP LENGTH PENALTY＝10)的Clustal比对方法(Higgins和Sharp，CABIOS 5：151-153(1989))进行序列的多重比对。用Clustal方法进行成对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE＝1、GAP PENALTY＝3、WINDOW＝5和DIAGONALS SAVED＝5。关于核酸，这些参数为GAP PENALTY＝10，GAP LENGTH PENALTY＝10，KTUPLE＝2，GAP PENALTY＝5，WINDOW＝4，和DIAGONALS SAVED＝4。氨基酸或核苷酸序列的“主要部分”包含足够的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列以提供该多肽或基因的推定鉴定，所述推定鉴定通过本领域技术人员的序列人工评估，或通过使用算法例如BLAST(Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1993))和Gapped Blast(Altschul，S.F.等人，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997))的计算机自动化的序列比较和鉴定。BLASTN指针对核苷酸序列数据库比较核苷酸查询序列的BLAST程序。
[0111] “基因”指表达特定蛋白质的核酸片段，其包括编码序列前的调控序列(5′非编码序列)和编码序列后的调控序列(3′非编码序列)。“天然基因”指自然状态下与其自身的调控序列一起的基因。可互换使用的“嵌合基因”或“重组表达构建体”指并非天然基因的任何基因，包含在自然界中未发现在一起的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或源自相同来源、但排列方式与天然存在的排列方式不同的调控序列和编码序列。“内源性基因”指在生物体基因组中处于其天然位置的天然基因。“外来基因”是指正常情况下不存在于宿主生物中的基因，它通过基因转移导入宿主生物内。外来基因可以包含插入到非天然生物体内的天然基因或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法导入基因组内的基因。
[0112] “编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“调控序列”指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。
[0113] “5′非编码序列”指位于编码序列上游的DNA序列，所述DNA序列影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。
[0114] “内含子”是基因中的间插序列，其被转录成RNA，但随后在生成成熟mRNA的过程中被切除。该术语也用于切除的RNA序列。“外显子”是被转录的基因序列的一部分，并且存在于得自该基因的成熟信使RNA中，但是不是编码最终基因产物的序列的必需部分。
[0115] 术语“组成型启动子”指在所有或大部分发育阶段在所有或大多数组织中活性的启动子。与分类为“组成型”的其他启动子(例如泛素)一样，绝对表达水平中的一些变化可存在于不同组织或阶段中。
[0116] 术语“组成型启动子”或“组织不依赖性启动子”在本文中可互换使用。
[0117] 术语“组织特异性启动子”指已显示仅在特定类型的细胞或组织中以更高水平指导RNA合成的启动子，并且如果启动子在某些组织中优选指导RNA合成，但在其他组织在也以减少水平指导RNA合成，则通常被称为“组织特异性启动子”或“组织优选的启动子”。
[0118] 在最常用的启动子中有胭脂碱合酶(NOS)启动子(Ebert等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：5745-5749(1987))，章鱼碱合酶(OCS)启动子，花椰菜花叶病毒属启动子例如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton等人，Plant Mol.Biol.9：315-324(1987))，CaMV 35S启动子(Odell等人，Nature 313：810-812(1985))，和玄参花叶病毒35S启动子(Sanger等人，Plant Mol.Biol.14：433-43(1990))，来自核酮糖二磷酸羟化酶小亚基的光诱导型启动子，Adh启动子(Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：6624-66280(1987)，蔗糖合酶启动子(Yang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：4144-4148(1990))，R基因复合体启动子(Chandler等人，Plant Cell 1：
1175-1183(1989))，叶绿素a/b结合蛋白基因启动子等。其他常用启动子是用于马铃薯块茎ADPGPP基因的启动子，蔗糖合酶启动子，颗粒结合淀粉合酶启动子，谷蛋白基因启动子，玉米蜡质启动子，Brittle基因启动子和Shrunken 2启动子，酸性壳多糖酶基因启动子和玉米醇溶蛋白基因启动子(15kD、16kD、19kD、22kD和27kD；Perdersen等人，Cell 29：
1015-1026(1982))。更多的启动子在于2000年4月6日公布的PCT公布WO 00/18963中描述，所述PCT公布的公开内容在此以引用方式并入。
1175-1183(1989))，叶绿素a/b结合蛋白基因启动子等。其他常用启动子是用于马铃薯块茎ADPGPP基因的启动子，蔗糖合酶启动子，颗粒结合淀粉合酶启动子，谷蛋白基因启动子，玉米蜡质启动子，Brittle基因启动子和Shrunken 2启动子，酸性壳多糖酶基因启动子和玉米醇溶蛋白基因启动子(15kD、16kD、19kD、22kD和27kD；Perdersen等人，Cell 29：
1015-1026(1982))。更多的启动子在于2000年4月6日公布的PCT公布WO 00/18963中描述，所述PCT公布的公开内容在此以引用方式并入。
[0119] “翻译前导序列”指位于基因的启动子序列和编码序列之间的DNA序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列的经充分加工后的mRNA上游。翻译前导序列可影响mRNA的初级转录过程、mRNA稳定性或翻译效率。翻译前导序列的例子已得到描述(Turner，R.和Foster，G.D.，Molecular Biotechnology 3：225(1995))。
[0120] “3′非编码序列”指位于编码序列下游的DNA序列，并且包括多腺苷酸化识别序列和其他编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的序列。多腺苷酸化信号通常表征为影响多腺苷酸片添加到mRNA前体的3′端。不同3’非编码序列的用途通过Ingelbrecht等人Plant Cell 1：671-680(1989)例示。
