除草剂抗性的芸苔属植物及其使用方法
阅读：2发布：2021-07-24
专利汇可以提供除草剂抗性的芸苔属植物及其使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了对AHAS抑制性 除草剂 具有改进 水 平的耐药性的转基因和非转基因 植物 。本发明还提供了编码乙酰羟酸合成酶（AHAS）大亚基的突变体的核酸、表达载体、包含编码含有一个、两个或更多个突变的AHASL亚基的多核苷酸的植物、包含一个、两个或更多个AHASL亚基单一突变多肽的植物，及其产生和使用方法，以及控制 杂草 的方法。，下面是除草剂抗性的芸苔属植物及其使用方法专利的具体信息内容。
1.一种控制芥菜植物田野的杂草的方法，所述方法包括：在田野中使芥菜生长，其中所述芥菜包含A基因组和B基因组，所述A基因组包含编码第一耐除草剂的AHASL多肽的第一芸苔属乙酰羟酸合成酶大亚基(AHASL)多核苷酸，其中AHASL多肽在对应于SEQ ID NO:3的635位的位置上具有天冬酰胺取代；所述B基因组包含编码第二耐除草剂的AHASL多肽的第二芸苔属AHASL多核苷酸，所述第二耐除草剂的AHASL多肽在对应于SEQ ID NO:4的107位的位置上具有苏氨酸取代；和
使田野中的芸苔属植物和杂草接触有效量的AHAS抑制性除草剂，所述芥菜植物对所述除草剂耐受，所述有效量的AHAS抑制性除草剂足以杀死或抑制野生型芥菜植物的生长，从而控制杂草。
2.根据权利要求1所述的方法，其中第一和第二耐除草剂的AHASL多肽向所述植物细胞提供对AHAS抑制性除草剂的协同耐受水平。
3.根据权利要求1所述的方法，其中该第一多核苷酸是A基因组的AHASL基因。
4.根据权利要求1所述的方法，其中第二多核苷酸是B基因组的AHASL基因。
5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述除草剂包括咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、三唑嘧啶除草剂和嘧啶氧基苯甲酸盐除草剂的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述除草剂包含咪唑啉酮除草剂。
7.根据权利要求6的方法，其中所述咪唑啉酮除草剂包含咪草烟、甲咪唑烟酸、甲氧咪草烟、灭草喹和灭草烟中的一种或多种。
8.一种鉴定或选择芥菜植物细胞、芥菜植物组织、芥菜植物种子、或芥菜植物或其部分的方法，其包括：
a)提供芥菜植物细胞、芥菜植物组织、芥菜植物种子、或芥菜植物或其部分，其中所述植物细胞、植物组织、植物种子或植物或其部分包含A基因组，所述A基因组包含编码第一耐除草剂的AHASL多肽的第一芸苔属乙酰羟酸合成酶大亚基(AHASL)多核苷酸，其中AHASL多肽在对应于SEQ ID NO:3的635位的位置上具有天冬酰胺取代；和B基因组，所述B基因组包含第二芸苔属AHASL多核苷酸，所述第二芸苔属AHASL多核苷酸编码第二耐除草剂的AHASL多肽，所述第二耐除草剂的AHASL多肽在对应于SEQ ID NO:4的107位的位置上具有苏氨酸取代；
b)将所述植物细胞、植物组织、植物种子或植物或其部分与至少一种AHAS抑制性化合物接触；
c)确定所述植物细胞、植物组织、植物种子或植物或其部分是否被所述AHAS抑制性化合物影响；和
d)鉴定或选择在AHAS抑制性化合物存在下生长的所述植物细胞、植物组织、植物种子或植物或其部分的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的方法，其中第一和第二耐除草剂的AHASL多肽向所述植物细胞、植物组织、植物种子或植物或其部分提供对AHAS抑制性除草剂的协同耐受水平。
10.根据权利要求8所述的方法，其中该第一多核苷酸是A基因组的AHASL基因。
11.根据权利要求8所述的方法，其中第二多核苷酸是B基因组的AHASL基因。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的方法，其中所述AHAS抑制性化合物包含咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、三唑嘧啶除草剂和嘧啶氧基苯甲酸盐除草剂中的一种或多种。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述AHAS抑制性化合物包含咪唑啉酮除草剂。
14.根据权利要求13的方法，其中所述咪唑啉酮除草剂包含咪草烟、甲咪唑烟酸、甲氧咪草烟、灭草喹和灭草烟中的一种或多种。
15.一种处理芥菜植物种子的方法，所述方法包括将有效量的种子处理制剂施用到所述种子，其中所述芥菜植物包含A基因组，所述A基因组包含编码第一耐除草剂的AHASL多肽的第一芸苔属乙酰羟酸合成酶大亚基(AHASL)多核苷酸，其中AHASL多肽在对应于SEQ ID NO:3的635位的位置上具有天冬酰胺取代；和B基因组，所述B基因组包含第二芸苔属AHASL多核苷酸，其中所述第二芸苔属AHASL多核苷酸编码第二耐除草剂的AHASL多肽，所述第二耐除草剂的AHASL多肽在对应于SEQ ID NO:4的107位的位置上具有苏氨酸取代，以及所述种子包括所述第一AHASL多核苷酸和第二AHASL多核苷酸。
16.根据权利要求15所述的方法，其中该第一多核苷酸是A基因组的AHASL基因。
17.根据权利要求15所述的方法，其中第二多核苷酸是B基因组的AHASL基因。
18.根据权利要求15-17中任一项的方法，其中所述种子处理制剂包括选择如下的除草剂：咪唑啉酮、磺酰脲、三唑嘧啶、嘧啶氧基苯甲酸盐及其混合物。
19.根据权利要求18的方法，其中所述种子处理制剂包括咪唑啉酮除草剂。
20.根据权利要求19的方法，其中所述咪唑啉酮除草剂包含咪草烟、甲咪唑烟酸、甲氧咪草烟、灭草喹和灭草烟中的一种或多种。
21.根据权利要求15-17中任一项的方法，其中所述处理为下述任一种：种子喷洒、拌种、种子包被、种子喷粉、种子浸泡、种子包衣或其混合。
22.根据权利要求15-17中任一项的方法，其中所述处理在播种之前和/或在种子催芽之后进行。
23.分离的、重组、诱变的或合成的多核苷酸，其包含：
第一乙酰羟酸合成酶大亚基(AHASL)多核苷酸，所述第一AHASL多核苷酸由选自下列的核苷酸序列组成：
a)编码多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的序列由如SEQ ID NO:3所示的序列组成；
b)编码a)所示的多肽的成熟多肽的核苷酸序列，其中该多肽在对应于SEQ ID NO:3的
635位的位置上具有天冬酰胺；和
c)与a)至b)所示核苷酸序列互补的核苷酸序列；以及
第二AHASL多核苷酸，所述第二AHASL多核苷酸由选自下列的序列组成：
i)编码AHASL多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的序列由如SEQ ID NO:4所示的序列组成；
ii)编码i)所示的多肽的成熟多肽的核苷酸序列，其中该多肽在对应于SEQ ID NO:4的
107位的位置上具有苏氨酸取代；和
iii)与i)至ii)所示核苷酸序列互补的核苷酸序列。
24.一种产生转基因植物细胞的方法，包括以下步骤：
以包含权利要求23所述的多核苷酸的表达载体转化芥菜植物细胞。
25.一种产生抗除草剂的芥菜植物的方法，包括：
用包含权利要求23所述的多核苷酸的表达载体转化芥菜植物细胞；和
从表达所述多核苷酸编码的多肽的植物细胞产生芥菜植物。
26.一种产生抗乙酰羟酸合成酶(AHAS)抑制性除草剂的芥菜植物的方法，所述方法包括：使来源于具有乙酰羟酸合成酶大亚基(AHASL)多核苷酸的种子的植物生长，其中芥菜植物能够表达所述AHASL多核苷酸并耐受AHAS抑制性除草剂，且其中所述种子包含A基因组，所述A基因组包含AHASL多核苷酸，所述AHASL多核苷酸编码第一耐除草剂的AHASL多肽，所述AHASL多肽在对应于SEQ ID NO:3的635位的位置上具有天冬酰胺取代；
和B基因组，所述B基因组包含第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码第二耐除草剂的AHASL多肽，所述第二耐除草剂的AHASL多肽在对应于SEQ ID NO:4的107位的位置上具有苏氨酸取代。
27.根据权利要求26的方法，其中所述种子在以抑制对应的野生型芥菜植物生长的浓度的AHAS抑制性除草剂的存在下生长。
28.根据权利要求26的方法，其中所述方法进一步包括从所述植物收获种子。
29.一种控制芥菜植物田野中的杂草的方法，所述方法包括种植由权利要求15-17中任一项所述的方法产生的种子。
除草剂抗性的芸苔属植物及其使用方法
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求申请日为2007年4月4日，申请号为60／910,008的美国临时申请的优先权，在此以参考方式全文引入本文。
技术领域
背景技术
[0005] 乙酰羟酸合成酶(AHAS；EC4.1.3.18，也称为乙酰乳酸合成酶或ALS)，是第一个催化支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成的酶(Singh (1999)″Biosynthesis of valine，leucine and isoleucine"，Plant Amino Acid，Singh，B.K.，ed.，Marcel Dekker Inc.New York，New York，pp.227-247)。AHAS是五个结构各异的除草剂家族的作用位点，所述除草剂家族包括磺酰脲(Tan等人(2005)Pest Manag.Sci.61：246-57；Mallory-Smith和Retzinger(2003)Weed Technology17：620-626；`LaRossa和Falco(1984)Trends Biotechnol.2：158-161)、咪唑啉酮(Shaner等人(1984)Plant Physiol.76：545-546)、三唑嘧啶(triazolopyrimidines)(Subramanian和Gerwick(1989)"Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines,″Biocatalysis in Agricultural Biotechnology，Whitaker，J.R.和Sonnet，P.E..eds.，ACS Symposium Series，American Chemical Society，Washington，D.C.，pp.277-288)，Tan等人(2005)Pest Manag.Sci.61：
246-57；Mallory-Smith和Retzinger(2003)Weed Technology17：620-626，磺酰基氨基羰基三唑啉酮(Tan等人(2005)Pest Manag.Sci.61：246-57；Mallory-Smith和Retzinger(2003)Weed Technology17：620-626)。由于在非常低的使用率时的有效性和在动物中相对没有毒性，咪唑啉酮和磺酰脲除草剂在现代农业中被广泛应 用。通过抑制AHAS活性，这些家族的除草剂防止易感植物包括很多杂草品种的进一步生长和发育。商售的咪唑啉酮除草剂的几个例子为： (咪草烟(imazethapyr))、 (灭草喹(imazaquin))和
(灭草烟(imazapyr))。磺酰脲除草剂的例子为：氯磺隆(chlorsulfuron)、甲
磺隆(metsulfuron methyl)、甲嘧磺隆(sulfometuron methyl)、氯嘧磺隆(chlorimuron ethyl)、噻吩磺隆(thifensulfuron methyl)、苯磺隆(tribenuron methyl)、苄嘧磺隆(bensulfuron methyl)、烟嘧磺隆(nicosulfuron)、胺苯磺隆(ethametsulfuron methyl)、砜嘧磺隆(rimsulfuron)、氟胺磺隆(triflusulfuron methyl)、醚苯磺隆(triasulfuron)、氟嘧磺隆(primisulfuron methyl)、醚磺隆(cinosulfuron)、酰嘧磺隆(amidosulfiuon)、fluzasulfuron、咪唑磺隆(imazosulfuron)、吡嘧磺隆(pyrazosulfuron ethyl)和氯吡嘧磺隆(halosulfuron)。
246-57；Mallory-Smith和Retzinger(2003)Weed Technology17：620-626，磺酰基氨基羰基三唑啉酮(Tan等人(2005)Pest Manag.Sci.61：246-57；Mallory-Smith和Retzinger(2003)Weed Technology17：620-626)。由于在非常低的使用率时的有效性和在动物中相对没有毒性，咪唑啉酮和磺酰脲除草剂在现代农业中被广泛应 用。通过抑制AHAS活性，这些家族的除草剂防止易感植物包括很多杂草品种的进一步生长和发育。商售的咪唑啉酮除草剂的几个例子为： (咪草烟(imazethapyr))、 (灭草喹(imazaquin))和
(灭草烟(imazapyr))。磺酰脲除草剂的例子为：氯磺隆(chlorsulfuron)、甲
磺隆(metsulfuron methyl)、甲嘧磺隆(sulfometuron methyl)、氯嘧磺隆(chlorimuron ethyl)、噻吩磺隆(thifensulfuron methyl)、苯磺隆(tribenuron methyl)、苄嘧磺隆(bensulfuron methyl)、烟嘧磺隆(nicosulfuron)、胺苯磺隆(ethametsulfuron methyl)、砜嘧磺隆(rimsulfuron)、氟胺磺隆(triflusulfuron methyl)、醚苯磺隆(triasulfuron)、氟嘧磺隆(primisulfuron methyl)、醚磺隆(cinosulfuron)、酰嘧磺隆(amidosulfiuon)、fluzasulfuron、咪唑磺隆(imazosulfuron)、吡嘧磺隆(pyrazosulfuron ethyl)和氯吡嘧磺隆(halosulfuron)。
[0006] 由于其高效性和低毒性，人们喜欢将咪唑啉酮除草剂喷洒到很大面积的植物的顶部。能够在很大范围的植物顶部喷洒除草剂的能力降低了与建立和保持耕地相关的成本，并减少了在使用这类化学物质之前的原地制备需求。在所需的耐药性品种顶部喷洒，还可由于没有了竞争性品种而得到所需品种的潜在的最大化产率。但是，是否能够使用这样的顶部喷洒技术取决于在所喷洒区域内所需植物中咪唑啉酮抗性品种的存在。
[0007] 在主要的农业作物中，一些豆科品种例如大豆，由于其快速代谢除草剂化合物的能力而对咪唑啉酮呈天然抗性(Shaner和Robinson(1985)Weed Sci.33：469-471)。其它作物例如玉米对于咪唑啉酮除草剂有一些易感性(Newhouse等人(1992)Plant Physiol.100：882886)。对于咪唑啉酮除草剂的不同敏感性取决于特定除草剂的化学本性和在每个植物中化合物从毒性到非毒性形式的不同代谢(Shaner等人(1984)PlantPhysiol.76：545-546；
Brown等人，(1987)Pestic.Biochem.Physiol.27：24-29)。其它的植物生理区别例如吸收性和迁移性也在敏感性中起重要作用(Shaner和Robinson(1985)Weed Sci.33：469-471)。
Brown等人，(1987)Pestic.Biochem.Physiol.27：24-29)。其它的植物生理区别例如吸收性和迁移性也在敏感性中起重要作用(Shaner和Robinson(1985)Weed Sci.33：469-471)。
[0008] 已经使用种子、小孢子、花粉和愈伤组织诱变在玉米(Zea mays)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、油菜(Brassica napus)(即卡诺拉(Canola))、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)和水稻(Oryza sativa)中成功产生了对咪唑啉酮、磺酰脲和三唑嘧啶呈抗性的植物(Sebastian等人 (1989)Crop Sci.29：1403-1408；Swanson等人，1989THeor.Appl.Genet.78；525-530；Newhouse等人(1991)Theor.Appl.Genet.83：65-70；
Sathasivan等人(1991)Plant Physiol.97：1044-1050；Mourand等人(1993)J.Heredity84：
91-96；美国专利号5，545，822)。在所有的情况下，单一的、部分显性核基因赋予抗性。已经在小麦(Triticum aestivum L.cv.Fidel)种子诱变后成功地分离出四个咪唑啉酮抗性小麦植物(Newhouse等人(1992)Plant Physiol.100：882-886)。遗传研究确定单一的部分显性基因赋予抗性。基于等位基因研究，几位作者得出结论：已鉴定的四个株系中的突变位于相同的基因座。其中一个Fidel栽培变种抗性基因被命名为FS-4(Newhouse等人(1992)Plant Physiol.100：882-886)。
Sathasivan等人(1991)Plant Physiol.97：1044-1050；Mourand等人(1993)J.Heredity84：
91-96；美国专利号5，545，822)。在所有的情况下，单一的、部分显性核基因赋予抗性。已经在小麦(Triticum aestivum L.cv.Fidel)种子诱变后成功地分离出四个咪唑啉酮抗性小麦植物(Newhouse等人(1992)Plant Physiol.100：882-886)。遗传研究确定单一的部分显性基因赋予抗性。基于等位基因研究，几位作者得出结论：已鉴定的四个株系中的突变位于相同的基因座。其中一个Fidel栽培变种抗性基因被命名为FS-4(Newhouse等人(1992)Plant Physiol.100：882-886)。
[0009] 对AHAS抑制剂复合物的三维构象基于电脑的模拟预测了在提议的抑制剂结合口袋中的几个氨基酸是诱导的突变可能赋予咪唑啉酮选择性抗性的位点(Ott等人(1996)J. Mol.Biol.263：359-368)。在提议的AHAS酶结合位点中带有一些此类理论设计突变的小麦植物实际上已表现出对单一类别的除草剂的特异性抗性(Ott等人(1996)J. Mol.Biol.263：359-368)。
[0010] 已经在一些植物中报道了咪唑啉酮除草剂抗性植物。美国专利号4,761，373，5，331，107，5，304,732，6，211，438，6，211，439和6，222,100大体上描述了改变的AHAS基因在植物中引起除草剂抗性的用途，特别揭示了一些咪唑啉酮抗性玉米系。美国专利号5，013,
659揭示了由于在一个或多个保守区域中至少一个氨基酸的突变而对除草剂表现出抗性的植物。其中所描述的突变编码咪唑啉酮和磺酰脲的交叉抗性或磺酰脲的特异性抗性，但是没有描述咪唑啉酮的特异性抗性。美国专利号5，731，180和美国专利号5，767，361讨论了分离的基因，其在野生型单子叶植物的AHAS氨基酸序列中具有一个氨基酸的替换从而引起对咪唑啉酮的特异性抗性。此外，已经通过突变育种以及通过从另一个培养物产生的水稻植物库选择除草剂抗性植物而发展了对干扰AHAS的除草剂呈抗性的水稻植物。参见美国专利号5,545,822，5,736，629，5，773,703，5,773，704，5,952,553和6,274,796。
659揭示了由于在一个或多个保守区域中至少一个氨基酸的突变而对除草剂表现出抗性的植物。其中所描述的突变编码咪唑啉酮和磺酰脲的交叉抗性或磺酰脲的特异性抗性，但是没有描述咪唑啉酮的特异性抗性。美国专利号5，731，180和美国专利号5，767，361讨论了分离的基因，其在野生型单子叶植物的AHAS氨基酸序列中具有一个氨基酸的替换从而引起对咪唑啉酮的特异性抗性。此外，已经通过突变育种以及通过从另一个培养物产生的水稻植物库选择除草剂抗性植物而发展了对干扰AHAS的除草剂呈抗性的水稻植物。参见美国专利号5,545,822，5,736，629，5，773,703，5,773，704，5,952,553和6,274,796。
[0011] 如同在其它所有已经检测过的生物中一样，在植物中，AHAS酶由两个亚基组成：大亚基(催化作用)和小亚基(调节作用)(Duggleby和Pang(2000).J. Biochem.Mol.Biol.33：1-36)。AHAS大亚基(此后也称作AHASL)在拟南芥和水稻中可由单独基因编码，或者在玉米、卡诺拉和棉花中可由多个基因家族成 员所编码。大亚基中特定的单一核苷酸取代会赋予该酶对于一种或多种类别的除草剂的不敏感性(Chang和Duggleby(1998)BiochemJ.333：
765-777)。
765-777)。
[0012] 例如，普通小麦即小麦(Triticum aestivum L.)，含有三个同源乙酰羟酸合成酶大亚基基因。基于在这三个基因中的每一个的突变体的除草剂反应和生物化学数据，每个基因均表现出显著性表达(Ascenzi等人(2003)International Society of Plant Molecular Biologists Congress，Barcelona，Spain，Ref.No.S10-17)。所有这三个基因的编码序列均在核苷酸水平具有高度同源性(WO03／014357)。通过对小麦的几个品种中AHASL基因进行测序得知，在大多数IMI耐药性(咪唑啉酮耐药性)品系中，除草剂耐药性的分子基础为Ser653(At)Asn突变，这表明在对应于拟南芥中653位氨基酸的位置发生了天冬酰胺取代丝氨酸的替代。这个突变是由于编码AHASL蛋白的DNA序列中的单核苷多态现象(SNP)。
[0013] 在双子叶植物物种中也已知多种AHASL基因。最近，Kolkman等人((2004)Theor.Appl.Genet.109：1147-1159)报道了来自向日葵的除草剂抗性和野生型基因型的三个AHASL基因(AHASLl，AHASL2和AHASL3)的鉴定、克隆和测序。Kolkman等人报道：除草剂抗性是由于在AHASL1蛋白中的Pro197Leu取代(使用拟南芥AHASL氨基酸位置命名法)或者是由于Ala205Val替换，并且这些替换中每个均提供对于咪唑啉酮和磺酰脲除草剂的双抗性。
[0014] 鉴于其高度有效性和低毒性，农业上喜欢使用咪唑啉酮除草剂。但是，能否在特定的作物生产系统中使用咪唑啉酮除草剂取决于目的植物作物中咪唑啉酮抗性品种的可获得性。为了使农民在使用咪唑啉酮和磺酰脲除草剂的种类和比率上具有更高的机动性，通常需要较强的除草剂耐药性。同时，发展除草剂耐药性品种的植物育种者希望通过突变提供更高的除草剂耐药性，使其在用于发展其品种的种质背景中具有更高的机动性。为了产生这样的咪唑啉酮抗性品种，植物育种者需要发展其它的育种品系，优选为具有更高的咪唑啉酮抗性。因此，需要其它的咪唑啉酮抗性育种品系和植物作物品种，以及生产和使用咪唑啉酮抗性育种品系和品种的方法和组合物。
发明内容
[0015] 本发明提供了与野生型芸苔属植物相比具有增加的除草剂抗性的芸苔属植物。特别地，本发明所述芸苔属植物与野生型芸苔属植物相比，对至少 一种干扰AHAS酶活性的除草剂具有增加的抗性。芸苔属植物在其基因组中包含至少一个拷贝的乙酰羟酸合成酶大亚基(AHASL)多核苷酸，其编码除草剂抗性AHASL多肽，其中该AHASL多肽选自：a)在对应于SEQ IDNO：1的653位、SEQ ID NO：2的638位或SEO ID NO：3的635位上是天冬酰胺的多肽；b)在对应于SEQ ID NO：1的122位、SEQ ID NO：4的107位或SEQ ID NO：5的104位上是苏氨酸的多肽；c)在对应于SEQ ID NO：1的574位或SEQ ID NO：6的557位上是亮氨酸的多肽。
[0016] 本发明还提供了增强的除草剂耐药性，这通过在芥菜(B.iuncea)植物中的不同基因组上组合AHAS突变来实现。在一个实施例中，bR(AHAS1)突变(位于芥菜的B基因组上)与基因渗入PM2(AHAS3)突变(位于基因渗入到芥菜中的油菜的B基因组上)组合。所得到的除草剂耐药性显著增强，具有令人惊奇的协同效应，比在现在商售的组合了PM1和PM2的产品中观察到的高。在另一个实施例中提供了组合了aR(AHAS1)突变(位于芥菜的A基因组上)和A107T突变(位于芥菜的B基因组上)的芥菜植物，其相对于组合了PM1和PM2突变的植物来说，也具有协同水平的除草剂耐药性。
[0017] 在一个实施方式中，本发明提供了除草剂抗性的双突变芸苔属植物，其来自称为J05Z-07801的芸苔属品系。在另一个实施方式中，本发明提供了除草剂抗性的芸苔属植物，其来自称为J04E-0139的芸苔属品系。在另一个实施方式中，本发明提供了除草剂抗性的芸苔属植物，其来自称为J04E-0130的芸苔属品系。在另一个实施方式中，本发明提供了除草剂抗性的芸苔属植物，其来自称为J04E-0122的芸苔属品系。
