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用于转导和扩增淋巴细胞以及调节其活性的方法及组合物

阅读:858发布:2020-05-08

专利汇可以提供用于转导和扩增淋巴细胞以及调节其活性的方法及组合物专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本公开提供用于以基因方式修饰淋巴细胞的方法及用于执行包括转导T细胞和/或NK细胞的过继性 细胞疗法 的方法。所述方法可包括抑制性RNA分子和/或可包括淋巴增生性组件的工程化 信号 传导多肽和/或嵌合 抗原 受体(CAR),例如受微环境限制的 生物 CAR(MRB-CAR)。本文中提供此类工程化信号传导多肽的额外组件,诸如驱动增生的那些组件及用于其的调节组件,以及复制 缺陷 型重组反转录病毒颗粒及 包装 细胞系以及其制造方法。提供用于调节经转导和/或经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞的许多组件及方法,例如,包括核糖 开关 、MRB-CAR、识别域和/或pH调节剂的组件和方法。,下面是用于转导和扩增淋巴细胞以及调节其活性的方法及组合物专利的具体信息内容。

1.一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在制备用于以基因方式修饰受试者的静息T细胞或静息NK细胞的试剂盒中的用途,其中所述试剂盒的用途包含:使所述T细胞或NK细胞离体与所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触,其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含表面上的假型组件及所述表面上的膜结合T细胞活化组件,其中所述接触有助于利用所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导所述T细胞或NK细胞,由此产生经基因方式修饰的T细胞或NK细胞,且其中所述接触进行1小时至12小时之间。
2.根据权利要求1所述的用途,其中所述接触进行1小时至6小时之间。
3.根据权利要求1所述的用途,其中所述膜结合T细胞活化组件为抗CD3 scFvFc。
4.根据权利要求1所述的用途,其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含多核苷酸,所述多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元,其中所述一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽和包含T细胞淋巴增生性组件的第二多肽,且其中所述经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞能够在不存在针对所述CAR的ASTR的靶标且不存在外源性细胞因子的情况下在离体培养物中存活至少7天。
5.根据权利要求4所述的用途,其中所述T细胞淋巴增生性组件包含嵌合细胞因子受体。
6.根据权利要求5所述的用途,其中所述嵌合细胞因子受体包含连接至IL-7受体α的IL-7,或其保留促进T细胞和/或NK细胞增生的能片段,且其中所述嵌合细胞因子受体是组成性活性的。
7.根据权利要求6所述的用途,其中所述嵌合细胞因子受体包含共价连接至能够结合IL-7的IL-7受体的功能性胞外片段、IL-7受体跨膜域及IL-7受体信号传导域的IL-7。
8.根据权利要求4所述的用途,其中所述CAR为MRB-CAR。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的用途,其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒,且其中所述经基因方式修饰的细胞为经基因方式修饰的T细胞。
10.一种经基因方式修饰的T细胞或NK细胞,其通过根据包含使静息T细胞和/或静息NK细胞离体与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触的方法转导静息T细胞和/或静息NK细胞来制得,其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上的假型组件及在其表面上的膜结合T细胞活化组件,其中所述接触有助于利用所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导所述静息T细胞和/或NK细胞,由此产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞,且其中所述接触进行1小时至12小时之间。
11.根据权利要求10所述的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞,其中所述接触进行1小时至6小时之间。
12.根据权利要求10所述的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞,其中所述膜结合T细胞活化组件为抗CD3 scFvFc。
13.根据权利要求10所述的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞,其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含多核苷酸,所述多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元,其中所述一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽和包含T细胞淋巴增生性组件的第二多肽,且其中所述经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞能够在不存在针对所述CAR的ASTR的靶标且不存在外源性细胞因子的情况下在离体培养物中存活至少7天。
14.根据权利要求13所述的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞,其中所述CAR为MRB-CAR。
15.根据权利要求13所述的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞,其中所述多核苷酸进一步包含Kozak相关序列、WPRE组件及多重终止序列中的一者或多者。
16.根据权利要求13所述的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞,其中所述T细胞淋巴增生性组件包含嵌合细胞因子受体。
17.根据权利要求10至16中任一项所述的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞,其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒,且其中所述经基因方式修饰的细胞为T细胞。
18.一种使用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导淋巴细胞的方法,其包含:
A.将包装细胞悬浮培养在无血清培养基中,其中所述包装细胞包含编码所述复制缺陷型反转录病毒颗粒的可包装RNA基因组、REV蛋白质、gag多肽、pol多肽及假型组件的核酸序列;
B.从所述无血清培养基采集所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒;以及
C.使所述淋巴细胞与所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触,其中所述接触进行少于12小时,由此转导所述淋巴细胞。
19.根据权利要求18所述的方法,其中所述包装细胞进一步包含编码活化组件的核酸。
20.根据权利要求19所述的方法,其中所述活化组件为抗CD3抗体
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述抗CD3抗体为抗CD3 scFvFc。
22.根据权利要求18所述的方法,其中所述包装细胞为包含稳定整合于其中的编码所述可包装RNA基因组的核酸的永生化细胞。
23.根据权利要求18所述的方法,其中所述gag多肽及所述pol多肽由一种或多种可诱导启动子表达且其中所述方法进一步包含:在所述培养期间添加反式激活因子以诱导从所述一种或多种可诱导启动子表达所述gap多肽及所述pol多肽。
24.根据权利要求18所述的方法,其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含多核苷酸,所述多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元,其中所述一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽。
25.根据权利要求24所述的方法,其中所述CAR为MRB-CAR。
26.根据权利要求18所述的方法,其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含多核苷酸,所述多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元,其中所述一个或多个转录单元编码淋巴增生性组件。
27.根据权利要求18所述的方法,其中所述接触进行1小时至12小时之间。
28.根据权利要求18所述的方法,其中所述淋巴细胞能够在不存在任何外源性细胞因子的情况下在体外扩增。
29.根据权利要求18至28中任一项所述的方法,其中所述淋巴细胞为静息T细胞且其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒。
30.一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其包含:
A.多核苷酸,其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元,其中所述一个或多个转录单元编码嵌合抗原受体(CAR);及B.在其表面上的假型组件及T细胞活化组件,其中所述T细胞活化组件不由所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码,且其中所述T细胞活化组件为抗CD3 scFvFc抗体。
31.根据权利要求30所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其中所述复制缺陷型反转录病毒颗粒进一步包含能够结合至CD28的膜结合多肽。
32.根据权利要求30所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其中所述抗CD3 scFvFc抗体与异源GPI锚定连接序列融合。
33.根据权利要求30所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其中所述一个或多个转录单元进一步编码淋巴增生性组件。
34.根据权利要求33所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其中所述CAR和所述淋巴增生性组件表达为分离的多肽。
35.根据权利要求34所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其中所述淋巴增生性组件为嵌合淋巴增生性组件。
36.根据权利要求35所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其中所述嵌合淋巴增生性组件为组成性活性嵌合细胞因子受体,且其中所述组成性活性嵌合细胞因子受体的表达处于控制组件的控制下。
37.根据权利要求36所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其中所述嵌合细胞因子受体包含IL-7受体的胞内信号传导域、IL-12受体的胞内信号传导域、IL-15受体的胞内信号传导域、IL-21受体的胞内信号传导域、IL-23受体的胞内信号传导域、IL-27受体的胞内信号传导域、转化生长因子β(TGFβ)诱饵受体的胞内信号传导域或CD28。
38.根据权利要求35所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其中所述嵌合淋巴增生性组件包含细胞因子受体且所述细胞因子受体包含连接至所述IL-7受体的IL-7,或其保留促进T细胞和/或NK细胞增生的能力的片段,且其中所述嵌合细胞因子受体是组成性活性的。
39.根据权利要求38所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其中所述嵌合细胞因子受体包含共价连接至能够结合IL-7的IL-7受体的功能性胞外片段、IL-7受体跨膜域及IL-7受体信号传导域的IL-7。
40.根据权利要求30所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其中所述多核苷酸进一步包含Kozak相关序列、WPRE组件及多重终止序列中的一者或多者。
41.根据权利要求30至39中任一项所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒且所述启动子在T细胞中为活性的。
42.一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其包含含有可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元的多核苷酸,其中所述一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽和包含组成性活性嵌合淋巴增生性组件的第二多肽,且其中所述嵌合淋巴增生性组件不包含连接至其同源受体或连接至其同源受体片段的细胞因子。
43.根据权利要求42所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其中所述嵌合淋巴增生性组件包含嵌合细胞因子受体。
44.根据权利要求42所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其中所述组成性活性嵌合淋巴增生性组件的表达处于控制组件的控制下。
45.根据权利要求42所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒进一步包含在其表面上的假型组件。
46.根据权利要求42所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒进一步包含在其表面上的T细胞活化组件,其中所述T细胞活化组件不由所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码。
47.根据权利要求46所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其中所述T细胞活化组件为抗CD3抗体。
48.根据权利要求47所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其中所述T细胞活化组件为抗CD3scFvFc。
49.根据权利要求42至47中任一项所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒,且其中所述启动子在T细胞中为活性的。
50.一种经基因方式修饰的T细胞或NK细胞,其中所述T细胞或NK细胞表达包含组成性活性嵌合淋巴增生性组件的第一工程化信号传导多肽及包含嵌合抗原受体(CAR)的第二工程化信号传导多肽,所述组成性活性嵌合淋巴增生性组件不包含连接至其同源受体或连接至其同源受体片段的细胞因子,所述嵌合抗原受体包括抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。
51.根据权利要求50所述的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞,其中所述第一工程化信号传导多肽的表达处于控制组件的控制下。
52.根据权利要求50所述的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞,其中所述细胞为T细胞。
53.根据权利要求50所述的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞,其中所述CAR为MRB-CAR。
54.一种用于转导静息T细胞和/或静息NK细胞的方法,其包含使所述静息T细胞和/或静息NK细胞离体与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触,其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上的假型组件及在其表面上的膜结合T细胞活化组件,其中所述接触有助于利用所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导所述静息T细胞和/或NK细胞,由此产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞,且其中所述接触进行1小时至12小时之间。