[0121] “RNA转录物”指得自RNA聚合酶催化的DNA序列转录的产物。当RNA转录物是DNA序列的完全互补的拷贝时，它被称为初级转录物，或它可以是衍生自初级转录物的转录后加工的RNA序列并被称为成熟RNA。“信使RNA”(“mRNA”)指无内含子并且可通过细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”指与mRNA模板互补并且利用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是单链的或通过使用DNA聚合成酶I的Klenow片段转换成双链的。“有义”RNA指包括mRNA并因此可在细胞内或体外翻译成蛋白质的RNA转录物。“反义RNA”指与靶初级转录物或mRNA的全部或一部分互补，并阻断靶基因表达或转录物累积的RNA转录物(美国专利5,107,065)。反义RNA可与特定基因转录物的任何部分，即5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或编码序列互补。“功能RNA”指反义RNA、核酶RNA或其他不能翻译但是对细胞过程有影响作用的RNA。
[0122] 术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的关联，以使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以按有义或反义的方向可操作地连接至调控序列。
[0123] 如本文所用的，术语“表达”指功能终末产物例如mRNA或蛋白质(前体或成熟的)的生产。
[0124] 如本文所用，术语“表达盒”指可将核酸序列或片段导入其中的不连续的核酸片段。
[0125] 基因的表达或过表达涉及基因转录和mRNA翻译成前体或成熟蛋白质。“反义抑制”指产生能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录物。“超表达”指在转基因生物中产生的基因产物超出在正常生物或未转化生物中产生的基因产物的水平。“共抑制”指能抑制相同的或基本上类似的外源或内源基因表达或转录物累积的有义RNA转录本的产生(美国专利5,231,020)。共抑制的机制可处于DNA水平(例如DNA甲基化)，转录水平，或转录后水平。
[0126] 以前已通过集中于超表达与内源mRNA具有同源性的核酸序列设计了植物中的共抑制构建体，它导致所有与超表达序列具有同源性的RNA减少(参见Vaucheret等人，Plant J.16：651-659(1998)；以及Gura，Nature 404：804-808(2000))。该现象的总体效率较低，并且RNA减少的程度变化较大。近期工作已描述了“发夹”结构的使用，该结构以互补方向掺入mRNA编码序列的全部或一部分，导致用于表达的RNA的潜在“茎-环”结构(于1999年10月21日公布的PCT公布WO 99/53050；和于2002年1月3日公布的PCT公布
WO 02/00904)。这在获得的转基因植物中提高了共抑制的频率。另一种变化描述了使用植物病毒序列指导近端mRNA编码序列的抑制或“沉默”(于1998年8月20日公布的PCT公布WO 98/36083)。遗传学和分子证据已获得，提示dsRNA介导的mRNA切割可能已成为在这些基因沉默现象下的保守机制(Elmayan等人，Plant Cell 10：1747-1757(1998)；Galun，In Vitro Cell.Dev.Biol.Plant 41(2)：113-123(2005)；Pickford等人，Cell.Mol.Life Sci.60(5)：871-882(2003))。
WO 02/00904)。这在获得的转基因植物中提高了共抑制的频率。另一种变化描述了使用植物病毒序列指导近端mRNA编码序列的抑制或“沉默”(于1998年8月20日公布的PCT公布WO 98/36083)。遗传学和分子证据已获得，提示dsRNA介导的mRNA切割可能已成为在这些基因沉默现象下的保守机制(Elmayan等人，Plant Cell 10：1747-1757(1998)；Galun，In Vitro Cell.Dev.Biol.Plant 41(2)：113-123(2005)；Pickford等人，Cell.Mol.Life Sci.60(5)：871-882(2003))。
[0127] 如本文所述，“抑制”指在与具有天然酶或蛋白质的非转基因或野生型植物中可检测的酶活性或蛋白质功能性水平进行比较时，在转基因植物中可检测的酶活性或蛋白质功能性(例如与蛋白质相关的表型)水平的减少。具有天然酶的植物中的酶活性水平在本文中被称为“野生型”活性。具有天然蛋白质的植物中的蛋白质功能性水平在本文中被称为“野生型”功能性。术语“抑制”包括减低、减少、下调、降低、抑制、消除和阻止。该减少可能是由于天然mRNA翻译成活性酶或功能蛋白质中的降低。也可能是由于天然DNA转录成mRNA的量降低和/或天然mRNA的降解加快。术语“天然酶”指在非转基因或野生型细胞中天然产生的酶。术语“非转基因”和“野生型”在本文中可互换使用。
[0128] “改变表达”指在转基因生物体中产生的基因产物的量或比例显著不同于通过相应的野生型生物体产生的基因产物的量(即表达是提高的或降低的)。
[0129] “转化”指将核酸片段转入宿主生物的基因组中，导致基因稳定遗传。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”生物体。优选的大豆细胞转化方法是使用粒子加速的或“基因枪”转化技术(Klein，T.，Nature(London)327：70-73(1987)；美国专利4,945,050)。
[0130] “瞬时表达”指通常报道基因例如β-葡糖苷酸酶(GUS)，荧光蛋白质基因GFP、ZS-YELLOW1N1、AM-CYAN1、DS-RED在宿主生物体的所选某些细胞类型中的瞬时表达，其中转基因基因通过转化方法瞬时导入。在瞬时基因表达测定法后，随后弃去宿主生物体的经转化的材料。
[0131] 本文所用的标准的重组DNA和分子克隆技术为本领域所熟知，并且Sambrook，J.等人 于Molecular Cloning：A Laboratory Manual；第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，New York，1989(下文“Sambrook等人，1989”)或Ausubel，F.M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.和Struhl，K.编辑；于Current Protocols in Molecular Biology；John Wiley and Sons：New York，1990(下文“Ausubel等人，1990”)中更全面地描述。
[0132] “PCR”或“聚合酶链反应”是用于合成大量的特定DNA区段的技术，由一系列重复循环组成(Perkin Elmer Cetus Instruments，Norwalk，CT)。典型地，双链DNA被热变性，两种与目标片段的3′端区域互补的引物在较低温度下与之退火，然后在中间温度下得到延伸。这三个连续步骤中的一组包含一个循环。