[0018] 本发明所述的除草剂抗性芸苔属植物可含有一个、两个、三个、四个或多个拷贝的编码本发明所述的除草剂抗性AHASL蛋白的基因或多核苷酸。本发明所述的除草剂抗性芸苔属植物可含有编码除草剂抗性AHASL蛋白的基因或多核苷酸，所述AHASL蛋白含有单一的、两个或更多个突变。本发明所述芸苔属植物还包括种子和子代植物，其包含至少一个拷贝的编码本发明所述的除草剂抗性AHASL蛋白的基因或多核苷酸。所产生的种子或子代植物(其包含一个编码含有单一的、两个或更多个突变的AHASL多肽的多核苷酸；或者包含两个或更多个编码AHASL单一突变多肽的多核苷酸)，相对于单一植物之中的AHASL单一突变多肽所预测的来说，表现出对于AHAS-抑制性除草剂的出乎意料的高水平耐药性，所述AHAS-抑制性除草 剂例如咪唑啉酮除草剂或磺酰脲除草剂。其植物和子代表现出除草剂耐药性的协同效应而不是加成效应，其中包含多个突变的植物和子代中除草剂耐药性的水平比包含AHASL单一突变蛋白的植物高。
[0019] 本发明提供了在本发明所述转基因和非转基因的除草剂抗性植物附近控制杂草的方法。这样的植物包括例如以上所描述的除草剂抗性芸苔属植物和用编码本发明所述除草剂抗性AHASL蛋白的多核苷酸分子转化的植物。经转化的植物在其基因组中包含至少一个表达框，该表达框包含在植物细胞中驱动基因表达的启动子，其中该启动子与本发明所述AHASL多核苷酸可操作地连接。所述方法包括：将有效量的除草剂施用于杂草和除草剂抗性植物，其中除草剂抗性植物与野生型或未转化的植物相比，对于至少一种除草剂特别是咪唑啉酮或磺酰脲除草剂具有增加的抗性。本发明提供了在植物中增加AHAS活性的方法，以产生除草剂抗性植物，以及在除草剂耐药性植物中增加除草剂耐药性。在本发明的一些实施方式中，方法包括：使用多核苷酸构建体转化植物细胞，所述多核苷酸构建体包含与启动子可操作地连接的核苷酸序列，所述启动子驱动(所述核苷酸序列)在植物细胞中的表达；并从经转化的植物细胞中再生出转化的植物。核苷酸序列选自那些编码本发明所述除草剂抗性AHASL蛋白的核苷酸序列。在其它实施方式中，方法包括常规的植物育种方法，其包括：将本发明所述除草剂抗性植物与另一种植物杂交授粉，还可包括选择子代植物，所述子代植物包含亲代植物即本发明所述除草剂抗性植物的除草剂抗性特性。
[0020] 本发明进一步提供了芸苔属AHASL蛋白的分离的多核苷酸分子和分离的多肽。本发明所述多核苷酸分子包含编码本发明所述除草剂抗性AHASL蛋白的核苷酸序列。本发明所述除草剂抗性AHASL蛋白包含由选自下列的核苷酸序列编码的多肽：a)如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列；b)如SEQID NO：14所示的核苷酸序列；c)如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列；d)与如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列有至少90％序列同一性的核苷酸序列，其中该蛋白在对应于SEQ ID NO：1的653位、或SEQ ID NO：2的638位或SEQ ID NO：3的635位上是天冬酰胺；e)与如SEQ ID NO∶14所示的核苷酸序列有至少90％序列同一性的核苷酸序列，其中该蛋白在对应于S EQID NO：1的122位、或SEQ ID NO：4的107位或SEQ ID NO：5的104位上是苏氨酸；f)与如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列有至少90％序列同一性的 核苷酸序列，其中该蛋白在对应于SEQ ID NO：1的122位、或SEQ ID NO：4的107位或SEQ ID NO∶5的104位上是苏氨酸。上述AHASL蛋白进一步包含至少一个选自下列的突变：a)在对应于SEQ ID NO：1的653位、或SEQID NO∶2的638位或SEQ ID NO：3的635位上的天冬酰胺；b)在对应于SEQID NO：1的122位、SEQ ID NO：4的107位或SEQ ID NO：5的104位上的苏氨酸；c)在对应于SEQ ID NO：1的574位或SEQ ID NO：6的557位上的亮氨酸。
[0022] 图1显示了以下基因的编码区域的核苷酸序列的比对：来自拟南芥的野生型AHASL基因(AtAHASL，SEQ ID NO：11)、来自J04E-0044品系的芥菜的除草剂抗性BiAHASL1B-S653N基因(J04E-0044，SEQ ID NO：12)、来自J04E-O139品系的芥菜的除草剂抗性BiAHASL1A-S653N基因(J04E-0139，SEQ ID NO：13)、来自J04E-0130品系的芥菜的除草剂抗性BiAHASL1B-A122T基因(J04E-0130，SEQ ID NO：14)、来自J04E-0122品系的芥菜的除草剂抗性BjAHASL1A-A122T基因(BjAHASL1A，SEQ1DNO：15)、来自PM2品系的油菜的除草剂抗性BnAHASL1A-w574L基因(BnAHASLl A，SEQ ID NO：16)、芥菜的野生型BjAHASL1A基因(BjAHASL1A，SEQ ID NO：17)、芥菜的野生型BjAHASL1B基因(BjAHASL1B，SEQ ID NO：18)、油菜的野生型BnAHASL1A基因(BnAHASL1A，SEQ ID NO：19)、油菜的野生型BnAHASL1C基因(BnAHASL1C，SEQ ID NO：20)。使用Fast Algor1thm(间隙开口15，间隙延伸6.66，间隙分离8，矩阵(matrix)为swgapdnamt)在Vector NTI软件包中进行分析。
[0023] 图2显示了以下基因的氨基酸序列的比对：来自拟南芥的野生型AHASI基因(AtAHASL，SEQ ID NO：1)、来自J04E-0044品系的芥菜的除草剂抗生BiAHASL1B-S653N基因(J04E-0044，SEQ ID NO∶2)、来自J04E-0139品系的芥菜的除草剂抗生BjAHASL1A-S653N基因(J04E-0139，SEQ IDNO：3)、来自J04E-0130品系的芥菜的除草剂抗性BjAHAS L1B-A122T基因 (J04E-0130，SEQ ID NO：4)、来自J04E-0122品系的芥菜的除草剂抗性BjAHASL1A-A122T基因(BjAHASL1A，SEQ ID NO：5)、来自PM2品系的油菜的除草剂抗性BnAHASL1A-W574L基因(BnAHAS L1A，SEQ ID NO：6)、芥菜的野生型BjAHAS L1A基因(BjAHASL1A，SEQ ID NO∶7)、芥菜的野生型BjAHASL1B基因(BjAHASL1B，SEQ ID NO：8)、油菜的野生型BnAHASL1A基因(BnAHAS L1A，SEQ ID NO：9)、油菜的野生型BnAHASL1C基因(BnAHASL1C，SEQ ID NO：10)。使用Fast Algorithm(间隙开口罚分=10，间隙延伸罚分=0.05，间隙分离罚分=8，blosum62MT2矩阵)在Vector NTI软件包中进行分析。
[0024] 图3为显示芥菜植物品系的AHAS酶活性分析的柱形图。
[0025] 图4为显示芥菜植物品系的温室喷洒结果的图。
[0026] 图5是显示对应的DNA或蛋白质序列的SEQ ID编号的表格。
[0027] 图6提供了在100μM甲氧咪草烟(Imazamox)存在下，从纯合芥菜品系中分离的蛋白提取物中的AHAS酶活性，所述纯合芥菜品系含有aR、bR、A107T和A104T芥菜突变的组合，这些突变彼此堆积(stack)并与在芥菜中基因渗入的(introgressed)PM2突变堆积。
[0028] 图7提供了在温室中喷洒35g ai／ha的甲氧咪草烟之后两周，芥菜F2品系的平均植物损伤(植物毒性)，所述芥菜F2品系含有不同的接合性(zygosity)和aR与A107T AHAS突变的组合。
[0029] 图8提供了喷洒35g ai／ha等量的甲氧咪草烟 之后两周纯合芥菜DH品系的平均植物毒性，所述纯合芥菜DH品系含有aR、bR、A107T和A104T芥菜突变的组合，这些突变彼此堆积并与在芥菜中基因渗入的PM2突变堆积。
[0030] 发明详述
[0031] 本发明涉及与野生型芸苔属植物相比具有增加的除草剂抗性的芸苔属植物。按照下文详细描述产生除草剂抗性的芸苔属植物：将分离的、野生型(针对除草剂抗性而言)芸苔属小孢子暴露于诱变物质，在有效量咪唑啉酮除草剂存在的情况下培养所述小孢子，并选择存活下来的胚芽(embryos)。从存活下来的胚芽中产生单倍体芸苔属植物，然后进行染色体加倍化以产生可繁殖的双单倍体芸苔属植物，其与野生型芸苔属植物相比对咪唑啉酮除草 剂表现出增加的抗性。在一个实施方式中，本发明提供了按照如下详细描述的小孢子诱变所产生的除草剂抗性芸苔属品系，将其称为J04E-0139。在另一个实施方式中，本发明提供了从小孢子诱变所产生的除草剂抗性芸苔属品系，将其称为J04E-0130。在另一个实施方式中，本发明提供了从小孢子诱变所产生的除草剂抗性芸苔属品系，将其称为J04E-0122。在另一个实施方式中，本发明提供了从芥菜bR突变品系(U.S.2005／0283858)与PM2突变品系(参见US2004／0142353和US2004／0171027；还参见Hattori等人，
Mol.Gen.Genet.246：419-425，1995)杂交产生的除草剂抗性芸苔属品系，将其称为J05Z-
07801，所述PM2突变品系最初是从油菜中基因渗入芥菜中。
Mol.Gen.Genet.246：419-425，1995)杂交产生的除草剂抗性芸苔属品系，将其称为J05Z-
07801，所述PM2突变品系最初是从油菜中基因渗入芥菜中。
[0032] 因此，本发明提供了对抑制AHAS的除草剂具有抗性的芥菜植物。提供了在至少一个AHASL多核苷酸中具有单一突变的芥菜品系，其中单一突变选自：在对应于拟南芥AHASL1序列的653位置上从G到A的转变和在对应于拟南芥AHASL1序列的122氨基酸位置上从G到A的转变。
[0033] 通过聚合酶链反应(PCR)扩增，从J04E-0139除草剂抗性芥菜植物和野生型芥菜植物两者中都分离了乙酰羟酸合成酶大亚基基因(称作AHASL1)的编码区域，并进行了测序。通过比较除草剂抗性和野生型芸苔属植物的多核苷酸序列发现：来自除草剂抗性芸苔属植物的AHASL1多核苷酸序列的编码区位于芥菜的A基因组上，其与野生型植物的AHAS L1多核苷酸序列有一个核苷酸的差别，即G转变为A(图1)。AHAS L1多核苷酸序列中的这个G到A的转变导致：相对于野生型AHASL1蛋白的氨基酸序列来说，在AHASL1蛋白的预测氨基酸序列的保守区域内，在635位氨基酸(对应于拟南芥AHASL1的653位氨基酸)上，发生了新型的从Ser到Asn的替换(图2)。
[0034] 通过聚合酶链反应(PCR)扩增，从J04E-0130除草剂抗性芥菜植物和野生型芥菜植物两者中都分离了乙酰羟酸合成酶大亚基基因(称作AHASL1)的编码区域，并进行了测序。通过比较除草剂抗性和野生型芸苔属植物的多核苷酸序列发现：来自除草剂抗性芸苔属植物品系J04E-130的AHASL1多核苷酸序列的编码区位于芥菜的B基因组上，其与野生型植物的AHASL1多核苷酸序列有一个核苷酸的差别，即G转变为A(图1)。AHASL1多核苷酸序列中的这个G到A的转变导致：相对于野生型AHASL1蛋白的氨基酸序列来说，在AHASL1蛋白的预测氨基酸序列的保守区域内， 在107位氨基酸(对应于拟南芥AHAS L1的122位氨基酸)上，发生了新型的从Ala到Thr的替换(图2)。
[0035] 通过聚合酶链反应(PCR)扩增，从J04E-0122除草剂抗性芥菜植物和野生型芥菜植物两者中都分离了乙酰羟酸合成酶大亚基基因(称作AHASL1)的编码区域，并进行了测序。通过比较除草剂抗性和野生型芸苔属植物的多核苷酸序列发现：来自除草剂抗性芸苔属植物品系J04E-122的AHASL1多核苷酸序列的编码区位于芥菜的A基因组上，其与野生型植物的AHASL1多核苷酸序列有一个核苷酸的差别，即G转变为A(图1)。AHASL1多核苷酸序列中的这个G到A的转变导致：相对于野生型AHAS L1蛋白的氨基酸序列来说，在AHASL1蛋白的预测氨基酸序列的保守区域内，在104位氨基酸(对应于拟南芥AHASL1的122位氨基酸)上，发生了新型的从Ala到Thr的替换(图2)。
[0036] 本公开还提供了含有至少两个突变的AHASL多核苷酸的芥菜植物。这样的植物本文还称作含有“堆积(stacked)”突变的植物。突变可以位于芥菜植物的相同或不同的基因组上。芥菜植物可含有任意数量的突变的AHASL多核苷酸和突变的任意组合，包括但不限于对应于SEQ ID NO：1的653位、SEQ ID NO：2的638位、SEQ ID NO：3的635位、SEQ ID NO：1的122位、SEQ ID NO：4的107位、SEQ ID NO：5的104位、SEQ ID NO：1的574位或SEQ ID NO：6的
557位的突变。
557位的突变。
[0037] 本文还提供了在不同的基因组上具有两个突变的AHASL多核苷酸的芥菜植物，其中一个突变的AHASL多核苷酸在A基因组上，第二个突变的AHASL多核苷酸在B基因组上。这样的具有两个突变的AHASL多核苷酸的芥菜植物包括含有bR突变和PM2突变的芥菜植物。这样的植物包括芥菜品系J05Z-07801及其种子，和通过与芥菜品系J05Z-07801杂交而获得的子代和后代。在另一个方面，具有两个突变的AHASL多核苷酸的芥菜植物包括在子代芥菜品系中组合了aR突变(例如来自J04E-0139品系)和A122T突变(例如来自J04E-0130品系)的那些。在一个方面，这样的组合了两个AHASL1突变的植物与分别含有单独突变的芥菜植物的除草剂耐药水平的加和相比，表现出协同水平的除草剂耐药性。
[0038] 按照Swanson等人(Plant Cell Reports7：83-87(1989))的描述，使用油菜的小孢子诱变发展了PM1和PM2突变。被认为位于油菜A基因组上 (Rutledge等人Mol.Gen.Genet.229：31-40(1991))的PM2突变的特征为，在AHAS3基因的3’末端存在单一核苷酸变化(G到T)，这导致从Trp到Leu的氨基酸变化，Trp556(Bn)Leu(Hattori等人，Mol.Gen.Genet.246：419-425，1995)。被认为是位于油菜的C基因组(Rutledge等人Mol.Gen.Genet.229：31-40(1991))上的PM1突变，其特征为在AHAS1基因上存在单一核苷酸变化(G到A)，这导致从Ser到Asn的氨基酸变化，Ser638(Bn)Asn(参见Sathasivan等人，Plant Physiol.97：1044-1050，1991，和Hattori等人，Mol.Gen.Genet.232：167-173，1992；
还参见US2004／0142353和US2004／0171027)。已经报道：突变的PM1(AHAS1)和PM2(AHAS3)基因以相加的方式作用来提供对于咪唑啉酮除草剂的耐药性(Swanson等人，
Theor.Appl.Genet.78：525-530，1989)。
还参见US2004／0142353和US2004／0171027)。已经报道：突变的PM1(AHAS1)和PM2(AHAS3)基因以相加的方式作用来提供对于咪唑啉酮除草剂的耐药性(Swanson等人，
Theor.Appl.Genet.78：525-530，1989)。
[0039] 由于PM2被认为是位于油菜的A基因组上，且芥菜和芜菁(Brassica rapa)均含有A基因组，所以可通过杂交这些种(基因渗入)并在低除草剂浓度下选择来实现将PM2突变基因从油菜转移入芥菜或芜菁。由于PM1被认为是位于油菜的C基因组上，将此突变从油菜中基因渗入芥菜(A、B)或芜菁(A、A)中要困难得多，因为其依赖于极少发生的染色体易位事件(即在油菜的C基因组和芥菜的A或B基因组之间)。这种染色体易位事件经常受到缺乏稳定性及不能够消除连锁拖动这一问题(使用该方法时经常发生该问题)的牵制。美国专利号6，613，963公开了使用基因渗入方法产生的除草剂耐药性PM1／PM2芥菜植物。基于油菜中PM1和PM2提供的加和性耐药性，可以遇见将这两个突变，PM1和PM2，基因渗入进入芥菜将提供加和性除草剂耐药性。
[0040] 为了克服与“将除草剂耐药性特性从油菜的C基因组转移进入芜菁和／或芥菜的A或B基因组”相关的问题，有利的是直接在所需要的基因组中产生突变。美国专利申请2005／0283858公开了除草剂耐药性芥菜AHAS1突变bR，其通过直接诱变在AHAS1基因上产生SNP，从而在B基因组的AHASL基因上引起Ser638Asn的替换(使用拟南芥AHASL氨基酸位置命名法则为653位)。
[0041] 这里所提供的具有两个或更多个AHASL突变的芥菜植物与单独突变的加和水平的抗性相比，具有增加的除草剂抗性水平。与单独突变的AHASL的加和水平的抗性相比，具有两个或更多个AHASL突变的植物可具有比其 高10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更高水平的抗性。
[0042] 抗性的增加可通过任何测定AHAS抗性的方法来测定。例如，可在使用AHAS-抑制性除草剂处理后10、12、14、16、18、20、22、24、26或28天或更多天的时间段，通过测定芥菜中抗性的百分率来测定。然后将抗性百分率与分别含有单独AHASL突变的植物的抗性百分率的加和的水平相比较。在一个方面，在植物中使用2x数量的AHAS-抑制性除草剂处理后14天测定抗性百分率从而确定抗性。
[0043] 本发明还涉及分离的多核苷酸分子，其包含编码乙酰羟酸合成酶大亚基(AHASL)蛋白的核苷酸序列，本发明还涉及这样的AHASL蛋白。本发明揭示了从除草剂抗性的芸苔属植物分离编码除草剂抗性芸苔属AHASL1蛋白的多核苷酸，还揭示了所述多核苷酸的核苷酸序列，所述除草剂抗性芸苔属植物是通过对野生型芸苔属植物进行化学诱变而产生的。本发明所述除草剂抗性AHASL1蛋白在位于A基因组的芥菜AHAS L1基因的635位上具有丝氨酸到天冬酰胺的替代；或在位于B基因组的芥菜AHASL1基因的107位上具有丙氨酸到苏氨酸的替代；或在位于A基因组的芥菜AHAS L1基因的104位上具有丙氨酸到苏氨酸的替代。本发明还揭示了编码野生型芸苔属AHASL1蛋白的多核苷酸分子的分离和核苷酸序列。
[0044] 本发明提供了编码来自芸苔属特别是芥菜的AHASL1蛋白的分离的多核苷酸分子。特别地，本发明提供了包含以下核苷酸序列的分离的多核苷酸分子：如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列，编码含有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的AHAS L1蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列，编码含有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的AHAS L1蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列，编码含有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的AHASL1蛋白的核苷酸序列，以及上述核苷酸序列的编码功能性AHASL1蛋白的片段和变体。
[0045] 本发明所述分离的除草剂抗性AHASL1多核苷酸分子包含编码除草剂抗性AHASL1蛋白的核苷酸序列。这样的多核苷酸分子可用于多核苷酸构建体以转化植物特别是农作物植物，从而增强植物对除草剂、特别是对已知抑制AHAS活性的除草剂、更特别的是对咪唑啉酮除草剂的抗性。这样的多核苷酸构建体可用于表达框、表达载体、转化载体、质粒等。使用这样的多核苷酸构建体转化之后所获得的转基因植物表现出对AHAS-抑制性除草剂 例如咪唑啉酮和磺酰脲除草剂的增加的抗性。
[0046] 本发明的组合物包含编码AHASL1蛋白的核苷酸序列。特别地，本发明提供了分离的多核苷酸分子，其包含编码如SEQ ID NO：3、4或5所示的氨基酸序列的核苷酸序列；以及多核苷酸分子的片段和变体，所述片段和变体编码包含AHAS活性的多肽。本发明进一步提供了多肽，其具有由本文所描述的多核苷酸分子编码的氨基酸序列，所述多核苷酸例如SEQ ID NO：13、14或15所示的核苷酸序列，以及其片段和变体，所述片段和变体编码包含AHAS活性的多肽。
[0047] 本发明提供了在本文所描述的芸苔属AHASL蛋白的保守区域内的特定氨基酸位置上具有氨基酸替换的AHASL蛋白。除非本文另外指明，否则特定氨基酸位置是指如SEQ ID NO：1所示的拟南芥AHASL全长氨基酸序列中的氨基酸位置。另外，本领域普通技术人员将认识到，这样的氨基酸位置将会根据是否有氨基酸被添加到例如氨基酸序列的N末端或者有氨基酸从氨基酸序列的N末端被切除而变化。因此，本发明包括在所述位置或等同位置上的氨基酸替换(例如，“氨基酸位置653或等同位置”)。“等同位置”是指与示例性氨基酸位置位于相同的保守区域内的位置。例如，SEQ ID NO：1中的122位氨基酸是SEQ ID NO：4中的107位氨基酸的等同位置，也是SEQID NO：5中的104位氨基酸的等同位置。类似的，具有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的拟南芥AHASL蛋白中的氨基酸653位是芸苔属AHAS L1B蛋白中的氨基酸638位的等同位置，也是芸苔属AHASL1A蛋白中的氨基酸635位的等同位置，芸苔属AHASL1B蛋白和芸苔属AHASL1A蛋白分别具有如SEQ ID NO：2和3所示的氨基酸序列。
[0048] 本发明包括分离的或基本上纯化的核酸或蛋白组合物。“分离的”或“纯化的”多核苷酸分子或蛋白，或其生物活性部分，基本上或实质上不含那些在自然发生的环境中通常伴随多核苷酸分子或蛋白的成分、或通常与多核苷酸分子或蛋白相互作用的成分。因此，分离的或纯化的多核苷酸分子或蛋白基本上不含其它细胞材料；或基本上不含培养液，如果是通过重组技术生产的话；或者，基本上不含化学前体或其它化学物质，如果是通过化学合成的话。优选地，“分离的”核酸不含那些核酸所源自的生物体的基因组DNA中核酸侧翼序列(优选为蛋白编码序列)(即位于核酸的5’或3’末端的序列)。例如，在各种实施方式中，分离的多核苷酸分子可含有少于核酸所源 自的细胞的基因组DNA中的多核苷酸分子的侧翼序列的约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、0.1kb的序列。基本上不含细胞材料的蛋白包括那些含有低于污染蛋白的约30％、20％、10％、5％、1％干重的蛋白制备物。当本发明所述蛋白或其生物活性部分通过重组方式产生时，优选地，培养液代表少于化学前体或非目的蛋白性化学物质的约30％、20％、10％、5％、1％的干重。
[0049] 本发明提供了包括AHASL1蛋白的分离多肽。分离的多肽包含选自下列的氨基酸序列：如SEQ ID NO：3、4或5所示的氨基酸序列；由SEQ ID NO：13、14或15所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列；所述氨基酸序列的功能性片段或变体，所述片段或变体编码包含AHAS活性的AHASL1多肽。“功能性片段或变体”是指示例性的多肽的片段或变体，其包含AHAS活性。
[0050] 在本发明的一些实施方式中，方法包括使用除草剂耐药性或除草剂抗性植物。“除草剂耐药性”或“除草剂抗性”植物是指对在通常将杀死或抑制正常或野生型植物生长的水平上的至少一种除草剂具有耐药性或抗性。在本发明的一个实施方式中，除草剂耐药性植物包含除草剂耐药性或除草剂抗性AHASL蛋白。“除草剂耐药性AHASL蛋白”或“除草剂抗性AHASL蛋白”是指：在已知干扰AHAS活性的至少一种除草剂存在且该除草剂的浓度或水平已知可抑制野生型AHASL蛋白的AHAS活性的情况下，相对于野生型AHASL蛋白的AHAS活性来说，表现出更高的AHAS活性的AHASL蛋白。此外，这样的除草剂耐药性或除草剂抗性AHASL蛋白的AHAS活性在本文中可被称为“除草剂耐药性的”或“除草剂抗性的”AHAS活性。
[0051] 对于本发明，术语“除草剂耐药性的”和“除草剂抗性的”可相互替换地使用，其具有相同的意思和范围。类似地，术语“除草剂耐药性”和“除草剂抗性”可相互替换地使用，其具有等同的意思和范围。同样地，术语“咪唑啉酮抗性的”和“咪唑啉酮抗性”可分别与“咪唑啉酮耐药性的”和“咪唑啉酮耐药性”相互替换地使用，其具有等同的意思和范围。
[0052] 本发明包括除草剂抗性AHASL1多核苷酸和除草剂抗性AHASL1蛋白。“除草剂抗性AHASL1多核苷酸”是指编码含有除草剂抗性AHAS活性的蛋白的多核苷酸。“除草剂抗性AHASL1蛋白”是指含有除草剂抗性AHAS活性的蛋白或多肽。
[0053] 此外，应认识到可通过使用编码除草剂耐药性或除草剂抗性AHASL蛋 白的核苷酸序列转化植物或其原种(ancestor)而将除草剂耐药性或除草剂抗性AHASL蛋白引入植物。这样的除草剂耐药性或除草剂抗性AHASL蛋白由除草剂耐药性或除草剂抗性AHASL多核苷酸所编码。或者，除草剂耐药性或除草剂抗性AHASL蛋白可以由于自然发生而在植物中产生，或者由于在植物或其祖先(progenitor)中的内源AHASL基因的诱导的突变而产生。
[0054] 本发明提供了植物、植物组织、植物细胞和宿主细胞，它们对于至少一种除草剂特别是干扰AHAS酶活性的除草剂，更特别是咪唑啉酮或磺酰脲除草剂，具有增加的和／或增强的抗性或耐药性。术语“增强的”是指抗性或耐药性数量比预期的要高。优选的除草剂的数量或浓度为“有效量”或“有效浓度”。“有效量”和“有效浓度”分别是指这样的数量和浓度，其足以杀死或抑制相似的野生型植物、植物组织、植物细胞、小孢子或宿主细胞的生长，但是所述数量不会杀死或严重抑制本发明所述除草剂抗性植物、植物组织、植物细胞、小孢子或宿主细胞的生长。通常，除草剂的有效量是在农业生产系统中常规用于杀死目的杂草的数量。这样的数量对于本领域普通技术人员来说是已知的，或者可使用本领域已知技术容易地确定。此外，还应该认识到，农业生产系统中所使用的除草剂有效量可能与植物培养系统例如小孢子培养系统中所使用的除草剂的有效量是实质上不同的。
