特异性结合EGFR抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽
阅读：1029发布：2020-06-14
专利汇可以提供特异性结合EGFR抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种竞争性结合EGFR抑制EGF促 肿瘤 细胞增殖 的多肽，属于 生物 医药技术领域；本发明以表皮细胞生长因子受体的胞外域EGFR‑ECD为靶分子，经 噬菌体 展示技术的淘选，以EGF为有效成分特异性洗脱结合靶分子的噬菌体，得到生物活性多肽TUZG14；经本发明证实，该生物活性多肽TUZG14显著抑制了由EGF引起的胃癌细胞的增殖过程；本发明多肽序列较短，易于合成和实现规模化生产，能抑制EGF的促癌作用，具备后续开发成为抗癌药物的潜 力 ，在抗癌药物研发方面具有重要应用价值。，下面是特异性结合EGFR抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽专利的具体信息内容。
1.一种抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽，其特征在于，所述多肽氨基酸序列为：Lys Val Trp Val Val Pro Asn。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽通过特异性结合EGFR抑制EGF促肿瘤细胞的增殖。
3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述肿瘤细胞为胃癌细胞。
4.根据权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述胃癌细胞为AGS细胞。
5.权利要求1所述的多肽在制备治疗肿瘤靶向药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为胃癌。
7.一种用于治疗或预防肿瘤的靶向药物，其特征在于，所述药物包括权利要求1所述的多肽。
8.根据权利要求7所述的靶向药物，其特征在于，所述肿瘤为胃癌。
特异性结合EGFR抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽
技术领域
背景技术
[0002] 表皮生长因子受体EGFR（Epidermal Growth Factor Receptor）属于 型表皮生长因子家族（即ErbB家族）。EGFR是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，它由1186个氨基酸残基组成，分子量为170KD，具有酪氨酸激酶活性。EGFR在结构上可分为三个部分：①胞外区：621个氨基酸残基，与其配体结合的区域；②跨膜区：23个氨基酸残基构成α螺旋结构，将受体固定于细胞膜上；③胞内区：542个氨基酸残基，含有典型的ATP结合位点和酪氨酸激酶磷酸化位点，负责下游通路的激活。在无配体结合状态下，EGFR以单体的形式存在于细胞膜表面，当它的胞外区与配体结合时，EGFR会形成同源或异源二聚体，EGFR的酪氨酸激酶磷酸化位点被激活并发生自磷酸化，磷酸化的酪氨酸锚定位点可以激活下游相关蛋白，为细胞提供分裂信号，刺激细胞生长、增殖。
[0003] 表皮生长因子（EGF）为表皮生长因子超家族的主要成员之一，是一种单链低分子量多肽，链内含53个氨基酸残基，3对二硫键，分子量为6045Da，等电点PI4.6，对热稳定，是目前已知的最稳定的蛋白质之一。EGF是一种多效应的细胞因子，EGF能够促进细胞增殖、刺激细胞分化，其主要功能是调节表皮细胞、上皮组织及间质的分化增殖。EGF通过与其细胞膜上的特异性受体EGFR相结合起到刺激细胞生长的作用。正常生理条件下，EGF与EGFR的结合对于调节正常细胞的增殖、生长和分化是必需的，但若EGF与EGFR介导的信号通路出现异常，都会使细胞的生长、分裂、分化从受控状态转变为失控状态，导致肿瘤的发生。研究表明，EGFR在许多癌症中存在高表达，如非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、结直肠癌等，所以EGFR是肿瘤治疗中一个十分重要的靶点。