[0133] 术语“重组多核苷酸”、“重组核苷酸”、“重组DNA”、“重组DNA构建体”和“重组表达构建体”在本文中可互换使用。重组DNA构建体包含人工的或异源的核酸序列组合，例如在自然界中未发现在一起的调控序列和编码序列。例如，重组DNA构建体可包含质粒载体或其片段，所述质粒载体包含本发明的诱导型启动子和异源目的多核苷酸。在其他实施例中，重组构建体可包含衍生自玉米、稻、高粱或不同来源的调控序列和编码序列，或衍生自相同来源但以不同于自然界中发现的方式排列的调控序列和编码序列。此类构建体可独自使用或与载体组合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于用以转化宿主细胞的方法，该宿主细胞是本领域的技术人员所熟知的。例如可以使用质粒载体。技术人员充分了解为了成功转化、选择和繁殖包含本文提供的任何分离的核酸片段的宿主细胞，必须存在于载体上的遗传元件。技术人员也应认识到不同的独立转化事件将导致不同水平和模式的表达(Jones等人，EMBO J.4：2411-2418(1985)；De Almeida等人，Mol.Gen.Genetics 218：78-86(1989))，并且因此必须筛选多个事件以便获得展示所需表达水平和模式的品系。这种筛选可通过DNA的Southern印迹分析、mRNA表达的Northern印迹分析、蛋白表达的免疫印迹分析或表型分析等完成。
[0134] 本文证实玉米甘露醇脱氢酶基因启动子ZmCAS1事实上可用作诱导型启动子，以驱动转基因的有效表达，并且此类启动子可通过本领域技术人员分离并使用。诱导的GUS和MS45表达已在库组织(sink tissue)例如花药、愈伤组织、根和幼苗的芽以及发育中的叶中观察到(实例1-3)。
[0135] 甘露醇代谢在针对生命和无生命胁迫两者的植物应答中起重要作用。(Stoop等人2001，Trends in Plant Science，第1卷，Issue 5，1996年5月，第139-144页)。暴露于高盐度的芹菜植物显示主要通过库组织中的甘露醇脱氢酶活性降低引起的甘露醇累积提高(Stoop和Pharr.1993Plant Physiol.103：1001-1008)。如图1B所示，ZmCAS1cDNA(SEQ ID NO：5)显示与玉米甘露醇脱氢酶(GI：226528549；SEQ ID NO：6)的高同一性％，图1(B)。
连同我们的下列观察：ZmCAS1启动子可通过化学品例如安全剂或胁迫例如热处理进行诱导，还可测试ZmCAS1启动子响应胁迫例如但不限于干旱、渗透或盐胁迫或其组合的能力。
连同我们的下列观察：ZmCAS1启动子可通过化学品例如安全剂或胁迫例如热处理进行诱导，还可测试ZmCAS1启动子响应胁迫例如但不限于干旱、渗透或盐胁迫或其组合的能力。
[0136] 由本文阐述的本公开明确的是，本领域普通技术人员可进行下列操作：
[0137] 1)使含有ZMCAS1启动子序列的核酸片段与合适的报道基因可操作地连接；存在本领域技术人员众所周知的多种报道基因，包括细菌GUS基因，萤火虫萤光素酶基因以及青色、绿色、红色和黄色荧光蛋白基因；对于其可获得容易可靠测定法的任何基因可充当报道基因。
[0138] 2)将嵌合ZmCAS1启动子：报道基因表达盒转化到适当植物内用于启动子的表达。存在本领域技术人员众所周知的可用作转化的宿主的多种适当植物，包括双子叶植物：拟南芥属、烟草、大豆、油料种子、花生、向日葵、红花、棉花、番茄、马铃薯、可可以及单子叶植物：玉米、小麦、稻、大麦和棕榈。
[0139] 3)通过测定报道基因产物的表达，来测试ZmCAS1启动子在多种转基因植物组织的细胞类型例如叶、根、花、种子中的表达，所述转基因植物组织用嵌合ZmCAS1启动子：报道基因表达盒转化。
[0140] 在另一个方面，本发明涉及重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至本发明的任何启动子或启动子元件的组合的至少一种异源核酸片段。重组DNA构建体可通过将本发明启动子的核酸片段或片段与异源核酸片段可操作地连接，所述片段基本上类似于并在功能上等价于SEQ ID NO：9或10中所示的核苷酸序列的任何部分。任何异源核酸片段可用于实践本发明。选择取决于待实现的所需应用或表型。可操纵多种核酸序列，以便提供以适当定向的核酸序列。认为如本文所述的启动子元件的多种组合可用于实践本发明。
[0141] 在另一个方面，本发明涉及重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至本发明的ZmCAS1启动子或启动子元件的组合的至少一种乙酰乳酸合酶(ALS)核酸片段。乙酰乳酸合酶基因涉及植物中支链氨基酸的生物合成，并且是几种除草剂包括磺酰脲的作用部位。编码可不再结合除草剂的蛋白质的突变的乙酰乳酸合酶基因的表达允许转基因植物对除草剂抗性(美国专利5,605,011、美国专利5,378,824)。突变的乙酰乳酸合酶基因也广泛应用植物转化中，以选择转基因植物。
[0142] 在另一个实施例中，本发明涉及宿主细胞，所述宿主细胞包含如本文所述的本发明的重组DNA构建体或如本文所述的本发明的分离多核苷酸。能用于实施本发明的宿主细胞的例子包括但不限于酵母、细菌、和植物。
[0143] 可构建包含本发明的重组表达构建体的质粒载体。质粒载体的选择取决于将用于转化宿主细胞的方法。技术人员熟知为了成功地转化、筛选和繁殖包含嵌合基因的宿主细胞，必须存在于质粒载体上的遗传元件。
[0144] 转化/转染方法对于本发明不是关键的；多种转化或转染方法是目前可获得的。随着更新的方法可由于转化作物或其他宿主细胞，它们可直接应用。因此，广泛多样的方法已开发用于将DNA序列插入宿主细胞的基因组内，以获得序列的转录或转录物和翻译，以实现生物体中的表型变化。因此，可采用提供用于有效转化/转染的任何方法。
[0145] 用于将表达载体导入对于本领域技术人员可获得的植物组织内的方法是不同的，并且将取决于所选植物。用于转化广泛多样的植物物种的操作是众所周知的并且在文献自始至终描述。参见例如，Miki等人，“Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants”于Methods in Plant Molecular Biotechnology，同上；Klein等人，Bio/Technology 10：268(1992)；和Weising等 人，Ann.Rev.Genet.22：421-477(1988)。 例如，可使用例如下列技术将DNA构建体导入植物细胞的基因组DNA内：微粒介导的递送(Klein等人，Nature 327：70-73(1987))；电穿孔(Fromm等人，Proc.Natl.Acad.Sci.82：5824(1985))；聚乙二醇(PEG)沉淀(Paszkowski等人，EMBO J.3：2717-2722(1984))；直接基因转移(WO 85/01856和EP No.0275069)；体外原生质体转化(美国专利4,684,611)；
和植物细胞原生质体或胚性愈伤组织的显微注射(Crossway，Mol.Gen.Genetics 202：
179-185(1985))。植物组织与根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的共培养是另一个选项，其中将DNA构建体置于二元载体系统内。参见例如美国专利5,591,616；
Ishida等人，“High Efficiency Transformation of Maize(Zea mays L.)mediated by Agrobacterium tumefaciens”Nature Biotechnology 14：745-750(1996)。当根癌土壤杆菌感染细胞时，根癌土壤杆菌宿主的毒性功能将指导该构建体插入植物细胞DNA内。参见例如Horsch等人，Science 233：496-498(1984)和Fraley等人，Proc.Natl.Acad.Sci.80：
4803(1983)。
和植物细胞原生质体或胚性愈伤组织的显微注射(Crossway，Mol.Gen.Genetics 202：