55.根据权利要求54所述的方法,其中所述接触进行1小时至6小时之间。
56.根据权利要求54所述的方法,其中所述膜结合T细胞活化组件为抗CD3 scFvFc。
57.根据权利要求54所述的方法,其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含多核苷酸,所述多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元,其中所述一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽及包含T细胞淋巴增生性组件的第二多肽,且其中所述经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞能够在不存在针对所述CAR的ASTR的靶标且不存在外源性细胞因子的情况下在离体培养物中存活至少7天。
58.根据权利要求57所述的方法,其中所述T细胞淋巴增生性组件包含嵌合细胞因子受体。
59.根据权利要求58所述的方法,其中所述嵌合细胞因子受体包含连接至IL-7受体α的IL-7,或其保留促进T细胞和/或NK细胞增生的能力的片段,且其中所述嵌合细胞因子受体是组成性活性的。
60.根据权利要求59所述的方法,其中所述嵌合细胞因子受体包含共价连接至能够结合IL-7的IL-7受体的功能性胞外片段、IL-7受体跨膜域及IL-7受体信号传导域的IL-7。
61.根据权利要求57所述的方法,其中所述CAR为MRB-CAR。
62.根据权利要求54至61中任一项所述的方法,其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒,且其中所述经基因方式修饰的细胞为经基因方式修饰的T细胞。
63.根据权利要求57所述的方法,其中10%至50%之间的所述静息T细胞和/或静息NK细胞经转导。
64.一种用于转导静息T细胞和/或静息NK细胞的方法,其包含使所述静息T细胞和/或静息NK细胞离体与转导反应混合物中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触,其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含其表面上的假型组件及其表面上的膜结合抗CD3 scFvFc抗体,其中所述接触有助于利用所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导所述静息T细胞和/或NK细胞,由此产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞。
65.根据权利要求64所述的方法,其中所述转导进行1小时至20小时之间。
66.根据权利要求64所述的方法,其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含多核苷酸,所述多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元,其中所述一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽及包含T细胞淋巴增生性组件的第二多肽,且其中所述经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞能够在不存在针对所述CAR的ASTR的靶标且不存在外源性细胞因子的情况下在离体培养物中存活至少7天。
67.根据权利要求66所述的方法,其中所述T细胞淋巴增生性组件包含嵌合细胞因子受体。
68.根据权利要求67所述的方法,其中所述嵌合细胞因子受体包含连接至IL-7受体α的IL-7,或其保留促进T细胞和/或NK细胞增生的能力的片段,且其中所述嵌合细胞因子受体是组成性活性的。
69.根据权利要求68所述的方法,其中所述嵌合细胞因子受体包含共价连接至能够结合IL-7的IL-7受体的功能性胞外片段、IL-7受体跨膜域及IL-7受体信号传导域的IL-7。
70.根据权利要求64至69中任一项所述的方法,其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒,且其中所述经基因方式修饰的细胞为经基因方式修饰的T细胞。
71.根据权利要求66所述的方法,其中10%至50%之间的所述静息T细胞和/或静息NK细胞经转导。

说明书全文

用于转导和扩增淋巴细胞以及调节其活性的方法及组合物

[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请为:2017年3月19日提交的国际申请第PCT/US2017/023112号的部分继续申请;2017年7月8日提交的国际申请第PCT/US2017/041277号的部分继续申请;2017年3月19
日提交的美国申请第15/462,855号的部分继续申请;以及2017年7月8日提交的美国申请第
15/644,778号的部分继续申请;并主张以下申请的权益:2017年3月3日提交的美国临时申
请第62/467,039号;2017年9月18日提交的美国临时申请第62/560,176号;2017年9月27日
提交的美国临时申请第62/564,253号;以及2017年9月28日提交的美国临时申请第62/564,
991号;国际申请第PCT/US2017/023112号主张2016年3月19日提交的美国临时申请第62/
390,093号、2016年7月8日提交的美国临时申请第62/360,041号以及2017年3月3日提交的
美国临时申请第62/467,039号的权益;国际申请第PCT/US2017/041277号主张2017年3月19
日提交的国际申请第PCT/US2017/023112号、2017年3月19日提交的美国专利申请第15/
462,855号、2016年7月8日提交的美国临时申请第62/360,041号以及2017年3月3日提交的
美国临时申请第62/467,039号的权益;美国申请第15/462,855号主张2016年3月19日提交
的美国临时申请第62/390,093号、2016年7月8日提交的美国临时申请第62/360,041号以及
2017年3月3日提交的美国临时申请第62/467,039号的权益;且美国申请第15/644,778号为
2017年3月19日提交的国际申请第PCT/US2017/023112号的部分继续申请及2017年3月19日
提交的美国专利申请第15/462,855号的部分继续申请,且主张2016年7月8日提交的美国临
时申请第62/360,041号及2017年3月3日提交的美国临时申请第62/467,039号的权益。这些
申请以全文引用的方式并入本文中。
[0003] 序列表
[0004] 本申请在此以引用方式并入与本申请一起提交的电子序列表的材料。该电子序列表中的材料作为在2018年3月3日创建的标题为“F1_001_WO_03_Sequence_Listing_2018_
03_03.txt”的文本(.txt)文件(其文件大小为526KB)提交,且以全文引用的方式并入本文
中。

技术领域

[0005] 本发明涉及免疫学领域,或更具体地,涉及T淋巴细胞或其他免疫细胞的基因修饰,以及制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒及控制其中基因表达的方法。

背景技术

[0006] 从受试者(例如,患者)分离的淋巴细胞可在体外活化且经基因修饰以表达合成蛋白,这些合成蛋白能够基于所合并的基因程序而与其他细胞及环境重新定位结合。这种合
成蛋白的一个实例为嵌合抗原受体(CAR)。目前使用的一种CAR为胞外识别域(例如,抗原结合域)、跨膜域及由复制缺陷型重组反转录病毒编码的一个或多个胞内信号传导域的融合。
[0007] 尽管重组反转录病毒已在感染非分裂细胞上显示出功效,但静息CD4及CD8淋巴细胞对这些载体的基因转导不敏感。为了克服这些困难,通常在可出现带有CAR基因载体的基因修饰之前,使用刺激剂来在体外活化这些细胞。在刺激及转导之后,经基因修饰的细胞在体外扩增且随后再引入至淋巴消耗(lymphodeplete)的患者中。在体内抗原结合之后,CAR
的胞内信号传导部分可在免疫细胞中启动活化相关的反应并释放细胞溶解分子以诱导肿
瘤细胞死亡。
[0008] 目前这些方法需要大量的操作及在T细胞再输注至患者中之前在体外制造增生性T细胞,以及淋巴消耗化学疗法以释放细胞因子及消耗竞争性受体以有助于T细胞移植。一
旦引入至身体中,这些CAR疗法还不能控制体内传播速率,也不能安全地定向同样在肿瘤
5 8
表达的靶标。因此,现今CAR疗法一般由使用1×10 个细胞/千克至1×10 个细胞/千克的剂
量离体扩增12天至28天的细胞输注,且定向靶标(例如,肿瘤靶标),对于该CAR疗法离开肿瘤在靶标毒性上一般是可接受的。这些相对较长离体扩增时间产生细胞存活性及无菌性问
题,以及包括可扩增性的挑战在内的样本一致问题。因此,亟需一种更安全、更有效的可扩增的T细胞或NK细胞疗法
[0009] 由于我们对驱动淋巴细胞的转导、增生和存活的过程的理解为涉及免疫过程的各种潜在商业用途的核心,因此需要经改进方法及组合物以供研究淋巴细胞。举例而言,其将有助于鉴别可用于更好的表征及理解淋巴细胞可如何经基因方式修饰的方法及组合物以
及影响其存活及增生的因素。此外,其将有助于鉴别驱动淋巴细胞增生及存活的组合物。这些组合物可用于研究对这些过程的调节。除用于研究淋巴细胞的方法及组合物以外,需要
经改进病毒包装细胞系及其制造及使用的方法。举例而言,这些细胞系及方法将适用于分
析重组病毒(诸如重组反转录病毒颗粒)的不同组分,以及用于使用包装细胞系以供生产重
组反转录病毒颗粒的方法。

发明内容

[0010] 本文中提供帮助克服涉及用于转导和/或以基因方式修饰淋巴细胞(诸如T细胞和/或NK细胞)的方法、组合物及试剂盒的有效性及安全性问题。这些方法的某些实施例
用于用这些细胞进行过继性细胞疗法。因此,在一些方面,本文中提供用于以基因方式修饰和/或转导淋巴细胞(尤其T细胞和/或NK细胞)和/或用于调节经转导和/或经基因方式修饰
的T细胞和/或NK细胞的方法、组合物及试剂盒。这些方法、组合物及试剂盒提供优于目前技术的改进的功效及安全性,尤其关于表达嵌合抗原受体(CAR)及在说明性实施例中微环境
限制生物CAR的T细胞和/或NK细胞。利用本文提供的方法和/或使用该方法生产的经转导
和/或经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞包括,在经由反转录病毒(例如,慢病毒)颗粒自反转录病毒(例如,慢病毒)基因组递送的说明性实施例中,为此类细胞及为利用此类细胞
的方法(诸如研究方法、商业生产方法及过继性细胞疗法)提供经改进特征的功能性及功能
性组合。举例而言,这些细胞可离体在较短时间内产生,及这些细胞具有可被更好调节的经改进的生长特性。
[0011] 在一些方面,本文中提供用于调节CAR、mRNA、抑制性RNA的表达的调节组件,和/或在淋巴细胞(诸如B细胞、T细胞及NK细胞)中的淋巴增生性组件,例如嵌合淋巴增生性组件。此外,在一些方面,本文中提供表达各种功能组件且在其表面上携载各种功能组件的重组
反转录病毒,以及用于生产这些重组反转录病毒的方法及包装细胞系。这些重组反转录病
毒及用于生产其的方法及细胞克服了先前技术关于基因组数目及大小的限制,具有在递送
至T细胞和/或NK细胞中时提供益处的不同功能组件。
[0012] 在一些方面,提供用于转导和/或以基因方式修饰淋巴细胞(诸如T细胞和/或NK细胞)的方法,且在说明性实施例中,提供用于转导和/或以基因方式修饰静息T细胞和/或NK
细胞的离体方法。这些方面中的一些方面可比先前方法快速得多地进行,可有助于更有效
的研究、更有效的商业生产以及经改进的患者护理方法。此外,本文在一些实施例中提供了利用在本文中一些方面提供的重组反转录病毒以及药用试剂以提供经改进的安全性机制
以帮助调节经转导和/或经基因方式修饰的淋巴细胞(诸如T细胞和/或NK细胞)的活性的方
法。这些方法、组合物及试剂盒可在商业生产中及在用表达CAR的经转导和/或经基因方式
修饰的T细胞和/或NK细胞的过继性细胞疗法中用作研究工具。
[0013] 贯穿本专利申请,提供了关于本发明的方面及实施例的更多细节。章节及章节标题并不意欲限制方法、组合物及试剂盒或其中的功能组件的组合。
附图说明
[0014] 图1显示包括包装细胞(100)及本公开的一个例示性、非限制性实施例的由包装细胞(100)产生的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(200)的说明性组合物的示意图。在图1中,能够编码本发明的方面的各种载体(被称为重组多核苷酸(110))被包装至重组反转录病毒
颗粒(200)中,该重组反转录病毒颗粒在其基因组中包括第一工程化信号传导多肽(其包括
一个或多个淋巴增生性组件)且在一些实施例中包括第二工程化信号传导多肽(其为嵌合
抗原受体或CAR)。复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其膜上表达:允许复制缺陷型重组反
转录病毒颗粒与靶细胞结合并融合的假型组件(在一个非限制性实施例中,麻疹病毒凝血
素(H)多肽及麻疹病毒融合(F)多肽、或其细胞质域缺失变体)(240);能够结合并活化静息T细胞的活化组件(在非限制性实施例中,具有能够结合CD28的多肽及能够结合CD3的多肽的
活化组件)(分别为210及220);及膜结合细胞因子(在一个非限制性实施例中,IL-7 DAF融
合多肽)(230)。标记为(250)、(260)、(270)、(280)及(290)的部分分别为Src-FLAG-Vpx、HIV gag基质、HIV gag衣壳、RNA及HIV pol。
[0015] 图2显示包括由包装细胞(100)产生的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(200)及由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(200)转染的静息T细胞(300)的说明性组合物的示意性
图。复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(200)的表面上的组件与静息T细胞的表面上的受体
和/或配位体结合。在非限制性实施例中,假型组件可包括有助于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(200)与T细胞结合及融合的结合多肽及促融合多肽(在非限制性实施例中,麻疹病
毒凝血素(H)多肽及麻疹病毒融合(F)多肽、或其细胞质域缺失变体)。在非限制性实施例
中,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(200)在其表面上包括能够通过结合T细胞受体复合物
及视情况存在的辅助受体(320)来活化静息T细胞的活化组件(在非限制性实施例中,具有
能够结合CD28的多肽及能够结合CD3的多肽的活化组件)。此外,存在于复制缺陷型重组反
转录病毒颗粒(200)的表面上的膜结合细胞因子(在非限制性实施例中,IL-7 DAF融合多
肽)与静息T细胞的表面上的IL-7Rα(310)结合。与T细胞融合的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(200)及编码包括淋巴增生性组件(在说明性实施例中,组成性活性IL-7Rα)(370)的第一工程化信号传导多肽的多核苷酸,在迁移至待并入至经活化T细胞的DNA中的细胞核之前
在胞溶质中经反转录。不受理论限制,在一些非限制性实施例中,用病毒包装的Src-FLAG-Vpx(250)进入静息T细胞的胞溶质且促进SAMHD1(350)降解,从而导致可用于反转录的细胞
质dNTP库增加。在一些实施例中,多核苷酸也可编码包括CAR(360)的第二工程化信号传导
多肽。在一些实施例中,在化合物与调节其表达的控制组件(在非限制性实施例中,该控制组件为结合核苷类似物的核糖开关)结合时,表达淋巴增生性组件。在一些实施例中,CAR的表达也受控制组件调节。部分(330)为SLAM及CD46。部分(340)为CD3。
[0016] 图3A至图3E显示用于转染包装细胞以产生本文描述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的非限制性、例示性载体构建体的示意图。图3A显示含有编码融合至NFκB p65活化子域(p65 AD)的FRB域及融合至组成性表达的三个FKBP重复的ZFHD1 DNA结合域的多核苷
酸序列的构建体。图3A中的构建体也包括HIV1 REV及作为在雷帕霉素诱导型ZFHD1/p65 AD
启动子下的SrcFlagVpx融合的Vpx。图3B显示含有在ZFHD1/p65 AD启动子的控制下编码
rtTA序列的多核苷酸的构建体。图3C显示含有编码侧接有loxP位点的嘌呤霉素抗性基因及