[0004] 大量研究表明，EGFR与胃癌组织的分化程度相关，EGFR的表达率越高表明肿瘤的恶性程度越高。胃癌的病情进展缓慢但持续发展，大多数胃癌患者在最初诊断时已有大量的转移性扩散，这也是胃癌预后不佳的一个主要原因，有研究表明，EGF能够促进胃癌细胞发生上皮-间质转化，有助于肿瘤细胞浸润和转移。EGF及EGFR的表达与胃癌的分化程度、浸润和转移密切相关，是胃癌治疗的理想靶点。
[0005] 靶向EGFR家族的药物包括两大类：抗体类药物和小分子酪氨酸激酶抑制剂。目前在我国已上市的EGFR抗体类药物有西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗等，虽然这些药物疗效显著、副作用较少，但它们的价格都十分昂贵，患者无法长期负担高额费用，使其应用也受到了限制。小分子抑制剂的作用机制与单克隆抗体不同，主要通过竞争性结合EGFR胞内段酪氨酸激酶的磷酸化位点，阻断其与ATP的相互作用，继而抑制EGFR的酪氨酸磷酸化及下游一系列的信号传导，因此小分子抑制剂在特异性方面不如单克隆抗体，且患者在使用过程中会出现腹泻、皮疹、恶心等副作用。
[0006] 近年来，多肽药物已经成为药物研发的热点。多肽药物分子量小，易于穿越人体屏障，其质量控制水平接近于传统的小分子化学药物，而活性接近于抗体类药物，结合了传统小分子化学药物和蛋白质药物的优势，且生产过程中排放的废物少，属于绿色制药范畴，具备广阔的开发前景。噬菌体展示技术将外源多肽的基因与噬菌体外壳蛋白基因融合，使随机多肽表达于噬菌体表面，构成了一个肽库，在淘选过程中，某些与靶分子能够特异性结合的噬菌体被保留下来，从而测序得到噬菌体表面的多肽序列。噬菌体展示技术具有较强的目的性，可实现高通量的淘选，多肽易于生产且成本不高，现已广泛应用于生物医药研究的多个领域，尤其在人工抗体和疫苗研制、多肽药物的开发等方面具有广阔的应用前景。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供一种新型的EGFR靶向多肽，具体提供一种由噬菌体展示技术筛选得到的以EGFR为靶点的具有抗肿瘤活性的多肽。
[0008] 本发明提供一种抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽，所述多肽为TUZG14，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，具体序列信息为：Lys Val Trp Val Val Pro Asn。
[0009] 其中，所述多肽通过特异性结合EGFR抑制EGF促肿瘤细胞的增殖；优选的，所述肿瘤细胞为胃癌细胞；优选的，所述胃癌细胞为AGS细胞。
[0010] 本发明还提供所述抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽在制备治疗肿瘤靶向药物中的应用。
[0011] 其中，优选的，所述肿瘤为胃癌。
[0013] 本发明首先将靶标EGFR胞外域（EGFR-ECD）的基因导入了原核表达载体pET-30a中，使带有载体上标签的重组蛋白EGFR-ECD大量表达，并从包涵体中纯化得到高纯度的目的蛋白EGFR-ECD。
[0014] 将EGFR-ECD包被固定，使噬菌体与之结合，以EGFR的配体EGF竞争洗脱特异性结合靶分子的噬菌体，经过3轮淘选，富集得到具有高亲和力的噬菌体。将淘选到的单克隆噬菌体扩增后提取DNA，对其进行测序，并合成了出现频率较高的多肽TUZG14。
[0015] 经MTT法对多肽进行体外活性的验证，结果表明多肽TUZG14对EGF促进胃癌细胞AGS的增殖具有抑制作用，其氨基酸序列为：Lys Val Trp Val Val Pro Asn。
[0016] 本发明的有益效果：本发明是以EGFR为靶标筛选得到的能够特异性结合EGFR并抑制EGF促进肿瘤细胞增殖的多肽TUZG14。本发明中以胃癌细胞为模型，验证了多肽TUZG14具有显著抑制EGF促进肿瘤细胞生长的活性，使之具有成为抗肿瘤药物的临床价值。本发明的多肽序列短、分子量小，易于实现规模化生产，且生产成本不高，具有广阔的市场前景。
附图说明
附图说明
[0017] 图1为原核表达蛋白EGFR-ECD的氨基酸序列；其中阴影部分为(His)6标签，下划线部分为目的蛋白EGFR-ECD的氨基酸序列。
[0018] 图2为构建的蛋白表达载体pET-30a / EGFR-ECD的凝胶电泳验证结果；其中图A为1%琼脂糖凝胶验证EGFR-ECD 的PCR扩增产物；图B为重组质粒pET-30a / EGFR-ECD的双酶切验证，其中M为DNA标记，1为pET-30a空载体的Bam H 、Eco R 的双酶切结果，2为EGFR-ECD的Bam H 、Eco R 的双酶切结果，3为EGFR-ECD的PCR扩增产物。
