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一种正相液相色谱-串联质谱法检测 口含烟中烟碱旋光异构体的方法

阅读：96发布：2020-05-14

专利汇可以提供一种正相液相色谱-串联质谱法检测口含烟中烟碱旋光异构体的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种正相液相色谱‑ 串联质谱法检测口含烟中烟碱旋光异构体的方法，其特征在于：首先对口含烟中的烟碱进行提取，采用手性色谱柱实现烟碱旋光异构体的分离，柱后高压输液泵引入异丙醇并进行分流，结合串联质谱进行分析测定，从而实现口含烟中S‑(‑)‑烟碱和R‑(+)‑烟碱的分离及灵敏检测。本发明的特点及有益效果如下：采用柱后高压输液泵引入异丙醇并分流，减少了进入质谱的非极性溶剂的量，同时补偿了极性溶剂异丙醇的量，提高了离子化效率，从而满足了液相色谱串联质谱分析的要求，并提高了分析的灵敏度；与现有方法相比，本发明两种烟碱旋光异构体的色谱分离度高（保留时间相差1min）；分析时间短（仅需17min）。，下面是一种正相液相色谱-串联质谱法检测口含烟中烟碱旋光异构体的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种正相液相色谱-串联质谱法检测口含烟中烟碱旋光异构体的方法，其特征在于：
首先对口含烟中的烟碱进行提取，采用手性色谱柱实现烟碱旋光异构体的分离，柱后高压输液泵引入异丙醇并进行分流，结合串联质谱进行分析测定，具体步骤如下：
a、口含烟中烟碱的萃取：
首先对口含烟进行预处理，称取处理后的口含烟样品0.1 0.5g，加入1 5 mL 5.0%NaOH~ ~
溶液，静置5 30 min，准确加入含有内标的正己烷溶液10 50 mL，超声萃取5 30 min，取上~ ~ ~
层清液过有机相滤膜，有机相滤膜上加有1 3.0 g无水硫酸钠，净化后的样品溶液进正相液~
相色谱-串联质谱分析；
b、样品的分析：
液相色谱条件：采用正相液相色谱-串联质谱分析，所用色谱柱为大赛璐手性色谱柱CHIRALPAK® IC，规格为4.6 mm×250 mm，i.d. 5 µm；柱温：30 oC；流动相A：含有碱性添加剂的正己烷，流动相B：异丙醇；等度洗脱：A:B = 95:5；流速0.5 1.0 mL/min；进样体积10 μ~
L，分析时间为17 min；所述碱性添加剂为二乙胺，添加量为正己烷质量的0.02% 0.2%；
~
柱后加入异丙醇及分流：在柱后通过三通阀连接，采用安捷伦高压输液泵引入异丙醇，控制异丙醇流速为0.1 1.0 mL/min，同时，采用离子源上配置的三通阀进行柱后分流，通过~
控制PEEK管的长度，控制分流比例为1:3 1:5；
~
离子源：电喷雾电离源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测MRM；电喷雾电压：5000 V；气帘气压力：30 psi；辅助气1压力：70 psi；辅助气2压力：70 psi；离子源温度：550 oC。
2.根据权利要求1所述的检测口含烟中烟碱旋光异构体的方法，其特征在于：所述口含烟包括以下类型口含烟：袋装口含烟、含化型口含烟、胶基型口含烟；所述口含烟预处理方式如下：袋装口含烟直接剪碎，含化型口含烟碾磨成粉，胶基型口含烟碾成片状并剪碎。
3.根据权利要求1所述的检测口含烟中烟碱旋光异构体的方法，其特征在于：步骤a中，采用外消旋的d3-烟碱为内标，d3-S-(-)-烟碱和d3-R-(+)-烟碱合并计算，浓度范围为1 10 ~
mg/mL。

说明书全文

一种正相液相色谱-串联质谱法检测 口含烟中烟碱旋光异构

体的方法

技术领域

[0001] 本发明属于复杂样品中手性异构体分离、分析检测技术研究，具体涉及一种正相液相色谱-串联质谱法分析口含烟中烟碱旋光异构体的方法，主要是针对不同类型口含烟样品，对烟碱进行提取，采用手性色谱柱实现烟碱旋光异构体的分离，柱后高压输液泵引入异丙醇并进行分流，结合串联质谱分析，实现了口含烟中S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的分离及灵敏检测。