侧接有lox2272位点的胞外MYC标记的多核苷酸的构建体。两个可选标记均在BiTRE启动子
的控制下,该BiTRE启动子侧接有FRT位点。图3D显示含有编码侧接有在TRE启动子的控制下的loxP位点及在TRE启动子与RFP的5’loxP位点之间的单个FRT位点的RFP的多核苷酸的构
建体。图3E显示含有编码侧接有在TRE启动子的控制下的loxP位点及在TRE启动子与GEP的
5’loxP位点之间的单个FRT位点的GFP的多核苷酸的构建体。图3C至图3E中的构建体充当其他多核苷酸序列插入至包装细胞系的基因组中的着陆点。
[0017] 图4A至图4C显示用于转染包装细胞以产生本文描述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的非限制性、例示性载体构建体的示意图。图4A显示含有编码具有CD14 GPI锚连接
位点的抗CD3(纯系UCHT1)scFvFc的三顺反子多核苷酸、能够使CD28与CD16B GPI锚连接位
点结合的CD80胞外域(ECD)及融合至衰变加速因子(DAF)的IL-7(其中,转座子序列侧接多
核苷酸区以用于整合至HEK293S基因组中)的构建体。图4B显示含有具有BiTRE启动子的多
核苷酸及在一个方向上编码gag多肽及pol多肽的多核苷酸区以及在另一方向上编码麻疹
病毒FΔx蛋白质及HΔy蛋白质的多核苷酸区的构建体。图4C显示含有编码CAR及在CD3Z启
动子(其在HEK293S细胞中不具有活性)的控制下的淋巴增生性组件IL7Rα-insPPCL的多核
苷酸序列的构建体,其中CAR及IL7Rα-insPPCL由编码T2A核糖体跳跃序列的多核苷酸序列
隔开,且IL7Rα-insPPCL具有阿昔洛韦(acyclovir)核糖开关控制的核糖核酸酶。含CAR的构建体进一步包括cPPT/CTS、RRE序列及编码HIV-1 Psi(Ψ)的多核苷酸序列。待被整合至基
因组中的含CAR的构建体上的整个多核苷酸序列侧接有FRT位点。
[0018] 图5A至图5C显示作为选择性核糖开关对照的代表性核苷类似物的阿昔洛韦(图5A)、喷昔洛韦(图5B)及2’-脱苷(图5C)的分子结构。
[0019] 图6表示Mesoplasma florum I-A型脱氧鸟苷核糖开关调节区及相关基因产物。序列为M.florum L1基因组DNA(AE017263.1)nt624396至nt625670的反向互补序列(其与
M.florum W37基因组DNA(CP006778.1)nt636277至nt637550相同)。结合用于初始筛选的适
体序列的脱氧鸟苷以粗体及下划线指示。下游基因产物(Ib类(需氧)核糖核苷酸还原酶,β亚基)以大写字母指示。
[0020] 图7表示用于定向进化策略的M.florum I-A型脱氧鸟苷核糖开关适体区。空椭圆内的核苷酸用于随机化。条纹椭圆内的核苷酸用于插入/缺失及随机化。
[0021] 图8A及图8B表示M.florum I-A型脱氧鸟苷核糖开关适体筛选库。在图8A中,具有实线的盒内的核苷酸为用于随机化的序列区,且具有虚线的盒内的核苷酸为用于插入/缺
失及随机化的序列区。图8B显示经由突变(随机核苷酸(“N”))及缺失/插入产生的可能序
列。
[0022] 图9表示合成为具有额外基对(添加其以允许PCR扩增)及T7启动子(添加其以用于在体外转录以用于文库筛选)的反向互补序列的M.florum I-A型脱氧鸟苷核糖开关适体
寡聚文库。还显示对应T7启动子扩增引物及反向扩增引物。
[0023] 图10表示枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)鸟苷xpt核糖开关调节区及相关基因产物。序列为枯草芽孢杆菌枯草亚种(B.subtilis subsp.subtilis)6051-HGW基因组DNA
(CP003329.1)nt2319439至nt2320353的反向互补序列。结合用于初始筛选的适体序列的鸟
苷以粗体及下划线指示。下游基因产物(黄嘌呤磷酸核糖转移酶xpt)以大写字母指示。
[0024] 图11表示用于定向进化策略的枯草芽孢杆菌鸟苷xpt核糖开关适体区。空椭圆内的核苷酸用于随机化。条纹椭圆内的核苷酸用于插入/缺失及随机化。
[0025] 图12A及图12B表示枯草芽孢杆菌鸟苷xpt核糖开关适体筛选文库。在图12A中,具有实线的盒内的核苷酸为用于随机化的序列区,且具有虚线的盒内的核苷酸为用于插入/
缺失及随机化的序列区。图12B显示经由突变(随机核苷酸(“N”))及缺失/插入产生的可能序列。
[0026] 图13表示合成为具有额外碱基对(添加其以允许PCR扩增)及T7启动子(添加其以用于在体外转录以用于文库筛选)的反向互补序列的枯草芽孢杆菌鸟苷xpt核糖开关适体
寡聚文库。还显示对应T7启动子扩增引物及反向扩增引物。
[0027] 图14显示选择文库构建。该文库为基于已知鸟苷-及脱氧鸟苷-结合RNA来构建(Pikovskaya,2013)。
[0028] 图15显示氧化石墨烯(GrO)适体选择的示意图。在步骤(1)中,转录RNA且将其纯化。在步骤(2)中,洗提经纯化的RNA。在步骤(3)中,将适体与反向靶标(counter-target)及缓冲液一起培育。在步骤(4)中,用氧化石墨烯移除与反向靶标或缓冲液组分结合的序列。
在步骤(5)中,离心分离上清液内的非特异性反应物种,接着将其丢弃。两次额外5分钟洗涤移除大部分的残余反向靶标结合序列及缓冲液结合序列。在步骤(6)中,将阿昔洛韦于1×
选择缓冲液中的溶液添加至GrO结合文库以用于阳性选择,因此潜在适体序列将经由与阳
性靶标相互作用而自GrO解吸附。在步骤(7)中,最终离心步骤将上清液中的靶标结合序列
自仍吸附至GrO的非反应序列分离。在步骤(8)中,反转录所选择的序列,接着经由PCR扩增文库,接着对该文库进行转录以产生用于下一轮选择的文库。
[0029] 图16显示氧化石墨烯平行评估的示意图。将经受平行评估的增浓文库分成四等份。接着,将文库样本添加至氧化石墨烯,且进行培育以将文库装载在氧化石墨烯上。使用两次5分钟洗涤以移除未结合材料。对于阳性(阿昔洛韦)及特殊靶标(喷昔洛韦)样本,各靶标分别在1×选择缓冲液中制备成1μM;反向靶标用10μM呈溶液形式的各反向靶标替换阳性靶标;阴性样本用等体积的不含核酸酶的替换阳性靶标。接着,使样本与其各别氧化石墨烯制剂组合且进行培育。培育后,离心样本以回收其上清液,且文库回收利用NanoDrop-
1000分光亮度计读数(Thermo Fisher Scientific;特拉华州威尔明顿)来测定。在变性
PAGE上分析剩余文库样本。在用Gel-Star染色/去染色之后获取凝胶的影像。回收与所期望文库大小对应的带以用于后续轮的平行评估,其中阳性靶标阿昔洛韦替代阴性、反向及特
殊靶标样本的预装载培育物的反向靶标。自第二平行评估回收的材料用于测序及分析。
[0030] 图17显示针对阿昔洛韦的七种适体候选物。各适体的自由能在37℃及1M Na+下由Quikfold 3.0(Zuker 2003)计算。使用专有算法来鉴别序列。各序列中的下划线区为PCR引物退火区。
[0031] 图18显示针对喷昔洛韦的七种适体候选物。各适体的自由能在37℃及1M Na+下由Quikfold 3.0(Zuker 2003)计算。使用专有算法来鉴别序列。各序列中的下划线区为PCR引物退火区。
[0032] 图19A提供IL7Rα变体在PBMC中表达时测试淋巴增生性/存活活性的示意图。图19B提供显示在存在及不存在IL-2下的PBMC的存活百分比的条形图。
[0033] 图20显示编码GFP、抗CD19嵌合抗原受体及eTAG(本文中称为F1-0-03)的慢病毒表达载体的示意图。
[0034] 图21A及图21B分别显示在用所指示的慢病毒颗粒转导来自供体12M的新鲜分离且未刺激的PBMC14小时后的第3天、第6天、第9天、第13天、第17天的总CD3+群体中的CD3+GFP+细胞百分比(%)的直方图及CD3+GFP+群体的绝对细胞计数/槽的直方图。各棒表示重复的
平均值+/-SD。
[0035] 图22A及图22B分别显示在用所指示的慢病毒颗粒转导来自供体13F的新鲜分离且未刺激的PBMC 14小时后的第3天及第6天的总CD3+群体中的CD3+GFP+细胞(%)的直方图及
CD3+GFP+群体的绝对细胞计数/槽的直方图。请注意,“A”显示使用VSV-G假型慢病毒颗粒(三次重复实验)的结果;“B”显示在向转导培养基添加OKT3 Ab(1μg/mL)的情况下使用VSV-G假型慢病毒颗粒(两次重复实验)的结果;“C”显示使用在其表面上表达GPI锚定
UCHT1scFvFc的VSV-G假型慢病毒颗粒(三次重复实验)的结果;及“D”显示使用在其表面上表达GPI锚定UCHT1scFvFc及GPI锚定CD80或其功能性胞外片段的VSV-G假型慢病毒颗粒(两
次重复实验)的结果。各棒表示两个重复或三个重复的平均值+/-SD,如图22A所示。
[0036] 图23A及图23B分别显示在用所指示的慢病毒颗粒转导来自供体12M的新鲜分离且未刺激的PBMC持续所指示的暴露时间(2h至20h)后的第3天、第6天及第9天的总CD3+群体中
的CD3+GFP+细胞百分比(%)的直方图及CD3+GFP+群体的绝对细胞计数/槽的直方图。转导
是在如所指示的盘或振荡器摇瓶中进行。各棒表示两次重复用VSV-G假型化慢病毒颗粒
(“VSV-G”)的平均值+/-SD;其他实验不具有重复。
[0037] 图24A为慢病毒载体主链F1-0-02的示意图,其包括驱动GFP及eTag的表达的转基因表达盒以及合成EF-1α启动子与GFP的上游内含子A。图24B显示将miRNA插入至F1-0-02主链的EF1α内含子A中。“1”表示EF1α重叠;“2”表示5′臂;“3”表示miRNA1 5′茎;“4”表示环;
“5”表示miRNA1 3′茎;“6”表示3′臂;“7”表示接头;“8”表示miRNA2 5′茎;“9”表示miRNA2 
3′茎;“10”表示miRNA3 5′茎;“11”表示miRNA3 3′茎;“12”表示miRNA4 5′茎;及“13”表示miRNA4 3′茎。
[0038] 图25为显示靶向处于EF-1α启动子内含子中的CD3ζ的miRNA能够阻断CD3复合物的表达的图。
[0039] 图26为显示用含有复制缺陷型慢病毒颗粒的miR-TCRα转导的样本的ΔΔCt的直方图。ΔΔCt值表示相对于未经转导对照的各经转导样本中的经处理miR-TCRa miRNA的
量。
[0040] 图27A至图27C为显示在经pH调节药用试剂处理或不经其处理的情况下CHO-靶标1细胞的特异性溶解百分比的图。在图27A中,CHO-靶标1细胞最初是在pH 6.7下,且在由箭头所指示的时间处,分别用NaHCO3或不用NaHCO3来处理实验槽(实线)及对照细胞(虚线)。在图
27B中,CHO-靶标1细胞最初是在pH 6.7下,且在由箭头所指示的时间处,分别用NaOH或不用NaOH来处理实验槽(实线)及对照细胞(虚线)。在图27C中,CHO-靶标1细胞最初是在pH 7.4
下,且分别用HCl或不用HCl来处理实验槽(实线)及对照细胞(虚线)。
[0041] 图28为显示在不存在(圆形)或存在(方形)阿昔洛韦的情况下F1A-795的热流通量相对于时间的图,如利用DSC所量测。
[0042] 图29为显示在施用PBS或酸氢盐之前及之后的CHO异种移植肿瘤携带小鼠中的ProSense FAST探针中的RFU百分比的图。
[0043] 图30为含有编码CAR及库1A、1.1A及1.1B的候选嵌合淋巴增生性组件(CLE)的多核苷酸序列的非限制性例示性转基因表达盒的示意图。
[0044] 图31为含有编码库2B及2.1B的候选CLE的多核苷酸序列的非限制性例示性转基因表达盒的示意图。
[0045] 图32为含有编码CAR及库3A、3B、3.1A及3.1B的候选CLE的多核苷酸序列的非限制性例示性转基因表达盒的示意图。
[0046] 图33为含有编码库4B及4.1B的候选CLE的多核苷酸序列的非限制性例示性转基因表达盒的示意图。
[0047] 图34分别显示在用所指示的慢病毒颗粒转导来自供体18的新鲜分离且未刺激的PBMC后第3天图34A活CD3+群体中的CD3+GFP+细胞百分比(%)的直方图及图34B每微升总的
活群体的绝对细胞计数的直方图。各棒表示重复的平均值+/-SD。
[0048] 图35为显示PBMC用编码个别CLE的慢病毒颗粒转导且在不存在外源性细胞因子的情况下培养35天的倍数扩增的图式。
[0049] 图36为显示PBMC用编码抗CD19 CAR构建体及个别CLE的慢病毒颗粒转导且在供体匹配的PBMC的存在下但在不存在外源性细胞因子的情况下培养35天的倍数扩增的图式。
[0050] 图37为显示所指示慢病毒颗粒在4小时中转导静息PBMC的效率的图式。如由FACS所测定,在不存在外源性细胞因子的情况下下,转导效率在6天后在培养物中经量测为CAR+PBMC%。各慢病毒颗粒编码CAR及CLE。用F1-1-228U及F1-3-219U转导的慢病毒颗粒在其表
面上显示UCHT1scFvFc-GPI。
[0051] 图38A及图38B为显示在静息PBMC用所指示慢病毒颗粒转导4小时且在不存在外源性细胞因子的情况下活体外培养6天后活细胞的总量的时间过程的图式。各慢病毒颗粒编
码CAR及CLE。用F1-1-228U及F1-3-219U转导的慢病毒颗粒在其表面上显示UCHT1scFvFc-
GPI。
[0052] 图39A、图39B及图39C为显示来自给药有用所指示慢病毒颗粒转导4小时的人类PBMC且经静脉内注射而无需离体扩增PBMC的携带肿瘤的NSG小鼠的血液的每微克基因组
DNA的慢病毒基因组的拷贝的时间过程的图式。各慢病毒颗粒编码CAR。F1-1-228、F1-1-
228U、F1-3-219及F1-3-219U也编码CLE。用F1-1-228U及F1-3-219U转导的慢病毒颗粒在其
表面上显示UCHT1scFvFc-GPI。
[0053] 图40为显示给药有用所指示慢病毒颗粒转导4小时的人类PBMC且经静脉内注射而无需离体扩增PBMC的携带肿瘤的NSG小鼠的每200μl血液的CAR+细胞的数目的图式。在将小鼠安乐死的时候取样血液。各慢病毒颗粒编码CAR。F1-1-228、F1-1-228U、F1-3-219及F1-3-
219U也编码CLE。用F1-1-228U及F1-3-219U转导的慢病毒颗粒在其表面上显示
UCHT1scFvFc-GPI。
[0054] 图41A为显示静脉内给药有用编码抗ROR2 MRB CAR及CLE的所指示慢病毒颗粒转导4小时的PBS或人类PBMC而无需离体扩增PBMC的NSG小鼠中的CHO-ROR2肿瘤的平均体积的
图式。图41B为显示静脉内给药有用编码抗CD19 CAR及CLE的所指示慢病毒颗粒转导4小时
的PBS或人类PBMC而无需离体扩增PBMC的NSG小鼠中的Raji肿瘤的平均体积的图式。用F1-
1-228U及F1-3-219U转导的慢病毒颗粒在其表面上显示UCHT1scFvFc-GPI。

具体实施方式

[0055] 定义
[0056] 如本文中所使用,术语“嵌合抗原受体”或“CAR”或“CARs”指工程化受体,其将抗原特异性移植至细胞上,例如T细胞、NK细胞、巨噬细胞及干细胞。本发明的CAR包括至少一个抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域(TM)及胞内活化域(IAD),且可包括柄(stalk)及一个或多个共刺激域(CSD)。在另一实施例中,CAR为对两种不同抗原或抗原决定基具有特异性的
双特异性CAR。在ASTR与靶标抗原特异性结合之后,IAD活化胞内信号传导。举例而言,IAD可以以非MHC限制的方式将T细胞特异性及反应性重新定位于所选择的靶标,从而利用抗体
抗原结合特性。非MHC限制的抗原识别赋予表达CAR的T细胞不依赖于抗原处理而识别抗原
的能,因此绕过肿瘤逃逸的主要机制。此外,当在T细胞中表达时,CAR有利地不与内源性T细胞受体(TCR)α链及β链二聚化。
[0057] 如本文中所使用,术语“微环境”意指与其他组织区域或身体区域具有恒定的或暂时的、物理的或化学的差异的组织或身体的任何部分或区域。举例而言,如本文中所使用的“肿瘤微环境”指肿瘤存在于其中的环境,该环境为肿瘤内的非细胞区域,且正好位于肿瘤组织外部的区域并不属于癌细胞自身的胞内隔室。肿瘤微环境可指代肿瘤环境的任何及所有条件,这些条件包括为恶化过程创建结构性和/或功能性环境以存活和/或扩增和/或扩
散的条件。举例而言,肿瘤微环境可包括条件的更改,这些条件诸如(但不限于):压力、温度、pH、离子强度、渗透压、重量渗透摩尔浓度、氧化应激、一种或多种溶质的浓度、电解质的浓度、葡萄糖的浓度、透明质酸的浓度、乳酸或乳酸盐的浓度、白蛋白的浓度、腺苷的水平、R-2-羟基戊二酸的水平、丙酸的浓度、氧气的浓度和/或氧化剂、还原剂或辅助因子的存在,以及熟练的技术人员将理解的其他条件。
[0058] 如本文中交换地使用,术语“多核苷酸”及术语“核酸”指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此,此术语包括(但不限于):单链、双链或多链的DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体,或包含嘌呤碱基及嘧啶碱基或其他天然、经化学方式或生物化学方式修饰的非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物