[0055] 本发明所述除草剂是那些干扰AHAS酶活性的除草剂，以致在该除草剂存在的情况下，AHAS酶的活性被降低。这样的除草剂在本文中也可被称为“AHAS-抑制性除草剂”或简单称作“AHAS抑制剂”。本文中所用的“AHAS-抑制性除草剂”或“AHAS抑制剂”不是限定于干扰AHAS酶的单一除草剂。因此，除非另有指明或上下文有证据表明，否则“AHAS-抑制性除草剂”或“AHAS抑制剂”可以是一种除草剂或两种、三种、四种或更多种除草剂的混合物，其中每种除草剂均干扰AHAS酶的活性。
[0056] “相似的野生型植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞”是指缺少除草剂抗性特性和／或本文中所揭示的本发明特定多核苷酸的植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞。因此，术语“野生型”的使用不是指植物、植物组织、植物细胞或其它宿主细胞在其基因组中缺少重组DNA和／或不具有不同于本文所描述的除草剂抗性特性。
[0057] 除非另外清晰指明，否则本文所用的术语“植物”是指处于任何发育阶段的植物，以及植物的任何部分，所述部分可以附着于或分离于整个完整植 物。这样的植物的部分包括但不限于植物的器官、组织和细胞，包括植物愈伤组织、植物团块(c1umps)、植物原生质体和植物细胞组织培养物，植物可从所述这些部分再生。特别的植物部分的例子包括茎、叶、根、花序、花、小花(floret)、果实、花梗(pedicle)、花序梗(peduncle)、雄蕊、花药、柱头、花柱、子房、花瓣、萼片、心皮、根尖、根冠、根毛、叶毛、种毛、花粉粒、小孢子、胚芽(embryos)、胚珠、子叶、胚轴、上胚轴、木质部、韧皮部、薄壁组织、胚乳、伴胞、保卫细胞以及任何已知的植物器官、组织和细胞。此外，应该认识到种子是植物。
[0058] 本发明所述植物既包括非转基因植物也包括转基因植物。“非转基因植物”是指在其基因组中缺少重组DNA的植物。“转基因植物”是指在其基因组中含有重组DNA的植物。这样的转基因植物可通过将重组DNA引入植物的基因组中来产生。当这样的重组DNA被引入转基因植物的基因组中时，植物的子代也会含有重组DNA。含有至少一个祖先转基因植物的重组DNA的至少一部分的子代植物也是转基因植物。
[0059] 本发明提供了除草剂抗性芸苔属品系，本文中称为J04E-0122（Mustard,Brassica Juncea）。已经于2006年10月19日将芸苔属J04E-0122品系的至少2500个种子保藏于专利保藏机构美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Mansassas,VA20110USA)，ATCC专利保藏号为PTA-7944。本发明提供了除草剂抗性芸苔属品系，本文中称为J04E-0130（Mustard,Brassica Juncea）。已经于2006年10月19日将芸苔属J04E-0130品系的至少2500个种子提交保藏，并被分配了ATCC专利保藏号PTA-7945。本发明提供了除草剂抗性芸苔属品系，本文中称为J04E-0139（Mustard,Brassica Juncea）。已经于2006年10月19日将芸苔属J04E-0139品系的至少2500个种子提交保藏，并被分配了ATCC专利保藏号PTA-7946。本发明提供了除草剂抗性双突变芸苔属品系，本文中称为J04Z-07801（Mustard,Brassica Juncea）。已经于2007年4月2日将芸苔属J04Z-07801品系的至少625个种子提交保藏，其余1875个种子于2008年1月15日提交保藏，并被分配了ATCC专利保藏号PTA-8305。本发明提供了芸苔属品系，本文中称为J04E-0044（Canola seed Brassica Juncea L Czern,and Coss）。已经于2004年11月
22日将芸苔属J04E-0044品系的种子提交保藏，并被分配了ATCC专利保藏号PTA-6324。保藏将在国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约下保持。芸苔属品系J04E-0122、J04E-0130、J04E-0130和J05Z-07801将持续至少30年以及ATCC收到最新的提供保藏样品需求之后至少5年。另外，申请人满足了37C.F.R.§§1.801-1.809的所有要求，包括提供样品存活性的指征。
22日将芸苔属J04E-0044品系的种子提交保藏，并被分配了ATCC专利保藏号PTA-6324。保藏将在国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约下保持。芸苔属品系J04E-0122、J04E-0130、J04E-0130和J05Z-07801将持续至少30年以及ATCC收到最新的提供保藏样品需求之后至少5年。另外，申请人满足了37C.F.R.§§1.801-1.809的所有要求，包括提供样品存活性的指征。
[0060] 本发明所述单一突变除草剂抗性芸苔属品系J04E-0122、J04E-0130、 J04E-0139是通过突变育种产生的。将野生型芸苔属小孢子暴露于诱变物质特别是化学诱变物质，更特别是乙基亚硝基脲(ENU)，而进行诱变。但是，本发明不限于通过包括化学诱变物质ENU在内的诱变方法而产生的除草剂抗性芸苔属植物。任何本领域已知的诱变方法均可用于产生本发明所述除草剂抗性芸苔属植物。这样的诱变方法可包括，例如，使用下列任何一个或多个诱变物质：射线例如X射线、γ射线(例如钴60或铯137)、中子(例如原子反应器中铀235核裂变产物)、β射线(例如从放射性同位素例如磷32或碳14中发射出)和紫外线(优选为250至290nn)；和化学诱变物质例如甲磺酸乙酯(EMS)、碱类似物(例如5-溴尿嘧啶)、相关化合物(例如8-乙氧基咖啡因)、抗生素(例如链黑菌素)、烷基化试剂(例如硫芥、氮芥、环氧化物、乙撑胺(ethylenamine)、硫酸盐、磺酸盐、砜、内酯)、叠氮化物、羟胺、亚硝酸或吖啶。还可通过使用组织培养方法来选择含有除草剂抗性突变的植物细胞然后从中再生出除草剂抗性植物来产生除草剂抗性植物。参见，例如美国专利号5,773，702和5，859，348，二者通过参考方式全文引入本文。可以在“Principals of Cultivar Development”Fehr，1993Macmillan Publishing Company中找到突变育种的进一步的细节，该文献通过参考方式引入本文。
[0061] 对芸苔属植物J04E-0139品系的AHASL1基因的分析揭示出一个突变，该突变在A基因组上芥菜AHASL基因的氨基酸635位引起从丝氨酸到天冬酰胺的替换，并且赋予对除草剂的增加的抗性。因此，本发明揭示了，在635位(对应于拟南芥AHASL1的653位氨基酸)用另一种氨基酸替换丝氨酸可引起芸苔属植物对除草剂特别是咪唑啉酮和／或磺酰脲除草剂产生增加的抗性。本发明所述除草剂抗性芸苔属植物包括但不限于这样的芸苔属植物，其在基因组中含有至少一个拷贝的编码除草剂抗性AHASL1蛋白的AHASL1多核苷酸，所述除草剂抗性AHASL1蛋白在氨基酸635位或等同位置上包含天冬酰胺。
[0062] 对芸苔属植物J04E-0130品系的AHASL1基因的分析揭示出一个突变，该突变在B基因组上芥菜AHASL基因的氨基酸107位引起从丙氨酸到苏氨酸的替换，并且赋予对除草剂的增加的抗性。因此，本发明揭示了，在107位(对应于拟南芥AHASL1的122位氨基酸)用另一种氨基酸替换丙氨酸可引起芸苔属植物对除草剂特别是咪唑啉酮和／或磺酰脲除草剂产生增加的 抗性。本发明所述除草剂抗性芸苔属植物包括但不限于这样的芸苔属植物，其在基因组中含有至少一个拷贝的编码除草剂抗性AHASL1蛋白的AHASL1多核苷酸，所述除草剂抗性AHASL1蛋白在氨基酸107位或等同位置上包含苏氨酸。
[0063] 对芸苔属植物J04E-0122品系的AHASL1基因的分析揭示出一个突变，该突变在A基因组上芥菜AHASL基因的氨基酸104位引起从丙氨酸到苏氨酸的替换，并且赋予对除草剂的增加的抗性。因此，本发明揭示了，在104位(对应于拟南芥AHASL1的122位氨基酸)用另一种氨基酸替换丙氨酸可引起芸苔属植物对除草剂特别是咪唑啉酮和／或磺酰脲除草剂产生增加的抗性。本发明所述除草剂抗性芸苔属植物包括但不限于这样的芸苔属植物，其在基因组中含有至少一个拷贝的编码除草剂抗性AHASL1蛋白的AHASL1多核苷酸，所述除草剂抗性AHASL1蛋白在氨基酸104位或等同位置上包含苏氨酸。
[0064] 本发明所述芸苔属植物还包括这样的植物，其相对于野生型AHASL1蛋白来说，在氨基酸653位(拟南芥命名法)上包含天冬酰胺，在氨基酸122位(拟南芥命名法)上包含苏氨酸，以及相对于野生型AHASL1蛋白来说，在AHASL1蛋白上具有一个或多个另外的氨基酸取代，其中这样的芸苔属植物与野生型芸苔属植物相比，对于至少一种除草剂具有增加的抗性。
[0065] 本发明提供了植物、制备AHAS除草剂抗性的芸苔属植物的方法、具有对AHAS除草剂增加的耐药性的芸苔属植物、以及这样的植物的种子。因此，这里所示例的植物可用于育种项目以发展另外的除草剂抗性芥菜植物，例如芥菜的商业品种。根据这些方法，可将第一芸苔属亲代植物与第二芸苔属亲代植物杂交，其中第一或第二芸苔属植物中的至少一种含有至少一个AHAS除草剂抗性突变。此方法的一个应用为生产F1杂交植物。此方法的另一个重要方面为用于发展新的亲代植物，双单倍体或近交(inbred)系。例如，本文所描述的芸苔属品系可与任何第二植物杂交，所得到的杂交子代每个自花授精和／或同胞交配(sibbed)约5至7或更多代，因此提供很多的不同的亲代品系。然后将这些亲代品系与其它品系杂交，分析所得到的杂交子代的有益特性。根据这种方法，可以鉴定赋予了所需要特性的新的品系。在该方法中可使用各种育种方式，包括单倍体化、谱系育种(pedigree breeding)、单粒传(single-seed descent)、改进的单粒传、轮回选择(recurrent selection) 以及回交。
[0066] 可通过天然或机械方法进行芸苔属品系的杂交。可通过控制转移到柱头上的花粉类型或者通过手工传粉来实现机械授粉。
[0067] 可通过任何方法来评价后代和／或子代芸苔属植物以确定突变的AHASL多核苷酸或多肽的存在。这样的方法包括表型评价、基因型评价或其组合。可以在子代芸苔属植物的后续传代中评价除草剂抗性和其它所需要的特性。可通过将植物暴露于一种或多种合适的AHAS-抑制性除草剂并评价除草剂损伤来评价对于AHAS-抑制剂除草剂的抗性。一些特性，例如抗倒性和植株高度，可通过目视调查来评价；而早熟则可通过目视调查荚果(pod)(长角果)内的种子来评价。其它的特性，例如种子中的含油百分率、蛋白质百分率和总芥子油苷(glucosinolate)可使用近红外光谱技术和／或液相色谱和／或气相色谱来评价。
[0068] 对芸苔属植物的基因型评价包括使用以下技术：例如同工酶电泳、限制性酶切片断多样性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、随意引物聚合酶链反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹(DAF)、序列特异性扩增区(SCAR)、扩增片断多样性(AFLP)、简单重复序列(SSR)(也称为微卫星)。这里所提供的用于分析芸苔属植物基因型的另外的组合物和方法包括在美国专利申请公开号2004／0171027、美国专利申请公开号2005／02080506和美国专利申请公开号2005／0283858中公开的那些，在这里全文引入作为参考。
[0069] 评价和操作(通过暴露于一种或多种合适的AHAS-抑制剂除草剂)可在几个世代中进行。可以使用与对照(check)品种相对比的客观性标准来评价新品系的表现。将表现出所需要的特性组合的品系与另一个品系杂交或者进行自花授粉以产生种子。自花授粉是指花粉从一朵花转移到同一个植物的同一朵花或同一个植物的另一朵花。经过自花授粉并经过很多世代的类型选择的植物在几乎所有的基因座变为纯合子，并产生真实育种子代的统一群体。
[0070] 本发明所述方法中可以使用任何育种方法。在一个实施例中，本发明所述除草剂抗性植物可通过使用单倍体方法来育种。在这样的方法中，将具有需要补充的特性的遗传基础的亲代在简单或复合杂交中进行杂交。杂交(或杂交授粉)是指花粉从一个植物转移到另一个不同的植物。使用本领域技术 人员已知的方法[例如Swanson，E.B.等人，″Efficient isolation ofmicrospores and the production of microspore-derived embryos in Brassica napus，L.Plant Cell Reports，6：94-97(1987)；和Swanson，E.B.，Microspore culture in Brassica，pp。159-169，Methods in Mo1ecular Biology，vol.6，Plant Cell and Tissue Culture，Humana Press，(1990)]使杂交的子代生长，分离并过滤小孢子(未成熟的花粉粒)。这些小孢子表现出基因的分离。在合适的AHAS一抑制性除草剂存在的情况下培育小孢子，所述除草剂例如咪草烟(例如PURSUIT.TM.)或甲氧咪草烟(例如RAPTOR.TM.)或50／50的咪草烟和甲氧咪草烟的混合物(例如ODYSSEY.TM.)，这些除草剂杀死那些缺乏引起除草剂抗性的突变的小孢子。携带引起除草剂抗性的基因的小孢子存活下来并产生胚芽，胚芽形成单倍体植物。然后将其染色体加倍来产生双单倍体。
[0071] 根据本发明也可使用其它育种方法。例如，可以使用谱系育种来改善大部分为自花授粉的作物例如芸苔属和卡诺拉。谱系育种起始于两个基因型的杂交，其中每个基因型具有一个或多个所需要的特性，该特性在另一个基因型中是缺少的或者补充了另一个基因型。如果两个原始的亲代不提供所有的所需要特性，则可在杂交计划中加入另外的亲代。
[0072] 可以用简单或复杂的方式进行这些亲代的杂交，以产生简单或复杂的F1。通过一个或几个F1植物自交或者通过两个F1互交(即同胞交配)而从F1获得F2世代。可以从F2世代开始选择最佳的个体，从F3开始选择最佳家族，在最佳家族中选择最佳个体。可从F4代开始进行家族的复制测试以改善对可遗传性低这一特性的选择的有效性。在近亲交配的较高阶段(即F6和F7)，可以测试最佳品系或表型相似品系的混合物以作为潜在的新的栽培变种。但是，用来发展改善的AHAS-除草剂抗性植物的谱系育种方法比单倍体方法更耗时间，因为植物对多个世代来说表现出基因分离，而所需要特性的恢复是相对较低的。
[0073] 还可使用单粒传(single-seed descent，SSD)程序来培育改良的品种。SSD程序在严格意义上是指种植基因分离的群体，每个植物收获一粒种子样品，使用单一种子的群体来种植下一代。当群体从F2进展到近亲繁殖的所需水平时，品系所源自的植物将每个回溯到不同的F2个体。群体中植物的数量在每个世代中下降，因为一些种子没有成功地发育或一些植物没有产生至少一个种子。结果是，当世代进程结束时，不是所有的最初取样于F2世 代的植物都由子代所代表。
[0074] 在多粒程序中，卡诺拉育种者通常从群体中的每个植物收获一个或多个荚果，然后将其一起脱粒而形成块(bulk)。使用块的一部分来种植下一代，并保留一部分该块。该程序被称为改进的单粒传或荚果-块技术。使用了多粒程序来节省收获时的人力。使用机器对荚果进行脱粒比单粒程序手工从每个之中收取一个种子要快很多。多粒程序还使在近亲繁殖的每一代中种植群体的相同数目的种子成为可能。收获足够的种子以补足那些不发育或不产生种子的植物。
[0075] 可使用回交育种将简单遗传的、高度可遗传的特性的基因从源品种或品系(供体亲代)转进另一个需要的栽培变种或近亲杂交品系(回归亲代)。在最初杂交之后，选择具有供体亲代表型的个体并与回归亲代重复进行杂交(回交)。当完成回交时，预期所得到的植物具有回归亲代的特征和从供体亲代转移而来的需要的特性。
[0076] 还可通过轮回选择来发展改进的品种。鉴定出或者通过几个不同亲代的相互杂交创造出遗传变异群体的杂合子个体。基于个体优越性、杰出子代或优良组合性来选择最佳植物。将所选择的植物相互杂交以产生新的世代，其中继续进行新的选择轮次。
[0077] 在另一个方面，本发明提供了产生对AHAS除草剂有抗性的芸苔属植物的方法，该方法包括：(a)将第一芸苔属品系与第二芸苔属品系杂交以形成基因分离的群体，其中第一芸苔属品系是AHAS除草剂抗性芸苔属植物；(b)筛选该群体的增加的AHAS除草剂抗性；和(c)选择所述群体中相对于野生型芸苔属植物来说具有增加的AHAS抗性的一个或多个成员。
[0078] 在另一个方面，本发明提供了将AHAS除草剂抗性特性基因渗入芸苔属植物中的方法，该方法包括：(a)将至少第一AHAS除草剂抗性的芸苔属品系与第二芸苔属品系杂交以形成基因分离的群体；(b)筛选该群体的增加的AHAS除草剂抗性；和(c)选择所述群体中具有增加的AHAS抗性的至少一个成员。
[0079] 或者，在本发明的另一个方面，第一和第二亲代芸苔属植物可以都是如本文描述的AHAS除草剂抗性芸苔属植物。因此，使用如本文描述的具有增加的AHAS除草剂抗性的芸苔属植物所产生的任何芸苔属植物均构成本发明的一部分。本文所用的杂交可以指自交、同胞交配、回交、与另一个或同 一个亲代品系杂交、与群体杂交等。
[0080] 本发明还提供了通过常规植物育种(包括有性繁殖)而产生除草剂抗性植物特别是除草剂抗性的芸苔属植物的方法。该方法包括：将对除草剂抗性的第一植物与对除草剂无抗性的第二植物杂交。第一植物可以是任何本发明所述除草剂抗性植物，包括例如转基因植物，该转基因植物包含至少一个本发明所述的编码除草剂抗性AHASL的多核苷酸；以及包括非转基因芸苔属植物，其包含J05Z-07801、J04E-0139、J04E-0130或J04E-0122的芸苔属植物的除草剂抗性特性。第二植物可以是当与第一植物杂交时能够产生有活力的子代植物(即种子)的任何植物。通常但不是必要的，第一和第二植物是同一个物种。本发明所述方法还包括将第一次杂交的子代植物与那些和第一或第二植物为相同品系植物或相同基因型的植物进行回交一个或多个世代。或者，第一次杂交的子代或任何后续杂交的子代可以与第三植物杂交，所述第三植物相对于第一或第二植物为不同的品系或基因型。本发明所述方法还可包括选择那些含有第一植物的除草剂抗性特性的植物。
[0081] 本发明还提供了通过常规植物育种(包括有性繁殖)而增加植物特别是除草剂抗性芸苔属植物的除草剂抗性的方法。该方法包括：将对除草剂抗性的第一植物与第二植物杂交，所述第二植物可以对所述除草剂有抗性或无抗性、或对于与第一植物而言的除草剂不同的(一种或多种)除草剂具有抗性。第一植物可以是任何本发明所述除草剂抗性植物，例如转基因植物，其包含至少一个本发明所述的编码除草剂抗性AHASL的多核苷酸；以及非转基因芸苔属植物，其包含J05Z-07801、J04E-0139、J04E-0130或J04E-0122的芸苔属植物的除草剂抗性特性。第二植物可以是当与第一植物杂交时能够产生有活力的子代植物(即种子)的任何植物。通常但不是必要的，第一和第二植物是同一个物种；以及，第一植物和第二植物可以是不同的种但是属于相同的属(例如：芥菜x油菜、芥菜x芜菁、芥菜x甘蓝(Brassica oleracea)、芥菜x黑芥(Brassica nigra)等)；另外，第一植物和第二植物属于不同的属(例如芸苔属x白芥属(Sinapis))。通过本发明所述这种方法产生的子代植物与第一或第二植物或二者相比，具有增加的除草剂抗性。当第一和第二植物对不同的除草剂具有抗性时，子代植物将具有第一和第二植物的组合除草剂抗性特性。本发明所述方法还包括将第一次杂交的子代植物与那些和第一或第二植物为同品系植物或相同基因型的植物进行回交一个或多 个世代。或者，第一次杂交的子代或任何后续杂交的子代可以与第三植物杂交，所述第三植物相对于第一或第二植物为不同的品系或基因型。本发明所述方法还可包括选择那些含有第一植物的除草剂抗性特性、第二植物的除草剂抗性特性或二者的除草剂抗性特性的植物。
[0082] 本发明所述植物可以是转基因的或非转基因的。具有对咪唑啉酮和／或磺酰脲除草剂增加的抗性的非转基因芸苔属植物的例子包括J05Z-07801、J04E-0139、J04E-0130或J04E-0122的芸苔属植物；或J05Z-07801、J04E-0139、J04E-0130或J04E-0122植物的突变体、重组体、或基因工程化衍生物；或J05Z-07801、J04E-0139、J04E-0130或J04E-0122植物的任何子代植物；或任何这些植物的子代植物；或包含J05Z-07801、J04E-0139、J04E-0130或J04E-0122植物的除草剂抗性特性的植物。
[0083] 本发明还提供了使用至少一个本发明所述多核苷酸分子、表达框或转化载体进行了转化的植物、植物器官、植物组织、植物细胞、种子和非人宿主细胞。这样的经转化的植物、植物器官、植物组织、植物细胞、种子和非人宿主细胞对于至少一种除草剂，在该除草剂分别杀死或抑制未转化的植物、植物组织、植物细胞或非人宿主细胞的水平上具有增加的耐药性或抗性。优选地，本发明所述转化的植物、植物组织、植物细胞和种子为芸苔属和农作物植物。
[0084] 本发明还提供了从本发明所述方法产生的芸苔属植物中获得的芸苔属植物的种子，其能够产生具有AHAS除草剂抗性的芸苔属植物。
[0085] 在另一个方面，本发明还提供了从具有AHAS除草剂抗性的芸苔属植物的种子中生长而来的植物(所述种子来自于用于生产具有除草剂抗性特性的种子的芸苔属植物)以及来自这样的植物的植物部分或和组织培养物。
[0086] 本文还提供了芸苔属种子的容器，其中所述种子能够产生AHAS除草剂抗性芸苔属植物。芸苔属种子的容器可含有任何数量、重量或体积的种子。例如，容器可含有至少或大于，约10、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多个种子。或者，容器可含有至少或大于，约1盎司、5盎司、
10盎司、1磅、2磅、3磅、4磅、5磅或更多种子。
10盎司、1磅、2磅、3磅、4磅、5磅或更多种子。
[0087] 芸苔属种子的容器可以是本领域中任何可以获得的容器。非限定性的例子如，容器可以是盒子、袋子、小包、小袋、胶带卷、桶、箔、管。
[0088] 在另一个方面，芸苔属种子容器中所包含的种子可以是处理的或未处理的种子。在一个方面，可处理种子以改善发育，例如通过给种子注水(priming)，或通过消毒以保护种子抵抗种传(seed-born)病原体。在另一个方面，可以用任何可获得的包被物对种子进行包被以改善例如其种植性、种子发芽(emergence)，并保护种子抵抗种传病原体。种子包被物可以是任何形式的种子包被物，包括但不限于包衣(pelleting)、薄膜包被物和硬壳。
[0089] 本发明还提供了在植物中增加AHAS活性的方法，包括：使用多核苷酸构建体转化植物，所述构建体包含与本发明所述AHASL1核苷酸序列可操作连接的启动子。该方法包括将本发明所述多核苷酸构建体引入至少一个植物细胞并从中再生出转化的植物。多核苷酸构建体包含至少一个编码本发明所述除草剂抗性AHASL蛋白的核苷酸，特别是如SEQ ID NO：13、14或15所示的核苷酸序列，编码如SEQ ID NO：3、4或5所示的氨基酸的核苷酸序列，及它们的片段和变体。该方法进一步包括使用能够驱动植物细胞中基因表达的启动子。优选地，所述启动子是组成型启动子或组织优选性启动子。通过这种方法产生的植物与未经转化的植物相比，包含增加的AHAS活性，特别是除草剂耐药性AHAS活性。因此，该方法能够用于增强或增加植物对至少一种干扰AHAS酶的催化活性的除草剂特别是咪唑啉酮除草剂的抗性。
[0090] 本发明提供了产生除草剂抗性的植物的方法，该方法包括使用多核苷酸构建体转化植物细胞，所述构建体包含与启动子可操作连接的核苷酸序列，所述启动子在植物细胞中驱动表达；从所述转化的植物细胞中再生出转化的植物。核苷酸序列选自那些编码本发明所述除草剂抗性AHASL蛋白的核苷酸序列，特别是如SEQ ID NO：13、14或15所示的核苷酸序列，编码如SEQID NO：3、4或5所示的氨基酸的核苷酸序列，及其片段或变体。通过这种方法产生的植物与未经转化的植物相比，相对于至少一种除草剂特别是干扰AHAS酶的除草剂例如咪唑啉酮除草剂或磺酰脲除草剂来说，包含增加的抗性。
[0091] 本发明提供了用于在植物、植物细胞和其它非人宿主细胞中表达本发明所述多核苷酸分子的表达框。表达框包含可在植物、植物细胞或其它目的宿主细胞中表达的启动子，该启动子与本发明所述的编码除草剂抗性AHASL蛋白的多核苷酸分子可操作地连接。如果需要将表达靶向叶绿体，表达框还 可包含可操作连接的叶绿体靶向序列，其编码叶绿体转移肽以把表达的AHASL蛋白引入叶绿体。
[0092] 本发明所述表达框可用于增强植物或宿主细胞的除草剂耐药性。方法包括使用本发明所述表达框转化植物或宿主细胞，其中表达框包含可在植物或目的宿主细胞中表达的启动子，该启动子与编码本发明所述的除草剂抗性AHASL蛋白的核苷酸序列可操作地连接。方法还包括从转化的植物中再生出转化的植物。