背景技术

[0002] 口含烟是通过口腔使用的无烟气烟草制品，是由烟粉/烟丝/烟草提取物以及添加的无机盐、香料、水分、保润剂等成分组成，产品形式包括美国湿鼻烟、瑞典鼻烟、含化型烟草制品、干鼻烟、胶基式烟草制品等。口含烟在消费时不经燃烧，不会产生“环境烟草烟气”。近些年，世界卫生组织烟草控制框架公约（WHO FCTC）禁止烟草烟气在公共场所扩散等限制和禁令对传统卷烟造成强大冲击。在这种背景之下，世界各国烟草行业纷纷把口含烟作为重要发展方向。

[0003] 烟碱是人类吸烟的主要动力。烟碱有两个旋光异构体，即S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱。二者具有完全不同的代谢机理和生理特性，S-(-)-烟碱的生理活性和毒性比R-(+)-烟碱更强。因此，烟碱旋光异构体的分离分析在药学和吸烟与健康方面具有重要意义。目前文献报道的烟碱旋光异构体的分离分析主要方法有手性色谱柱-二维气相色谱法、手性色谱柱-液相色谱法等。手性色谱柱-二维气相色谱法存在的问题分析时间长；而手性色谱柱-液相色谱法存在的问题是灵敏度较低。

发明内容

[0004] 本发明的目的是针对以上问题，提出了一种正相液相色谱-串联质谱法分析口含烟中烟碱旋光异构体的方法。采用手性色谱柱-正相液相色谱法实现了烟碱旋光异构体的分离；为满足串联质谱分析的要求，采用高压输液泵柱后加入异丙醇并进行分流，有利于离子化效率及分析方法灵敏度的提高，从而实现烟碱旋光异构体的分析测定。

[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

[0006] 一种正相液相色谱-串联质谱法检测口含烟中烟碱旋光异构体的方法，首先对口含烟中的烟碱进行提取，采用手性色谱柱实现烟碱旋光异构体的分离，柱后高压输液泵引入异丙醇并进行分流，结合串联质谱进行分析测定，具体步骤如下：

[0007] a、口含烟中烟碱的萃取：

[0008] 为实现口含烟样品中烟碱的完全萃取，对不同类型口含烟样品（袋装、含化型、胶基型）首先进行预处理：袋装口含烟直接剪碎，含化型口含烟碾磨成粉，胶基型口含烟碾成片状并剪碎。称取预处理后的口含烟样品0.1 0.5g，加入1 5 mL 5.0%NaOH溶液，静置5 30 ~ ~ ~min，准确加入含有内标的正己烷溶液10 50 mL，超声萃取5 30 min，取上层清液过有机相~ ~
滤膜，有机相滤膜上加有1 3.0 g无水硫酸钠，净化后的样品溶液进正相液相色谱-串联质~
谱分析。

[0009] b、样品的分析：

[0010] 液相色谱条件：采用正相液相色谱-串联质谱分析，所用色谱柱为手性色谱柱；柱温：30 oC；流动相A：含有碱性添加剂的正己烷，流动相B：异丙醇；等度洗脱；流速0.5 1.0 ~mL/min；进样体积10 μL，分析时间为17 min。

[0011] 柱后加入异丙醇及分流：为提高正相液相色谱-串联质谱法的灵敏度，实现烟碱旋光异构体定量分析的要求，在柱后通过三通阀连接，采用安捷伦高压输液泵引入异丙醇，控制异丙醇流速。同时，为适应质谱分析的要求，进行柱后分流以减少进入质谱的溶剂量。采用离子源上配置的三通阀进行柱后分流，通过控制PEEK管的长度，控制分流比。

[0012] 离子源：电喷雾电离源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测MRM；电喷雾电压：5000 V；气帘气压力：30 psi；辅助气1压力：70 psi；辅助气2压力：70 psi；离子源温度：550 oC。各化合物及内标的保留时间、母离子、子离子、碰撞能量（CE）及去簇电压（DP）参见表1。

[0013]

[0014] 在本发明中，步骤a中所述内标为：采用外消旋的d3-烟碱为内标，d3-S-(-)-烟碱和d3-R-(+)-烟碱合并计算，浓度范围为1~10 mg/mL。