[0059] 如本文中所使用,术语“抗体”包括多克隆抗体及单克隆抗体,这些多克隆抗体及单克隆抗体包括完整的抗体及保留特异性结合抗原的抗体片段。抗体片段可为(但不限于):片段抗原结合(Fab)片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、Fab’-SH片段、(Fab’)2Fv片段、Fd片段、重组IgG(rIgG)片段、单链抗体片段,包括单链可变片段(scFv)、二价scFv、三价scFv及单域抗体片段(例如,sdAb、sdFv、纳米抗体)。该术语包括免疫球蛋白的基因方式工程化和/或其他修饰形式,诸如:胞内抗体、肽抗体、嵌合抗体、单链抗体、全人类抗体、人类化抗体、包括抗体及非抗体蛋白质的抗原特异性靶向区的融合蛋白质、杂结合抗体、多特异性抗体(例如,双特异性抗体、双功能抗体、三功能抗体及四功能抗体)、串联双-scFv及串联三-scFv。除非另外陈述,否则术语“抗体”应理解为包括其功能性抗体片段。该术语还包括完整或全长抗体,其包括任何类别或子类别的抗体,包括IgG及其子类别、IgM、IgE、IgA及IgD。
[0060] 如本文中所使用,术语“抗体片段”包括完整抗体的一部分,例如,完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2及Fv片段;双功能抗体;线性抗体(Zapata等人,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995));单链抗体分子;及由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段,每一者具有单个抗原结合位点)及一残余“Fe”片段(一种反映容易结晶的能力的指示)。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原的F(ab’)2片段。
[0061] 如本文中可交换使用那样,术语“单链Fv”、“scFv”或“sFv”抗体片段包括抗体的VH域及VL域,其中这些域存在于单个多肽链中。在一些实施例中,Fv多肽进一步包括在VH域与VL域之间的可使sFv能够形成针对抗原结合的所需结构的多肽接头或间隔区。对于sFv的综述,参见Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,
Rosenburg及Moore编,Springer-Verlag,纽约,第269至315页(1994)。
[0062] 如本文中所使用,“天然存在”的VH域及VL域指已从宿主分离而不进一步分子进化以改变其在特殊条件下以scFv形式产生时的亲和性的VH域及VL域,诸如美国专利8709755B2及申请WO/2016/033331A1中所公开的那些。
[0063] 如本文中所使用,术语“亲和性(affinity)”指两种试剂可逆结合的平衡常数,且被表达为解离常数(Kd)。亲和性可比抗体针对不相关基酸序列的亲和性高至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少1000倍,或更高。抗体对于靶蛋白的亲和性可为(例如)约100纳摩尔(nM)至约0.1nM、约
100nM至约1皮摩尔(pM),或约100nM至约1飞摩尔(fM)或更高。如本文中所使用,术语“亲合力(avidity)”指两种或更多种试剂的复合物在稀释后对于解离的抗性。关于抗体和/或抗
原结合片段,术语“免疫反应性”及“优先结合”在本文中互换地使用。
[0064] 如本文中所使用,术语“结合(binding)”指归因于(例如)共价相互作用、静电相互作用、疏水相互作用及离子相互作用和/或氢键相互作用(包括诸如盐桥键及水桥键的相互作用)而在两个分子之间的直接缔合。非特异性结合应当是指亲和性低于约10-7M的结合,例-6 -5 -4
如,亲和性低于10 M、10 M、10 M等的结合。
[0065] 如本文中所使用,提及“细胞表面表达系统(cell surface expression system)”或“细胞表面显示系统(cell surface display system)”是指蛋白质或其部分在细胞表面上的显示或表达。通常,生成表达与细胞表面蛋白质融合的感兴趣的蛋白质的细胞。举例而言,蛋白质表达为具有跨膜域的融合蛋白质。
[0066] 如本文中所使用,术语“组件”包括多肽(包括多肽的融合体、多肽的区(region)及其功能性突变体或片段)及多核苷酸(包括微小RNA及shRNA,以及其功能性突变体或片段)。
[0067] 如本文中所使用,术语“区(region)”为多肽或多核苷酸的任何区段。
[0068] 如本文中所使用,“域(domain)”为具有功能性和/或结构性特性的多肽或多核苷酸的区。
[0069] 如本文中所使用,术语“柄”或“柄域”指提供结构性柔性且与侧翼多肽区间隔的柔性(flexible)多肽连接区,且可由天然或合成的多肽组成。柄可衍生自免疫球蛋白(例如,IgGl)的铰链或铰链区,其一般被定义为自人类IgGl的Glu216拉伸至Pro230(Burton(1985)Molec.Immunol.,22:161-206)。可通过使第一个半胱氨酸与最后一个半胱氨酸在相同位置
形成重链间二硫键(S-S)来将其他IgG同型的铰链区与IgG1序列进行比对。柄可为天然存在
或非天然存在的,其包括(但不限于)经改变的铰链区,如美国专利第5,677,425号所公开。
柄可包括衍生自任何类别或子类别的抗体的完整铰链区。柄也可包括衍生自CD8、CD28或在提供柔性且与侧翼区间隔上提供类似功能的其他受体的区。
[0070] 如本文中所使用,术语“(经)分离”意味着材料从其原始环境(例如,当其为天然存在时,则为从天然环境)移除。举例而言,存在于活体动物中的天然存在的多核苷酸或多肽为未经分离的,但从天然系统中的共存材料的一些或全部分离的相同多核苷酸或多肽则为经分离的。此类多核苷酸可为载体的一部分,和/或此类多核苷酸或多肽可为组合物的一部分,且仍是经分离的,这是因为载体或组合物并非其天然环境的部分。
[0071] 如本文中所使用,“多肽”为由肽键连接的单链氨基酸残基。多肽既不折叠成固定结构,也不具有任何翻译后修饰。“蛋白质”为折叠成固定结构的多肽。“多肽”及“蛋白质”在本文中互换地使用。
[0072] 如本文中所使用,多肽可经“纯化”以移除多肽的天然环境的杂质组分,例如,将干扰多肽的诊断或治疗用途的材料,诸如,酶、激素及其他蛋白质或非蛋白质溶质。多肽可(1)纯化至按抗体重量计高于90%、高于95%或高于98%,如利用洛瑞法(Lowry method)测定,例如,高于99重量%,(2)借助于旋转杯序列分析仪纯化至足以获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度,或(3)利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在还
原条件或非还原条件下使用库斯蓝或染料纯化至均一性。
[0073] 如本文中所使用,术语“免疫细胞”一般包括衍生自骨髓中产生的造血干细胞(HSC)的白血细胞(白血球)。“免疫细胞”包括(例如)淋巴细胞(T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞)及衍生自骨髓的细胞(嗜中性细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核球、巨噬细胞、树突状细胞)。
[0074] 如本文中所使用,“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞,其包括辅助T细胞(CD4+细胞)、细胞毒性T细胞(CD8+细胞)、调节性T细胞(Treg)及γ-δT细胞。
[0075] 如本文中所使用,“细胞毒性细胞”包括CD8+ T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细+胞、γδT细胞(一种CD4细胞的子群)及嗜中性细胞(其为能够介导细胞毒性反应的细胞)。
[0076] 如本文中所使用,术语“干细胞”一般包括分化多能或多潜能干细胞(pluripotent或multipotent stem cell)。“干细胞”包括(例如)胚胎干细胞(ES)、间充质干细胞(MSC)、诱导型分化多能性干细胞(iPS)及定型祖细胞(造血干细胞(HSC)、骨髓衍生细胞等)。
[0077] 如本文中所使用,术语“治疗(treatment/treating)及类似者”指获得所需药理学和/或生理学效果。该效果就完全或部分地预防疾病或其症状而言可为预防性的,和/或就部分或完全治愈疾病和/或由疾病引起的不良影响而言可为治疗性的。如本文中所使用的
“治疗”涵盖哺乳动物中的(例如,人类中的)疾病的任何治疗,且包括:(a)预防在易患疾病但尚未被诊断为患有其的个体中发生疾病;(b)抑制疾病,即遏止其发展;及(c)减轻疾病,即引起疾病消退。
[0078] 如本文中互换地使用,术语“个体(individual)”、“受试者(subject)”、“宿主”及“患者”指哺乳动物,其包括(但不限于)人类、鼠类(例如,大鼠、小鼠)、兔类(例如,兔)、非人类灵长类、人类、犬、猫、类动物(例如,马、绵羊、猪、山羊)等。
[0079] 如本文中所使用,术语“治疗有效量”或“有效量”指在向哺乳动物或其他个体施用用于治疗疾病时足以影响疾病的此类治疗的试剂的量或两种试剂的组合量。“治疗有效量”将根据试剂、疾病及其严重程度以及待治疗的个体的年龄、体重等而变化。
[0080] 如本文中所使用,术语“进化(evolution/evolving)”是指使用一种或多种突变方法以产生编码不同多肽的不同多核苷酸,该多肽自身为经改进的生物分子和/或有助于产生另一经改进的生物分子。“生理学”或“正常”或“正常生理学”条件为诸如(但不限于)以下的条件:压力、温度、pH、离子强度、渗透压、重量渗透摩尔浓度、氧化应激、一种或多种溶质的浓度、电解质的浓度、葡萄糖的浓度、透明质酸的浓度、乳酸或乳酸盐的浓度、白蛋白的浓度、腺苷的水平、R-2-羟基戊二酸的水平、丙酮酸的浓度、氧气的浓度和/或氧化剂、还原剂或辅助因子的存在,以及将被视为在施用部位处或在作用部位处的组织或器官处对于个体
是在正常范围内的其他条件。
[0081] 如本文中所使用,“以基因方式修饰的细胞”包括含有外源性核酸的细胞,无论是否将这些外源性核酸整合至细胞的基因组中。
[0082] 如本文中所使用的“多肽”可包括蛋白质分子的部分或完整蛋白质分子以及任何翻译后或其他修饰。
[0083] 如本文中所使用的假型组件可包括:“结合多肽”,其包括识别且结合靶标宿主细胞的一种或多种多肽(通常为糖蛋白);及一种或多种“促融合多肽”,其介导反转录病毒与靶标宿主细胞膜融合,从而使反转录病毒基因组进入靶标宿主细胞。如本文中所使用的“结合多肽”也可被称为“T细胞和/或NK细胞结合多肽”或“靶标接合组件”,且“促融合多肽”也可被称为“促融合组件”。
[0084] “静息”淋巴细胞(诸如,静息T细胞)为细胞周期在并不表达活化标记(诸如Ki-67)的G0阶段中的淋巴细胞。静息淋巴细胞可包括从未接触特异性抗原的原生T细胞及已由与抗原的先前接触而更改的记忆T细胞。“静息”淋巴细胞也可被称为“静态”淋巴细胞。
[0085] 如本文中所使用,“淋巴消耗(lymphodepletion)”涉及(例如通过施用淋巴消耗试剂)减少个体中的淋巴细胞的数目的方法。部分身体或全身分级辐射疗法还可导致淋巴消耗。淋巴消耗试剂可为能够在将其向哺乳动物施用时减少该哺乳动物中的功能性淋巴细胞
的数目的化学化合物或组合物。此类试剂的一个实例为一种或多种化学治疗剂。此类试剂
及剂量为已知的,且可视待治疗的个体而定由治疗医师来选择。淋巴消耗试剂的实例可包
括(但不限于)氟达拉滨(fludarabine)、环磷酰胺、克拉屈滨(cladribine)、地尼白细胞介素(denileukin diftitox)或其组合。
[0086] RNA干扰(RNAi)为一种生物学过程,在其中RNA分子通过中和经靶标RNA分子来抑制基因表达或翻译。RNA靶标可为mRNA,或其可为对RNAi的功能性抑制敏感的任何其他RNA。
如本文中所使用,“抑制性RNA分子”指其存在在细胞内产生RNAi且致使抑制性RNA分子靶向的转录物的表达降低的RNA分子。如本文中所使用的抑制性RNA分子具有能够形成RNA双螺
旋的5’茎及3’茎。抑制性RNA分子可为(例如)miRNA(内源性或人工的)或shRNA、miRNA的前体(亦即Pri-miRNA或pre-miRNA)或shRNA、或作为经分离核酸直接转录或引入至细胞或个
体的dsRNA。
[0087] 如本文中所使用,“双链RNA”或“dsRNA”或“RNA双螺旋”是指由两条链组成的RNA分子。双链分子包括由杂交以形成双螺旋RNA结构的两条RNA链组成的那些,或其自身折叠以形成双螺旋结构的单链RNA。大多数但未必的是,双螺旋区中的所有碱基为碱基配对的。双螺旋区包含与靶标RNA互补的序列。与靶标RNA互补的序列为反义序列,且通常为18至29、19至29、19至21或25至28个核苷酸长,或在一些实施例中在低值端点(low end)上为18、19、
20、21、22、23、24、25个与高值端点(high end)上为21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个之间,其中给定范围通常具有低于高值端点的低值端点。此类结构通常包括5’茎、环及由与各茎相邻的环(其并非双螺旋的部分)连接的3’茎。在某些实施例中,该环包含至少3、4、5、6、
7、8、9或10个核苷酸。在其他实施例中,该环包含2至40、3至40、3至21或19至21个核苷酸;或在一些实施例中,在低值端点为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与高值端点为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35或40个之间,其中给定范围通常具有低于高值端点的低值端点。
[0088] 如本文中所使用的术语“微小RNA侧翼序列”指包括微小RNA处理组件的核苷酸序列。微小RNA处理组件为有助于由前体微小RNA产生成熟微小RNA的最小核酸序列。这些组件通常位于侧接微小RNA茎环结构的40个核苷酸序列之内。在一些情况下,在侧接微小RNA茎
环结构的长度在5与4,000个核苷酸之间的核苷酸序列的延伸内发现微小RNA处理组件。
[0089] 术语“接头”在用于提及多重抑制性RNA分子时指加入两个抑制性RNA分子的连接构件。
[0090] 如本文中所使用,除非将其明确地指出为可复制反转录病毒,否则“重组反转录病毒”指不可复制的或“复制缺陷型”反转录病毒。术语“重组反转录病毒”及“重组反转录病毒颗粒”在本文中互换地使用。此类反转录病毒/反转录病毒颗粒可为任何类型的反转录病毒颗粒,其包括(例如)γ反转录病毒及(在说明性实施例中)慢病毒。众所周知,此类反转录病毒颗粒(例如慢病毒颗粒)通常在包装细胞中通过用质粒(其包括诸如Gag、Pol及Rev的包装组分)及包膜或假型质粒(其编码假型组件)及转移的、基因组的或反转录病毒(例如慢病
毒)表达载体(该表达载体通常为在其上编码基因或其他相关编码序列的质粒)转染这些包
装细胞来形成。因此,反转录病毒(例如慢病毒)表达载体包括在转染至细胞中后促进表达
及包装的序列(例如,侧接例如psi包装组件及靶标异源编码序列的5’LTR及3’LTR)。术语“慢病毒”及“慢病毒颗粒”在本文中互换地使用。
[0091] miRNA的“框架”由围绕miRNA的“5’微小RNA侧翼序列”和/或“3’微小RNA侧翼序列”及(在一些情况下)将miRNA中的茎环结构的茎隔开的环序列构成。在一些实施例中,“框架”衍自天然存在的miRNA,诸如,miR-155。术语“5’微小RNA侧翼序列”及“5’臂”在本文中互换地使用。术语“3’微小RNA侧翼序列”及“3’臂”在本文中互换地使用。
[0092] 如本文中所使用,术语“miRNA前体”指可以酶促方式加工成miRNA的任何长度的RNA分子,诸如初级RNA转录物、pri-miRNA或pre-miRNA。
[0093] 应理解,本发明及本文提供的方面及实施例并不限于所公开的特定实例,因此当然可能有变化。还应理解,本文中所使用的技术仅出于公开特定实例及实施例的目的,且并不旨在为限制性的,其为由于本发明的范畴将仅有随附申请专利范围所限定。
[0094] 当提供值的范围时,应理解,在该范围的上限与下限之间的各中间值(除非上下文另外明确指示,否则为下限单位的十分之一)与该陈述范围中的任何其他值或中间值均涵
盖在本发明内。这些较小范围的上限及下限可独立地包括在较小范围中,且也涵盖在本发
明内,该陈述范围中的任何特异性排除的极限除外。当所陈述范围包括极限的一个或两个
时,排除那些所包括的极限的一个或两个的范围也包括在本发明中。当针对范围给定重叠
的多个低值及多个高值时,熟练的技术人员应认识到,所选择范围将包括低于高值的低值。
说明书中的所有标题均为易于阅读起见,且并非是限制性的。
[0095] 除非另外定义,否则本文所使用的所有技术及科学术语均具有与本发明所属领域的一般技术人员所通常理解相同的含义。尽管类似于或等效于本文描述的那些的任何方法
也可用于本发明的实践或测试,但现在描述较佳的方法及材料。本文所提及的所有公开案