179-185(1985))。植物组织与根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的共培养是另一个选项，其中将DNA构建体置于二元载体系统内。参见例如美国专利5,591,616；
Ishida等人，“High Efficiency Transformation of Maize(Zea mays L.)mediated by Agrobacterium tumefaciens”Nature Biotechnology 14：745-750(1996)。当根癌土壤杆菌感染细胞时，根癌土壤杆菌宿主的毒性功能将指导该构建体插入植物细胞DNA内。参见例如Horsch等人，Science 233：496-498(1984)和Fraley等人，Proc.Natl.Acad.Sci.80：
4803(1983)。
[0146] 用于转化低芥酸 菜子的标准方法在Moloney等 人“High EfficiencyTransformation of Brassica napus using Agrobacterium Vectors”Plant Cell Reports
8：238-242(1989)中描述。玉米转化通过Fromm等人，Bio/Technology 8：833(1990)描述。土壤杆菌属(Agrobacterium)主要用于双子叶植物中，但某些单子叶植物例如玉米也可通过土壤杆菌属进行转化(美国专利5,550,318)。稻转化通过Hiei等人，“Efficient Transformation of Rice(Oryza sativa L.)Mediated by Agrobacterium and Sequence Analysis of the Boundaries of the T-DNA”The Plant Journal 6(2)：271-282(1994)，Christou等人，Trends in Biotechnology 10：239(1992)和Lee等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 88：6389(1991)。小麦可通过类似于用于转化玉米或稻的技术进行转化。高粱转化在Casas等人，同上以及通过Wan等人，PlantPhysiol.104：37(1994)描述。大豆转化在许多出版物包括美国专利5,015,580中描述。
8：238-242(1989)中描述。玉米转化通过Fromm等人，Bio/Technology 8：833(1990)描述。土壤杆菌属(Agrobacterium)主要用于双子叶植物中，但某些单子叶植物例如玉米也可通过土壤杆菌属进行转化(美国专利5,550,318)。稻转化通过Hiei等人，“Efficient Transformation of Rice(Oryza sativa L.)Mediated by Agrobacterium and Sequence Analysis of the Boundaries of the T-DNA”The Plant Journal 6(2)：271-282(1994)，Christou等人，Trends in Biotechnology 10：239(1992)和Lee等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 88：6389(1991)。小麦可通过类似于用于转化玉米或稻的技术进行转化。高粱转化在Casas等人，同上以及通过Wan等人，PlantPhysiol.104：37(1994)描述。大豆转化在许多出版物包括美国专利5,015,580中描述。
[0147] 当提及将核苷酸序列“导入”植物内时，它意指这可通过直接转化方法发生，例如植物组织的土壤杆菌转化、微粒轰击、电穿孔或本领域技术人员已知的许多方法中的任何一种；或者，它可通过使具有异源核苷酸序列的植物与另一种植物杂交，使得后代具有掺入其基因组内的核苷酸序列而发生。此类育种技术是本领域技术人员众所周知的。
[0148] 用于转化双子叶植物(主要通过使用根瘤土壤杆菌)并获得转基因植物的方法已得到公布，尤其用于棉花(美国专利5,004,863、美国专利5,159,135)；大豆(美国专利5,569,834，美国专利5,416,011)；芸苔属(美国专利5,463,174)；花生(Cheng等人，Plant Cell Rep.15：653-657(1996)，McKently等人，Plant Cell Rep.14：699-703(1995))；番木瓜(Ling等人，Bio/technology 9：752-758(1991))；以及豌豆(Grant等人，Plant Cell Rep.15：254-258(1995))。关于其他常用植物转化方法的综述，参见Newell，C.A.，Mol.Biotechnol.，16：53-65(2000)。这些转化方法之一使用发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)(Tepfler，M.和Casse-Delbart，F.Microbiol.Sci.，4：24-28(1987))。已公布了使用DNA直接递送的大豆转化，使用PEG融合(PCT公布WO 92/17598)、电穿孔(Chowrira等人，Mol.Biotechnol.，3：17-23(1995)；Christou等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：
3962-3966(1987))、显微注射或粒子轰击(McCabe等人，BiolTechnology 6：923(1988)；
Christou等人，Plant Physiol.87：671-674(1988))。
3962-3966(1987))、显微注射或粒子轰击(McCabe等人，BiolTechnology 6：923(1988)；
Christou等人，Plant Physiol.87：671-674(1988))。
[0149] 存在多种用于从植物组织再生植物的方法。再生的具体方法将取决于起始植物组织以及待再生的具体植物物种。从单植物原生质体转化体或从多种经转化的外植体再生、发育和培养植物是本领域所熟知的(Weissbach和Weissbach，编辑；于Methods for Plant Molecular Biology；Academic Press，Inc.：San Diego，CA，1988)。该再生和生长过程通常包括如下步骤：选择经转化的细胞，培养这些个体化的细胞通过胚发育的通常阶段或通过生根小植株阶段。转基因胚以及种子以类似的方式再生。随后将所得的转基因的生根小苗种植在诸如土壤之类的合适植物生长培养基中。优选地，将再生的植物进行自花授粉以产生纯合的转基因植物。或者，将得自再生植物的花粉与农学上重要的品系的产生种子的植物进行杂交。相反，将来自这些重要品系的植物的花粉用于给再生植物授粉。利用本领域技术人员所熟知的方法培育含有所需多肽的本发明的转基因植物。
[0150] 除以上所讨论的操作外，从业者熟悉标准资源材料，所述材料描述用于大分子(例如DNA分子、质粒等等)的构建、操纵和分离，重组DNA片段和重组表达构建体的生成以及克隆的筛选和分离的特定条件和操作(参见例如Sambrook，J.等人，于Molecular Cloning：A Laboratory Manual；第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，New York，1989；Maliga等人，于Methods in Plant Molecular Biology；Cold Spring Harbor Press，1995；Birren等人，于Genome Ahalysis：Detecting Genes，