[0093] 这里所使用的术语“多核苷酸构建体”不是为了将限制本发明为使用包含DNA的多核苷酸构建体。本领域普通技术人员将认识到，本文所描述的方法中也可使用包含核糖核苷酸以及核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸之组合的那些多核苷酸构建体特别是多核苷酸和寡聚核苷酸。因此，本发明所述多核苷酸构建体包括可用于本发明所述转化植物的方法中的所有的多核苷酸构建体，包括但不限于那些包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸及其组合的。这样的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然发生的分子和合成的类似物。本发明所述多核苷酸构建体还包括所有形式的多核苷酸构建体，包括但不限于单链形式、双链形式、发卡、主干-环-结构等。此外，本领域普通技术人员应该理解这里所揭示的每个核苷酸序列还包括所示例的核苷酸序列的互补。
[0094] 此外应该认识到，本发明所述方法可使用这样的多核苷酸构建体，其能够在转化的植物里指导至少一个蛋白或至少一个RNA的表达，所述RNA例如与mRNA的至少一个部分互补的反义RNA。通常这样的多核苷酸构建体包含蛋白的编码序列或者与5’和3’转录调节区域可操作连接的RNA。或者，还应该认识到，本发明所述方法可使用这样的多核苷酸构建体，其不能够在转化的植物里指导蛋白或RNA的表达。
[0095] 此外还应该认识到，为了在目的宿主细胞中表达本发明所述多核苷酸，通常将多核苷酸与能够在目的宿主细胞中驱动基因表达的宿主细胞可操作地连接。本发明所述在宿主细胞中表达多核苷酸的方法不依赖于特定的启动子。该方法包括使用本领域已知的任何能够在目的宿主细胞中驱动基因表达的启动子。
[0096] 本发明包括AHASL1多核苷酸分子及其片段和变体。本发明中也包括作为这些核苷酸序列的片段的多核苷酸分子。“片段”是指编码本发明所述 AHAS L1蛋白的核苷酸序列的一部分。本发明所述AHASL1核苷酸序列的片段可编码AHASL1蛋白的生物活性部分，或者可以是使用下面描述的方法用作杂交探针或PCR引物的片段。AHASL1蛋白的生物活性部分可这样制备：分离本发明所述AHASL1核苷酸序列的一部分，表达AHASL1蛋白的编码部分(例如通过体外重组表达)，并测定AHASL1蛋白的编码部分的活性。取决于所需要的用途，作为AHASL1核苷酸序列的片段的多核苷酸分子包含至少约15、20、50、75、100、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850或900个核苷酸，或本文所揭示的全长核苷酸序列的数目的核苷酸。
[0097] 编码本发明所述AHASL1蛋白的生物活性部分的AHASL核苷酸序列的片段将编码至少约15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、225或250个连续氨基酸，或全长的本发明所述AHASL1蛋白中存在的总数目的氨基酸。用于PCR引物的杂交探针的AHASL1核苷酸序列的片段通常不需要编码AHASL1蛋白的生物活性部分。
[0098] 本发明还包括作为本文所揭示的核苷酸序列的变体的多核苷酸分子。本发明所述AHASL核苷酸序列的“变体”包括这样的序列：其编码本文所揭示的AHASL1蛋白但是由于遗传密码的简并性这些序列保守性有区别。可使用熟知的分子生物学技术例如聚合酶连反应(PCR)和下面描述的杂交技术来鉴定天然发生的这些等位基因变体。核苷酸序列变体还包括使用例如定点诱变技术产生的合成的核苷酸序列，如下面讨论的，其仍然编码本发明所揭示的AHASL1蛋白。通常，本发明所述核苷酸序列变体相对于本文所揭示的特定核苷酸序列来说具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。AHASL1核苷酸序列变体将分别编码这样的AHASL1蛋白，其氨基酸序列与本文所揭示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或99％的同一性。
96％、97％、98％或99％的同一性。
[0099] 此外，技术人员还将认识到，可通过突变向本发明所述核苷酸序列中引入变化，从而引起所编码的AHASL1蛋白的氨基酸序列的改变而不改变AHASL1蛋白的生物活性。因此，可通过向对应于本文所揭示的核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸替换、添加或删除(以致于在所编码的蛋白中一个或多个氨基酸被替换、添加或删除)而创造出具有不同于SEQ ID NO：11所 示的序列但编码AHASL1蛋白的分离的多核苷酸分子。可通过标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变来引入突变。这样的核苷酸序列变体也包含在本发明中。
[0100] 例如，优选地，可在一个或多个预测的、非必要氨基酸残基上进行保守性氨基酸替换。“非必要”氨基酸残基是指：其可从野生型AHASL1蛋白的序列(例如SEQ ID NO：1的序列)中被改变而不改变生物活性；而“必要”氨基酸残基对于生物活性是必须的。“保守性氨基酸残基替换”是指：氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；酸性侧链的(例如天冬氨酸、谷氨酸)；不带电极性侧链的(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)；非极性侧链的(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)；β侧链的(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链的(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。对于保守性氨基酸残基或对于位于保守性基序中的氨基酸残基不进行这样的替换。
[0101] 本发明所述蛋白可以各种方法被改变，包括氨基酸的替换、删除、截短和插入。这样的操作的方法在本领域是公知的。例如AHASL1蛋白的氨基酸序列变体可通过DNA突变来制备。诱变和核苷酸序列改变的方法在本领域是公知的。参见例如，Kunke1(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488-492；Kunkel等人(1987)MethodsinEnzymol.154：367-382；美国专利号4，873，192；Walker and Gaastra，eds.(1983)Techniques inMolecular Biology(MacMillan Publishing Company，New York)以及本文中所引参考文献。可以在Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure
(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)(引入本文作为参考)的模型中找到进行合适的氨基酸替换而不影响目的蛋白的生物活性的指引。保守性替换例如使用另一个具有相似性质的氨基酸替换一个氨基酸是优选的。
(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)(引入本文作为参考)的模型中找到进行合适的氨基酸替换而不影响目的蛋白的生物活性的指引。保守性替换例如使用另一个具有相似性质的氨基酸替换一个氨基酸是优选的。
[0102] 或者，AHASL1变体可通过过引入随机沿着AHASL1蛋白编码序列的全部或部分的突变来制备，例如通过饱和诱变；然后筛选所得到的突变体的AHAS活性从而鉴定出保留了AHAS活性的突变体，包括除草剂抗性AHAS活性。诱变之后，编码的蛋白可随机表达，蛋白活性可使用标准测定技术进行确定。
[0103] 因此，本发明所述核苷酸序列包括本文所揭示的序列及其片段和变体。本发明所述AHASL1核苷酸序列及其片段和变体可用作探针和／或引物以在其它植物中鉴定和／或克隆AHASL同源物。这样的探针可用于检测编码相同或同一个蛋白的转录序列或基因组序列。
[0104] 按照这种方式，可使用例如PCR、杂交等方法来鉴定与本发明所述序列具有实质同一性的序列。参见，例如Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY)和Innis，等人(1990)PCR Protocols.AGuide to Methods and Applications(Academic Press，NY)。本发明包括基于与本文所示的AHASL1核苷酸序列或其片段和变体的序列同一性而分离的AHASL核苷酸序列。
[0105] 在杂交方法中，可以使用已知的AHAS L1核苷酸序列的全部或一部分来筛选cDNA或基因组文库。构建这样的cDNA和基因组文库的方法在本领域中是广为人知的，在Sambrook等人(1989)Molecular Cloning.ALaboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY)中有揭示。所谓的杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，且可以用可检测基团例如32P或其它任何可检测标记例如其它放射性同位素、荧光化合物和酶、酶辅助因子来标记。可通过标记基于已知的本文所揭示的AHASL1核苷酸序列的合成寡核苷酸来制备杂交探针。还可使用基于已知的AHASL1核苷酸序列或编码的氨基酸序列中的保守性核苷酸或氨基酸残基而设计的简并探针。探针通常包含在严谨条件下与本发明所述AHASL1核苷酸序列或其片段或变体的至少约12个、优选约25个、更优选约50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、300、400、500、
600、700、800或900个连续核苷酸杂交的核苷酸区域。杂交探针的制备在本领域中是广为人知的，在Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY)中有揭示，引入本文作为参考。
600、700、800或900个连续核苷酸杂交的核苷酸区域。杂交探针的制备在本领域中是广为人知的，在Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY)中有揭示，引入本文作为参考。
[0106] 例如，本文所揭示的全长AHASL1序列或其一个或多个部分可被用作探针，所述探针能够与对应的AHASL1序列和信使RNA特异性杂交。杂交技术包括植板(plated)DNA文库的杂交筛选(斑或群落；参见例如Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY))。
[0107] 可在严谨条件下进行这样的序列的杂交。“严谨条件”或“严谨杂交条件”是指在这样的条件下，相对于探针与其它序列的杂交来说，探针与其靶序列的杂交为可检测的较高水平(例如，至少比背景高2倍)。严谨条件是序列依赖性的且在不同的情况下会不一样。
[0108] 通常，严谨条件为：在pH为7.0至8.3时，盐浓度低于约1.5M Na离子，通常为约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，温度对短探针(例如10至50个核苷酸)来说为至少约30℃时，对长探针(例如多于50个核苷酸)来说为至少约60℃。严谨条件也可通过加入去稳定化试剂例如甲酰胺来实现。示例性的低度严谨条件包括：在37℃时，在缓冲液为30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)中杂交，在50至55℃时在1x至2X SSC(20X SSC=3.0M NaCI／0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性中度严谨条件包括：在37℃时，在40至45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，在55至60℃时在0.5X至1X SSC中洗涤。示例性高度严谨条件包括：
在37℃时，在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，在60至65℃时在0.1x SSC中洗涤。可选地，洗涤缓冲液可包含约0.1％至约1％的SDS。杂交持续时间通常为少于约24小时经常为约
4至约12小时。
在37℃时，在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，在60至65℃时在0.1x SSC中洗涤。可选地，洗涤缓冲液可包含约0.1％至约1％的SDS。杂交持续时间通常为少于约24小时经常为约
4至约12小时。
[0109] 特异性通常是杂交后洗涤的作用，关键因素是最后洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交来说，Tm可以大约为Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284的公式计算：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500／L，其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分率，％甲酰胺是杂交溶液中甲酰胺的百分比，L是碱基对中杂交的长度。Tm是50％的互补靶序列杂交至完美配对探针的温度。每1％的错配，Tm降低大约1℃；因此，可以调节Tm、杂交、和／或洗涤条件来与所需同一性序列进行杂交。例如，如果寻求的序列为＞90％同一性，则Tm可降低10℃。通常，将杂交条件选择为，相对于确定离子强度和pH时的特异性序列及其互补序列的热熔解温度(Tm)低约5℃。但是，高度严谨条件可使用比热熔解温度(Tm)低约1、2、3或4℃的杂交和／或洗涤；中度严谨条件可使用比热熔解温度(Tm)低约6、7、8或9℃的杂交和／或洗涤；低度严谨条件可使用比热熔解温度(Tm)低约11、12、13、14、15或20℃的杂交和／或洗涤。使用这个公式、杂交和洗涤成分和所需Tm，普通技术人员将会明白杂交严谨程度和／或洗涤溶液的变化本质上已得到描 述。如果所需错配程度引起Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选为增加SSC的浓度从而可以使用更高的温度。可以在Tijssen(1993)Laboratory Techniques in BiochemistryandMolecularBiology--Hybridization withNucleic Acid Probea，Part I，Chapter2(Elsevier，New York)；以及Ausubel等人，eds.(1995)Current Protoco如inMolecu缸rBiology，Chapter2(Greene Publishing and Wiley-
Interscience，New York).See Sambrook等人(1989)MolecularCloning：ALaboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)中找到详细的核苷酸杂交的指引。
Interscience，New York).See Sambrook等人(1989)MolecularCloning：ALaboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)中找到详细的核苷酸杂交的指引。
[0110] 应该认识到：本发明所述的多核苷酸分子和蛋白包括这样的多核苷酸分子和蛋白，其包含与SEQ ID NO：13、14和／或15所示的核苷酸序列、或者与SEQ ID NO：3、4和／或5所示的氨基酸序列足够相同的核苷酸或氨基酸序列。本文所用的术语“足够相同”是指：第一个氨基酸或核苷酸序列包含足够数目或最少数目的与第二个氨基酸或核苷酸序列相同或等同(例如具有相似的侧链)的氨基酸残基或核苷酸，以致第一个和第二个氨基酸或核苷酸序列具有共同的结构域和／或共同的功能活性。例如，具有共同结构域且该共同结构域具有至少约45％、55％或65％同一性、优选75％同一性、更优选85％、95％、98％同一性的氨基酸或核苷酸序列为本文所定义的足够相同。
[0111] 为了确定两个核酸的两个氨基酸序列的同一性百分率，将序列进行最佳比较目的的比对。两个序列间的同一性百分率是序列间相同位置的数目的函数(即同一性百分率＝相同位置的数目／位置的总数目(例如重叠位置)x100)。在一个实施方式中，两个序列是相同长度的。可使用下面描述的技术类似的技术(有或没有允许的间隙(alloWing gap))来确定两个序列的同一性百分率。在计算同一性百分率时，通常计数精确的配对。
[0112] 可使用数学运算法则来确定两个序列的同一性百分率。优选的非限定性的用于比较两个序列的数学运算法则的 例子为Karlin和Altschul (1990)Proc.Natl.Acad .Sci.USA87：2264(在Karlin和Altschul(1993)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877中修改)的运算法则。这样的运算法则被引入Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403的NBLAST和XBLAST程序。BLAST核苷酸的搜索可以使用NBLAST程序进行，得分=100，单词长度=12，以获得与本发明所述多核苷酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质的搜索可以使用XBLAST程序进行，得分=50，单词长度=3，以获得与本发明所述蛋白 质分子同源的氨基酸序列。为了获得比较目的的间隙比对(gapped alignment)，可以使用如Altschul等人(1997)NucleicAci由Res.25：3389中描述的Gapped BLAST。或者，可以使用PSI-Blast来进行检测分子间不同关系的多重搜索。参见以上的Altschul等人(1997)。当使用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可使用各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。另一个优选的非限定性的用于序列比较的数学运算法则为Myers和Miller(1988)CABIOS4：11-17运算法则。这个运算法则被引入到ALIGN程序(2.0版本)中，其为GCG序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程序来比较氨基酸序列时，可使用PAMl20的重量残基表，间隙长度罚分12和间隙罚分4。还可通过调查人工进行比对。
Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877中修改)的运算法则。这样的运算法则被引入Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403的NBLAST和XBLAST程序。BLAST核苷酸的搜索可以使用NBLAST程序进行，得分=100，单词长度=12，以获得与本发明所述多核苷酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质的搜索可以使用XBLAST程序进行，得分=50，单词长度=3，以获得与本发明所述蛋白 质分子同源的氨基酸序列。为了获得比较目的的间隙比对(gapped alignment)，可以使用如Altschul等人(1997)NucleicAci由Res.25：3389中描述的Gapped BLAST。或者，可以使用PSI-Blast来进行检测分子间不同关系的多重搜索。参见以上的Altschul等人(1997)。当使用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可使用各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。另一个优选的非限定性的用于序列比较的数学运算法则为Myers和Miller(1988)CABIOS4：11-17运算法则。这个运算法则被引入到ALIGN程序(2.0版本)中，其为GCG序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程序来比较氨基酸序列时，可使用PAMl20的重量残基表，间隙长度罚分12和间隙罚分4。还可通过调查人工进行比对。
[0113] 除非另有指明，本文所提供的序列同一性／相似性数值是指：使用本发明所述全长序列，并使用Vector NTI Suite Version9(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)软件包中所包括的AlignX程序使用默认参数使用Clustal w(Nucleic Acid Research，22(22)：4673-4680，1994)的运算法以多重对比方法所获得的数值或其任何等同程序所获得的数值。“等同程序”是指用于比较任何两个问题序列的任何序列比对程序，其与对应的Vector NTI Suite Version9软件包中所包括的AlignX程序相比，产生具有相同核苷酸或氨基酸残基配对和相同的序列同一性百分率的比对。
[0114] 本发明所述AHASL1核苷酸序列既包括天然发生的序列也包括突变形式，特别是编码包含除草剂抗性AHAS活性的AHASL1蛋白的突变形式。同样的，发明所述蛋白既包括天然发生的序列也包括其变体和修饰的形式。这样的变体将继续具有所需要的AHAS活性。显而易见地，在编码变体的DNA中所做的突变必须不会将序列置于读码框以外，优选不会产生降低次级mRNA结构的的互补区域。参见，欧洲专利申请号75,444。
[0115] 本文所包括的蛋白序列的删除、插入和替换不期望产生蛋白特性的显著变化。但是，当难于预先预测替换、删除或插入的准确效应时，本领域技术人员将明白通过常规筛选方法来评价该效应。即，可通过AHAS活性测试来评估活性。参见，例如Singh等人(1988)Anal.Biochem.171：173-179，这里引入作为参考。
[0116] 变体核苷酸序列和蛋白还包括源自突变和重组基因程序例如DNA改组的序列和蛋白。使用这样的程序可操作一个或多个不同的AHASL编码序列 以制造出具有所需特性的新的AHASL蛋白。通过这种方式，从包含具有实质序列同一性的序列区域的相关的多核苷酸序列世代中产生重组多核苷酸文库，并可以在体外或体内同源性再次组合。例如，使用这种方法，编码目的域的序列基序可在本发明所述AHASL1基因和其它已知的AHASL1基因间改组以获得新的基因，其编码具有改进的目的特征的蛋白，例如如果是酶的话Km值升高。这样的DNA改组的策略在本领域是已知的。参见，例如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature370：389-391；Crameri等人(1997)Nature
Biotech.15：436-438；Moore等人(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhang等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：4504-4509；Crameri等人(1998)Nature391：288-291；以及美国专利号5，605，793and5，837，458。
Biotech.15：436-438；Moore等人(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhang等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：4504-4509；Crameri等人(1998)Nature391：288-291；以及美国专利号5，605，793and5，837，458。
[0117] 可使用本发明所述核苷酸序列从其它生物特别是其它植物更特别是其它双子叶植物中分离相对应的序列。通过这种方式，可使用例如PCR、杂交等方法基于与本文所示序列的序列同源性来鉴定这样的序列。本发明包括基于本文所示的AHASL1全长序列的序列同一性而分离的序列或其片段。因此，本发明包括编码AHASL蛋白且在严谨条件下与本文所揭示序列或其片段杂交的分离的序列。
[0118] 在PCR方法中，可设计寡核苷酸引物以用于PCR反应来从任何目的植物提取的cDNA或基因组DNA来扩增对应的DNA序列。设计PCR引物的方法和PCR克隆在本领域是广为人知的，在Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)中有揭示。另参见Innis等人，eds.(1990)PCRProtocols：AGuide to Methods and Applications(Academic Press，New York)；Innis和Gelfand，eds.(1995)PCR Strategies(Academic Press，New York)；以及Innis和Gelfand，eds.(1999)PCR Metho由Manual(Academic Press，New York)。已知的PCR方法包括但不限于使用配对引物、巢式引物、单一特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等引物的方法。