均以引用的方式并入本文中以公开及描述与所引用的公开案相关的方法和/或材料。
[0096] 必须注意的是,除非上下文另外明确指示,否则如本文所使用及在随附申请专利范围中,单数形式包括复数个指示物。因此,例如,提及“嵌合抗原受体”包括复数个此类嵌合抗原受体及熟练此项技术人员已知的其等效物等。应进一步注意,申请专利范围可能被
设计成排除任何视情况可选用的要素。因此,此陈述意欲充当使用与申请专利范围要素的
引用相关的诸如“单独”、“仅”及类似者的排他性术语或使用“阴性”限制的前提基础
[0097] 应理解,为清楚起见在独立实施例的上下文中描述的本发明的某些特征也可以组合方式在单个实施例中提供。相反地,为简洁起见在单个实施例的上下文中描述的本发明
的各种特征也可单独提供或以任何适合的子组合方式提供。属于本发明的实施例的所有组
合均特异性地包涵在本发明中,且正如各组合及每一组合单独及清楚地公开一样公开于本
文中。另外,各种实施例及其要素的所有子组合也均特异性地包涵在本发明中,且正如各子组合及每一此类子组合单独及清楚地公开一样公开于本文中。
[0098] 实施方式
[0099] 本发明通过提供用于以基因方式修饰淋巴细胞(例如NK细胞,且在说明性实施例中为T细胞)的经改进方法及组合物来克服现有技术挑战。举例而言,这些方法中的一些不
包括预活化淋巴细胞,且这些方法中的一些在比先前方法更少的时间内进行。此外,提供具有许多用途(包括其在这些经改进方法中的用途)的组合物。这些组合物中的一些为以基因
方式修饰的淋巴细胞,其具有经改进的增生及存活质量,包括在活体外培养时,例如在缺失生长因子的情况下。这些以基因方式修饰的淋巴细胞将具有例如以下的用途:作为研究工
具,以更好的理解影响T细胞增生及存活的因素;及商业生产,例如可经采集及测试或用于商业产品的某些因子(诸如生长因子及免疫调节剂)的生产。
[0100] 本文提供的一些实施例为用于执行过继性细胞疗法的方法,其包括离体需要少许时间(例如,24小时、12小时或8小时或更少)转导T细胞和/或NK细胞,且在一些实施例中不需要进行预先离体刺激。这些方法很好地适合于离体处理来自个体的血液的封闭系统,且
可对于存在于与一些实施例相同的房间中的个体和/或在一些实施例中的个体在其血液或
其经分离血细胞的其视线之内在进行该方法期间的所有时间内进行。更具体言的,本文中
公开内容的方面及实施例通过提供用于转导静息T细胞和/或静息NK细胞的方法克服了与
目前过继性细胞疗法相关的问题,这些方法通常利用有助于复制缺陷型重组反转录病毒颗
粒与静息T细胞和/或静息NK细胞结合及融合的假型组件,以利用复制缺陷型重组反转录病
毒颗粒有助于静息T细胞和/或静息NK细胞的基因修饰。此外,本文提供的方法通过在说明
性实施例中利用嵌合抗原受体及一个或多个淋巴增生性组件克服了本领域的问题,这些淋
巴增生性组件的表达是在控制组件的控制下,使得个体暴露于结合控制组件的化合物,或
终止此类暴露促进体内经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞的扩增。
[0101] 由于本文中详细公开的这些及其他改进,在一个方面中,本文中提供一种用于以基因方式修饰个体(诸如患有疾病或病症的患者)的静息T细胞和/或静息NK细胞的方法,其
中收集来自个体的血液;静息T细胞和/或NK细胞通过使其与复制缺陷型重组反转录病毒颗
粒接触来以基因方式修饰;且通常在比现有技术方法中更短时间段(例如在24小时内及在
一些非限制性实施例中为在12小时内)内且/或不进一步离体扩增经基因方式修饰的T细胞
和/或NK细胞的群而将经基因方式修饰的细胞再引入至个体中,例如使得经基因方式修饰
的静息T细胞和/或NK细胞并不经历多于4次离体细胞分裂。因此,本文提供的方法可在比目前CAR疗法短很多的时间内进行,从而提供个体可在离体步骤的整个时间内留在诊所中的
方法。此有助于在封闭系统中进行离体步骤,此降低了污染及混合患者样本的机会且可更
容易地由临床实验室进行。
[0102] 因此,图1及图2提供用于本文提供的方法中的说明性组合物的示意性框图。图1提供包装细胞(100)及由此类包装细胞产生的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(200)的框图。
包装细胞(100)包括并入至其基因组(其包括表达反转录病毒蛋白质的重组转录组件)中的
重组多核苷酸(110)及在可诱导启动子(其由结合配位体且有配位体活化的反式激活因子
调节)的控制下的各种不同膜结合多肽。这些反式激活因子、可诱导启动子及配位体用于诱导依序表达及细胞膜结合多肽的积聚,这些细胞膜结合多肽将被并入至复制缺陷型重组反
转录病毒颗粒的膜以及为包装及组装复制缺陷型重组反转录病毒颗粒所必需的反转录病
毒组分中。
[0103] 由于如下文中详细论述的各种多核苷酸的依序诱导表达,产生图1中说明的说明性包装细胞(100),且可将该包装细胞用于说明性方法以产生用于转染本文提供的静息T细
胞和/或NK细胞(图2中的(300))的方法中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。在非限制性
实施例中,包装细胞(100)在其基因组中包括编码可包装反转录病毒RNA基因组的核酸,该
可包装反转录病毒RNA基因组包括为包装及组装复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(作为非
限制性说明性实施例,反转录病毒psi组件、反转录病毒gag多肽及反转录病毒pol多肽)所
必需的反转录病毒基因组的组件中的至少一些。
[0104] 与包装细胞的细胞膜结合或缔合的一些膜结合多肽将并入或缔合至复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中,但并不由反转录病毒基因组编码。举例而言,包装细胞及尤其形成的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可包括:反转录病毒Vpx多肽(250),在非限制性实施例
中其可表达为膜缔合的融合蛋白质,例如Src-Flag-Vpx多肽;可包括结合多肽及促融合多
肽的假型组件(240),在非限制性实施例中,其包括麻疹病毒凝血素(H)多肽及麻疹病毒融
合(F)多肽、或其细胞质域缺失变体;视情况可选用的一个或多个活化组件(210,220),在非限制性实施例中,其包括能够与CD3结合的膜结合多肽及能够与CD28结合的膜结合多肽;
和/或视情况选用的膜结合细胞因子(230),其的非限制性实施例为包括融合于DAF或其片
段的IL-7的融合多肽。本文中提供这些膜结合多肽的各种其他特异性类型。
[0105] 作为通过包装细胞依序表达转录组件的结果,产生复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。变为复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的基因组的包装细胞的基因组内且通常被整合至
其中的RNA反转录病毒基因组包括为反转录病毒产生、感染及整合至宿主细胞(其通常为静
息T细胞和/或NK细胞)的基因组中所必需的反转录病毒组分(作为非限制性说明性实施例,
反转录病毒Gag及Pol多核苷酸)。此外,反转录病毒基因组进一步包括编码本文提供的一个或通常两个工程化信号传导多肽的多核苷酸。工程化信号传导多肽中的一者通常编码至少
一个淋巴增生性组件(在非限制性实施例中,组成性白细胞介素7受体突变)且其他工程化
信号传导多肽通常编码嵌合抗原受体。
[0106] 接着,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(200)用于以本文提供的方法来转导静息T细胞和/或静息NK细胞(300)。如图2所显示,在使静息T细胞和/或NK细胞(300)与复制缺陷
型重组反转录病毒颗粒(200)接触之后,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上的上文
所论述的膜多肽与静息T细胞和/或NK细胞(300)的表面上的受体和/或配位体结合。举例而
言,如上文所指示可包括与静息T细胞和/或静息NK细胞的表面上的分子结合的结合多肽及
促融合多肽的假型组件有助于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(200)与T细胞和/或NK细胞
膜的结合及融合。活化组件(210,220)通过接合T细胞受体复合物(一种在接触的时程中发
生的过程或其后的培育物)来使静息T细胞和/或NK细胞(300)活化。此外,膜结合细胞因子
(230)可存在于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上,且结合静息T细胞和/或NK细胞
(300)的表面上的细胞因子受体(310),从而进一步促进结合及活化。因此,不受理论限制,在本文提供的说明性实施例中,由于这些复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(200)组分中的
一者或多者,不需要利用尚未在复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(200)中或上的组件的离
体刺激或活化。此转而帮助缩减完成本文提供的这些说明性方法中的方法所需的离体时
间。
[0107] 在与T细胞和/或NK细胞(200)结合后,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接着与T细胞和/或NK细胞(300)融合,且复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多肽及核酸进入T细胞
和/或NK细胞(300)。如上文所指示,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的这些多肽中的一
者为Vpx多肽(250)。Vpx多肽(250)与降解细胞质中的游离dNTP的SAMHD1限制因子(350)结
合且诱导其降解。因此,细胞质中的游离dNTP的浓度随着Vpx降解SAMHD1而增加,且增加反转录活性,从而有助于反转录病毒基因组的反转录及整合至T细胞和/或NK细胞基因组中。
[0108] 在将反转录病毒基因组整合至T细胞和/或NK细胞(200)中之后,T细胞和/或NK细胞基因组包括编码信号传导多肽(其编码淋巴增生性组件(370))的核酸及视情况选用的编
码CAR(360)的信号传导多肽。淋巴增生性组件及视情况选用的CAR的表达是在控制组件的
控制下。暴露于结合控制组件的化合物中(此可通过将该化合物施用转导其T细胞和/或NK
细胞(300)的个体中来在体外或体内发生)通过表达淋巴增生性组件及视情况由于CAR的表
达以及CAR与其靶细胞的结合来促进体外或体内中的T细胞和/或NK细胞(300)的增生。因
此,本文中用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导的T细胞和/或NK细胞具有驱动增生和/
或抑制细胞死亡(在说明性实施例中,此转而避免在将经转导T细胞和/或NK细胞返回个体
中之前需要先前方法以使宿主淋巴消耗)的一个或多个信号。在说明性实施例中,此转而进一步降低在将经转导T细胞和/或NK细胞再引入至个体中之前处理所需天数。因此,在说明
性实施例中,自个体采集血液至将血液再引入至个体所需时间不多于36小时、24小时、12小时,或在一些情况下甚至不多于8小时,此从根本上改变来自先前技术方法的CAR-T方法。此外,控制组件还提供本文提供的安全性机制中的一者。举例而言,停止施用化合物可下调或甚至终止淋巴增生性组件及视情况选用的CAR的表达,从而结束对于经转导T细胞和/或NK
细胞及其子代的增生和/或存活信号。
[0109] 用于转导和/或以基因方式修饰淋巴细胞的方法
[0110] 在某些方面中,本文提供一种转导和/或以基因方式修饰淋巴细胞,通常是T细胞和/或NK细胞,且通常是静息T细胞和/或静息NK细胞的方法,其包括使淋巴细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触,其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒通常包含在其表面上的
假型组件,其中该接触(及在接触条件下的培育)有助于通过复制缺陷型重组反转录病毒颗
粒转导静息T细胞和/或NK细胞,由此产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞。这些假型
组件通常能够结合静息T细胞和/或NK细胞且通常有助于其自身的膜融合或与复制缺陷型
重组反转录病毒颗粒的其他蛋白质结合。
[0111] 在一些实施例中,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可进一步包括活化组件,其可为本文提供的任何活化组件。在说明性实施例中,活化组件可为抗CD3,诸如抗CD3 scFv或抗CD3 scFvFc。在一些实施例中,该接触可进行1小时至24小时,例如1小时至12小时或1小时至6小时。在一些实施例中,该接触可进行少于24小时,例如少于12小时、少于8小时或少于4小时。包装细胞(且在说明性实施例中,包装细胞系,且在特定说明性实施例中,本文中的某些方面中提供的包装细胞)用于产生复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。在这些方法的
例示性实施例中,以基因方式修饰的T细胞或NK细胞能够在不存在由CAR识别的靶抗原的情
况下及不存在细胞因子(诸如IL-2、IL-15或IL-7)的情况下离体培养至少7天、14天、21天、
28天、35天、42天或60天中存活。在这些方法的例示性实施例中,经基因方式修饰的T细胞或NK细胞能够在小鼠中活体内移植和/或在小鼠中活体内富集至少7天、14天或28天。熟练的
技术人员将认识到,这些小鼠可经处理或以其他方式经基因方式修饰,使得经基因方式修
饰的T细胞或NK细胞之间的任何免疫学差异不会产生在小鼠中引发的针对由复制缺陷型重
组反转录病毒颗粒转导的淋巴细胞的任何组分的免疫反应。在一些实施例中,包装细胞系
可为悬浮细胞系。在说明性实施例中,包装细胞系可在无血清培养基中生长。在一些实施例中,淋巴细胞可来自个体。在说明性实施例中,淋巴细胞可来自个体的血液。
[0112] 用于转导和/或以基因方式修饰淋巴细胞(例如NK细胞,或在说明性实施例中,T细胞)的以上方面中的任一者的另外的实施例可包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒、淋巴
增生性组件、CAR、假型组件、核糖开关、活化组件、膜结合细胞因子、miRNA和/或本文公开的其他组件的实施例中的任一者,且可与本文中的方法组合以用于使用包装细胞产生反转录
病毒颗粒。在某些说明性实施例中,反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒。用于转导T细胞和/或NK细胞的此方法可在活体外或离体进行。熟练的技术人员将认识到,用于转导和/或以基因方式修饰T细胞和/或NK细胞的本文提供的细节可适用于包括此步骤的任何方面,包括针对用
于转导和/或以基因方式修饰淋巴细胞(诸如T细胞和/或NK细胞)的方法的方面。
[0113] 因此,在一个方面中,本文中提供一种用于转导(和/或以基因方式修饰)淋巴细胞(一般来自经分离血液的静息T细胞和/或静息NK细胞)的方法,该方法包含:
[0114] A.自个体收集血液;
[0115] B.分离包含静息T细胞和/或静息NK细胞的周边血单核细胞(PBMC);及
[0116] C.使受试者的静息T细胞和/或静息NK细胞与非复制型重组反转录病毒颗粒离体接触,其中非复制型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上的能够结合静息T细胞和/或静息
NK细胞且有助于非复制型重组反转录病毒颗粒与其的膜融合的假型组件,其中该接触有助
于利用非复制型重组反转录病毒颗粒转导至少5%的静息T细胞和/或静息NK细胞,从而产
生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞,从而转导静息T细胞和/或NK细胞。
[0117] 在包括转导T细胞和/或NK细胞的步骤的本文中的任何方法的一些实施例中,可使细胞在无需预先活化的情况下与反转录病毒颗粒接触。在包括转导T细胞和/或NK细胞的步
骤的本文中的任何方法的一些实施例中,在转导之前,在黏着于单核球的基质上培育T细胞和/或NK细胞在一个实施例中多于4小时,或在另一实施例中多于6小时,或在又一实施例中多于8小时。在一个说明性实施例中,在转导之前,在黏着物基质上培育T细胞和/或NK细胞隔夜以移除单核球。在另一实施例中,该方法可包括,在转导之前在结合单核球的黏着物基质上培育T细胞和/或NK细胞不多于30分钟、1小时或2小时。在另一实施例中,在该转导步骤之前,T细胞和/或NK细胞不暴露于通过在黏着物基质上培育来移除单核球的步骤。在另一
实施例中,在转导之前或在转导期间,T细胞和/或NK细胞并不与牛血清(诸如细胞培养牛血清,例如胎牛血清)一起培育或不暴露于其中。