1；Cold Spring Harbor：New York，1998；Birren等人，于Genome Analysis：Analyzing DNA，2；Cold Spring Harbor：New York，1998；Clark编辑，于Plant Molecular Biology：A Laboratory Manual；Springer：New York，1997)。
1；Cold Spring Harbor：New York，1998；Birren等人，于Genome Analysis：Analyzing DNA，2；Cold Spring Harbor：New York，1998；Clark编辑，于Plant Molecular Biology：A Laboratory Manual；Springer：New York，1997)。
[0151] 技术人员还将认识到，不同的独立转化事件将导致不同水平和模式的嵌合基因表达(Jones等人，EMBO J.4：2411-2418(1985)；DeAlmeida等人，Mol.Gen.Genetics 218：78-86(1989))。因此，必须筛选多重事件以便获得显示期望表达水平和模式的品系。此类筛选可通过mRNA表达的RNA分析、蛋白质表达的蛋白质分析或表型分析来完成。还关注的是得自展示所需基因表达概况的转化植物的种子。
[0152] 嵌合基因在大多数植物细胞中的诱导性表达使得当需要靶异源核酸片段的诱导性表达时，本发明的ZmCAS1启动子尤其有用。
[0153] 本发明的ZmCAS1启动子的另一个一般应用是构建嵌合基因，所述嵌合基因可用于减少植物细胞中的至少一种异源核酸片段的表达。为了实现这点，设计用于异源核酸片段的基因沉默的嵌合基因可通过将该片段与本发明的ZmCAS1启动子连接进行构建。(关于经由共抑制阻断植物基因表达的方法，参见美国专利5,231,020，以及于1999年10月21日公布的PCT公布WO 99/53050、于2002年1月3日公布的PCT公布WO 02/00904和于1998年8月20日公布的PCT公布WO 98/36083。)作为另外一种选择，设计为表达用于异源核酸片段的反义RNA的嵌合基因可通过将该片段以反向方向与本发明的ZmCAS1启动子连接进行构建。(关于经由反义RNA阻断植物基因表达的方法，参见美国专利5,107,065。)共抑制或反义嵌合基因可经由转化导入植物内。随后选择其中异源核酸片段的表达是降低或消除的转化体。
[0154] 本发明还涉及改变(提高或降低)植物细胞中的至少一种异源核酸片段表达的方法，所述方法包括：
[0155] (a)用本文描述的重组表达构建体转化植物细胞；
[0156] (b)通过对(a)的细胞的化学品或胁迫处理来诱导该诱导型启动子；
[0157] (c)由步骤(a)的经转化的植物细胞生长能繁殖的成熟植物；以及，
[0158] (d)选择含有经转化的植物细胞的植物，其中所述异源核酸片段的表达是提高的或降低的。
[0159] 转化和选择可使用本领域技术人员众所周知的方法包括但不限于本文描述的方法来实现。
[0160] 本文所公开的组合物和方法的非限制性例子如下：
[0161] 1.一种分离的多核苷酸，包含：
[0162] a)包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10中所示的序列的核苷酸序列或其全长互补序列；
[0163] b)包含SEQ ID NO：10的功能片段的核苷酸序列或其全长互补序列；
[0164] c)包含基于BLASTN比对方法，在与(a)或(b)的核苷酸序列进行比较时具有至少85％序列同一性的序列的核苷酸序列；
[0165] d)在65℃下0.1SSC、0.1％(w/v)SDS洗涤的高度严格条件下与SEQ ID NO：9杂交的核苷酸序列；
[0166] e)包含甘露醇脱氢酶的1.7kb 5′非编码序列的全部或片段的核苷酸序列；或，[0167] f)通过一个或多个核苷酸的替换、添加和/或缺失而获得的(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中指示的核苷酸序列之一的衍生物；并且，其中所述核苷酸序列是诱导型启动子。
[0168] 2.根据实施例1所述的分离的多核苷酸，其中基于BLASTN比对方法，c)的核苷酸序列在与SEQ ID NO：1中所示的序列进行比较时具有至少90％同一性。
[0169] 3.根据实施例1所述的分离的多核苷酸，其中基于BLASTN比对方法，c)的核苷酸序列在与SEQ ID NO：1中所示的序列进行比较时具有至少95％同一性。
[0170] 4.根据实施例1所述的分离的多核苷酸，其中基于BLASTN比对方法，c)的核苷酸序列在与SEQ ID NO：1中所示的序列进行比较时具有至少98％同一性。
[0171] 5.根据实施例1所述的分离的多核苷酸，其中所述诱导型启动子通过化学品或胁迫处理进行诱导。
[0172] 6.根据实施例1所述的分离的多核苷酸，其中所述诱导型启动子通过安全剂或热处理进行诱导。
[0173] 7.根据实施例6所述的分离的多核苷酸，其中所述安全剂是N-(氨基羰基)-2-氯苯磺酰胺。
[0174] 8.根据实施例6所述的分离的多核苷酸，其中所述热处理包括大于26℃的温度。
[0175] 9.一种重组DNA构建体，包含可操作地连接至少一种异源核酸序列的实施例1所述的分离的多核苷酸。
[0176] 10.根据实施例9所述的重组DNA构建体，其中所述异源核酸序列编码选自下列的基因：双链断裂诱导基因、重组酶基因、报道基因、选择标记、疾病抗性赋予基因、除草剂抗性赋予基因、昆虫抗性赋予基因；涉及碳水化合物代谢的基因、涉及脂肪酸代谢的基因、涉及氨基酸代谢的基因、涉及植物发育的基因、涉及植物生长调控的基因、涉及产量改善的基因、涉及干旱抗性的基因、涉及寒冷抗性的基因、涉及植物中的热和盐抗性的基因。
[0177] 11.根据实施例9所述的重组DNA构建体，其中所述异源核酸序列编码选自下列的蛋白质：双链断裂诱导蛋白质、重组酶蛋白质、报道蛋白质、选择标记、赋予疾病抗性的蛋白质、赋予除草剂抗性的蛋白质、赋予昆虫抗性的蛋白质；涉及碳水化合物代谢的蛋白质、涉及脂肪酸代谢的蛋白质、涉及氨基酸代谢的蛋白质、涉及植物发育的蛋白质、涉及植物生长调控的蛋白质、涉及产量改善的蛋白质、涉及干旱抗性的蛋白质、涉及寒冷抗性的蛋白质、涉及植物中的热抗性和盐抗性的蛋白质。
[0178] 12.一种载体，包含实施例9所述的重组DNA构建体。
[0179] 13.一种细胞，包含实施例9所述的重组DNA构建体。
[0180] 14.根据实施例13所述的细胞，其中所述细胞是植物细胞。
[0181] 15.根据实施例14所述的植物细胞，所述植物细胞具有稳定掺入其基因组内的实施例9所述的重组DNA构建体。
[0182] 16.一种转基因植物，所述转基因植物具有稳定掺入其基因组内的实施例9所述的重组DNA构建体。
[0183] 17.根据实施例16所述的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物。
[0184] 18.根据实施例17所述的转基因植物，其中所述单子叶植物选自：玉米、小麦、稻、大麦、高粱、粟、甘蔗和黑麦。
[0185] 19.根据实施例16所述的转基因植物，其中所述植物是双子叶植物。
[0186] 20.根据实施例19所述的转基因植物，其中所述双子叶植物选自：大豆、芸苔属物种、棉花、红花、烟草、苜蓿和向日葵。