[0119] 本发明所述AHASL多核苷酸序列以用于目的植物中表达的表达框提供。表达框将包括与本发明所述AHASL1多核苷酸序列可操作连接的5’和3’调节序列。“可操作连接”是指在启动子和第二序列之间的功能性连接，其 中启动子序列启动并调节对应于第二序列的DNA序列的转录。通常，可操作连接意思是所连接的核酸序列为连续的且如果必要将两个蛋白编码区域相接的话，为在相同的读码框中连续。表达框还可包含至少一个将共转化进入生物的其它基因。或者，可在多个表达框中提供其它基因。
[0120] 这样的表达框中提供多个限制性位点以插入AHASL1多核苷酸序列于调节区域的转录调节下。表达框还可包括选择性标记基因。
[0121] 表达框在5’至3’转录方向将包括转录和翻译起始区域(即启动子)、本发明所述AHASL1多核苷酸序列、在植物中起功能的转录和翻译终止区域(即终止区域)。启动子可以是天然的或类似的，或对于植物宿主和／或本发明所述AHASL1多核苷酸序列来说是外源的或异源的。此外，启动子可以是天然序列或者是合成序列。当启动子对植物宿主是“外源”或“异源”时，其是指在启动子被引入的天然植物中找不到该启动子。当启动子对本发明所述AHASL1多核苷酸序列是“外源”或“异源”时，其是指该启动子不是天然的或天然发生的与本发明所述AHASL1多核苷酸序列可操作连接的启动子。本文所用的嵌合基因包括与转录起始区域可操作连接的编码序列，所述转录起始区域与编码区域是异源的。
[0122] 虽然优选为使用异源启动子来表达本发明所述AHASL1多核苷酸，但是也可使用天然启动子。这样的构建体将改变植物或植物细胞中的AHASL1蛋白的表达水平。因此改变了植物或植物细胞的表型。
[0123] 终止区域可以相对于转录起始区域是天然的，相对于可操作连接的目的AHASL1序列是天然的，相对于植物宿主是天然的，或者源自另外的来源(即对启动子、目的AHASL1多核苷酸序列、植物宿主或任何其组合是外源或异源的)。方便的终止区域可从根癌农杆菌的Ti质粒中获得，例如肉碱(octopine)合成酶终止区域、胭脂碱合成酶终止区域。另参见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell64：671-674；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen等人(1990)Plant Cell2：1261-1272；
Munroe等人(1990)Gene91：151-158；Ba11as等人(1989)Nuc1eic Acids Res.17：7891-
7903；以及Joshi等人(1987)Nuc1eicAcid Res.15：9627-9639。
Munroe等人(1990)Gene91：151-158；Ba11as等人(1989)Nuc1eic Acids Res.17：7891-
7903；以及Joshi等人(1987)Nuc1eicAcid Res.15：9627-9639。
[0124] 合适时，可将基因优化以在转化的植物中增加表达。即，可使用用于改善表达的植物优选的密码子来合成基因。参见，例如Campbell和Gowri(1990) Plant Physiol.92:1-11中讨论的宿主优选密码子的使用。本领域中有合成植物优选基因的方法。参见，例如美国专利号5，380，831和5，436，391，以及Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.17∶477-498，这里引入作为参考。
[0125] 已知有其它的序列修改可增强细胞宿主中的基因表达。这些包括除去编码假的多聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复的序列以及其它可对基因表达有害的已经鉴定出的序列。可以调整序列的G-C含量至给定细胞宿主的平均水平，如参考宿主细胞中表达的已知的基因来计算。如果可能，修改序列以避免预测的次级mRNA结构中的发卡结构。
[0126] 也可在植物表达载体申使用用于增强基因表达的核苷酸序列。这些包括玉米AdhI内含子、内含子1基因(Callis等人Genes and Development1：1183-1200，1987)和前导序列，来自烟草花叶病毒(TMV)、玉米枯黄斑点病毒、苜蓿花叶病毒(W-序列)(Gallie等人Nucleic Acid Res.15：8693-8711，1987和Skuzeski等人Plant Mol.Biol.15:65-79，1990)。已经表明来自玉米的shrunkent-1基因座的第一个内含子增加嵌合基因构建体中的基因表达。美国专利号5，424，412和5，593，８７４公开了特定内含子在基因表达构建体中的用途，Gallie等人(Plant Physiol.106：929-939,1994)也表明内含子对于基于组织特异性的基因表达的调节是有用的。为了进一步增强或优化AHAS小亚基的基因表达，本发明所述植物表达载体可含有包含基质附着区域(MAR)的DNA序列。以这样的修改的表达系统转化的植物细胞可表现出本发明所述核苷酸序列的过度表达或组成型表达。
[0127] 表达框还可以在表达框构建体中含有5'前导序列。这样的前导序列可对增强翻译发挥作用。转录前导序列在本领域是已知的，包括:小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5'非编码区)(Elroy-Stein等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:6126-6130);马铃薯Y病毒属(potyvirus)前导序列例如TEV前导序列(马铃薯蚀刻病毒)(Gallie等人(1995)Gen9165(2):233-238)，MDMV前导序列(玉米矮小花叶病毒)
(Virology154:9-20)，和人类免疫球蛋自重链结合蛋白(BiP)(Macejak等人(1991)Natur9353:90-94);苜蓿花叶病毒包被蛋白mRNA的非转录区前导序列(AMVRNA4)(Jobling等人(1987)Nature325:622.625);烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等人(1989)，Molecular Biology of RNA，ed.Cech(Liss，NewYork)，pp.237-256);和玉米枯黄斑点病毒前导序列(MCMV)(Lomnel 等人(1991)Virology81：382-385)。还参见Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84：965-968。还可使用其它已知的增强翻译的方法，例如内含子等。
(Virology154:9-20)，和人类免疫球蛋自重链结合蛋白(BiP)(Macejak等人(1991)Natur9353:90-94);苜蓿花叶病毒包被蛋白mRNA的非转录区前导序列(AMVRNA4)(Jobling等人(1987)Nature325:622.625);烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等人(1989)，Molecular Biology of RNA，ed.Cech(Liss，NewYork)，pp.237-256);和玉米枯黄斑点病毒前导序列(MCMV)(Lomnel 等人(1991)Virology81：382-385)。还参见Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84：965-968。还可使用其它已知的增强翻译的方法，例如内含子等。
[0128] 在制备表达框时，可操作各种DNA片段以提供正确方向的DNA序列，及提供正确的读码框的DNA序列。为了这个目的，可使用接头(adapter)或连接子(linker)来连接DNA片段，或者可涉及其它操作来提供方便的限制性位点、除去多余DNA、除去限制性位点等。为了这个目的，可涉及体外诱变、引物修补、限制性(restriction)、退火、重新替换例如易位和转换。
[0129] 实践本发明时可使用多种启动子。可基于所需要的结果选择启动子。可为了在植物中的表达而将核酸与组成型、组织优选性或其它启动子组合。
[0130] 这样的组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子和在WO99／43838和美国专利号6，072,050中公开的其它组成型启动子；核心CaMV35S启动子(Odell等人(1985)Nature313：810-812)；水稻肌动蛋白(McElroy等人(1990)Plant Cell2：163-171)；泛素(Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632and Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等人(1984)EMBOJ.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5，659，026)等。其它的组成型启动子包括例如美国专利号5，608，149；5，608，144；5，604，121；5，569，597；5，466，785；5，399，680；5，268，463；5，608，142；和6，177，611。
[0131] 可使用组织优选性启动子在特定植物组织中增强AHASL1的表达。这样的组织优选性启动子包括但不限于叶-优选性启动子、根-优选性启动子、种子-优选性启动子和茎-优选性启动子。组织优选性启动子包括Yamamoto等人(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kawamata等人(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803；Hansen等人(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337-343；Russell等人(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168；Rinehart等人(1996)PlantPhysiol.112(3)：1331-1341；Van Camp等人(1996)Plant Physiol.112(2)：
525-535；Canevascini等人(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524；Yamamoto等人(1994)Plaant Cell Physiol.35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20：181-
196；Orozco等人(1993)Plant Mol Biol.23(6)：1129-1138；Matsuoka等人(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590；and Guevara-Garcia等人(1993)Plant J.4(3)：
495-505。如果需要的话这样的启动子可被修改以削弱表达。
525-535；Canevascini等人(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524；Yamamoto等人(1994)Plaant Cell Physiol.35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20：181-
196；Orozco等人(1993)Plant Mol Biol.23(6)：1129-1138；Matsuoka等人(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590；and Guevara-Garcia等人(1993)Plant J.4(3)：
495-505。如果需要的话这样的启动子可被修改以削弱表达。
[0132] 在一个实施方式中，目的核酸被靶向叶绿体进行表达。通过这样方式，其中目的核酸不是直接被插入叶绿体，表达框将另外含有叶绿体靶向序列，该序列包含编码叶绿体转移肽的核苷酸序列以将目的基因产物引导至叶绿体。这样的转移肽在本领域是已知的。至于叶绿体靶向序列，“可操作连接”意思是编码转移肽的核酸序列(即叶绿体靶向序列)与本发明所述AHASL多肽连接以使两个序列是连续的且在相同的读码框内。参见，例如Von Heijne等人(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126；C1ark等人(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer等人(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；and Shah等人(1986)Science233：478-
481。当本发明所述AHASL1蛋白包括天然叶绿体转移肽时，可通过将叶绿体靶向序列可操作连接至编码本发明所述的成熟的AHASL1蛋白的核苷酸序列的5’端而将任何本领域已知的叶绿体转移肽融合至本发明所述成熟的AHAS L1蛋白的氨基酸序列。
481。当本发明所述AHASL1蛋白包括天然叶绿体转移肽时，可通过将叶绿体靶向序列可操作连接至编码本发明所述的成熟的AHASL1蛋白的核苷酸序列的5’端而将任何本领域已知的叶绿体转移肽融合至本发明所述成熟的AHAS L1蛋白的氨基酸序列。
[0133] 叶绿体靶向序列在本领域是已知的且包括1，5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubiSco)的叶绿体小亚基(de Castro Silva Filho等人(1996)Plant Mo1.Biol.30∶769-780；Schnell等人(1991)J. Bio1.Chem.266(5)：3335-3342)；5-(烯醇丙酮)莽草酸-3-磷酸酯(5-(enolpyruvyl)shikimate-3-phosphate)合成酶(EPSPS)(Archer等人(1990)J.Bioenerg.Biomemb.22(6)：789-810)；色氨酸合成酶(Zhao等人(1995)J.Bio1.Chem.270(11)∶6081-6087)；质体蓝素(Lawrence等人(1997)J.Bio1.Chem.272(33)：20357-20363)；
分支酸合成酶(Schmidt等人(1993)J.Bio1.Chem.268(36)：27447-27457)；集光叶绿素a／b结合蛋白(LHBP)(Lamppa等人(1988)J. Bio1.Chem.263：14996-14999)。还参见Von Heijne等人(1991)Plant Mol.Bio1.Rep.9：104-126；C1ark等人(1989)J.Biol.Chem.264：17544-
17550；Della-Cioppa等人(1987)Plant Ph少siol.84：965-968；Romer等人(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；和Shah等人(1986)Science233：478-481。
分支酸合成酶(Schmidt等人(1993)J.Bio1.Chem.268(36)：27447-27457)；集光叶绿素a／b结合蛋白(LHBP)(Lamppa等人(1988)J. Bio1.Chem.263：14996-14999)。还参见Von Heijne等人(1991)Plant Mol.Bio1.Rep.9：104-126；C1ark等人(1989)J.Biol.Chem.264：17544-
17550；Della-Cioppa等人(1987)Plant Ph少siol.84：965-968；Romer等人(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；和Shah等人(1986)Science233：478-481。
[0134] 转化叶绿体的方法在本领域是已知的。参见例如，Svab等人(1990)Proc .Natl.4cad.Sci.USA87∶8526-8530；Svab和Maliga(1993)
Pro6c.Natl.A4cad.Sci.USA90：913-917；Svab和Maliga(1993)EMBOJ.12：601-606。该方法依赖于通过基因枪传输含有选择性标记的DNA并通过同源重组将DNA 靶向质体基因组。另外，可通过核编码和质体指引的RNA聚合酶的组织优选性表达来转激活沉默的质体-携带的(borne)转基因，从而实现质体转化。这样的系统已经在McBride等人(1994)
ProG.Natl.Acad.Sci.USA91：7301-7305中报道。
Pro6c.Natl.A4cad.Sci.USA90：913-917；Svab和Maliga(1993)EMBOJ.12：601-606。该方法依赖于通过基因枪传输含有选择性标记的DNA并通过同源重组将DNA 靶向质体基因组。另外，可通过核编码和质体指引的RNA聚合酶的组织优选性表达来转激活沉默的质体-携带的(borne)转基因，从而实现质体转化。这样的系统已经在McBride等人(1994)
ProG.Natl.Acad.Sci.USA91：7301-7305中报道。
[0135] 靶向叶绿体的目的核酸可被优化以适于在叶绿体中表达以解决植物细胞核和此细胞器中的密码子使用区别的问题。通过这种方式，可使用叶绿体优选性密码子来合成目的核酸。参见，例如美国专利号5，380,831，这里引入作为参考。
[0136] 如本文所揭示的，本发明所述AHASL1核苷酸序列在增强那些在其基因组中包含编码除草剂耐药性的AHASL1蛋白的植物的除草剂耐药性中有用。这样的基因可是内源的基因或转基因。此外，在一些实施方式中，本发明所述核酸序列可与目的多核苷酸序列的任何组合相堆积，以产生具有所需表型的植物。例如，本发明所述多核苷酸可与任何其它编码具有杀虫剂和／或杀昆虫剂活性的多肽堆积，所述其它编码具有杀虫剂和／或杀昆虫剂活性的多肽例如苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白(在美国专利号5，366,892；5,747,450；5，737，514；5,723,756；5，593，881；和Geiser等人(1986)Gene48：109中描述)。产生的组合还可包括任何一个目的多核苷酸的多个拷贝。
[0137] 应该认识到：使用这些核苷酸序列，可以构建反义构建体，所述反义构建体与AHASL1多核苷酸序列的信使RNA(mRNA)的至少一部分互补。构建反义核苷酸来与对应的mRNA杂交。可制作这些反义序列的修饰只要该序列与对应的mRNA杂交并干扰其表达。通过这种方式，可以使用与对应的反义序列具有70％、优选80％，更优选85％序列同一性的反义构建体。此外，可使用反义核苷酸的一部分来破坏目的基因的表达。通常，可以使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸或更多个核苷酸的序列。
[0138] 还可在正义方向使用本发明所述核苷酸序列来抑制植物中内源基因的表达。在植物中使用正义方向多核苷酸序列来抑制基因表达的方法是已知的。该方法通常包括：使用DNA构建体转化植物，该DNA构建体包含启动子，该启动子在植物中驱动基因表达且可操作地连接至对应于内源基因转录本的核苷酸序列的至少一部分。通常，这样的核苷酸序列与内源基因的转录本序列具有实质上的序列同一性，优选为约65％以上序列同一性，更优选 为约85％以上序列同一性，最优选为约95％以上序列同一性。参见，美国专利号5，283，184和5，034，323，这里引入作为参考。
[0139] 当本发明所述除草剂抗性AHASL1多核苷酸用于植物转化的选择性标记基因时，本发明所述表达框可包括另一个用于选择转化植物的选择性标记基因。选择性标记基因，包括本发明所述的那些，被用于选择转化的细胞或组织。标记基因包括但不限于，编码抗生素抗性的基因，例如那些编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草剂化合物例如草铵磷、溴苯腈(bromoxynil)、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧乙酸盐(2,4-D)的抗性的基因。大体上参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3∶506-511；Christopherson等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：6314-6318；Yao等人(1992)Cell71：63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422；Barkley等人(1980)，TheOperon，pp.177-220；Hu等人(1987)Cell48：555-566；Brown等人(1987)Cell49：603-
612；Figge等人(1988)Cell52：713-722；Deuschle等人(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA86：
5400-5404；Fuerst等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：2549-2553；Deuschle等人(1990)Science248：480-483；Gossen(1993)Ph.D.TheSis，University of Heidelberg；
Reines等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：1917-1921；LaboW等人(1990)
Mol.Cell.Biol.10：3343-3356；Zambretti等人(1992)Proc.NatloAcad.Sci.USA89：3952-
3956；Baim等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci. USA88：5072-5076；Wyborski等人(1991)Nucleic AcidsRes.19：4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics
Mol.Struuc.Biol.10∶143-162；Degenko1b等人(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：
1591-1595；Kleinschnidt等人(1988)Biochemistry27：1094-1104；Bonin(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Gossen等人(1992)Proc.Natl.
Acad.Sci.USA89：5547-5551；O1iva等人(1992)AAntimicrob.Agents Chemother.36：913-
919；H1avka等人(1985)HandbookofExperimentalPharmacology，Vo1.78(Springer-Verlag，Berlin)；Gill等人(1988)Nature334：721-724。这样的公开物引入本文作为参考。
612；Figge等人(1988)Cell52：713-722；Deuschle等人(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA86：
5400-5404；Fuerst等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：2549-2553；Deuschle等人(1990)Science248：480-483；Gossen(1993)Ph.D.TheSis，University of Heidelberg；
Reines等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：1917-1921；LaboW等人(1990)
Mol.Cell.Biol.10：3343-3356；Zambretti等人(1992)Proc.NatloAcad.Sci.USA89：3952-
3956；Baim等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci. USA88：5072-5076；Wyborski等人(1991)Nucleic AcidsRes.19：4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics
Mol.Struuc.Biol.10∶143-162；Degenko1b等人(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：
1591-1595；Kleinschnidt等人(1988)Biochemistry27：1094-1104；Bonin(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Gossen等人(1992)Proc.Natl.