[0118] 因此,在另一方面中,本文中提供一种用于以基因方式修饰或转导个体的淋巴细胞(在说明性实施例中,T细胞和/或NK细胞,或T细胞和/或NK细胞群)的方法,该方法包括使一般个体的T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒离体接触,该复制缺陷型
重组反转录病毒颗粒在其基因组中包含多核苷酸,该多核苷酸包含可操作地连接至在T细
胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列,其中该一种或多种核酸序列
中的第一核酸序列编码针对一种或多种RNA靶目标两个或更多个抑制性RNA分子,且该一种
或多种核酸序列中的第二核酸序列编码包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化
域的嵌合抗原受体(CAR),其中该接触有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静
息T细胞和/或NK细胞或静息T细胞和/或NK细胞中的至少一些,从而产生经基因方式修饰的
T细胞和/或NK细胞。
[0119] 在另一方面中,本文中提供一种用于以基因方式修饰或转导个体的淋巴细胞(例如,T细胞和/或NK细胞)或其群的方法,该方法包括使个体的淋巴细胞(例如,T细胞和/或NK细胞)或其群与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒离体接触,该复制缺陷型重组反转录病毒
颗粒在其基因组中包含多核苷酸,该多核苷酸包含可操作地连接至在淋巴细胞(例如,T细
胞和/或NK细胞)中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列,其中该一种或多种核酸序列
中的第一核酸序列编码针对一种或多种RNA靶目标一种或多种(例如两个或更多个)抑制性
RNA分子,且该一种或多种核酸序列中的第二核酸序列编码包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域的嵌合抗原受体(CAR),其中该接触有助于利用复制缺陷型重组反转
录病毒颗粒基因修饰和/或转导淋巴细胞(例如,T细胞和/或NK细胞)或淋巴细胞(例如,T细胞和/或NK细胞)中的至少一些,从而产生经基因方式修饰和/或经转导的淋巴细胞(例如,T细胞和/或NK细胞)。
[0120] 在紧接着上文提供的方法的一些实施例中,将经基因方式修饰和/或经转导的淋巴细胞(例如,T细胞和/或NK细胞)或其群引入至个体中。在一些实施例中,经基因方式修饰和/或经转导的淋巴细胞(例如,T细胞和/或NK细胞)或其群在引入或再引入至个体中之前,离体进行4次或更少的细胞分裂。在一些实施例中,淋巴细胞为与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触1小时与12小时之间的静息T细胞和/或静息NK细胞。在一些实施例中,自个体收集血液的时间与将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞再引入至个体中的时间之间不多
于8小时。在一些实施例中,在收集血液之后及再引入血液之前的所有步骤均在封闭系统中进行,在整个处理期间人监测该封闭系统。
[0121] 在紧接着上文所提供的包括多核苷酸的方法方面的任一者中,该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列,其中该一
种或多种核酸序列中的第一核酸序列编码针对一种或多种RNA靶目标一种或多种(例如两
个或更多个)抑制性RNA分子,且该一种或多种核酸序列中的第二核酸序列编码包含抗原特
异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域的嵌合抗原受体(CAR),该多核苷酸可进一步包括编码不为抑制性RNA分子的至少一个淋巴增生性组件的第三核酸序列。在一些实施例中,淋巴增生性组件可为细胞因子或细胞因子受体多肽,或其包含信号传导域的片段。在一些实
施例中,淋巴增生性组件为组成性活性。在某些实施例中,淋巴增生性组件可为IL-7受体或其片段。在说明性实施例中,淋巴增生性组件可为组成性活性IL-7受体或其组成性活性片
段。
[0122] 在紧接着上文提供的包括多核苷酸的方法方面中的任一者中,该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列,其中该一
种或多种核酸序列中的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如,两
个或更多个)抑制性RNA分子,抑制性RNA分子在一些实施例中可包括与彼此部分或完全互
补的5’链及3’链,其中该5’链及该3’链能够形成18至25个核苷酸RNA双螺旋。在一些实施例中,5’链长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸,且3’链长度可为18、19、20、21、22、
23、24或25个核苷酸。在一些实施例中,5’链及3’链长度可相同或不同。在一些实施例中,RNA双螺旋可包括一个或多个错配。在替代实施例中,RNA双螺旋不具有错配。
[0123] 在紧接着上文提供的包括多核苷酸的方法方面中的任一者中,该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列,其中该一
种或多种核酸序列中的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如,两
个或更多个)抑制性RNA分子,抑制性RNA分子可为miRNA或shRNA。在一些实施例中,抑制性分子可为miRNA的前体,诸如Pri-miRNA或Pre-miRNA,或shRNA的前体。在一些实施例中,抑制性分子可为人工衍生的miRNA或shRNA。在其他实施例中,抑制性RNA分子可为经处理成
siRNA的dsRNA(经转录或人工引入)或siRNA本身。在一些实施例中,抑制性RNA分子可为
miRNA或shRNA,其具有在自然界中未发现的序列,或具有在自然界中未发现的至少一个功
能片段,或具有在自然界中未发现的功能区段的组合。在说明性实施例中,抑制性RNA分子中的至少一者或全部为miR-155。
[0124] 在紧接着上文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方法方面中的任一者中,其中该一种或多种
核酸序列中的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如,两个或多
个)抑制性RNA分子,在一些实施例中,抑制性RNA分子可自5’至3’定向包含:5’臂、5’茎、环、与该5’茎部分或完全互补的3’茎,及3’臂。在一些实施例中,该两个或更多个抑制性RNA分子中的至少一者具有此排列。在其他实施例中,所有该两个或更多个抑制性RNA分子皆具有此排列。在一些实施例中,5’茎长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施例中,3’茎长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施例中,环长度可为3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、
31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。在一些实施例中,5’臂、3’臂或两者均衍生自天然存在的miRNA。在一些实施例中,5’臂、3’臂或两者均衍生自天然存在的miRNA,该miRNA选自由以下组成的群:miR-155、miR-30、miR-17-92、miR-122及miR-21。在说明性实施例中,
5’臂、3’臂或两者均衍生自miR-155。在一些实施例中,5’臂、3’臂或两者均衍生自小家鼠miR-155或智人miR-155。在一些实施例中,5’-臂具有SEQ ID NO:256中所阐述的序列或为其功能性变体,诸如与SEQ ID NO:256长度相同,或为SEQ ID NO:256的长度的95%、90%、
85%、80%、75%,或50%,或为100个核苷酸或更少、95个核苷酸或更少、90个核苷酸或更少、85个核苷酸或更少、80个核苷酸或更少、75个核苷酸或更少、70个核苷酸或更少、45个核苷酸或更少、40个核苷酸或更少、35个核苷酸或更少、30个核苷酸或更少、或25个核苷酸或更少的序列;且与SEQ ID NO:256至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%一致。在一些实施例中,3’臂具有阐述于SEQ ID NO:260中的序列或其功能性变体,诸如与SEQ ID NO:260长度相同,或为SEQ ID NO:260的长度的95%、90%、85%、80%、
75%,或50%,或为100个核苷酸或更少、95个核苷酸或更少、90个核苷酸或更少、85个核苷酸或更少、80个核苷酸或更少、75个核苷酸或更少、70个核苷酸或更少、65个核苷酸或更少、
60个核苷酸或更少、55个核苷酸或更少、50个核苷酸或更少、45个核苷酸或更少、40个核苷酸或更少、35个核苷酸或更少、30个核苷酸或更少,或25个核苷酸或更少的序列;且与SEQ ID NO:260至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%一致。在一些实施例中,3’臂包含小家鼠BIC的核苷酸221至283。
[0125] 在紧接着上文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方法方面中的任一者中,其中该一种或多种
核酸序列中的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的两个或更多个抑制性RNA分子,
在一些实施例中,该两个或更多个抑制性RNA分子可连续地位于第一核酸序列中。在一些实施例中,抑制性RNA分子可利用非功能性接头序列直接或间接地与彼此连接。在一些实施例中,接头序列长度可在5个与120个核苷酸之间,或长度在10个与40个核苷酸之间。
[0126] 在紧接着上文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方法方面中的任一者中,其中该一种或多种
核酸序列中的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的两个或更多个抑制性RNA分子,
在一些实施例中,该第一核酸序列编码两个至四个抑制性RNA分子。在说明性实施例中,第一核酸序列中包括2个与10个之间、2个与8个之间、2个与6个之间、2个与5个之间、2个与4个之间、3个与5个之间或3个与6个之间的抑制性RNA分子。在一说明性实施例中,第一核酸序列中包括四个抑制性RNA分子。
[0127] 在紧接着上文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方法方面中的任一者中,其中该一种或多种
核酸序列中的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如两个或更多
个)抑制性RNA分子,该一个或多个(例如两个或更多个)抑制性RNA分子可处于内含子中。在一些实施例中,内含子在启动子中。在说明性实施例中,内含子为EF-1α内含子A。在一些实施例中,内含子与启动子相邻且在启动子下游,在说明性实施例中,该内含子在用于产生复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的包装细胞中为无活性的。
[0128] 在紧接着上文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方法方面中的任一者中,其中该一种或多种
核酸序列中的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的两个或更多个抑制性RNA分子,
在一些实施例中,该两个或更多个抑制性RNA分子可针对不同靶标。在一替代实施例中,两个或更多个抑制性RNA分子针对同一靶标。在一些实施例中,RNA靶标为自由T细胞表达的基因转录的mRNA,这些mRNA诸如(但不限于):PD-1(防止失活);CTLA4(防止失活);TCRa(安全地防止自体免疫);TCRb(安全-防止自体免疫);CD3Z(安全-防止自体免疫);SOCS1(防止失活);SMAD2(防止失活);miR-155靶标(促进活化);IFNγ(减少CRS);cCBL(延长信号传导);
TRAIL2(防止死亡);PP2A(延长信号传导);ABCG1(通过限制胆固醇的清除来增加胆固醇微
含量)。在一些实施例中,RNA靶标为自编码T细胞受体(TCR)复合物的组分的基因转录的
mRNA。在一些实施例中,两个或更多个抑制性RNA分子中的至少一者可减少T细胞受体(在说明性实施例中,T细胞的一个或多个内源性T细胞受体)的表达。在某些实施例中,RNA靶标可为自T细胞的内源性TCRα或TCRβ基因转录的mRNA,该T细胞的基因组包含编码一个或多个
miRNA的第一核酸序列。在说明性实施例中,RNA靶标为自TCRα基因转录的mRNA。
[0129] 在紧接着上文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方法方面中的任一者中,其中该一种或多种
核酸序列中的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如两个或更多
个)抑制性RNA分子,且该一种或多种核酸序列中的第二核酸序列编码包含抗原特异性靶向
区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域的嵌合抗原受体(CAR),在一些实施例中,CAR为受微环境限制的生物(MRB)-CAR。在其他实施例中,CAR的ASTR与肿瘤相关的抗原结合。在其他实施例
中,CAR的ASTR为微环境受限的生物(MRB)-ASTR。
[0130] 在紧接着上文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方法方面中的任一者中,其中该一种或多种
核酸序列中的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如两个或更多
个)抑制性RNA分子,且该一种或多种核酸序列中的第二核酸序列编码包含抗原特异性靶向
区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域的嵌合抗原受体(CAR),且在一些情况下,该一种或多种核酸序列中的第三核酸序列编码不为抑制性RNA分子的至少一个淋巴增生性组件,在一些实
施例中,该第一核酸序列、该第二核酸序列及该第三核酸序列中的任一者或所有可操作地
连接至核糖开关。在一些实施例中,核糖开关能够结合核苷类似物。在一些实施例中,核苷类似物为抗病毒药物。
[0131] 在一些实施例中,提供方法以用于通过使细胞与本文中公开的反转录病毒颗粒及呈25ng/ml至200ng/ml、50ng/ml至150ng/ml、75ng/ml至125ng/ml或100ng/ml的可溶性抗
CD3抗体接触来活化和/或以基因方式修饰且通常转导静息T细胞或NK细胞(在说明性实施
例中,静息T细胞)。在说明性实施例中,这些方法在无需预先活化的情况下进行,且可进行例如8小时或更少,4小时或更少,或2小时与8小时之间、2小时与4小时之间,或2小时与3小时之间。
[0132] 在某些方面中,本文提供用于对于个体进行过继性细胞疗法的方法,作为一说明性实施例,该方法可包括以下:
[0133] A.自个体收集血液;
[0134] B.分离包含静息T细胞和/或静息NK细胞的周边血单核细胞(PBMC);
[0135] C.使个体的静息T细胞和/或静息NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒离体接触,其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上的能够结合静息T细胞和/或NK
细胞且有助于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒与其的膜融合的假型组件,其中该接触有助
于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞,从而产生经基因方式
修饰的T细胞和/或NK细胞;及
[0136] D.在自个体采集血液的36小时、24小时、12小时或甚至8小时内,将经基因方式修饰的细胞再引入至个体中,从而在个体中进行过继性细胞疗法。
[0137] 本文提供的一些方面中,具有类似步骤的方法被称为用于以基因方式修饰及扩增个体的淋巴细胞的方法。熟练的业内人士应理解,本文中的论述在其应用于进行过继性细
胞疗法的方法及组合物时还应用于以基因方式修饰且扩增个体的淋巴细胞的方法。
[0138] 通常,本发明的过继性细胞疗法利用自体性转移来进行,其中细胞经分离和/或以另外方式自接受细胞疗法的个体或自衍自此类个体的样本来制备。因此,在一些方面中,细胞为衍自需要治疗的个体(例如,患者)及在给与相同个体分离及处理之后的细胞。在本文