[0187] 21.由实施例16的转基因植物产生的转基因种子。
[0188] 22.一种用重组表达构建体稳定转化的植物，所述重组表达构建体包含植物启动子和可操作地连接至所述启动子的异源核酸片段，其中所述启动子是诱导型启动子且能够控制所述异源核酸片段在植物细胞中的表达，并且进一步地，其中所述启动子包含SEQ ID NO：10的片段。
[0189] 23.一种在植物细胞中表达编码序列或功能RNA的方法，包括：
[0190] a)将实施例9所述的重组DNA构建体导入植物细胞内，其中所述至少一种异源序列包含编码序列或功能RNA；
[0191] b)使步骤a)的植物细胞生长；
[0192] c)通过对b)的植物细胞的化学品或胁迫处理来诱导所述诱导型启动子；以及，[0193] d)选择展示重组DNA构建体的编码序列或功能RNA表达的植物细胞。
[0194] 24.根据实施例23所述的方法，其中所述化学品是安全剂。
[0195] 25.根据实施例23所述的方法，其中所述胁迫处理是热处理。
[0196] 26.根据实施例23所述的方法，所述方法还包括使d)的植物细胞生长成植物。
[0197] 27.一种在花药细胞中表达编码序列或功能RNA的方法，所述方法
[0198] 包括：
[0199] a)将实施例9所述的重组DNA构建体导入植物细胞内，其中所述至少一种异源序列包含编码序列或功能RNA；
[0200] b)使步骤a)的植物细胞生长；
[0201] c)通过对b)的植物细胞的化学品或胁迫处理来诱导所述诱导型启动子；以及，[0202] d)鉴定展示重组DNA构建体的编码序列或功能RNA表达的花药细胞。
[0203] 28.根据实施例23或实施例27所述的方法，其中所述至少一种异源序列是瞬时表达的。
[0204] 29.根据实施例23或实施例27所述的方法，其中所述至少一种异源序列稳定掺入所述植物细胞中。
[0205] 30.一种用于改变植物中至少一种异源核酸片段的表达的方法，包括：
[0206] (a)用实施例9所述的重组表达构建体转化植物细胞；
[0207] (b)通过对(a)的细胞的化学品或胁迫处理来诱导所述诱导型启动子
[0208] (c)由步骤(a)的经转化的植物细胞生长能繁殖的成熟植物；以及，
[0209] (d)选择含有所述经转化的植物细胞的植物，其中所述异源核酸片段的表达是提高的或降低的。
[0210] 31.一种转基因改变可销售的植物性状的方法，包括：
[0211] a)将实施例9所述的重组DNA构建体导入植物内；
[0212] b)通过对(a)的植物的化学品或胁迫处理来诱导所述诱导型启动子；
[0213] c)使得自步骤b)的能繁殖的、成熟植物生长；以及
[0214] d)基于所述改变的可销售的性状，选择在至少一种植物组织中表达所述至少一种异源核苷酸序列的植物。
[0215] 32.根据实施例31所述的方法，其中所述可销售的性状选自：疾病抗性、除草剂抗性、昆虫抗性、碳水化合物代谢、脂肪酸代谢、氨基酸代谢、植物发育、植物生长调控、产量改善、干旱抗性、寒冷抗性、热抗性和盐抗性。
[0216] 33.一种分离的多核苷酸，包含：
[0217] a)包含SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：22的全部或功能片段的核苷酸序列；
[0218] b)包含核苷酸序列(a)的全长互补序列的核苷酸序列；或，
[0219] c)包含基于BLASTN比对方法，在与(a)或(b)的核苷酸序列进行比较时具有至少90％序列同一性的序列的核苷酸序列；并且，
[0220] 其中所述核苷酸序列是启动子。
[0221] 34.根据实施例33所述的分离的多核苷酸，其中所述启动子是诱导型启动子。
[0222] 实例
[0223] 本发明将在下列实例中进一步限定，其中除非另有说明，否则份数和百分比是以重量计并且度数是摄氏度。除非另有说明，否则本发明中列出的启动子、cDNA、衔接子和引物的序列全部采取5’至3’方向。分子生物学中的技术通常如下列中所述进行：Ausubel，F.M.等人，于Current Protocols in Molecular Biology；John Wiley and Sons：New York，1990或Sambrook，J.等人，于Molecular Cloning：A Laboratory Manual；第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，New York，1989(下 文“Sambrook等人，1989”)。应该理解，这些实例尽管说明了本发明的优选实施例，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实例，本领域的技术人员能够确定本发明的基本特征，并且在不脱离其实质和范围的情况下，能够对本发明做出多种变化和修改以使其适用于多种用法和条件。因此，除那些本文所示和所述的那些外，根据前文所述，本发明的多种修改形式对本领域的技术人员来说将是显而易见的。这些修改形式也旨在涵盖于所附权利要求书的范围内。
[0224] 本文阐述的每篇参考文献的公开内容均全文以引用的方式并入本文。
[0225] 实例1
[0226] 在小孢子和/或绒毡层中表达的安全剂诱导的cDNA的鉴定。
[0227] 用于鉴定安全剂诱导的cDNA的策略设计。
[0228] 不同于安全剂诱导的启动子ZmIN2-2，在植物中具有组织特异性的条件调控的启动子的分离(Hershey等人美国专利5,364,780，1994年11月15日)，将允许小孢子和/或绒毡层中的基因的条件调控。此前，已证实虽然在安全剂处理后，ZmIN2-2转录物表达在玉米中的愈伤组织、叶和花药组织中提高，但通过该启动子调控的基因在玉米绒毡层细胞中不表达(Cigan等人2001.Sex.Plant Reprod.14，135-142)。免疫定位研究证实通过ZmIN2-2调控的基因存在于除了绒毡层或小孢子之外的所有花药细胞类型中。迄今为止，未鉴定响应CBSU(氯苯磺酰胺)安全剂并在小孢子发生的四分体阶段在绒毡层细胞或小孢子中特异性表达的启动子。为了允许分离在小孢子或绒毡层中表达的安全剂诱导的候选启动子，设计利用由植物作出的两个基础观察的策略，所述植物用由玉米花药特异性启动子5126(5126：DAM；Unger等人，2001，Transgenic Res.10，409-422)表达的大肠杆菌(E.coli)去甲基化酶(DAMethylase)基因转化。首先，来自表达5126：DAM的雄性不育植物的四分体阶段花药的细胞学检查揭示在其他方面结构正常显示的花药中的异常小孢子和几乎去除的绒毡层细胞。其次，从5126：DAM不育花药中分离的mRNA的RNA分析指示两个绒毡层特异性转录物5126和MS45的丧失，而未预期为绒毡层特异性的转录物(玉米肌动蛋白)容易地检测到(Cigan等人2001.Sex.Plant Reprod.14，135-142)。因此，从5126：DAM不育植物中分离的花药应减少或可能完全缺乏绒毡层和/或小孢子特异性mRNA。
[0229] 此外，来自从野生型雄性能繁殖的CBSU处理的植物中分离的RNA与从雄性不育CBSU处理的5126：DAM植物中分离的RNA的ZmIN2-2转录物表达的比较显示，与MS45和5126绒毡层特异性mRNA形成对比，ZmIN2-2在从5126：DAM CBSU处理的植物中分离的花药RNA中不减少(Cigan等人2001.Sex.Plant Reprod.14，135-142)。