[0015] 步骤b中所述的手性色谱柱为大赛璐手性色谱柱CHIRALPAK® IC，规格为4.6 mm×250 mm，i.d. 5 µm；碱性流动相添加剂为二乙胺，添加量为正己烷质量的0.02% 0.2%；所述~
的等度洗脱条件为A: B = 95：5；柱后分流比例为1:3 1:5；柱后加入异丙醇流速为0.1 1.0 ~ ~
mL/min。

[0016] 本发明采用正己烷配制烟碱旋光异构体混合母液用于配制标准工作溶液，氘代内标溶液和标准工作溶液同样采用正己烷配制。分别对标准工作溶液进行正相液相色谱-串联质谱法分析，并以S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱与内标物峰面积比对浓度比进行线性回归，得到各目标化合物的标准工作曲线。取最低浓度标准工作溶液，10次平行测定，计算标准偏差，3倍标准偏差为检测限，10倍标准偏差为定量限，结果见表2。

[0017]

[0018] 本发明的有益效果如下：

[0019] （1）首次采用正相液相色谱-串联质谱法实现了口含烟中烟碱旋光异构体的分离检测；

[0020] （2）由于正相液相色谱流动相主要为非极性溶剂（正己烷），离子化效率低，不适合质谱检测。因此，采用柱后高压输液泵引入异丙醇，提高极性溶剂的比例，以提高质谱离子化效率和分析的灵敏度。同时，为了进一步提高质谱的雾化和离子化效率，在加入异丙醇后再进行柱后分流，减少进入质谱的溶剂量，满足液相色谱串联质谱分析的要求，提高分析的灵敏度；

[0021] （3）与文献报道方法比较，本发明两种烟碱旋光异构体的色谱分离度高（保留时间相差1min）；分析时间短（仅需17min）；方法灵敏度高，满足含量较低的R-(+)-烟碱的定量要求。附图说明

[0022] 图1 为烟碱旋光异构体的多反应监测质谱（MRM）图，

[0023] 其中：a为S-(-)-烟碱，b为R-(+)-烟碱。

具体实施方式

[0024] 本发明以下将结合实施例作进一步说明：

[0025] 实施例1

[0026] （1）不同类型口含烟样品预处理：

[0027] 袋装湿鼻烟：袋口剪开，取出里面的烟丝，并将袋子剪碎，与口含烟烟丝混合。

[0028] 含化型口含烟：取含化型口含烟直接碾磨成粉。

[0029] 胶基型口含烟：取胶基型口含烟用碾钵碾成片状，然后用剪刀剪碎。

[0030] （2）口含烟中烟碱的萃取：称取预处理好的口含烟样品0.3g，加入2 mL 5.0%NaOH溶液，静置20 min，准确加入含有外消旋的d3-烟碱内标的正己烷溶液20 mL，外消旋的d3-烟碱浓度为5mg/mL，超声萃取30 min，取上层清液有机相滤膜，有机相滤膜上加了2.0 g无水硫酸钠，净化后的样品溶液进正相液相色谱-串联质谱分析。

[0031] （3）仪器分析：采用正相液相色谱-串联质谱法分析，所用色谱柱为大赛璐手性色谱柱CHIRALPAK® IC，规格为4.6 mm×250 mm，i.d. 5 µm；柱温：30 oC；流动相A：含有0.1%二乙胺的正己烷，流动相B：异丙醇；95%A+5%B等度洗脱；流速1.0 mL/min；进样体积10 μL，分析时间为17 min。采用安捷伦高压输液泵进行柱后加入异丙醇，控制异丙醇流速为1.0 mL/min；并利用离子源上配置的三通阀进行柱后分流，控制分流比为1:5。采用ESI离子源，正离子扫描模式；多反应监测MRM；电喷雾电压：5000 V；气帘气压力：30 psi；辅助气1压力：70 psi；辅助气2压力：70 psi；离子源温度：550 oC。

[0032] 实施例2

[0033] 选取袋装湿鼻烟、含化型口含烟、胶基型口含烟典型样品各2种，按照实施例1所述的分析方法，测定口含烟中烟碱旋光异构体的含量，结果如表3所示。

[0034] 表3：口含烟中烟碱旋光异构体的含量（mg/g）

[0035]样品编号 S-(-)-烟碱 R-(+)-烟碱
袋装湿鼻烟1 5.6 0.011
袋装湿鼻烟2 13.7 0.037
含化型口含烟1 4.8 0.014
含化型口含烟2 6.9 0.017
胶基型口含烟1 9.8 0.027
胶基型口含烟2 7.6 0.017

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