公开的方法及组合物的一些实施例中,患有疾病或病症的个体进入使用已知方法(诸如静
脉穿刺)抽取个体的血液的医疗机构中。在某些实施例中,自个体抽取的血液的体积在范围的低值端点为10ml、15ml、20ml、25ml、30ml、35ml、40ml、50ml、75ml或100ml与范围的高值端点为200ml、250ml、300ml、350ml、400ml、500ml、750ml、1000ml、2000ml或2500ml之间。在一些实施例中,自个体抽取10ml与400ml之间的血液。在一些实施例中,自个体抽取20ml与
250ml之间的血液。在一些实施例中,血液在处理时为新鲜的。在本文所公开的实施例中的任一者中,新鲜血液可为自之前少于15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟或180分钟的个体抽取的血液。在一些实施例中,以本文提供的方法处理血液而无需储存。
[0139] T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒之间的接触通常有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导T细胞和/或NK细胞。贯穿本发明中经转导T细胞和/
或NK细胞包括离体经转导细胞的保持在离体转导期间被并入至细胞中的核酸或多核苷酸
中的至少一些的子代。在引用“再引入”经转导细胞的本文中的方法中,应理解,此类细胞在其自个体的血液收集时通常并不处于经转导状态。本文公开的方面中的任一者中的受试者
可为(例如)动物、哺乳动物及在说明性实施例中的人类。
[0140] 不受理论限制,在非限制性说明性方法中,将编码淋巴增生性组件的多核苷酸(诸如IL7组成性活性突变体)(其可整合至T细胞和/或NK细胞的基因组中)离体递送至静息T细
胞和/或NK细胞提供了具有用于体内扩增的驱动子的细胞而无需使宿主淋巴消耗。因此,在说明性实施例中,个体在进行接触的1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天或28天内或1个月、2个月、3个月或6个月内,接触期间和/或在将经修饰的T细胞和/或NK细胞再引回至个体后的1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天或28天内或1个月、2个月、3个月或6个月内并不暴露于淋巴消耗试剂中。此外,在非限制性实施例中,可进行本文提供的方法而不在其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒与个体的静息T细胞和/或NK细胞
接触的步骤期间或在整个离体方法期间使个体暴露于淋巴消耗试剂中。
[0141] 因此,活体内扩增个体中的经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞为本发明的一些实施例的特征。在说明性实施例中,这些方法为离体无传播的或基本上无传播的。
[0142] 在本文的非限制性说明性实施例中,自个体抽取血液至离体转导T细胞和/或NK细胞后将血液再引入回至个体的此整个方法/过程可在以下时间段内发生:少于48小时、少于
36小时、少于24小时、少于12小时、少于11小时、少于10小时、少于9小时、少于8小时、少于7小时、少于6小时、少于5小时、少于4小时、少于3小时、2小时或少于2小时。在其他实施例中,自个体抽取/收集血液至离体转导(在本文的非限制性说明性实施例中)T细胞和/或NK细胞
后将血液再引入回至个体的此整个方法/过程在以下时间段内发生:1小时与12小时之间、
或2小时与8小时之间、或1小时与3小时之间、或2小时与4小时之间、或2小时与6小时之间、或4小时与12小时之间、或4小时与24小时之间、或8小时与24小时之间、或8小时与36小时之间、或8小时与48小时之间、或12小时与24小时之间、或12小时与36小时之间、或12小时与48小时之间;或在以下时间段内发生:在范围的低值端点为15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、
120分钟、180分钟及240分钟与范围的高值端点为120分钟、180分钟、及240分钟、300分钟、
360分钟、420分钟及480分钟之间。在其他实施例中,自个体抽取/收集血液至离体转导T细胞和/或NK细胞后将血液再引入回至个体的此整个方法/过程在以下时间段内发生:在范围
的低值端点为1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、10小时及12小时与范围的高值端点为8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18小时、24小时、36小时或48小时之间。在一些实施例中,经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞是在发生接触的时间段后自复制缺陷型重
组反转录病毒颗粒分离。
[0143] 在本文中的任何方法(其包括血液收集的步骤及转导淋巴细胞(在说明性实施例中,T细胞和/或NK细胞,包括静息T细胞及NK细胞)的步骤)的一些实施例中,自血液收集至转导T细胞和/或NK细胞的方法并不包括通过在黏着物基质上培育在一个实施例中多于4小
时、或在另一实施例中多于6小时或在又一实施例中多于8小时来移除单核球的步骤。在一
个说明性实施例中,自血液收集至转导T细胞和/或NK细胞的方法并不包括在黏着物基质上
隔夜培育以移除单核球。在另一实施例中,自血液收集至转导T细胞和/或NK细胞的方法包
括通过在黏着物基质上培育不多于30分钟、1小时或2小时来移除单核球的步骤。在另一实
施例中,自个体进行血液收集至转导淋巴细胞(在说明性实施例中,T细胞和/或NK细胞,包括静息T细胞和/或NK细胞)的方法不包括通过在黏着物基质上培育移除单核球的步骤。在
另一实施例中,自个体进行血液收集至转导淋巴细胞(在说明性实施例中,T细胞和/或NK细胞,包括静息T细胞和/或NK细胞)的方法包括,该方法期间T细胞和/或NK细胞不与牛血清
(诸如细胞培养牛血清,例如胎牛血清)一起培育或不暴露于其中。
[0144] 在本文中的任何方法(其包括血液收集的步骤及转导淋巴细胞(在说明性实施例中,T细胞和/或NK细胞,包括静息T细胞及NK细胞)的步骤)的一些实施例中,自个体进行血液收集至再引入T细胞和/或NK细胞至个体中的方法并不包括通过在黏着物基质上培育在
一个实施例中超过4小时、或在另一实施例中多于6小时或在又一实施例中多于8小时来移
除单核球的步骤。在一个说明性实施例中,自个体进行血液收集至再引入T细胞和/或NK细
胞至个体中的方法并不包括在黏着物基质上培育隔夜以移除单核球。在另一实施例中,自
个体进行血液收集至再引入T细胞和/或NK细胞的方法包括通过在黏着物基质上培育不多
于30分钟、1小时或2小时来移除单核球的步骤。在另一实施例中,自个体进行血液收集至再引入T细胞和/或NK细胞至个体中的方法并不包括通过在黏着物基质上培育隔夜来移除单
核球的步骤。在另一实施例中,自个体进行血液收集至再引入T细胞和/或NK细胞至个体中
的方法,在该方法期间T细胞和/或NK细胞并不与牛血清(诸如细胞培养牛血清,例如胎牛血清)一起培育或并不暴露于其中。
[0145] 因为本文提供的用于过继性细胞疗法的方法,及用于在活体内扩增T细胞和/或NK细胞之前离体修饰静息这些T细胞和/或NK细胞的相关方法,可以显著短于先前方法的时间
来进行,使得患者护理及安全性以及产品制造性的基本改进成为可能。因此,在负责批准在活体内进行用于治疗性目的时的此类方法的法规机构看来,此类方法预计是有利的。举例
而言,在非限制性实施例中,在经修饰的T细胞和/或NK细胞再引入至患者中之前,在样本处理的整个时间,个体可留在与处理其血液或样本的机构的相同建筑(例如输注诊所)或房间
中。在非限制性说明性实施例中,在自个体进行血液抽取/收集至离体转导T细胞和/或NK细胞后将血液再引入至个体的整个方法/过程中,个体保持在位置线内和/或其正被处理的血
液或细胞的100、50、25或12英尺或臂的距离内。在其他非限制性说明性实施例中,在自个体进行血液抽取/收集至离体转导T细胞和/或NK细胞后将血液再引入至个体的整个方法/过
程中和/或连续地,个体保持清醒和/或至少一个人可继续监测个体的正被处理的血液或细
胞。因为本文提供的改进,用于过继性细胞疗法和/或转导静息T细胞和/或NK细胞的自个体进行血液抽取/收集至离体转导T细胞和/或NK细胞后将血液再引入至个体的整个方法/过
程,可与人类的连续监测一起进行。在其他非限制性说明性实施例中,在自个体进行血液抽取/收集至离体转导T细胞和/或NK细胞后将血液再引入至个体的整个方法/过程的任何点
处,均不会将血液细胞培育在无个人存在的房间中。在其他非限制性说明性实施例中,自个体进行血液抽取/收集至离体转导T细胞和/或NK细胞后将血液再引入至个体的整个方法/
过程是紧挨着个体和/或在与个体相同的房间中和/或紧接着个体的床或椅子上进行。因
此,可避免样本一致性混乱,以及避免超过数天或数周的长且昂贵的培育。本文提供的方法容易地适用于封闭及自动化血液处理系统的事实进一步证实此优点,其中将再引入至个体
中的血液样本及其组分仅与单次、一次性使用的组分进行接触。
[0146] 用于进行本文提供的过继性细胞疗法的方法一般包括1)转导淋巴细胞(诸如T细胞和/或NK细胞,其在说明性实施例中为静息T细胞和/或NK细胞)的方法,和/或包括2)用于以基因方式修饰淋巴细胞(诸如T细胞和/或NK细胞,其在说明性实施例中为静息T细胞和/
或NK细胞)的方法,其两者(1及2)自身各自形成本发明的不同方面。此类方法可在具有或不具有在本文中经鉴别用于进行过继性细胞疗法的其他步骤的情况下来进行。在用于过继性
细胞疗法的方法及本文中提供的包括离体转导静息T细胞和/或静息NK细胞的任何方法中,
通常在将细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之前,自血细胞分离出嗜中性细胞/
粒细胞。在一些实施例中,使用例如血球分离术和/或密度梯度离心法,自血液样本的其他组分分离出包括周边血淋巴细胞(PBL)(诸如T细胞和/或NK细胞)的周边血单核细胞
(PBMC)。在一些实施例中,在PBMC和/或T细胞和/或NK细胞被处理、与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触、转导或转染之前,移除嗜中性细胞。关于待治疗的个体,细胞可为异体性和/或自体性的。
[0147] 作为非限制性实施例,在本文中用于转导或以基因方式修饰的方法的一些实施例中,使用Sepax或Sepax 2细胞处理系统(BioSafe)分离PBMC。在一些实施例中,使用
CliniMACS Prodigy细胞处理器(Miltenyi Biotec)分离PBMC。在一些实施例中,使用自动
血球分离器,自个体采集血液,使血液穿过挑选出周边细胞类型(诸如,PBMC)的装置,且使剩余部分返回至个体中。密度梯度离心可在血球分离之后进行。在一些实施例中,使用去除白血球的过滤器器件分离PBMC。在一些实施例中,接着使用磁珠活化细胞分类术以根据细
胞表型(亦即阳性选择)来纯化来自PBMC(诸如,PBL或其子集)的特异性细胞群。也可使用用于纯化的其他方法,诸如,基质黏着,其利用模拟T细胞在补充期间遭遇的环境的基质,从而使其黏着及迁移,或阴性选择,其中不需要的细胞利用抗体复合物(靶向不需要的细胞)来
移除。在一些实施例中,红细胞花结术可用于纯化细胞。
[0148] 在本文中的相关方面的任一者的一些说明性实施例中,PBL包括T细胞和/或NK细胞。在本文中的某些实施例期间,例如在修饰淋巴细胞的方法及进行过继性细胞疗法的方
法中,与本发明的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触的T细胞和/或NK细胞主要为静息T
细胞。在一些实施例中,T细胞和/或NK细胞包含95%与100%之间的静息细胞(Ki-67-)。在一些实施例中,与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触的T细胞和/或NK细胞包括在范围的
低值端点为90%、91%、92%、93%、94%及95%静息细胞与范围的高值端点为96%、97%、
98%、99%或100%静息细胞之间。在一些实施例中,T细胞和/或NK细胞包括原生细胞。
[0149] 在本文公开的方法及组合物的一些实施例中,T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒离体接触以以基因方式修饰T细胞和/或NK细胞,以在再引入至个体中时
在个体中引起靶向免疫反应。在接触时段期间,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒识别T细胞和/或NK细胞且与T细胞和/或NK细胞结合,此时反转录病毒与宿主细胞膜开始融合。接着,经由转导程序,来自复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的基因材料进入T细胞和/或NK细胞,
且并入至宿主细胞DNA中。慢病毒转导的方法为已知的。例示性方法描述于例如Wang等人
(2012)J.Immunother.35(9):689-701,Cooper等人(2003)Blood.101:1637-1644,
Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114,及Cavalieri等人(2003)Blood.102
(2):497-505中。
[0150] 本文提供的方法中的许多方法包括转导T细胞和/或NK细胞。在此项技术中已知用于离体用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(诸如复制缺陷型重组慢病毒颗粒)转导T细胞
和/或NK细胞的方法。在说明性实施例中,本文中提供的方法并不需要离体刺激或活化。因此,在本方法中可避免先前方法中的此常规步骤,但在转导期间可存在离体刺激性分子(诸如抗CD3和/或抗CD28珠粒)。然而,利用本文提供的说明性方法,不需要离体刺激。在某些例示性方法中,可使用在3重与10重感染(MOI)之间,且在一些实施例中,在5MOI与10MOI之间的单位的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,例如慢病毒。
[0151] 转导反应可在封闭系统(诸如如本文所论述的Sepax系统)中进行,其中转导反应可在该系统上装载的一次性袋子中进行。一旦从粒细胞(包括嗜中性细胞)分开、分离和/或纯化出自个体收集的血液样本的血细胞(诸如PBMC),这些血液细胞可与本文公开的复制缺
陷型重组反转录病毒颗粒在袋子中接触,这些粒细胞在接触步骤(亦即转导反应)期间通常
不存在。
[0152] 复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可再引入至含有经分离PBMC的袋中,从而接触PBMC。自个体收集血液的时间至将血细胞(诸如PBMC)添加至转导反应袋的时间可在30分钟
与4小时之间、在30分钟与2小时之间,或在一些实施例中大约1小时。可将诸如培养基、人类血清白蛋白、人类AB+血清和/或源自个体的血清的添加物添加至转导反应混合物中。通常
存在培养基,诸如此项技术中已知用于离体处理的那些(作为非限制性实施例,X-VIVO 15
(Lonza))或CTS培养基(Thermo Fisher Scientific)。可将支持性细胞因子添加至转导反
应混合物,诸如IL2、IL7或IL15,或HAS中发现的那些。
[0153] 转导反应混合物可在23℃与39℃之间,且在一些实施例中在37℃下培育。在某些实施例中,转导反应可在37℃至39℃下进行以供较快速融合/转导。可将dGTP添加至转导反应。转导反应混合物可培育1至12小时,且在一些实施例中,在进行洗涤之前培育6至12小
时,而无论这些细胞是否将在活体外、离体或引入至个体中进行研究。因此,在其中将细胞输注至个体中的某些实施例中,在转导后,在将经转导T细胞和/或NK细胞输注回至个体中
之前,洗涤细胞以在输注回至个体中之前移除转导反应混合物。举例而言,在将经转导的细胞输注回个体之前,系统(诸如Sepax仪器)可用于例如用10ml至50ml的洗涤溶液来洗涤细
胞。在一些实施例中,在PBMC和/或T细胞和/或NK细胞经处理、与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触、转导或转染之前,移除嗜中性细胞。
[0154] 在用于进行过继性细胞疗法的一说明性实施例中,将血液自个体收集至血袋中,且将该血袋连接至细胞处理系统,诸如Sepax细胞处理系统。将使用细胞处理系统分离的
PBMC收集至袋子中,使这些PBMC与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在足以转导T细胞和/或
NK细胞的条件下接触,并对其进行培育。在培育之后,将含有PBMC与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的混合物的袋子连接至细胞处理系统,且洗涤PBMC。将经洗涤的PBMC收集至袋子