Acad.Sci.USA89：5547-5551；O1iva等人(1992)AAntimicrob.Agents Chemother.36：913-
919；H1avka等人(1985)HandbookofExperimentalPharmacology，Vo1.78(Springer-Verlag，Berlin)；Gill等人(1988)Nature334：721-724。这样的公开物引入本文作为参考。
[0140] 上面列举的选择性标记基因不是为了限定。本发明中可使用任何选择性标记基因。
[0141] 包含编码本发明所述AHAS L1蛋白的核苷酸序列的分离的多核苷酸分 子可用于载体中以转化植物，以致所产生的植物对于除草剂特别是咪唑啉酮除草剂具有增强的抗性。本发明所述分离的AHAS L1多核苷酸分子可单独使用于载体或者与编码AHAS酶小亚基(AHASS)的核苷酸序列组合使用以在植物中赋予除草剂抗性。参见美国专利号6，348，643，其在这里引入作为参考。
[0142] 因此，本发明提供了转化载体，其包含本发明的选择性标记基因。选择性标记基因包含启动子，该启动子在宿主细胞中驱动基因表达且可操作地连接至包含本发明所述除草剂抗性AHASL蛋白的核苷酸序列的多核苷酸。转化载体还可包含在宿主细胞中表达的目的基因，如果需要还可包含与本发明所述多核苷酸可操作连接的叶绿体靶向序列。
[0143] 本发明还提供了使用本发明所述转化载体来选择经目的基因转化的细胞的方法。这样的方法包括：使用转化载体转化宿主细胞，将细胞暴露于能够杀死或抑制未转化宿主细胞生长的水平的咪唑啉酮或磺酰脲除草剂，通过能够在除草剂存在的情况下生长来鉴定出转化的宿主细胞。在本发明的一个实施方式中，宿主细胞是植物细胞，选择性标记基因包含在植物细胞中驱动表达的启动子。
[0144] 本发明所述转化载体可用于产生经目的基因转化的植物。转化载体可包含本发明所述选择性标记基因和待引入的、通常在转化植物中表达的目的基因。这样的选择性标记基因包含本发明所述除草剂抗性AHASL1多肽，其与在宿主细胞中驱动表达的启动子可操作地连接。为了在植物和植物细胞中使用，转化载体包含选择性标记基因，其包括与在植物细胞中驱动表达的启动子可操作连接的本发明所述除草剂抗性AHASL1多核苷酸。
[0145] 本发明还涉及植物表达载体，其包含在植物中驱动表达的启动子，该启动子与本发明所述分离的多核苷酸分子可操作地连接。分离的多核苷酸分子包含编码AHAS L1蛋白的核苷酸序列，特别是编码包含如SEQ ID NO：2、3、4、5或6所示的氨基酸序列的AHASL1蛋白或其功能性片段和变体的核苷酸序列。本发明所述植物表达载体不依赖于特定的启动子，只要这样的启动子能够在植物细胞中驱动基因表达。优选的启动子包括组成型启动子和组织优选性启动子。
[0146] 本发明所述目的基因根据所需要的结果而变化。例如，表型中各种变化可以是目的，包括修饰植物中的脂肪酸组成、改变植物的氨基酸含量、改变 植物的昆虫和／或病原体抵御机制等。这些结果可通过在植物中提供异源产物的表达或增加内源产物的表达来实现。或者，这些结果可通过在植物中提供一个或多个内源产物特别是酶或辅助因子的表达的降低来实现。这些改变导致转化的植物的表型变化。
[0147] 在本发明的一个实施方式中，目的基因包括昆虫抗性基因例如苏云金杆菌毒性蛋白基因(美国专利号5,366,892；5,747,450；5,736，514；5,723，756；5，593，881；和Geiser等人(1986)Gene48∶109)。
[0148] 本发明所述AHASL1蛋白或多肽可以从例如芸苔属植物中纯化，可用于组合物中。另外，编码本发明所述AHASL1蛋白的分离的多核苷酸分子可用于在微生物例如大肠杆菌或酵母中表达本发明所述AHASL1蛋白。可通过本领域普通技术人员已知的任何方法从大肠杆菌的提取物中纯化表达的AHASL1蛋白。
[0149] 本发明还涉及生产对除草剂抗性的转基因植物的方法，其包括：使用植物表达载体转化植物，所述表达载体包含在植物中驱动表达的启动子，该启动子与本发明所述分离的多核苷酸分子可操作连接。分离的多核苷酸分子包含编码本发明所述AHASL1蛋白的核苷酸序列，特别是编码包含如下氨基酸序列的AHASLl蛋白：如SEQ ID NO：2、3、4、5或6所示的氨基酸序列，由SEQ ID NO：12、13、14、15或16所编码的氨基酸序列，或所述氨基酸序列的功能性片段和变体。
[0150] 本发明还涉及非转基因芸苔属植物，通过本发明所述方法产生的转基因植物，这样的非转基因和转基因植物的子代和其它后代，这些植物对于干扰AHAS酶的除草剂特别是咪唑啉酮和磺酰脲除草剂表现出增强的或增加的抗性。
[0151] 本发明所述AHASL1多核苷酸，特别是那些编码除草剂抗性AHASL1蛋白的AHASL1多核苷酸，可用于增强除草剂耐药性植物的抗性。在本发明的一个实施方式中，除草剂耐药性植物包含除草剂耐药性或除草剂抗性AHSAL蛋白。除草剂耐药性植物既包括以除草剂耐药性AHASL核苷酸序列转化的植物也包括在其基因组中包含编码除草剂耐药性AHASL蛋白的内源基因的植物。这样的除草剂耐药性植物可以是：为了除草剂耐药性而经过遗传工程化的除草剂耐药性植物；或者通过不涉及重组DNA的方式而发展的除草剂耐药性植物，例如本发明所述芸苔属植物。编码除草剂耐药性 AHASL蛋白的核苷酸序列和包含编码除草剂耐药性AHASL蛋白的内源基因的除草剂耐药性植物包括本发明所述多核苷酸和植物，以及本领域已知的那些。参见，例如美国专利号5，013，659，5，731，180，5，767，361，5，545，822，5，736，629，5，773，703，5，773，704，5，952，553和6，274，796，所有这些引入本文作为参考。这样的增强除草剂耐药性植物的抗性的方法包括：使用至少一个多核苷酸构建体转化除草剂耐药性植物，所述构建体包含在植物细胞中驱动表达的启动子，该启动子与本发明所述除草剂抗性AHASL1多核苷酸可操作连接，所述多核苷酸特别是如SEQ ID NO：12、13、14、15或
16所示的编码除草剂抗性AHASL1蛋白的多核苷酸，编码如SEQ ID NO：2、3、4、5或6所示的氨基酸序列的多核苷酸，以及编码含有除草剂抗性AHAS活性的多肽的所述多核苷酸的功能性片段和变体。通过这种方法产生的植物与经本发明所述多核苷酸构建体转化之前的除草剂抗性植物相比，对至少一种除草剂具有增强的抗性。
16所示的编码除草剂抗性AHASL1蛋白的多核苷酸，编码如SEQ ID NO：2、3、4、5或6所示的氨基酸序列的多核苷酸，以及编码含有除草剂抗性AHAS活性的多肽的所述多核苷酸的功能性片段和变体。通过这种方法产生的植物与经本发明所述多核苷酸构建体转化之前的除草剂抗性植物相比，对至少一种除草剂具有增强的抗性。
[0152] 用于转化植物的许多植物转化载体和方法都是可以获得的。参见例如，An，G.等人(1986)Plant Pysiol.，81：301-305；Fry，J.，等人(1987)Plant Cell Rep.6：321-325；Block，M.(1988)Theor.Appl Genet.76：767-774；Hinchee，等人(1990)
Stadler.Gennet.Symp.203212.203-212；CouSins，等人(1991)Aust.J.Plant Phvsiol.18：
481-494；Chee，P.P.and Slightom，J.L.(1992)Gene.118：255-260；Christou，等人(1992)Tren由.Biotechnot.10：239-246；D′Halluin，等人(1992)Bio／Technol.10：309-314；Dhir，等人(1992)Plant Ph少siol.99：81-88；Casas等人(1993)Proc.Nat.Acad Sci.USA90：
11212-11216；Christou，P.(1993)InVitroCeell.Dev.Biol.-Plant；29P：119-124；Davies，等人(1993)PlanntCellRep.12：180-183；Dong，J.A.和Mchughen，A.(1993)Plant Sci.91：
139-148；Frank1in，C.I.and Trieu，T.N.(1993)Plant.Physiol.102∶167；Go1ovkin，等人(1993)PlantSci.90：41-52；Guo ChinSci.Bull.38∶2072-2078；Asano，等人(1994)Plant CellRep.13；Ayeres N.M.和Par k，W.D.(1994)Crit.Rev.Plaant.Sci.13∶219-239；
Barcelo，等人(1994)Plant.J.5：583-592；Becker，等人(1994)Plant.J.5：299-307；
Borkowska等人(1994)Acta.PhysiolPlant.16：225-230；ChriStou，P.(1994)
Agro.Food.Ind.HiTech.5：17-27；Eapen等人(1994)Plant Cell Rep.13：582-586；
Hartman，等人(1994)Bio-Technology12：919923；Ritala，等人 (1994)
Plant.Mol.Biol.24：317-325；以及Wan，Y.C.和Lemaux，P.G.(1994)Plant Physiol.104：
3748。
Stadler.Gennet.Symp.203212.203-212；CouSins，等人(1991)Aust.J.Plant Phvsiol.18：
481-494；Chee，P.P.and Slightom，J.L.(1992)Gene.118：255-260；Christou，等人(1992)Tren由.Biotechnot.10：239-246；D′Halluin，等人(1992)Bio／Technol.10：309-314；Dhir，等人(1992)Plant Ph少siol.99：81-88；Casas等人(1993)Proc.Nat.Acad Sci.USA90：
11212-11216；Christou，P.(1993)InVitroCeell.Dev.Biol.-Plant；29P：119-124；Davies，等人(1993)PlanntCellRep.12：180-183；Dong，J.A.和Mchughen，A.(1993)Plant Sci.91：
139-148；Frank1in，C.I.and Trieu，T.N.(1993)Plant.Physiol.102∶167；Go1ovkin，等人(1993)PlantSci.90：41-52；Guo ChinSci.Bull.38∶2072-2078；Asano，等人(1994)Plant CellRep.13；Ayeres N.M.和Par k，W.D.(1994)Crit.Rev.Plaant.Sci.13∶219-239；
Barcelo，等人(1994)Plant.J.5：583-592；Becker，等人(1994)Plant.J.5：299-307；
Borkowska等人(1994)Acta.PhysiolPlant.16：225-230；ChriStou，P.(1994)
Agro.Food.Ind.HiTech.5：17-27；Eapen等人(1994)Plant Cell Rep.13：582-586；
Hartman，等人(1994)Bio-Technology12：919923；Ritala，等人 (1994)
Plant.Mol.Biol.24：317-325；以及Wan，Y.C.和Lemaux，P.G.(1994)Plant Physiol.104：
3748。
[0153] 本发明所述方法包括将多核苷酸构建体引入植物。“引入”是指将多核苷酸构建体以可以进入该植物细胞内部的方式将多核苷酸构建体给予该植物。本发明所述方法不依赖于将多核苷酸构建体引入植物的特定方法，只要多核苷酸构建体可以进入植物的至少一个细胞的内部。将多核苷酸构建体引入植物的方法在本领域是已知的，包括但不限于，稳定转化方法，瞬间转化方法和病毒介导的方法。
[0154] “稳定转化方法”是指引入植物的多核苷酸构建体整合入植物的基因组且能够被其子代遗传。“瞬间转化方法”是指引入植物的多核苷酸构建体不被整合入植物的基因组。
[0155] 为了转化植物和植物细胞，使用标准技术将本发明所述核苷酸序列插入能够适合在植物或植物细胞中表达核苷酸序列的任何本领域已知的载体。载体的选择取决于优选的转化技术和待转化的目标植物种。在本发明的一个实施方式中，AHASL1核苷酸序列可操作地连接于植物启动子，该启动子已知在植物细胞中用于高度表达，然后将此构建体引入对咪唑啉酮除草剂易感的植物，从而再生出转化的植物。转化的植物对暴露于能够杀死或严重损伤未转化植物的咪唑啉酮除草剂的水平是耐药性的。此方法可适用于任何植物种；但是，最有益为适用于农作物植物，特别是通常生长于至少一种除草剂特别是咪唑啉酮除草剂存在的情形下的农作物植物。
[0156] 构建植物表达框并将外源核酸引入植物的方法在本领域是广为人知的，且已经被描述。例如，可使用肿瘤诱导(Ti)质粒载体将外源DNA引入植物。基于农杆菌的转化技术在本领域是广为人知的。农杆菌菌株(例如根癌农杆菌或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)包含质粒(Ti或Ri质粒)和T-DNA元件，其在使用农杆菌感染后被转移入植物。T-DNA(转移的DNA)被整合入植物细胞的基因组。T-DNA可位于Ri或Ti质粒或分别包含于所谓的二元载体。农杆菌介导的转化的方法已经描述，例如，在Horsch RB等人(1985)Science225：1229f。既可以在双子叶植物又可以在单子叶植物中使用农杆菌介导的转化。
在White FF，Vectors fbr Gene Transferin Higher Plants；Transgenic Plants，Vo1.1，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press，1993，pp.15-38；
Jenes B等人(1993)Techniques for GeneIransfer，Iransgenic Plants，Vo1.1，Engineering and Utilzation，S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press，pp.128-143；
Potrykus(1991)Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Bio142：205-225中描述了使用农杆菌转化植物。其它的用于传送外源基因的方法包括使用PEG介导的原生质体转化、电穿孔、微注射whiskers、弹道(bio1istics)或微投射轰击进行直接的DNA摄取。这样的方法在本领域是已知的(Vasil等人的美国专利号5，405，765；Bilang等人(1991)Gene100∶247-
250；Scheid等人，(1991)Mol.Gen.Genet.，228：104-112；Guerche等人，(1987)Plant Science52：111-儿6；Neuhause等人，(1987)Theor.Appl Genet.75：30-36；Klein等人，(1987)Nature327：70-73；Howell等人，(1980)Science208：1265；Horsch等人，(1985)Science227：1229-1231；DeBlock等人，(1989)Plant Physiology91：694-701；Methodsfor Plant Molecular Biology(Weissbach and Weissbach，eds.)Academic Press，Inc.(1988)以及Methods inPlant MolecularBiology(Schuler and Zielinski，eds.)Academic Press，Inc.(1989)。转化方法取决于待转化的植物细胞、所用的载体的稳定性、基因产物的表达水平和其它参数。
在White FF，Vectors fbr Gene Transferin Higher Plants；Transgenic Plants，Vo1.1，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press，1993，pp.15-38；
Jenes B等人(1993)Techniques for GeneIransfer，Iransgenic Plants，Vo1.1，Engineering and Utilzation，S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press，pp.128-143；
Potrykus(1991)Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Bio142：205-225中描述了使用农杆菌转化植物。其它的用于传送外源基因的方法包括使用PEG介导的原生质体转化、电穿孔、微注射whiskers、弹道(bio1istics)或微投射轰击进行直接的DNA摄取。这样的方法在本领域是已知的(Vasil等人的美国专利号5，405，765；Bilang等人(1991)Gene100∶247-
250；Scheid等人，(1991)Mol.Gen.Genet.，228：104-112；Guerche等人，(1987)Plant Science52：111-儿6；Neuhause等人，(1987)Theor.Appl Genet.75：30-36；Klein等人，(1987)Nature327：70-73；Howell等人，(1980)Science208：1265；Horsch等人，(1985)Science227：1229-1231；DeBlock等人，(1989)Plant Physiology91：694-701；Methodsfor Plant Molecular Biology(Weissbach and Weissbach，eds.)Academic Press，Inc.(1988)以及Methods inPlant MolecularBiology(Schuler and Zielinski，eds.)Academic Press，Inc.(1989)。转化方法取决于待转化的植物细胞、所用的载体的稳定性、基因产物的表达水平和其它参数。
[0157] 其它的适合于将核苷酸序列引入植物细胞以及接下来插入植物基因组的方法包括Crossway等人(1986)Biotechniques4：320-334描述的微注射，Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：5602-5606描述的电穿孔，Townsend等人，美国专利号5，563,055，Zhao等人，美国专利号5，981，840描述的农杆菌介导的转化，PaSzkoWSki等人(1984)EMBOJ.3：2717-2722描述的直接基因转移，以及弹道颗粒加速，如Sanford等人，美国专利号
4，945，050；Tomes等人，美国专利号5，879，918；Tomes等人，美国专利号5，886，244；Bidney等人，美国专利号5，932，782；Tomes等人(1995)″DirectDNA Transfer into Intact P1ant Cells via Microprojectile Bombardment,″in Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；
McCabe等人(1988)Biotechnology 6∶923-926)所描述；和Lecl转化(WO00／28058)。还参见Weissinger等人(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford等人(1987)Particulate Science and Technology5：27-37(洋葱)；Christou等人(1988)PlantPhysiol.87：671-674(大豆)；McCabe等人(1988)Bio／Technology6：923-926(大豆)；Finer and McMullen(1991)In Vitro CellDev.Biol.27P：175-182(大豆)；Singh 等人(1998)Theor.Appl.Genet.96：
319-324(大豆)；Datta等人(1990)Biotechnology8：736-740(水稻)；Klein等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：4305-4309(玉米)；Klein等人(1988)Biotechnology6：559-
563(玉米)；Tomes，美国专利号5，240，855；Buising等人，美国专利号5，322，783和5，324，
646；Tomes等人(1995)″Direct DNA Transger into Intact Plant cells Via
Microprojectile Bombardment,″inPlantCell，Tissue，and Organ Culture.Fundamental Metho由，ed.Gamborg(Springer-Verlag，Berlin)(玉米)；Kleln等人(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm等人(1990)Biotechnology8：833-839(玉米)；
Hooykaas-Van Slogteren等人(1984)Noture (London)311：763-764；Bowen等人，美国专利号5，736，369(谷类)；Bytebier 等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：5345-5349(百合科(Liliaceae))；DeWet等人(1985)inThe Experimental Manipulation of Ovule Tissues，ed.Chapman等人(Longman，New York)，pp.197-209(花粉)；Kaeppler等人(1990)Plant Cell Reports9：415-418以及Kaeppler等人(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(whisker介导的转化)；D′Halluin等人(1992)PlantCell 4：1495-1505(电穿孔)；Li等人(1993)Plant CellReports12：250-255and Christou and Ford(1995)Annals of Botany75：407-413(rice)；Osjoda等人(1996)Nature Biotechnology14：745-750(玉米通过根癌农杆菌)；这些均引入本文作为参考。
4，945，050；Tomes等人，美国专利号5，879，918；Tomes等人，美国专利号5，886，244；Bidney等人，美国专利号5，932，782；Tomes等人(1995)″DirectDNA Transfer into Intact P1ant Cells via Microprojectile Bombardment,″in Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；
McCabe等人(1988)Biotechnology 6∶923-926)所描述；和Lecl转化(WO00／28058)。还参见Weissinger等人(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford等人(1987)Particulate Science and Technology5：27-37(洋葱)；Christou等人(1988)PlantPhysiol.87：671-674(大豆)；McCabe等人(1988)Bio／Technology6：923-926(大豆)；Finer and McMullen(1991)In Vitro CellDev.Biol.27P：175-182(大豆)；Singh 等人(1998)Theor.Appl.Genet.96：
319-324(大豆)；Datta等人(1990)Biotechnology8：736-740(水稻)；Klein等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：4305-4309(玉米)；Klein等人(1988)Biotechnology6：559-