[0230] 使用不育植物设计了策略，所述不育植物减少或缺乏绒毡层和/或小孢子特异性mRNA。该策略涉及用CBSU处理玉米植物，并且比较来自这些处理的对照植物与处理的5126：DAM植物的花药mRNA转录物概况。此类策略的确导致mRNA的鉴定和分离，并且最终导致如下所述响应安全剂并且是小孢子或绒毡层表达的启动子的鉴定和分离。
[0231] 为此，差异RNA杂交用于富集通过安全剂或热处理提高的玉米花药或愈伤组织mRNA。随后，这些mRNA用作探针以从由CBSU处理的玉米植物制备的花药cDNA文库中分离cDNA。这些cDNA随后用于筛选从雄性能繁殖的和雄性不育的5126：DAM对照和安全剂处理的植物中分离的mRNA，作为如下所述鉴定通过CBSU或热处理诱导或和在绒毡层或小孢子中表达的转录物的方法。
[0232] 来自CBSU处理的野生型植物的玉米花药cDNA文库构建和安全剂诱导的cDNA的分离。
[0233] 野生型玉米植物生长至小孢子发育的减数分裂阶段。植物用30mg 2-CBSU进行浇水并允许发育至小孢子发育的四分孢子和早期空泡阶段。聚A+花药RNA从野生型对照和CBSU处理的植物中分离并贮存。由从CBSU处理的植物中分离的mRNA构建cDNA文库，排列在尼龙滤网上并贮存。遵循制造商的说明书，使用Clontech PCR-选择cDNA消减试剂盒(#K1804-1)生成cDNA消减文库，以富集CBSU特异性转录物。使用该方法，来自野生型植物的花药聚A+mRNA用于富集在来自CBSU处理的植物的花药聚A+mRNA中发现的转录物。将该cDNA消减文库亚克隆到pSPORT(BRL)载体内，将集落铺平板，挑选并测序。在测序的载体插入片段中，两种DNA序列以高比例存在，超过测序的插入片段的10％，并且被称为ZmCAS1c-1(477bp；SEQ ID NO：1)和ZmCAS1c-2(438bp；SEQ ID NO：2)(CBSU-S花药消减1)。ZmCAS1c-1和ZmCAS1c-2两者均与来自植物的甘露醇脱氢酶具有序列同一性。ZmCAS1c-1和ZmCAS1c-2 DNA片段用作杂交探针，以筛选滤网排列的上述cDNA CBSU-花药文库，以分离含有全长cDNA的杂交克隆。ZmCAS1c-1和ZmCAS1c-2两者均鉴定相同的cDNA克隆。一个cDNA克隆含有1354bp SalI-NotI插入片段(SEQ ID NO：3)，所述SalI-NotI插入片段进行测序并鉴定为1338bp全长cDNA克隆，称为ZmCAS1cDNA(SEQ ID NO：4)。ZmCAS1cDNA能够编码354氨基酸序列(SEQ ID NO：5)，与玉米甘露醇脱氢酶(GI编号226528549，NP_001147757.1，SEQ ID NO：6；图1)具有99.7％同一性。
[0234] 为了测定ZmCAS1cDNA是否1)通过CBSU处理在玉米花药中被诱导，和2)在来自CBSU处理的5126：DAM植物中的绒毡层和小孢子去除的玉米花药中减少或不存在，将477bp ZmCAS1c-1DNA片段(SEQ ID NO：1)以及来自ZmMS45、Zm5126、ZmActin和ZmUbiquitin的DNA片段(Cigan等人2001.Sex.Plant Reprod.14，135-142)用作针对从雄性能繁殖的(F)和雄性不育(S)、对照(-)或CBSU处理的(+)植物中分离的玉米花药mRNA的杂交探针。如图2所示，组成性表达的玉米肌动蛋白(ACTIN)和泛素(UBI)转录物容易地检测到，并且跨越所有花药RNA样品和处理不改变其稳态水平。MS45和5126转录物在来自雄性能繁殖的植物的花药RNA中容易地检测到，但在来自雄性不育植物的花药RNA中不存在(图2)，进一步支持这些RNA局限于玉米绒毡层的观察(Cigan等人2001.Sex.Plant Reprod.14，135-142)。
[0235] 来自对照雄性能繁殖的(-，F)和对照不育植物(-，S)的花药RNA不揭示可检测水平的IN2-2转录物，而强杂交信号在来自衍生自CBSU处理的对照雄性能繁殖的和雄性不育植物的花药的mRNA中检测到(图2)。相比之下，关于ZmCAS1的强杂交信号仅在来自衍生自雄性能繁殖的CBSU处理的植物(+，F)的花药的mRNA中揭示。在来自雄性不育的CBSU处理的植物(+，S)的花药的mRNA中观察到的减少的ZmCAS1信号指示该ZmCAS1转录物存在于花药的细胞层中。该观察指示ZmCAS1组织特异性表达不同于IN2-2表达，并且因此使得ZmCAS1启动子成为不同于在花药中以空间表达的IN2-2启动子的候选物。
[0236] 当ZmCAS1探针用于与由CBSU处理的玉米愈伤组织或玉米叶杂交时，强杂交在来自愈伤组织、叶和花药的mRNA中观察到(图3)，类似于IN2-2探针，提示除在花药中的表达外，ZmCAS1转录物也响应安全剂CBSU处理在愈伤组织和叶中表达。
[0237] 1.7kb和截短的1.0kb ZmCAS1启动子片段的分离
[0238] 为了分离对应于ZmCAS1启动子的DNA序列，使用477bp ZmCAS1c-1DNA片段(SEQ ID NO：1)作为杂交探针，筛选来自玉米品系B73的亚基因组SauIIIA基因组噬菌体文库。分离含有4069bp玉米B73DNA片段(SEQ ID NO：7)并与ZmCAS1c-1探针杂交的噬菌体，切除质粒并测序。该4069bp基因组DNA的DNA序列分析鉴定了与ZmCAS1C cDNA具有序列同一性的几个区域。对于启动子研究，寡核苷酸指导的诱变用于在SEQ ID NO：7中的核苷酸位置3447-3452处导入RcaI DNA限制位点，根据厂商说明书，使用MORPH位点特异性质粒DNA诱变试剂盒5引物-3引物(Boulder，CO)，使用寡核苷酸5’-GCAGTTCATTCCTCATGACTGCTGCAGCAGAGC-3’(SEQ ID NO：8)。分离包含SEQ ID NO：9的截短的1.0kb玉米ZmCAS1启动子的HindIII-RcaI片段(ZmCAS1HindIII Pro，SEQ ID NO：15)和包含SEQ ID NO：10的
1.7kb玉米ZmCAS1启动子的BamHI-RcaI(ZmCAS1BamPro，SEQ ID NO：16)片段，并用于植物中的启动子研究。
1.7kb玉米ZmCAS1启动子的BamHI-RcaI(ZmCAS1BamPro，SEQ ID NO：16)片段，并用于植物中的启动子研究。
[0239] 如图4、实例2和本文描述的其他实例所示，1.7kb ZmCAS1启动子(SEQ ID NO：10)和截短的1.0kb ZmCAS1启动子(SEQ ID NO：9)在植物细胞中是活性的，并且通过安全剂(CBSU，图4A、4B)和/或热处理(图4B)两者诱导。
[0240] 实例2
[0241] 当GUS和ZmMS45置于ZmCAS1启动子的转录控制下时，响应安全剂CBSU或热处理，在玉米细胞和植物中观察到这些基因的提高表达。
[0242] 土壤杆菌属介导的未成熟胚芽的转化用于生成下列的整合拷贝：包含1.0kb ZmCAS1 启 动 子 (SEQ ID NO：9) 的 PHP16974(SEQ ID NO：11；ZmCAS1HindIII Pro：GUS/35SPAT)，包含1.7kb ZmCAS1启动子(SEQ ID NO：10)的PHP16975(SEQ ID NO：12，ZmCAS1BamPro：GUS/35SPAT)，以及包含1.0kb ZmCAS1启动子的PHP16972(SEQ ID NO：13，ZmCAS1HindIII Pro：MS45/35SPAT)或包含1.7kb ZmCAS1启动子的PHP16973(SEQ ID NO：
14，ZmCAS1BamPro：MS45/35SPAT：)。