[0019] 图3为重组蛋白EGFR-ECD在BL21(DE3)中的表达及纯化验证结果；其中图A为超声破碎后未离心的菌液，其中M是蛋白标记，1为转化pET-30a空载体的转化子，2为转化pET-30a / EGFR-ECD重组载体的转化子；图B为超声破碎并离心后的上清液，其中M是蛋白标记，
1为转化pET-30a空载体的转化子，2为转化pET-30a / EGFR-ECD重组载体的转化子；图C为蛋白透析复性结果，1为转化pET-30a / EGFR-ECD重组载体的转化子超声破碎后未离心的菌液，2为离心后沉淀经变性及透析复性后蛋白样品条带。
1为转化pET-30a空载体的转化子，2为转化pET-30a / EGFR-ECD重组载体的转化子；图C为蛋白透析复性结果，1为转化pET-30a / EGFR-ECD重组载体的转化子超声破碎后未离心的菌液，2为离心后沉淀经变性及透析复性后蛋白样品条带。
[0020] 图4为EGF敏感性胃癌细胞株的筛选结果；其中图A为EGF对BGC-803细胞存活率的影响；B为EGF对MGC-803细胞存活率的影响；C为EGF对AGS细胞存活率的影响。
[0021] 图5为多肽TUZG14的活性验证结果；EGF的浓度为0.033 µg/mL（5 nM），TUZG14的浓度分别为5 nM、15 nM、50 nM、150 nM，不加任何物质的纯对照组（Control），EGF组及加入EGF和不同量TUZG14各组的细胞存活率；图中 *, P<0.05; **, P<0.01。
具体实施方式
[0023] 实施例1：pET-30a/EGFR-ECD蛋白表达载体的构建从Genebank中获取EGFR的序列信息，登录号为CCDS5514.1，共3363bp。EGFR胞外域（Extracellular Domain）为其中一段（aa25-645），共1863bp，从EGFR整个序列中提取编码EGFR-ECD片段的DNA序列，如SEQ.ID.NO.2所示，并根据其设计PCR引物：
正向引物（SEQ.ID.NO.3）：
5’-GCTGATATCGGATCCATGCTGGAGGAAAAGAAAGT-3’
和反向引物（SEQ.ID.NO.4）：
5’-ACGGAGCTCGAATTCTCAGGACGGGATCTT AGG-3’，下划线部分分别为两端的酶切位点Bam HI和Eco RI。将EGFR-ECD的PCR产物和载体pET-30a（Novagen,#69909-3）经Bam HI和Eco RI 在37 ℃下酶切1 h之后，用T4DNA连接酶在16 ℃连接12 h。将连接产物转化进入DH5α感受态细胞（全式金，CD201），待卡那霉素（50 µg/mL）抗性LB平板上长出单菌落，挑取单菌落，扩增细菌，提取质粒进行酶切验证，将重组质粒送到华大基因测序，测序结果验证连接转化准确的质粒为pET-30a/EGFR-ECD。
正向引物（SEQ.ID.NO.3）：
5’-GCTGATATCGGATCCATGCTGGAGGAAAAGAAAGT-3’
和反向引物（SEQ.ID.NO.4）：
5’-ACGGAGCTCGAATTCTCAGGACGGGATCTT AGG-3’，下划线部分分别为两端的酶切位点Bam HI和Eco RI。将EGFR-ECD的PCR产物和载体pET-30a（Novagen,#69909-3）经Bam HI和Eco RI 在37 ℃下酶切1 h之后，用T4DNA连接酶在16 ℃连接12 h。将连接产物转化进入DH5α感受态细胞（全式金，CD201），待卡那霉素（50 µg/mL）抗性LB平板上长出单菌落，挑取单菌落，扩增细菌，提取质粒进行酶切验证，将重组质粒送到华大基因测序，测序结果验证连接转化准确的质粒为pET-30a/EGFR-ECD。
[0024] 图2为构建的蛋白表达载体pET-30a/EGFR-ECD的凝胶电泳验证结果；其中图A为1% 琼脂糖凝胶验证EGFR-ECD 的PCR扩增产物凝胶电泳验证结果；图B为重组质粒pET-30a/EGFR-ECD的双酶切验证结果；其中M为DNA marker标记，1为pET-30a空载体的Bam HI、Eco RI的双酶切结果，2为EGFR-ECD的Bam HI、Eco RI的双酶切结果，3为EGFR-ECD的PCR扩增产物。实验结果显示，PCR扩增EGFR-ECD成功；并且重组质粒pET-30a/EGFR-ECD构建成功。