563(玉米)；Tomes，美国专利号5，240，855；Buising等人，美国专利号5，322，783和5，324，
646；Tomes等人(1995)″Direct DNA Transger into Intact Plant cells Via
Microprojectile Bombardment,″inPlantCell，Tissue，and Organ Culture.Fundamental Metho由，ed.Gamborg(Springer-Verlag，Berlin)(玉米)；Kleln等人(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm等人(1990)Biotechnology8：833-839(玉米)；
Hooykaas-Van Slogteren等人(1984)Noture (London)311：763-764；Bowen等人，美国专利号5，736，369(谷类)；Bytebier 等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：5345-5349(百合科(Liliaceae))；DeWet等人(1985)inThe Experimental Manipulation of Ovule Tissues，ed.Chapman等人(Longman，New York)，pp.197-209(花粉)；Kaeppler等人(1990)Plant Cell Reports9：415-418以及Kaeppler等人(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(whisker介导的转化)；D′Halluin等人(1992)PlantCell 4：1495-1505(电穿孔)；Li等人(1993)Plant CellReports12：250-255and Christou and Ford(1995)Annals of Botany75：407-413(rice)；Osjoda等人(1996)Nature Biotechnology14：745-750(玉米通过根癌农杆菌)；这些均引入本文作为参考。
[0158] 可通过使用病毒或病毒核酸接触植物而将本发明所述多核苷酸引入植物。通常，这样的方法包括将本发明所述多核苷酸构建体并入病毒DNA或RNA分子。应该认识到，本发明所述AHASL1蛋白最初可作为病毒多聚蛋白的一部分被合成，然后通过体内或体外蛋白水解处理而产生所需要的重组蛋白。此外，应认识到，本发明所述启动子也包括用于病毒RNA聚合酶转录的启动子。将多核苷酸构建体引入植物并表达其所编码蛋白的方法，包括病毒DNA或RNA分子，在本领域是已知的。参见，例如美国专利号5，889，191，5，889，190，5，866,785，5，589，367和5，316，931；这里引入作为参考。
[0159] 可通过各种常规方法使经转化的细胞进入植物中生长。参见，例如McCormick等人(1986)Plant Cell Reports5∶81-84。然后可使这些植物生长并用相同的经转化的植株或不同的植株来授粉，然后鉴定所得到的具有所需要表型特征组成型表达的杂种。可生长两代或多代以确保所需要表型特征的 表达被稳定地保持且被遗传，然后收获种子以确保实现了所需要表型特征的表达。通过这种方式，本发明提供了转化的种子(也称作转基因种子)，其具有稳定整合入其基因组的本发明所述多核苷酸构建体，例如本发明所述表达框。
[0160] 本发明可用于转化任何种的植物，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。感兴趣的植物种包括但不限于，玉蜀黍(corn)或玉米(maize)(zza mays)，芸苔属(例如油菜、芜菁、芥菜)，特别是那些用作种子油来源的芸苔属，紫花苜蓿(Medicago sativa)，水稻(Oryza sativa)，黑麦(Secale cereale)，高粱(Sorghum bicolor，Sorghum vulfare)，稷(例如珍珠稷(Pennisetum glaucum)，黍糜(Panicum miliaceum)，小米(Setaria italica)，穇(Eleusine coracana))，向日葵(Helianthus annuuS)，红花(Carthamus tinctorius)，小麦(Triticum aestivum，T. Turgidum ssp.durum)，大豆(Glycine max)，烟草(Nicotiana tabacum)，马铃薯(Solanum tuberosum)，花生(Arachis hypogaea)，棉花(Gossypium barbadense，Gossypium hirsutum)，甘薯(Ipomoea batatus)，木薯(Manihot esculenta)，咖啡(Coffea spp.)，椰子(Cocos nucofera)，凤梨(Ananas comosus)，柑橘树(Citrus spp.)，可可树(Theobroma cacao)，茶(Camellia sinensis)，香蕉(Musa spp.)，鳄梨(Persea americana)，无花果(Ficus casica)，番石榴(Psidium guajava)，芒果(Mangifera indica)，橄榄(Olea europaea)，木瓜(Carica papaya)，腰果(Anacardium occidentale)，澳大利亚坚果(Macadamia integrifolia)，杏树(Prunus amygdalus)，糖用甜菜(Beta vulfaris)，甘蔗(Saccharum spp.)，燕麦，大麦，蔬菜，观赏植物和松柏类。优选地，本发明所述植物为农作物植物(例如，向日葵、芸苔属、棉花、糖用甜菜、大豆、花生、紫花苜蓿、红花、烟草、玉米、水稻、小麦、黑麦、大麦、黑小麦、高粱、稷等)。
[0161] 本发明所述除草剂抗性植物在控制杂草的方法中有用。因此，本发明进一步提供了控制本发明所述除草剂抗性植物附近的杂草的方法。该方法包括向杂草和除草剂抗性植物施用有效量的除草剂，其中所述除草剂抗性植物与野生型植物相比，对至少一种除草剂特别是咪唑啉酮或磺酰脲除草剂具有增加的抗性。在这样的控制杂草的方法中，本发明所述除草剂抗性植物优选为农作物植物，包括但不限于，向日葵、紫花苜蓿、芸苔属、大豆、棉花、红花、花生、烟草、番茄、马铃薯、小麦、水稻、玉米、高粱、大麦、黑麦、稷和高粱。
[0162] 通过提供对除草剂特别是咪唑啉酮和磺酰脲除草剂具有增加的抗性的植物，可应用很多种类的制剂用于保护植物抵抗杂草，从而增加植物生长，减少营养竞争。可在出芽前、出芽后、种植前和种植时将除草剂自身用于控制本发明所述植物周围的杂草，或者可使用含有其它添加剂的咪唑啉酮除草剂制剂。除草剂还可用作种子处理。即，有效浓度或有效量的除草剂或含有有效浓度或有效量除草剂的组合物可在播种前或播种时直接施用于种子。可包含在咪唑啉酮或磺酰脲除草剂制剂或组合物中的添加剂有其它除草剂、清洁剂、佐剂、扩展剂、粘着剂、稳定剂等。除草剂制剂可以是湿的或干的制剂，包括但不限于，流动粉末、可乳化浓缩物和液体浓缩物。除草剂和除草剂制剂可以常规方法施用，例如通过喷雾、灌溉、喷粉(dusting)、包被(coating)等。
[0163] 本发明提供了包括使用AHAS-抑制性除草剂的方法。在这些方法中，AHAS-抑制性除草剂可通过任何本领域已知的方法施用，包括但不限于，种子处理、土壤处理和叶子处理。
[0164] 本发明提供了用于增强植物、植物组织、植物细胞或其它宿主细胞对至少一种干扰AHAS酶活性的除草剂的耐药性或抗性的方法。优选地，这样的AHAS-抑制性除草剂为咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、三唑嘧啶除草剂、嘧啶氧基苯甲酸盐(pyrimidinyloxybenzoate)、磺酰基氨基羰基三唑啉酮除草剂或其混合物。更优选的，这样的除草剂为咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂或其混合物。对于本发明，咪唑啉酮除草剂包括但不限于，(咪草烟)、 (甲咪唑烟酸(imazapic))、 (甲氧咪草烟)、
(灭草喹(imazaquin))、 (imazethabenz)、 (灭草
烟)、上述任何除草剂的衍生物、上述除草剂的两种或更多种的混合物，例如咪草烟／甲氧咪草烟 更特别的，咪唑啉酮除草剂选自，但不限于：2-(4-异丙基-4-甲基-
5-氧基-2-咪唑啉-2-基)-烟酸，[2-(4-异丙基)-4-][甲基-5-氧基-2-咪唑啉-2-基)-3-喹啉羧基]酸，[5-乙基-2-(4-异丙基-]4-甲基-5-氧基-2-咪唑啉-2-基)-烟酸，2-(4-异丙基-
4-甲基-5-氧基-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸，[2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧基-
2-]咪唑啉-2-基)-5-甲基烟酸，和甲基[6-(4-异丙基-4-]甲基-5-氧基-2-咪唑啉-2-基)-间-甲苯甲酸盐和甲基[2-(4-异丙基-4-甲基-5-]氧基-2-咪唑啉-2-基)-对-甲苯甲酸盐的混合物。优选使用[5-乙基-2-(4-异丙基-]4-甲基-5-氧基-2-咪唑啉-2- 基)-烟酸和[2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧基-2-咪唑啉-2-]基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸。特别优选使用[2-(4-异丙基-4-]甲基-5-氧基-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸。
(灭草喹(imazaquin))、 (imazethabenz)、 (灭草
烟)、上述任何除草剂的衍生物、上述除草剂的两种或更多种的混合物，例如咪草烟／甲氧咪草烟 更特别的，咪唑啉酮除草剂选自，但不限于：2-(4-异丙基-4-甲基-
5-氧基-2-咪唑啉-2-基)-烟酸，[2-(4-异丙基)-4-][甲基-5-氧基-2-咪唑啉-2-基)-3-喹啉羧基]酸，[5-乙基-2-(4-异丙基-]4-甲基-5-氧基-2-咪唑啉-2-基)-烟酸，2-(4-异丙基-
4-甲基-5-氧基-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸，[2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧基-
2-]咪唑啉-2-基)-5-甲基烟酸，和甲基[6-(4-异丙基-4-]甲基-5-氧基-2-咪唑啉-2-基)-间-甲苯甲酸盐和甲基[2-(4-异丙基-4-甲基-5-]氧基-2-咪唑啉-2-基)-对-甲苯甲酸盐的混合物。优选使用[5-乙基-2-(4-异丙基-]4-甲基-5-氧基-2-咪唑啉-2- 基)-烟酸和[2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧基-2-咪唑啉-2-]基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸。特别优选使用[2-(4-异丙基-4-]甲基-5-氧基-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸。
[0165] 对于本发明，磺酰脲除草剂包括但不限于，氯磺隆(chlorsulfuron)、甲磺隆(metsulfuron methyl)、甲嘧磺隆(sulfometuron methyl)、氯嘧磺隆(chlorimuron ethyl)、噻吩磺隆(thifensulfuron methyl)、苯磺隆(tribenuron methyl)、苄嘧磺隆(bensulfuron methyl)、烟嘧磺隆(nicosulfuron)、胺苯磺隆(ethametsulfuron methyl)、砜嘧磺隆(rimSulfuron)、氟胺磺隆(trifiusulfuron methyl)、醚苯磺隆(triasulfuron)、氟嘧磺隆(primisulfuron methyl)、醚磺隆(cinosulfuron)、酰嘧磺隆(amidosulfiuon)、啶嘧磺隆(fiuzasulfuron)、咪唑磺隆(imazosulfuron)、吡嘧磺隆(pyrazosulfuron ethyl)、氯吡嘧磺隆(halosulfuron)、四唑嘧磺隆(azimsulfuron)、环丙嘧磺隆(cycloSulfuron)、乙氧嘧磺隆(ethoxysulfuron)、啶嘧磺隆(flazasulfuron)、氟啶嘧磺隆(flupyrsulfuron methyl)、甲酰胺磺隆(fbramsulfuron)、碘磺隆(iodosulfuron)、环氧嘧磺隆(oxasulfuron)、磺胺磺隆(mesosulfuron)、氟磺隆(prosulfuron)、磺酰磺隆(sulfosulfuron)、三氟啶磺隆(trifloxysulfuron)、三氟甲磺隆(tritoSulfuron)，上述任何除草剂的衍生物、上述除草剂的两种或更多种的混合物。本发明所述的三唑嘧啶除草剂包括包括但不限于，氯酯磺草胺(cloransulam)、双氯磺草胺(diclosulam)、双氟磺草胺(florasulam)、氟唑嘧磺草胺(flumetsulam)、磺草唑胺(metosulam)、五氟磺草胺(penoxsulam)。本发明所述的嘧啶氧基苯甲酸盐除草剂包括但不限于，双草醚
(bispyribac)、嘧草硫醚(pyrithiobac)、嘧草醚(pyriminobac)、嘧啶肟草醚
(pyribenzoxim)、环酯草醚(pyri ftalid)。本发明所述的磺酰基氨基-羰基三唑啉酮除草剂包括但不限于氟酮磺隆(fiucarbazone)和丙苯磺隆(propoxycarbazone)。
(bispyribac)、嘧草硫醚(pyrithiobac)、嘧草醚(pyriminobac)、嘧啶肟草醚
(pyribenzoxim)、环酯草醚(pyri ftalid)。本发明所述的磺酰基氨基-羰基三唑啉酮除草剂包括但不限于氟酮磺隆(fiucarbazone)和丙苯磺隆(propoxycarbazone)。
[0166] 应该认识到，嘧啶氧基苯甲酸盐除草剂与嘧啶硫代苯甲酸盐除草剂是密切相关的，概括描述于Weed Science Society of America的“嘧啶硫代苯甲酸盐除草剂”标题下。因此，本发明除草剂还包括嘧啶硫代苯甲酸盐除草剂，包括但不限于嘧啶氧基苯甲酸盐除草剂。
[0167] 在应用之前，AHAS-抑制性除草剂可被转化为习惯的制剂，例如溶液、乳剂、悬浮液、粉尘、粉末、糊剂和颗粒。使用形式取决于特定的应用目的； 在每种情况下，应该确保本发明所述化合物精细且均匀分布。
[0168] 制剂根据已知的方式来制备(参见，例如US3，060，084，EP-A707445(液体浓缩物)，Browning，”Agglomeration”，Chemical Engineering，Dec.4，1967，147-48，Perry’s Chemical Engineer’s Handbook，4th Ed.，McGraw-Hill，New York，1963，第8-57页，以及et seq.WO91／13546，US4，172，714，US4，144，050，US3，920，442，US5，180，587，US5，232，701，US5，208，030，GB2，095，558，US3，299，566，K1ingman，Weed Control as a Science，John Wiley and Sons，Inc.，New York，1961，Hance等人，Weed Control Handbook，8th Ed.，Blackwell Scientific PublicationS，Oxford，1989and Mollet，H.，Grubemann，A.，Formulation teehno1ogy，Wiley VCH Verlag GmbH，Weinheim(Germany)，2001，
2.D.A.Knowles，Chemistry and Techno1ogy of Agrochemical Formulations，K1uwer Academic Publishers，Dordrecht，1998(ISBN0-7514-0443-8)，例如通过使用适合于农业化学物质制剂的佐剂来延伸活性化合物，例如溶剂和／或载体、如果需要的话乳剂、表面活性剂和分散剂、防腐剂、消泡剂、抗冻剂，对于种子处理制剂来说还任选着色剂和／或粘合剂和／或胶凝剂。
2.D.A.Knowles，Chemistry and Techno1ogy of Agrochemical Formulations，K1uwer Academic Publishers，Dordrecht，1998(ISBN0-7514-0443-8)，例如通过使用适合于农业化学物质制剂的佐剂来延伸活性化合物，例如溶剂和／或载体、如果需要的话乳剂、表面活性剂和分散剂、防腐剂、消泡剂、抗冻剂，对于种子处理制剂来说还任选着色剂和／或粘合剂和／或胶凝剂。
[0169] 合适的溶剂的例子为水、芳香族溶剂(例如So1vesso产品、二甲苯)、石蜡(例如矿物油提取物)、醇类(例如甲醇、丁醇、戊醇、苯甲醇)、酮类(例如环己酮、γ-丁内酯)、吡咯烷酮(NMP、NOP)、乙酸酯(乙二醇二乙酸酯)、乙二醇、脂肪酸二甲胺、脂肪酸和脂肪酸酯。原则上，也可使用溶剂混合物。
[0172] 所用的合适的表面活性剂为碱金属、碱土金属和木素磺化酸的铵盐、萘磺酸、苯磺酸、二丁基萘磺酸、烷基芳基磺酸盐、烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、脂肪醇硫酸盐、脂肪酸和硫化脂肪醇乙二醇醚、磺化的萘和萘衍生物与甲醛的进一步缩合物、萘与苯酚和甲醛的缩合物或萘磺酸与苯酚和甲醛的缩合物、聚氧乙烯辛基酚醚、乙氧化异辛基酚、辛基酚、壬基酚、烷基酚聚乙二 醇醚、三丁基酚聚乙二醇醚、三硬脂酚聚乙二醇醚、烷基芳基聚醚醇、醇和脂肪醇乙撑氧的缩合物、乙氧化蓖麻油、聚氧乙烯烷基醚、乙氧化聚氧乙烯、月桂醇聚乙二醇醚乙缩醛、山梨醇酯、木质素亚硫酸盐废弃物液体和甲基纤维素。
[0173] 适合于制备直接喷洒的溶液、乳剂、糊剂或油分散剂的物质为中至高沸点的矿物油馏分例如煤油或柴油，深度煤焦油和植物或动物来源的油，脂肪族、环化和芳香族烃，例如甲苯、二甲苯、石蜡、四氢萘、烷基化萘或其衍生物、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、环己醇、环己酮、异佛乐酮，高极性溶剂例如二甲基亚砜，N-甲基吡咯烷酮或水。
[0174] 还可向制剂中加入抗冻剂例如甘油、乙二醇、丙烯乙二醇和杀细菌剂。
[0175] 合适的消泡剂例如基于硅或硬脂酸镁的消泡剂。种子处理制剂还可包含粘合剂和可选的着色剂。
[0176] 可加入粘合剂以改进处理之后活性材料在种子上的粘性。合适的粘合剂为嵌段共聚物EO／PO表面活性剂，也可为聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丁烯、聚异丁烯、聚苯乙烯、聚乙烯胺、聚乙烯酰胺、聚乙烯亚胺 聚醚、聚氨酯、聚醋酸乙烯酯、纤基乙酸钠和衍生自这些聚合物的共聚物。
[0177] 任选地，制剂中还可包含着色剂。用于种子处理制剂的合适的着色剂或染料为若丹明B(Rhodamin B)、C.I.颜料红112，C.I.苏丹红1，颜料蓝15：4，颜料蓝15：3，颜料蓝15：2，颜料蓝15：1，颜料蓝80，颜料黄1，颜料黄13，颜料红112，颜料红48：2，颜料红48：1，颜料红57：1，颜料红53：1，颜料橙43，颜料橙34，颜料橙5，颜料绿36，颜料绿7，颜料白6，颜料棕25，碱性紫10，碱性紫49，酸性红51，酸性红52，酸性红14，酸性蓝9，酸性黄23，碱性红10，碱性红
108。
108。
[0178] 合适的胶凝剂的例子为角叉菜 可通过混合或同时研磨活性物质与固体载体来制备粉末、用于撒播的材料和可粉尘化产品。
[0179] 颗粒，例如包被颗粒、浸渍颗粒和匀质颗粒，可通过将活性化合物与固体载体粘合来制备。固体载体的例子为矿物土例如硅胶，硅酸盐，云母，高岭土，镁质粘土，石灰石，石灰，白垩，红玄武土(bo1e)，黄土，粘土，白云石，硅藻土，硫酸钙，硫酸镁，氧化镁，研磨的合成材料，肥料例如硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、尿素，和植物来源的产品例如谷类粗磨粉、树皮粗 磨粉、木材粗磨粉和坚果壳粗磨粉，纤维素粉末和其它固体载体。
[0180] 通常，制剂包含0.01至95重量％，优选0.1至90重量％的AHAS-抑制性除草剂。在这种情况下，以90％至100重量％的纯度，优选95％至100重量％的纯度(根据NMR谱)来使用AHAS-抑制性除草剂。为了种子处理的目的，可分别稀释制剂至2-10倍从而产生随时可用的制剂中0.01至60重量％的活性化合物，优选为0.1至40重量％。
[0181] AHAS-抑制性除草剂可用作例如制剂形式或从制剂形式制备的使用形式，例如直接喷洒的溶液、粉末、悬浮液或分散液、乳剂、油分散剂、糊剂、可粉尘化产品、用于撒播的材料、或颗粒，通过喷洒、离子化、粉尘化、撒播或倾倒的方式。使用方式完全取决于需要的目的；其为了确保在每种情况下本发明所述AHAS-抑制性除草剂的最大可能的精细分布。
[0182] 可通过加入水而从乳液浓缩物、糊剂或可湿性粉末(喷雾粉末、油分散剂)来制备水性的使用形式。为了制备乳液、糊剂或油分散剂，可通过润湿剂、增粘剂、分散剂或乳剂将物质(本身或溶于油或溶剂中)在水中进行匀质。但是，也可以制备由活性物质、润湿剂、增粘剂、分散剂或乳剂以及如果合适的话，溶剂或油，组成的浓缩物，这样的浓缩物适合用水稀释。
[0183] 随时可用的制剂中的活性化合物的浓度可在相对宽的范围内变化。通常，其为0.0001至10％单位重量，优选为0.01至1％单位重量。
[0184] AHAS-抑制性除草剂还可成功用于超低体积处理(ULV)，可以使用包含超过95重量％的活性化合物的制剂，或甚至应用不含添加剂的活性化合物。
[0185] 以下为制剂的例子：
[0186] 1.用于叶子施用的以水稀释的产品。如果是种子处理的目的，这种产品可适用于稀释的或未稀释的种子。
[0187] A)水溶性浓缩物(SL、LS)
[0188] 将10重量份的AHAS-抑制性除草剂溶于90重量份的水或水溶性溶剂。或者，可加入润湿剂或其它佐剂。AHAS-抑制性除草剂在用水稀释并溶解之后，获得10％(w／w)AHAS-抑制性除草剂的制剂。
[0189] B)可分散浓缩物(DC)
[0190] 将20重量份的AHAS-抑制性除草剂溶于70重量份的环己酮，加入10重量份的分散剂例如聚乙烯吡咯烷酮。以水稀释得到分散剂，从而获得20％ (w／w)的AHAS-抑制性除草剂制剂。
[0191] C)可乳化浓缩物(EC)
[0192] 将15重量份的AHAS-抑制性除草剂溶于7重量份的二甲苯，加入十二烷基苯磺酸钙和蓖麻油乙氧化物(均为5重量份)。以水稀释得到乳液，从而获得15％(w／w)的AHAS-抑制性除草剂的制剂。
[0193] D)乳液(EW、EO、ES)
[0194] 将25重量份的AHAS-抑制性除草剂溶于35重量份的二甲苯，加入十二烷基苯磺酸钙和蓖麻油乙氧化物(均为5重量份)。将此混合物通过乳化机器(例如Ultraturrax)加到30重量份的水中制成匀质乳液。以水稀释得到乳液，从而获得25％(w／w)的AHAS-抑制性除草剂的制剂。
[0195] E)悬浮液(SC、OD、FS)
[0196] 在振动球磨机内，将20重量份的AHAS-抑制性除草剂与10重量份的分散剂、润湿剂和70重量份的水或有机溶剂粉碎，从而得到精细的AHAS-抑制剂除草剂悬浮液。以水稀释得AHAS-抑制性除草剂的稳定悬浮液，从而获得20％(w／w)的AHAS-抑制性除草剂的制剂。
[0197] F)水分散性颗粒和水溶性颗粒(WG、SG)
[0198] 将50重量份的AHAS-抑制性除草剂与50重量份的分散剂、润湿剂精细地研磨，通过技术设备(例如挤压、喷淋塔、流化床)制成水分散性颗粒或水溶性颗粒。以水稀释得到AHAS-抑制剂除草剂的稳定悬浮液或溶液，从而获得50％(w／w)的AHAS-抑制性除草剂的制剂。
[0199] G)水分散性粉末和水溶性粉末(WP、SP、SS、WS)
[0200] 在转子-定子研磨机内，将75重量份的AHAS-抑制性除草剂与25重量份的分散剂、润湿剂和硅胶研磨。以水稀释得到AHAS-抑制性除草剂的稳定悬浮液或溶液，从而获得75％(w／w)的AHAS-抑制性除草剂的制剂。