14，ZmCAS1BamPro：MS45/35SPAT：)。
[0243] 如实例1和图3所示，除在花药中的表达外，ZmCAS1转录物也响应安全剂CBSU处理在愈伤组织和叶组织中表达。选择双丙氨磷抗性愈伤组织事件用于分析和植物再生。
[0244] 为了测定来自玉米的1.7kb或1.0kb ZmCAS1启动子是否能够指导GUS报道基因的诱导表达，在室温下将三个双丙氨磷抗性愈伤组织事件置于维持培养基和含有提高量的安全剂CBSU-2的维持培养基上共18小时，取出并用X-Gluc染色以检测GUS活性。如图4A所示，轻微GUS表达在维持培养基上生长的愈伤组织中检测到(图4A：C)。相比之下，低水平的GUS表达在10mg/l CBSU上生长的愈伤组织中检测到(图4A：10)，而强GUS表达在
100mg/l CBSU上生长的PHPl6975愈伤组织事件中观察到(图4A：100)。该数据指示1.7kb ZmCAS1启动子在玉米愈伤组织中是活性的，并且可通过安全剂处理进行诱导。
100mg/l CBSU上生长的PHPl6975愈伤组织事件中观察到(图4A：100)。该数据指示1.7kb ZmCAS1启动子在玉米愈伤组织中是活性的，并且可通过安全剂处理进行诱导。
[0245] 当在室温下在100mg/升CBSU的存在下温育时，含有PHP16974(其含有驱动GUS报道基因的ZmCAS1启动子的截短的1.0kb片段)的七个随机双丙氨磷抗性愈伤组织事件能够诱导GUS表达(图4B；26C+CBSU)。在分离的实验中，当这7个愈伤组织事件在不含CBSU的维持培养基上生长但在37℃下温育2天，回到室温并且随后用X-gluc染色时，也观察到提高的GUS表达(图4B；37C)。该数据指示截短的1.0kb ZmCAS1启动子在玉米愈伤组织中是活性的，并且可通过安全剂和/或热处理进行诱导。
[0246] 植物还由含有PHP16975得愈伤组织事件再生，并在温室中生长至大约5叶期。在该发育阶段，在用30mg 2-CBSU浇水前(C)和浇水后(S)收集图5所示来自由3个双丙氨磷抗性事件再生的植物的叶穿孔，以检查响应安全剂的施加在叶中的GUS表达。如图5所示，跨越分析的3个PHP16975转化的植物，在用CBSU浇水后(S)2天的叶穿孔中检测到强GUS表达。)。该数据还指示1.7kb ZmCAS1启动子在玉米叶中是活性的，并且可通过安全剂进行诱导。
[0247] T-DNA载 体 PHP16972(SEQ ID NO：13，ZmCAS1HindIII Pro：MS45/35S：PAT) 和PHP16973(SEQ ID NO：14，ZmCAS1BamPro：MS45/35S：PAT)用于转化玉米愈伤组织，所述玉米愈伤组织生成为含有MS45/ms45杂合和ms45/ms45纯合突变型植物的分离群体。为了检测在玉米花药中在1.0或1.7kb ZmCAS启动子的控制下的MS45RNA或蛋白质表达，含有在玉米MS45基因中的天然存在的突变的植物用于这些研究，所述突变导致MS45RNA和蛋白质的丧失。来自MS45/ms45植物的花粉用于给雄性不育ms45/ms45植物授精，用于生成将为如Cigan等人2001中所述的ms45/ms45的胚芽。通过将玉米MS45基因置于这些转化载体中的ZmCAS1启动子的控制下，除GUS外的基因可测试在愈伤组织、叶和玉米花药中响应安全剂的转录诱导，如先前已对于ZmIn2-2：MS45调控的表达证实的(Cigan等人2001.Sex.Plant Reprod.14，135-142)。在室温下将含有整合的PHP16972拷贝的五个随机双丙氨磷抗性事件置于维持培养基(图5，(-))和含有100mg/升安全剂CBSU-2的维持培养基(图5(+))上共18小时，取出并且如所述的制备聚A+RNA并用于RNA分析(Cigan等人2001.Sex.Plant Reprod.14，135-142)，使用ZmMS45和ZmActin探针用于杂交分析。如图6所示，对应于MS45mRNA的杂交信号的强诱导在来自在CBSU(+)上生长的ms45/ms45愈伤组织的RNA转录物内检测到。当愈伤组织在不存在CBSU的情况下生长时，观察到极低信号。肌动蛋白用作对照探针以显示在所有样品中存在几乎相等的RNA水平。多重植物由用PHP16973转化的ms45/ms45愈伤组织事件再生并在温室中生长。植物在小孢子发育的减数分裂阶段用30mgCBSU浇水。2天后由对照和CBSU处理的植物收集叶和花药(四分体，早期单核小孢子阶段)，并且如所述的(Cigan等人2001)，由4个叶穿孔或6个花药制备全细胞蛋白质提取物。叶和花药蛋白质在10％SDS变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，转移至支持硝酸纤维素，并且用于使用针对玉米MS45蛋白质的抗体的蛋白质分析。来自PHP16973对照(C)和处理的(+)植物的叶提取物的检查(图7)证实在衍生自CBSU处理的植物的叶提取物中提高的MS45蛋白质稳态水平(泳道3、5、7、9)。提高的MS45蛋白质也在衍生自PHP16973CBSU处理的植物花药的提取物(图8)中检测到(泳道2、4、7)。该数据进一步支持当通过安全剂进行诱导时，ZmCAS1启动子在玉米细胞例如花药、愈伤组织和叶中是活性的。
[0248] 本文描述的GUS和MS45结果合在一起支持当置于玉米细胞和植物中的1.7kb或1.0Kb ZmCAS1启动子的控制下时，该基因可被转录诱导，并且转录可响应安全剂CBSU和或热处理店施加在愈伤组织、叶和花药中提高。
[0249] 实例3
[0250] 用包含驱动GUS表达的截短的1.0kb ZmCAS1启动子的PHP16974转化的稻植物的热处理导致在发芽幼苗中的GUS表达。
[0251] 为了测定ZmCAS1启动子是否可在除玉米以外的植物物种中响应安全剂处理或热处理而条件调控表达，土壤杆菌属介导的转化用于生成包含截短的1.0kb ZmCAS1启动子的PHP16974(ZmCAS1HindIII Pro：GUS)的整合拷贝，用于在稻中的研究。来自10-14日龄的发芽种子(水稻cv.Kitaake)的盾片用于稻转化实验(Toki 1997，Pl Mol.Biol Reporter15：16-21)。选择含有PHP16974的双丙氨磷抗性愈伤组织事件，并就其响应安全剂施加的能力进行筛选。四个独立的双丙氨磷抗性事件在维持培养基或含有100mg/升CBSU的维持培养基上生长24小时，取出并用X-Gluc染色。如图9所示，当在含有CBSU安全剂的培养基上生长时，在PHP16974愈伤组织事件中观察到强GUS表达(图9)。使PHP16974双丙氨磷抗性事件再生成植物。叶组织由这些植物收集并用于DNA杂交分析，以鉴定单拷贝PHP16974插入片段。这些植物允许设置自交种子并用于后续研究，以监控在ZmCAS1启动子的转录控制下的GUS表达。使选自2个单拷贝PHP16974事件的十六粒种子灭菌，在无激素培养基上在28℃或37℃下生长48小时，并允许发芽。发芽的种子随后在28C下温育另外2天，并且用X-Gluc组织化学染色，以检测GUS活性(参考)。如图10A和10C所示，在28℃下发芽的幼苗显示出极低水平的可检测的Gus染色。相比之下，在37℃下发芽的稻幼苗显示在根以及枝基部处显著的蓝色染色(图10B和10D)。这些结果与玉米中的观察一致。即，当GUS基因通过1.0kb ZmCAS1启动子进行调控时，在37C下的温育导致即使在不存在安全剂处理的情况下提高的Gus活性。
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