[0025] 实施例2：EGFR-ECD的诱导表达及复性纯化EGFR-ECD的诱导表达：将构建成功的重组质粒pET-30a / EGFR-ECD转化宿主菌BL21(DE3)（全式金），利用卡那霉素抗性平板筛选重组子，挑取单菌落于含卡那霉素的LB液体培养基中培养10 h。将培养物以体积比1:100的比例接种于LB液体培养基，37 ℃剧烈震荡培养至OD600=0.5~0.6，加入0.1 M IPTG，使其终浓度为0.5 mM，25 ℃诱导4 h。
[0026] 目的蛋白的表达验证：将上述经过诱导的菌液5000 rpm，离心10 min，去上清，以菌液体积:裂解液体积= 20:1的比例将细菌重悬于裂解液（50 mM Tris-HCl pH7.5，500 mM NaCl，10%甘油，1% TritonX-100，1 mM蛋白酶抑制剂 PMSF，1 mg/mL溶菌酶）中，置于冰上超声，200 W功率超声3 s，间隔5 s，直至菌液澄清为止。将超声破碎后的菌液15000×g，4 ℃离心30 min，得到上清液与沉淀。将超声破碎后未离心的菌液与离心后的上清液都进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并用考马斯亮蓝染色。
[0027] 图3为重组蛋白EGFR-ECD在宿主菌BL21(DE3)中的表达及纯化验证结果；其中图A为超声破碎后未离心的菌液，其中M是蛋白marker标记，1为转化pET-30a空载体的转化子，2为转化pET-30a/EGFR-ECD重组载体；图B为超声破碎并离心后的上清液，其中M是蛋白marker标记，1为转化pET-30a空载体的转化子，2为转化pET-30a/EGFR-ECD重组载体的转化子；C为蛋白透析复性结果，其中1为转化pET-30a/EGFR-ECD重组载体的转化子超声破碎后未离心的菌液，2为转化pET-30a/EGFR-ECD重组载体的转化子离心后的沉淀经变性及透析复性后蛋白样品条带。
[0028] 实验结果显示，图2A中，与转化pET-30a空载体的转化子相比，转化pET-30a/EGFR-ECD重组载体的转化子的细菌裂解液中出现大量的EGFR-ECD，表明EGFR-ECD在BL21(DE3)中成功表达；而图2B显示离心之后上清液中无EGFR-ECD条带，证明EGFR-ECD在BL21(DE3)中是以不可溶的包涵体形式表达的。
[0029] 所以本发明中先用Buffer I洗去可溶性蛋白，再用Buffer T洗去脂溶性蛋白，将包涵体溶于高浓度的尿素缓冲液，使其变性，再逐步透析，降低尿素浓度，使蛋白复性，从而纯化获得目的蛋白。
[0030] 变性、复性及纯化目的蛋白EGFR-ECD：弃去离心后的上清液，沉淀分别经与裂解液体积相同的buffer I（50 mM Tris-HCl pH8.0，50 mM NaCl，5%甘油，2 M尿素）、buffer T（50 mM Tris-HCl pH8.0，50 mM NaCl，5%甘油，1% TritonX-100）超声重悬，每次重悬后15000×g，4 ℃离心30 min，弃上清。然后经buffer （50 mM Tris-HCl pH8.0，150 mM NaCl，8 M尿素）超声重悬，4 ℃静置过夜，15000×g，4 ℃离心30 min，弃沉淀得变性后的蛋白EGFR-ECD。以上清液:buffer = 1:5的比例（体积比）将蛋白液稀释后置于透析袋中，依次用6 M、4 M、2 M、1 M、0.5 M、0 M的尿素缓冲液透析，使蛋白复性。透析完成后，15000×g，4 ℃离心30 min，去除沉淀。将上清装入15 mL、30 KDa的超滤管中，5000×g，4 ℃离心，浓缩到体积为1 mL左右，得到纯化后的目的蛋白EGFR-ECD。
[0031] 实施例3：噬菌体展示淘选特异性结合EGFR的生物活性肽靶分子固定化：将100 µL浓度为100 µg/mL的靶分子EGFR-ECD蛋白溶液（0.1 M TBS pH7.4）加入96孔板中，置于摇床上轻微振荡，在增湿容器中4 ℃孵育过夜。除去靶分子溶液并用TBST（50 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl，0.1%[v/v] Tween-20）清洗6次。最后用封阻液（0.1 M NaHCO3 pH 8.6，5 mg/mL BSA，0.02% NaN3）封闭1 h。