[0201] I)凝胶-制剂(GF)
[0202] 在振动球磨机内，将20重量份的AHAS-抑制性除草剂与10重量份的分散剂、1重量份的凝胶制剂润湿剂和70重量份的水或有机溶剂粉碎，从而得到精细的AHAS-抑制剂除草剂悬浮液。以水稀释得到AHAS-抑制性除草剂的稳定悬浮液，从而获得20％(w／w)的AHAS-抑制性除草剂的制剂。这种凝胶制剂适合于用作种子处理。
[0203] 2.不经稀释即施用于叶子的产品。如果是种子处理的目的，这种的产 品可适用于稀释的种子。
[0204] A)可粉尘化粉末(DP、DS)
[0205] 将5重量份的AHAS-抑制性除草剂精细地研磨并与95重量份的精细分散的高岭土紧密混合，从而获得具有5％(w／w)的AHAS-抑制性除草剂的可粉尘化产品。
[0206] B)颗粒(GR、FG、GG、MG)
[0207] 将0.5重量份的AHAS-抑制性除草剂精细地研磨并与95.5重量份的载体混合，从而获得0.5％(w／w)的AHAS-抑制性除草剂的制剂。现在的方法为挤压、喷雾干燥或流化床。这产生可不经稀释即用于叶子的颗粒。
[0208] 常规的种子处理制剂包括例如可流动的浓缩物FS、溶液LS、用于干燥处理的粉末DS、用于浆液处理的水分散性粉末WS、水溶性粉末SS和乳液ES和EC以及凝胶制剂GF。这些制剂可用于稀释或未稀释的种子。在播种之前或者直接施用于种子。
[0209] 在优选的实施方式中，FS制剂用于种子处理。通常，FS制剂可含有1-800g／1的活性成分、1-200g／1的表面活性剂、0-200g／1的抗冻剂、0-400g／1的粘合剂、0-200g／l的颜料和直至1升的溶剂，优选为水。
[0210] 本发明提供了本发明所述除草剂抗性植物的转基因和非转基因种子。这样的种子包括例如非转基因芸苔属种子，其包含J05Z-07801、J04E-0139、J04E-0130或J04E-0122植物的除草剂抗性特性；以及转基因种子，其包含编码除草剂抗性AHAS L1蛋白的本发明所述多核苷酸分子。
[0211] 对于种子处理，使用除草剂，优选为选自下列的AHAS-抑制性除草剂来处理本发明所述除草剂抗性植物：酰嘧磺隆、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氯嘧磺隆、氯磺隆、醚磺隆、环丙嘧磺隆、胺苯磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰胺磺隆、氯吡嘧磺隆、咪唑磺隆、碘磺隆、磺胺磺隆、甲磺隆、烟嘧磺隆、环氧嘧磺隆、氟嘧磺隆、氟磺隆、吡嘧磺隆、砜嘧磺隆、甲嘧磺隆、磺酰磺隆、噻吩磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、三氟啶磺隆、氟胺磺隆、三氟甲磺隆、咪草酯、甲氧咪草烟、甲咪唑烟酸、灭草烟、灭草喹、咪草烟、氯酯磺草胺、双氯磺草胺、双氟磺草胺、氟唑嘧磺草胺、磺草唑胺、五氟磺草胺、双草醚、嘧草醚、丙苯磺隆、氟酮磺隆、嘧啶肟草醚、环酯草醚、嘧草硫醚，及其混合物，或包含AHAS-抑制性除草剂的制剂。
[0212] 术语“种子处理”包括本领域已知的所有合适的种子处理技术，例如拌 种、种子包被(coating)、种子喷粉(seed dusting)、种子浸泡和种子包衣(pelleting)。
[0213] 根据本发明的一种变化形式，本发明的另一个主题为处理土壤的方法，特别是通过将以下施用到条播机中：粒状制剂，其含有AHAS-抑制性除草剂，作为与任选地一种或多种固体或液体、农业上可接受的载体和／或与任选地一种或多种农业上可接受的表面活性剂的组合物／制剂，例如粒状制剂。此方法有利地用于例如谷类、玉米、棉花和向日葵的苗床。
[0214] 本发明还包括以种子处理制剂包被的种子或包含种子处理制剂的种子，所述种子处理制剂包含至少一种选自以下的ALS抑制剂：酰嘧磺隆、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氯嘧磺隆、氯磺隆、醚磺隆、环丙嘧磺隆、胺苯磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰胺磺隆、氯吡嘧磺隆、咪唑磺隆、碘磺隆、磺胺磺隆、甲磺隆、烟嘧磺隆、环氧嘧磺隆、氟嘧磺隆、氟磺隆、吡嘧磺隆、砜嘧磺隆、甲嘧磺隆、磺酰磺隆、噻吩磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、三氟啶磺隆、氟胺磺隆、三氟甲磺隆、咪草酯、甲氧咪草烟、甲咪唑烟酸、灭草烟、灭草喹、咪草烟、氯酯磺草胺、双氯磺草胺、双氟磺草胺、氟唑嘧磺草胺、磺草唑胺、五氟磺草胺、双草醚、嘧草醚、丙苯磺隆、氟酮磺隆、嘧啶肟草醚、环酯草醚和嘧草硫醚。
[0215] 术语“种子”包括所有种类的种子和植物繁殖体(propagule)，包括但不限于实生种子(true seed)、插条(seed pieces)、吸根(sucker)、球茎、鳞茎、果实、块茎、谷粒(grain)、插支(cutting)、伐条(cut shoot)等，在优选的实施方式中为实生种子。
[0216] 术语“以……包被和／或包含……”通常表示在施用时活性成分的主要部分位于繁殖产品的表面，虽然更大或更小部分的成分可穿透入繁殖产品中，这取决于施用方法。当所述繁殖产品被(重)种植时，它可吸收活性成分。
[0217] 使用AHAS-抑制性除草剂或包含AHAS-抑制性除草剂的制剂来处理种子是在植物播种前或植物发芽前通过对种子进行喷洒或喷粉来进行。
[0218] 在处理种子时，通过使用有效量的AHAS-抑制性除草剂或包含AHAS-抑制性除草剂的制剂来施用相应的制剂。这里，施用率通常为每1()()kg种子0.1g至10kg a.i.(或a.i.的混合物，或制剂)，优选为每100kg种子1g至5kg，特别是每100kg种子1g至2.5kg。对于特定的作物例如莴苣，施 用率可更高。
[0219] 本发明提供了对抗不想要的植物或控制杂草的方法，其包括在播种前和／或催芽后将本发明所述抗性植物的种子与AHAS-抑制性除草剂接触。该方法还包括将种子播种到例如田地中的土壤或温室中的盆罐介质中。该方法在对抗不想要的植物或控制与种子非常临近的杂草中是特别有用的。
[0220] 控制不想要的植物被理解为杀死杂草和／或延迟或抑制杂草的正常生长。杂草，在最宽泛的意义上被理解为所有的在不需要它们的地方生长的植物。
[0221] 本发明所述杂草包括但不限于，双子叶和单子叶杂草。双子叶杂草包括但不限于以下属的杂草：欧白芥属(Sinapis)、独行菜属(Lepidium)、拉拉藤属(Galium)、繁缕属(Stellaria)、母菊属(Matricaria)、春黄菊属(Anthemis)、牛膝菊属(Galinsoga)、藜属(Chenopodium)、荨麻属(Urtica)、千里光属(Senecio)、苋属(Amaranthus)、马齿苋属(Portulaca)、苍耳属(Xanthium)、旋花属(Convolvulus)、番薯属(Ipomoea)、蓼属(Polygonum)、田菁属(Sesbania)、豚草属(Ambrosia)、蓟属(Cirsium)、飞廉属(Carduus)、苦苣菜属(Sonchus)、茄属(Solanum)、蔊菜属(Rorippa)、节节菜属(Rotala)、母草属(Lindernia)、野芝麻属(Lamium)、婆婆纳属(Veronica)、苘麻属(Abutilon)、蓼属(Emex)、曼陀罗属(Datura)、堇菜属(Viola)、鼬瓣花属(Galeopsis)、罂粟属(Papaver)、矢车菊属(Centaurea)、车轴草属(Trifolium)、毛茛属(Ranunculus)和蒲公英属(Taraxacum)。单子叶杂草包括但不限于以下属的杂草：稗属(Echinochloa)、狗尾草属(Setaria)、黍属(Panicum)、马唐属(Digitaria)、梯牧草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、羊茅属(Festuca)、椮属(Eleusine)、臂形草属(Brachiaria)、毒麦属(Lolium)、雀麦属(Bromus)、燕麦属(Avena)、莎草属(Cyperus)、高粱属(Sorghum)、冰草属(Agropyron)、狗牙根属(Cynodon)、雨久花属(Monochoria)、飘拂草属(Fimbristyslis)、慈姑属(Sagittaria)、荸荠属(Eleocharis)、藨草属(Scirpus)、雀稗属(Paspalum)、鸭嘴草属(Ischaemum)、密穗桔梗属(Sphenoclea)、龙爪茅属(Dactyloctenium)、剪股颖属(Agrostis)、看麦娘属(Alopecurus)、和Apera属。
[0222] 此外，本发明所述杂草可包括例如在不想要的区域生长的农作物植物。例如，在主要包含大豆植物的田地里的自发的玉米植物可被认为是杂草，如 果在大豆植物田地里不需要玉米植物的话。
[0223] 本文所用的冠词“一、“一个”是指一个或多个(即至少一个)该冠词的语法客体。例如，“一个元件”是指一个或多个元件。
[0224] 本文所用的单词“包含”或其变体例如“含有”、“包括”将被理解为包括所指元素、整数或步骤，或元素、整数或步骤的组，但不排除任何其它的元素、整数或步骤，或元素、整数或步骤的组。
[0225] 按照示例性方式而非限制性方式提供了以下实施例。
[0226] 实施例1-AHAS体外酶测试
[0227] AHAS酶测试是快速显色方法，其通过在AHAS抑制剂存在的情况下测定AHAS酶活性的水平被用于定量不同样品的耐药性水平，如Singh等人所描述(Ana8l.Biochem.171：173-179，1988)。使用了两种类型的测试：只使用一种抑制剂的基础测试和需要使用两种抑制剂的精确测试。这两种测试均指示咪唑啉酮耐药性水平；精确测试能够测出一些植物品系之间的细微的耐药性水平差异。AHAS测试贮存溶液含有：0.2M磷酸二氢钠+0.2M磷酸氢二钠十
50M1，1环丙烷二羧酸(CPCA)+完全强度Murashige&Skoogs碱性盐+1mM甲氧咪草烟(AC299，
263工业级)+5％H2SO4+2M NaOH+2.5％α-萘酚+0.25％肌氨酸，在pH6.0的1M磷酸盐缓冲液中。
50M1，1环丙烷二羧酸(CPCA)+完全强度Murashige&Skoogs碱性盐+1mM甲氧咪草烟(AC299，
263工业级)+5％H2SO4+2M NaOH+2.5％α-萘酚+0.25％肌氨酸，在pH6.0的1M磷酸盐缓冲液中。
[0228] 最终的AHAS测试溶液包括三种类型的溶液：溶液A包括：10mM磷酸盐缓冲液+10％M＆S培养基+500μM CPCA+0.5％L-丙氨酸+50mM丙酮酸盐。溶液B含有：溶液A+2.5μM甲氧咪草烟。溶液C含有：溶液B+0.2μM氯磺隆。
[0229] 基础AHAS测试：甲氧咪草烟抑制剂：
[0230] 测试在96孔板中进行。每个96孔板具有19-21个样品(包括对照)的空间。每个孔含有100μ1的AHAS缓冲液，如下所述。在层流通风厨中，将无菌AHAS缓冲液无菌操作转移至两个溶液盆(标为A和B)中。从贮存液中向B盆中加入等于2.5μM浓度的甲氧咪草烟。将100μl的溶液A移入每个板的所有的奇数行，将100μ1的溶液B移入每个板的所有的偶数行。
[0231] 第1个阶段∶取样
[0232] 使用钻孔器从10日龄的苗的最小的叶子的底部截取4个圆片。在抽苔期之前进行植物取样，因为在这个生长期之后另一个AHAS基因被激活，因 此会潜在地引起假性结果。在截取之后，将圆片转移至含有A和B溶液的微量滴定板中。
[0233] 一旦整个微量滴定板满了之后，将其在室温荧光下温育14-18小时。然后在-80℃的冰箱中冷冻培养板来终止温育。
[0234] 第2个阶段：反应
[0235] 从-80℃的冰箱中移出AHAS板，在室温下或在60℃的温育箱内融化。向每个孔中加入25微升的H2SO4。在60℃温育酸化的板大约15分钟直至所有的圆片均完全变为褐色。在这个时间内制备萘酚溶液，然后向每个孔中加入150μl α-萘酚／肌氨酸溶液。将每个板在60℃温育15分钟。温育后，目视比较咪唑啉酮和非咪唑啉酮样品之间的AHAS活性的差异。使用微量滴定板读数器测定AHAS活性而产生的“红”颜色的强度，从而确定咪唑啉酮和非咪唑啉酮样品的定量值。
[0236] 在530nm读取每个孔的吸收值。在这个设定下，给出代表红色强度的数值。将红色的强度转化为每个孔AHAS活性的量。当给定样品的甲氧咪草烟孔的AHAS活性除以对照的AHAS活性时，给出“相对于对照的AHAS活性百分率”。
[0237] 精确AHAS测试：甲氧咪草烟和氯磺隆抑制剂
[0238] 在AHAS测试中引入氯磺隆，SU，是基于PM1和bR基因的耐药性行为。PM1和bR对SU为非耐药性的，而PM2对SU确实表现出一些耐药性。SU活性除以甲氧咪草烟活性的比值给出对于所有四个耐药性水平(PM1／PM2，PM2，PM1，WT)的唯一数值。
[0239] 结果显示于图3：芥菜中bR、PM2和bR／PM2，当以甲氧咪草烟和氯磺隆抑制时。
[0240] 在甲氧咪草烟存在的情况下不同的芥菜突变组合的AHAS酶活性
[0241] 测定了从纯合子双单倍体(DH)芥菜品系(含有不同的突变组合：aR xbR，PM2x A107T，PM2x bR，A104T x bR)中获得的蛋白提取物中的AHAS酶的活性，其作为未处理(0μM甲氧咪草烟)样品的活性的百分率。作为对照，也包括了从三个油菜品系中获得的蛋白提取物：油菜PM1，油菜PM2和油菜PM1／PM2。100μM甲氧咪草烟存在下的三个突变组合和对照(check)的结果显示于图6。
[0242] 实施例2-温室中除草剂耐药性测试
[0243] 第一个实验设计为确定含有一个基因(bR或PM2)和两个基因
[0244] (bR／PM2)的芥菜品系相对于含有两个基因(PM1／PM2)的油菜品系是否存在咪唑啉酮除草剂耐药性的区别。
[0245] 将来自每个品系的6个单独植物进行各喷雾处理。在2-3叶的阶段施用1x(17g ai／英亩)、2x(34g ai／英亩)和3x(51g ai／英亩)的咪唑啉酮除草剂 在大约种植14天后的2-3叶阶段进行喷雾。将喷雾枪设定为40psi，速度设定为′80′(34.98L／ac)。进行以下计算以制备25m1Odyssey贮存液：17*0.025／34.98=0.1215g的Odyssey颗粒。这是基于以下数值估计：每英亩所需要的Odyssey的量为17g，喷雾枪推进一次输送8.33m1溶液。以
0.5L／100L或0.000125L或125μL的施用率(rate)加入 喷雾后，
0.5L／100L或0.000125L或125μL的施用率(rate)加入 喷雾后，
[0246] 在漕沟内将植物随机排列。根据以下标准对植物的除草剂可见损伤打分(喷雾后7-10天)：
[0247] 1.未表现出任何损伤的植物
[0248] 2.显示出叶子褪色或轻微叶子卷缩的植物
[0249] 3.表现出显著叶子褪色(例如变黄或变紫)以及出现一些基础分枝(basalbranehing)
[0250] 4.显示出显著损伤而导致死亡或严重挫折。
[0251] 在损伤显现后测定植物高度和生物量(植物重量)。在喷雾处理和对照间对每个品种进行比较。结果显示于表1。
[0252]
[0253]
[0254] 第二个实验设计为在温室中以不同施用率的甲氧咪草烟处理时比较芥菜中不同的突变即bR、bR／PM2、PM2、aR、A104T和A107T。用于甲氧咪草烟喷雾测试的样品(第二个温室实验)显示于下表2。
[0255] 表2：用于第二个温室实验的芥菜品系
[0256]编号 种 突变 品系 注／Rep
1 芥菜 aR J04E-0139 M4aR S653N A基因组
2 芥菜 A107T J04E-0130 M3A122T B基因组
3 芥菜 bR J04E-0044 M3bR S653N B基因组
4 芥菜 A104T J04E-0122 M3A122T A基因组
5 芥菜 - Arid Lot C3J3
6 芥菜 bR／PM2 J05Z-07801 DH1bR／PM2
7 芥菜 PM2 J03Z-03315 PM2Lot M5T2-002
1 芥菜 aR J04E-0139 M4aR S653N A基因组
2 芥菜 A107T J04E-0130 M3A122T B基因组
3 芥菜 bR J04E-0044 M3bR S653N B基因组
4 芥菜 A104T J04E-0122 M3A122T A基因组
5 芥菜 - Arid Lot C3J3
6 芥菜 bR／PM2 J05Z-07801 DH1bR／PM2
7 芥菜 PM2 J03Z-03315 PM2Lot M5T2-002
[0257] 每个品系中12个个体植物进行每个水平的处理，如表3所示。共有7个甲氧咪草烟+0.5％v／v 处理。在1-2真叶期时处理植物。结果显示于图4。
[0258] 表3.处理水平
[0259]处理 甲氧咪草烟(g ai／ha)
1 0
2 10
3 20
4 35
5 40
6 70
7 100
1 0
2 10
3 20
4 35
5 40
6 70
7 100
[0260] 在另一个温室实验中，从含有A基因组AHAS突变(aR、A104T或PM2)的芥菜品系和含有B基因组AHAS突变(bR、A107T)的芥菜品系杂交而产生芥菜DH品系。选择那些确定为A基因组和B基因组突变均为纯合子的DH品系(例如aR／bR或A104T／bR等)用于下面的温室除草剂耐药性实验，该实验以0、35、70和100g ai／ha的甲氧咪草烟进行。植物毒性以0至9的级别评级，0为没有作物损伤，9为严重的植物坏死引起植物死亡。
植物毒性曲线的结果显示于图8。
植物毒性曲线的结果显示于图8。
[0261] 对于那些没有鉴定出双纯合DH品系的组合(例如aR/A107T突变组合)，在温室中种植出基因分离的F2群体。对每个F2个体进行测序以确定突变的本质和接合性，然后以35g ai／ha的甲氧咪草烟喷雾以确定各自的损伤表型。对于aR和A107T突变来说，基因型与作物损伤表型的关系显示于图7。
[0262] 实施例3-田野中除草剂耐药性测试
[0263] 在North Dakota的四个位置的随机裂区设计试验(4次重复)中进行4个芥菜条目和1个油菜条目的除草剂耐药性测试(不同的处理参见表4)并测试产量。小块土地(plot)为最小1.5x5m大小，每个小块被围住(swathed)，在成熟时收割。在4个芥菜条目中，1个是PM1／PM2芥菜品系，其为通过常规回交技术将PM1和PM2突变从油菜中基因渗入到芥菜中，然后两个世代的自交以产生纯合子芥菜PM1／PM2。其它三个芥菜条目为不同的芥菜基因型，其含有B基因组bR突变及堆积的PM2突变。所有的bR/PM2芥菜品系均为两个突变的纯合子。油菜条目为 商售对照品种的PM1／PM2突变纯合子。在处理后5至7天(DAT)和18至24DAT进行作物损伤评级(％植物毒性)。表5中显示四个位置之一的平均百分植物毒性。
[0264] 表4.除草剂处理
[0265]
[0266] 表5：Velva、North Dakota的一个位置施用1x除草剂Odyssey后芥菜PM1／PM2和芥菜bR／PM2条目的平均百分植物毒性和平均产量
[0267]
[0268]
[0269] 表5中的结果显示，芥菜中基因渗入的PM1／PM2突变没有足够进行商业化的耐药性。在所有的测试位置(Velva、Mohall、Fargo、Hettinger)，PM1／PM2芥菜品系的除草剂后植物毒性评级为25-50％范围内，而相对于未喷雾处理的PM1／PM2芥菜条目， 处理的PM1／PM2芥菜条目的产量平均降低了50％。bR／PM2芥菜条目(S006、S007、S008)证明：对于任何测试位置在 处理后没有植物毒性，也没有证实
产量上的任何显著降低。还证实在所有位置，bR／PM2芥菜条目比PM1／PM2油菜条目的植物毒性评级低。
产量上的任何显著降低。还证实在所有位置，bR／PM2芥菜条目比PM1／PM2油菜条目的植物毒性评级低。
[0270] 类似地，在三个位置进行了含有bR/PM2堆积突变的28个不同的芥菜条目(基因型)以及一个单独PM2芥菜条目(J03Z-16413)和一个含有PM1／PM2堆积突变的商售油菜对照的田野测试。使用了随机完全区块(block)设计(1个处理)，其
由2个重复组成，其中平均小块的大小为1.5m x5m。使用区域卡诺拉播种率，对于每个位置，基于每个条目1000个种子重量将每个个体土地小块的播种率调整为相同的播种密度。在下表6中显示了施用于此试验中所有条目的除草剂。
由2个重复组成，其中平均小块的大小为1.5m x5m。使用区域卡诺拉播种率，对于每个位置，基于每个条目1000个种子重量将每个个体土地小块的播种率调整为相同的播种密度。在下表6中显示了施用于此试验中所有条目的除草剂。
[0271] 表6：除草剂处理
[0272]
[0273] 表7：农学评级
[0274]
[0275]
[0276]
[0277] 将另外两个含有bR/PM2堆积突变的不同芥菜条目(基因型)和一个含有PM1／PM2堆积突变的商售 油菜对照在多个位置在两个连续年份进行田野测试。使用区域卡诺拉播种率，对于每个位置，基于每个条目1000个种子重量将每个个体土地小块的播种率调整为相同的播种密度。在下表9中显示了施用于此试验中所有条目的除草剂[0278] 表9：
[0279]
[0280]
[0281]
[0282] 还从三个含有bR和PM2双突变(bR/PM2的纯合子)的不同品系中获得了田野植物毒性数据，并与含有PM1和PM2双突变(PM1／PM2的纯合子)的商售油菜目比较。以1x(35g ai／ha的甲氧咪草烟)喷洒这些品系，并在处理后7-10天(DAT)对植物毒
性进行评级。也用 喷洒芥菜野生品系(即不含有任何AHAS突变)作为对照。
结果显示于下表10。
性进行评级。也用 喷洒芥菜野生品系(即不含有任何AHAS突变)作为对照。
结果显示于下表10。
[0283] 表10：
[0284]
[0285] 在另外四个含有bR和PM2双突变(bR/PM2的纯合子)的中度油(mid-o1eic)芥菜品系中进行了类似的实验系列，以2x BEYONDTM喷洒。结果显示于下表11。
[0286] 表11：
[0287]
[0288] 为了研究bR和PM2突变堆积到一起相对于各自单独突变的效应，在单独含有PM2突变、单独含有bR突变、同时含有bR和PM2突变的芥菜条目上进行了除草剂耐药性田野测试。在所有的条目中所有的突变均为纯合。使用了随机完全区块(block)设计(4个处理)，其由3次重复组成，平均土地小块大小为1.5mx5m。使用区域卡诺拉播种率，对于每个位置，基于每个条目1()()0个种子重量将每个个体土地小块的播种率调整为相同的播种密度。在下表
10中显示了施用于此试验中所有条目的除草剂 1x施用率为35g ai／ha)。以0x、
1x、2x或4x水平的除草剂处理含有单一或组合特性的芥菜品系，在处理后10天、12天、14天或28天(DAT)进行评级。两个不同的记录员在处理后10天、12天、14天和／或28天记录各个数量的除草剂处理后的植物毒性(如表10所示：记录员1vs记录员2)。结果显示于下表12。
10中显示了施用于此试验中所有条目的除草剂 1x施用率为35g ai／ha)。以0x、
1x、2x或4x水平的除草剂处理含有单一或组合特性的芥菜品系，在处理后10天、12天、14天或28天(DAT)进行评级。两个不同的记录员在处理后10天、12天、14天和／或28天记录各个数量的除草剂处理后的植物毒性(如表10所示：记录员1vs记录员2)。结果显示于下表12。
[0289] 表12：
[0290]
[0291]
[0292] 为了更清晰地证明在bR／PM2堆积突变品系中的耐药性比各自突变品系的耐药性的和要大(作物损伤或植物毒性显示于表12)，将bR/PM2堆积的实际的百分除草剂耐药性与单一bR突变品系加上单一PM2突变品系的百分除草剂耐药性的和相比较(预测除草剂耐药性)(表13)。在挑战或压倒单一突变的除草剂水平时(最显著为2x和4x施用率)，在bR/PM2堆积突变品系中观测到的除草剂耐药性水平超过了单一bR+单一PM2两种耐药性之和。在超过30种不同的含有bR/PM2堆积突变的芥菜基因型中观测到了这种加强水平的(协同的)咪唑啉酮耐药性。
[0293] 表13：
[0294]
[0295]
[0296] 综上，芥菜bR／PM2品系中的协同或加强水平的耐药性比油菜PM1／PM2堆积突变品系中观测到的耐药性水平高，也比芥菜PM1／PM2堆积突变品系中观测到的耐药性水平高得多(表5)。当以咪唑啉酮除草剂处理时，芥菜bR／PM2品系没有显示出任何产量损失(field penalty)，然而，当以商售施用率的咪唑啉酮除草剂处理时，芥菜PM1／PM2品系显示出显著的产量损失。
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