[0032] 噬菌体随机肽库与靶分子结合：除去封阻液，并用TBST（含0.1%[v/v] Tween-20）清洗10次。噬菌体库（NEB（北京）有限公司，Ph.D.-7噬菌体展示肽库试剂盒，货号#E8100S）或扩增后的噬菌体经TBST（含0.1%[v/v] Tween-20）稀释后，噬菌体的滴度在109 1011之间，~将稀释好的噬菌体加入到六孔板上使之与靶分子结合，室温孵育10 60 min。
~
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[0033] 洗去未结合噬菌体：TBST（第一轮用含0.1%的，之后都用含0.5%[v/v] Tween-20的）清洗10次，每次清洗后用力在灭菌滤纸上拍打，去除残留液。
[0034] 洗脱特异性结合噬菌体：将100 µL EGF（生工生物工程（上海）股份有限公司，C610033）（100 µg/mL）溶液加入六孔板（Corning公司）中，室温轻微摇动10 60 min。收集~洗脱液，即得到被竞争性洗脱下来的特异性结合靶分子的噬菌体。
[0035] 噬菌体扩增：将洗脱下来的噬菌体加入20 mL处于对数前期的ER2738宿主菌（NEB（北京）有限公司）中，37 ℃剧烈摇晃4.5 h。将培养物转入离心管中，4 ℃，12000×g离心10 min，上清液转入另一离心管中，重复离心。将上清的上部80%转入新离心管中，加入1/6体积的PEG / NaCl（20% [w/v] PEG-8000， 2.5 M NaCl），4 ℃沉淀过夜。再次离心、1 mL TBS重悬、PEG / NaCl沉淀60 min之后，12000×g离心10 min，将沉淀溶于200 µL TBS，14000 rpm，离心1 min，将上清转移至另一微量离心管中，即为扩增后的洗脱物。取出1 µL用于滴度测定，其他用来进行下一轮淘选或保存。
[0036] 单克隆噬菌体信息的提取：4轮淘选后，将最后一轮洗脱下来的噬菌体感染宿主菌ER2378后铺在LB / IPTG / Xgal板上。13 h后，噬菌体蓝斑长成，挑取蓝斑并进行单克隆噬菌体扩增。4 h后将培养物14000 rpm离心30 s，取上清，如此重复2次，最后取80%的上清即为扩增后的单克隆噬菌体。以单克隆噬菌体为模板，设计PCR引物正向引物（SEQ.ID.NO.5）：5’-TTATTCGCAATTCCTTTAG-3’
和反向引物（SEQ.ID.NO.6） ：5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’
扩增序列，对扩增产物进行测序（华大基因），得到一条占优势的多肽序列，命名为TUZG14，然后将多肽序列送到公司（南京金斯瑞生物科技有限公司）合成。多肽TUZG14序列如SEQ.ID.NO.1所示：TUZG14 （SEQ.ID.NO.1）：Lys Val Trp Val Val Pro Asn。
和反向引物（SEQ.ID.NO.6） ：5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’
扩增序列，对扩增产物进行测序（华大基因），得到一条占优势的多肽序列，命名为TUZG14，然后将多肽序列送到公司（南京金斯瑞生物科技有限公司）合成。多肽TUZG14序列如SEQ.ID.NO.1所示：TUZG14 （SEQ.ID.NO.1）：Lys Val Trp Val Val Pro Asn。
[0037] 实施例4：EGF敏感细胞株的筛选本发明选取了几种EGFR高表达的胃癌细胞系作为实验对象，分别为AGS、BGC-803、MGC-
803（美国模式培养物保藏所）。以上3种细胞培养于含10%胎牛血清及青霉素-链霉素的RMPI-1640培养基中，每天定期观察细胞生长状态，及时传代。
803（美国模式培养物保藏所）。以上3种细胞培养于含10%胎牛血清及青霉素-链霉素的RMPI-1640培养基中，每天定期观察细胞生长状态，及时传代。
[0038] 种板：从CO2培养箱中取出培养的细胞，弃去原培养基，加入1 mL PBS清洗，用巴氏管吸去上清液。加入0.5 mL胰蛋白酶消化，转移至微量离心管中，200×g离心5 min，巴氏管吸去上清液。吸取1 mL含10% 胎牛血清及青霉素-链霉素的RMPI-1640培养基吹打混匀，用移液枪取10 mL细胞悬液于细胞计数板计数。每孔种4000个细胞，一共6组孔，每组5个复孔，取出所需细胞悬液稀释到相应体积，吹打混匀后加入到96孔板中。放入CO2恒温培养箱过夜培养12 16 h，待其贴壁。~
[0039] 加药：加入不同浓度的EGF。将100 mg EGF溶于1 mL ddH2O中，配制成100 µg/mL的贮存液。采用梯度稀释法，用培养基（1%胎牛血清及青霉素-链霉素）将100 µg/mL EGF稀释成以下6个浓度：0 µg/mL（对照）、0.01 µg/mL、0.033 µg/mL、0.1 µg/mL、0.33 µg/mL、1 µg/mL，加入到相应的孔中，每个浓度5个复孔。加药结束后放入CO2恒温培养箱（37 ℃）培养48 h。
[0040] MTT比色法：将加药处理48 h后的细胞取出，向每孔中加入10 µL MTT（5 mg/mL），放入CO2恒温培养箱（37 ℃）反应1~1.5 h，待细胞染成蓝紫色后吸去培养基，加入0.1 mL的DMSO并轻轻震荡使结晶溶解。用酶标仪在550 nm波长下测定各孔的吸收值，记录结果，并计算细胞存活率：细胞存活率=（实验组OD值/对照组OD值）×100%。
[0041] 图4为EGF敏感性胃癌细胞株AGS、BGC-803、MGC-803的筛选结果；其中图A为EGF对BGC-803细胞存活率的影响；B为EGF对MGC-803细胞存活率的影响；C为EGF对AGS细胞存活率的影响。 EGF设置以下浓度：0 µg/mL、0.01 µg/mL、0.033 µg/mL、0.1 µg/mL、0.33 µg/mL、1 µg/mL，48h之后考察EGF对三种细胞系存活率的影响。从图4A、B中可以看出，EGF对BGC-803细胞和MGC-803细胞的生长没有显著影响，从图4 C中可以看出，EGF具有显著的促进AGS细胞增殖的作用。
[0042] 实施例5：多肽的活性验证种板：从CO2培养箱取出培养的AGS细胞，弃原培养基，加入1 mL PBS清洗，用巴氏管吸去上清液。加入0.5 mL胰蛋白酶消化，转移至微量离心管中，200×g离心5 min，巴氏管吸去上清液。吸取1 mL含10%胎牛血清及青霉素-链霉素的RMPI-1640培养基吹打混匀，用移液枪取10 µL细胞悬液于细胞计数板计数。根据每孔种4000个细胞，一共6组孔，每组5个复孔，取出所需细胞悬液稀释到相应体积，吹打混匀后种到96孔板中。放入CO2恒温培养箱过夜培养
12 16 h，待其贴壁。
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12 16 h，待其贴壁。
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[0043] 加药：加入EGF及不同浓度的多肽。用含1%胎牛血清的培养基配制浓度为0.033 µg/mL（5 nM）的EGF溶液，并将其分为5组，向其中加入不同量的多肽溶液，配制成以下浓度：0 nM、5 nM、15 nM、50 nM、150 nM。将细胞分为6组处理，分别为不加任何物质的纯对照（Control）组、EGF组、EGF+5nM TUZG14组、EGF+15nM TUZG14组、EGF+50nM TUZG14组、EGF+150nM TUZG14组。最后放入CO2恒温培养箱（37 ℃）培养48 h。
[0044] MTT比色法：将加药处理48 h后的细胞取出，向每孔中加入10 µL MTT（5 mg/mL），放入CO2恒温培养箱（37 ℃）反应1~1.5 h，待细胞染成蓝紫色后吸去培养基，加入0.1 mL的DMSO并轻轻震荡使结晶溶解。用酶标仪在550 nm波长下测定各孔的吸收值，记录结果，并计算细胞存活率：细胞存活率=（实验组OD值/对照组OD值）×100%。
[0045] 图5为多肽TUZG20的活性验证结果；在EGF为0.033 µg/mL（5 nM）的作用浓度下，分别以1:1（5 nM）、1:3（15 nM）、1:10（50 nM）、1:30（150 nM）的比例加入TUZG14，在培养48h后分别测定不加任何物质的对照组（Control），EGF组及加入EGF和不同量TUZG14各组的细胞存活率。*, P<0.01; **, P<0.05。图5中可知，与EGF组相比，对照组的细胞生长较缓慢，说明EGF促进了AGS肿瘤细胞的增长，加入TUZG14后，AGS细胞的生长随TUZG14浓度的升高而逐渐下降，TUZG14在50 nM和150 nM浓度下，AGS肿瘤细胞生长加快的情况被显著抑制，表明TUZG14能显著抑制EGF的促肿瘤细胞增殖作用。
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