中,且再输注至个体中。在一些实施例中,自收集血液至再输注经转导T细胞和/或NK细胞的整个方法在1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、15小时、18小时或24小时内进行。在说明性实施例中,整个方法在12小时内进行。
[0155] 在一些实施例中,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的靶标细胞为PBL。在一些实施例中,靶细胞为T细胞和/或NK细胞。在一些实施例中,T细胞为辅助T细胞和/或杀伤T细胞。
[0156] 在一些实施例中,本文提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其表面上具有假型组件,这些假型组件能够结合T细胞和/或NK细胞且有助于与复制缺陷型重组反转录病毒
颗粒的膜融合。在其他实施例中,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其表面上具有能够结
合静息T细胞和/或NK细胞的活化组件。在又其他实施例中,复制缺陷型重组反转录病毒颗
粒在其表面上具有膜结合细胞因子。在一些实施例中,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包
括多核苷酸,该多核苷酸具有编码一个或多个工程化信号传导多肽的一个或多个转录单
元,这些工程化信号传导多肽中的一者或多者包括一个或多个淋巴增生性组件。在其他实
施例中,当利用两种信号传导多肽时,一种包括至少一个淋巴增生性组件,且另一种通常为包括抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域的嵌合抗原受体(CAR)。如本文所指
示,通常与本文提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面缔合的活化组件能够接触静
息T细胞和/或NK细胞足够时段,且由于该接触及在适当条件下活化静息T细胞和/或NK细
胞。应理解,此活化在本文中的方法的接触步骤期间随时间推移而发生。此外,应理解,在其中在结合T细胞和/或NK细胞的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上发现假型组件的
一些实施例中,在本文中的方法中,活化可通过结合假型组件来诱导。活化组件在那些实施例中视情况存在。
[0157] 本文中的其他部分中提供关于假型组件、活化组件、膜结合细胞因子、工程化信号传导多肽、淋巴增生性组件及CAR的其他描述。
[0158] 在本文公开的方法及组合物的一些实施例中,自血液收集的总淋巴细胞的5%与90%之间经转导。在某些实施例中,经转导的淋巴细胞的百分比是在为5%、10%、15%、
20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%及60%的范围低值端点与为50%、55%、
60%、65%、70%、75%、80%、85%及90%的范围高值端点之间。在一些实施例中,经转导的淋巴细胞的百分比为至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少
35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%或至少60%。
[0159] 在本文公开的方法及组合物的一些实施例中,将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞引回、再引入或再输注至个体中而无需额外离体操作,诸如刺激和/或活化T细胞和/或NK细胞。在现有技术方法中,离体操作用于刺激/活化T细胞和/或NK细胞,及用于在将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞引入至个体中之前扩增经基因方式修饰的T细胞和/或NK
细胞。在先前技术方法中,此通常花费数天或数周,且需要个体在初始血液抽取之后返回诊所以血液输注数天或数周。在本文公开的方法及组合物的一些实施例中,在T细胞和/或NK
细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之前,T细胞和/或NK细胞并不通过暴露于抗
CD3/抗CD28固体载体(诸如,涂布有抗CD3/抗CD28的珠粒)而离体进行刺激。因此,本文中提供一种离体无传播方法。在其他实施例中,经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞是指活体
内(亦即在个体内)扩增或主要在活体内扩增,而并不离体扩增,或仅离体扩增较小数目的
细胞分裂(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10轮的细胞分裂)。在一些实施例中,不添加额外培养基以允许细胞的另外扩增。在一些实施例中,在PBL与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触时,不发生PBL的细胞制造。在说明性实施例中,当PBL离体时不发生PBL的细胞制造。在过继性细胞疗法的先前方法中,个体在再输注经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞之前进行淋
巴消耗。在一些实施例中,患者或个体在抽取血液之前并不进行淋巴消耗。在一些实施例
中,患者或个体在再输注经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞之前并不进行淋巴消耗。
[0160] 在本文公开的实施例中的任一者中,待再输注至个体中的T细胞和/或NK细胞的数目可在范围的低值端点为1×103、2.5×103、5×103、1×104、2.5×104、5×104、1×105、2.5
×105、5×105、1×106、2.5×106、5×106及1×107个细胞/公斤与范围的高值端点为5×104、
1×105、2.5×105、5×105、1×106、2.5×106、5×106、1×107、2.5×107、5×107及1×108个细
胞/公斤之间。在说明性实施例中,待再输注至个体中的T细胞和/或NK细胞的数目可在范围的低值端点为1×104、2.5×104、5×104及1×105个细胞/公斤与范围的高值端点为2.5×
4 4 5 5 5 6
10、5×10、1×10、2.5×10 、5×10 及1×10个细胞/公斤之间。在一些实施例中,待再输
注至个体中的PBL的数目可少于范围的低值端点为5×105、1×106、2.5×106、5×106、1×
107、2.5×107、5×107及1×108个细胞,与范围的高值端点为2.5×106、5×106、1×107、2.5
×107、5×107、1×108、2.5×108、5×108及1×109个细胞。在一些实施例中,可用于再输注至
5 8
70kg个体或患者中的T细胞和/或NK细胞的数目在7×10个细胞与2.5×10 个细胞之间。在
其他实施例中,可用于转导的T细胞和/或NK细胞的数目大约为7×106个加或减10%。
[0161] 在本文公开的方法中,整个过继性细胞疗法程序(自抽取血液至再输注经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞)可有利地在比先前方法更短的时间中进行。在一些实施例中,整个过继性细胞疗法程序可在少于1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、15小时、18小时或24小时中进行。在说明性实施例中,整个过继性细胞疗法程序可在少于1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时中进行。在一些实施例中,整个过继性细胞疗法程序可在范围的低值端点为1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时或15小时与范围的高值端点为1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、15小时、18小时或24小时之间进行。
[0162] 在本文中的一些实施例中,封闭系统用于处理PBMC,例如在包括以基因方式修饰PBMC、NK细胞且在说明性实施例中T细胞的方法中,例如通过转导PBMC或其子集。这些方法可用于以基因方式修饰待用于科学研究、商业生产或治疗方法的淋巴细胞。举例而言,这些方法可包括将周边血液单核细胞(PBMC)(包括NK细胞、T细胞或两者,且在一些实施例中,静息T细胞和/或静息NK细胞)自容器转移至封闭系统内的转导反应混合物中,其因此不需要
环境暴露。该容器例如可为管、袋、注射器或其他容器。在一些实施例中,容器为用于研究设施的容器。在一些实施例中,容器为用于商业生产的容器。在其他实施例中,容器可为永夜血液收集过程的收集容器。本文中用于以基因方式修饰的方法通常涉及其中淋巴细胞与复
制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触的接触步骤。在一些实施例中,该接触可在容器中(例
如,在血袋内)进行。在其他实施例中,可将PBMC或其子部分自容器转移至封闭系统内的另一容器(例如自第一容器转移至第二容器)以供接触。第二容器可为封闭装置(诸如G-Rex装
置)的细胞处理区室。在一些实施例中,在接触后,可将经基因方式修饰(例如,经转导)的细胞转移至封闭系统内的不同容器(亦即无需暴露于环境)。在此转移之前或之后,通常在封
闭系统内洗涤细胞以基本上移除所有或所有反转录病毒颗粒。在一些实施例中,在接触之
后将PBMC或其部分转移至其中接触(例如,转导)将经由洗涤细胞发生的容器中的此段落中
所公开的过程在12小时内进行。在一些实施例中,其在范围的低值端点为1小时、2小时、3小时或4小时与范围的高值端点为4小时、8小时、10小时或12小时之间进行。
[0163] 在本文提供的一些实施例中,自个体抽取血液样本、使T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触、和/或将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞引入至个
体中的步骤,发生在封闭系统中。封闭系统为一种对污染通常封闭或完全封闭的培养方法。
由此,这是统或过程不会将细胞暴露于环境。本发明的一优势为,本文中提供用于在封闭系统中进行CAR疗法的方法。对于细胞处理程序中的安全性及调控的最高险中的一者为经
由频繁暴露于环境的污染的风险,如在传统开放式细胞培养系统中所发现的。为了缓和此
风险,尤其在不存在抗生素时,已研发出致力于使用一次性(单次使用)设备的一些商业方
法。然而,即使在无菌条件下使用,打开烧瓶以取样或添加额外生长培养基总是存在污染风险。为了克服此问题,本文中提供一种封闭系统方法,一种经设计且可经操作使得产物并不暴露于外部环境的方法。这是重要的,因为外部环境通常不系无菌的。经由无菌连接或焊接管进行材料转移。用于气体交换的空气经由透气膜或类似其他添加物经由0.2μm过滤器来
进行以防止环境暴露。
[0164] 在一些实施例中,封闭系统包括连接至个体的活体内循环系统的离体循环系统,使得抽取血液,且接着在被引回至个体之前循环至离体循环系统。在一些实施例中,离体循环系统包括与用于将细胞暴露于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的系统或装置结合的用
于分离PBL的系统或装置和/或用于分离T细胞和/或NK细胞的系统或装置。在一些实施例
中,封闭系统并不允许T细胞和/或NK细胞暴露于空气。
[0165] 此类封闭系统方法可利用可商购的器件来进行。举例而言,该方法可在适用于封闭系统T细胞制造的器件中进行。此类器件包括G-RexTM、WAVEBioreactorTM、OriGen 
PermaLifeTM袋及 袋。
[0166] 在本文公开的方法及组合物的一些实施例中,将个体内的经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞暴露于与其中存在的活体内控制组件结合的化合物,其中控制组件为由复
制缺陷型重组反转录病毒颗粒引入的基因材料的一部分。在一些实施例中,控制组件可为
核糖开关,且化合物可结合核糖开关的适体域。在一些实施例中,控制组件可为分子伴侣。
在本文所公开的实施例中的任一者中,化合物可为核苷类似物。在一些实施例中,核苷类似物可为核苷类似抗病毒药物,其中抗病毒药物为一种由食品与药物管理局(Food and Drug Administration)针对抗病毒治疗批准的化合物或一种美国抗病毒临床试验中的化合物。
在说明性实施例中,化合物可为阿昔洛韦或喷昔洛韦。在一些实施例中,化合物可为泛昔洛韦(famciclovir)(喷昔洛韦的口服前体药物)或伐昔洛韦(valaciclovir)(阿昔洛韦的口
服前体药物)。化合物与控制组件的结合影响经引入的基因材料的表达,且因此影响经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞的传播。
[0167] 在一些实施例中,在自个体的血液分离PBL之前、同时和/或之后,且在T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之前,将核苷类似抗病毒药物或前体药物(例如阿昔洛韦、伐昔洛韦、喷昔洛韦或泛昔洛韦)施用至个体。在一些实施例中,在自血液分离PBL之前或在T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之前,在范围
的低值端点为5分钟、10分钟、15分钟、30分钟及60分钟与范围的高值端点为1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时或24小时之间,将核苷类似抗病毒药物或前体药物施用至个体。在其他实施例中,在自血液分离PBL及在T细胞和/或NK细胞与本文所提供的方法中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之后,在范围的低值端点为1.5小时、2
小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时或24小时与范围的高值端点为1/2天、1天、
2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天或28天之间,将核苷类似抗病毒药物或前体药物施用至个体。在一些实施例中,在自血液分离PBL及在T细胞和/或NK细胞与本文所提供的方法中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之后的至少1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时或24小时,或至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天或28天,将核苷类似抗病毒药物或前体药物施用至个体。在一些实施例中,在已将PBL再输注至个体之后的至少1天、2天、3天、4天、5天、7天、10天、14天、21天、28天、30天、60天、90天或120天,或5个月、6个月、9个月、12个月、24个月、36个月、48个月、60个月、72个月、84个月、
96个月、120个月或无限期,将核苷类似抗病毒药物或前体药物施用至个体。在本文所公开的实施例中的任一者中,在PBL再输注之前和/或期间和/或已将PBL再输注之后,可施用核
苷类似抗病毒药物或前体药物。
[0168] 在一些实施例中,向个体每日施用与控制组件结合的化合物一次、两次、三次或四次。在一些实施例中,提供日剂量的化合物1周、2周、4周、3个月、6个月、1年,直至个体无病(诸如无癌症)或无限期地提供。在说明性实施例中,药物为与核苷类似物结合的核苷类似抗病毒药物,诸如核糖开关,如在本文中进一步详细公开。
[0169] 用于递送药物的方法在此项技术中为已知的,该药物无论为小分子抑或生物制剂且可用于本文提供的方法。任何此类方法均可用于递送用于本发明的方法中的药物或候选
化合物或抗体。举例而言,投药的常规路径包括非侵袭性经口(经由口)、局部(皮肤)、经黏膜(鼻、颊/舌下、阴道、眼及直肠)及吸入途径。许多蛋白质及肽药物(诸如单克隆抗体)必须通过注射或纳米针数组来递送。举例而言,许多免疫接种是基于蛋白质药物的递送,且通常通过注射来进行。
[0170] 工程化信号传导多肽
[0171] 在一些实施例中,用于接触T细胞和/或NK细胞的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒具有多核苷酸,该多核苷酸具有编码一种或多种工程化信号传导多肽的一个或多个转录单
元。在一些实施例中,工程化信号传导多肽包括胞外域(例如,抗原特异性靶向区或ASTR)、视情况选用的柄及跨膜域的任何组合,与一个或多个胞内活化域、一个或多个调节域(诸如共刺激域)及一个或多个T细胞存活基元组合。在说明性实施例中,工程化信号传导多肽中
的至少一者、两者或全部为嵌合抗原受体(CAR)或包括嵌合淋巴增生性组件(CLE)的淋巴增
生性组件。在一些实施例中,当利用两个信号传导多肽时,一个编码淋巴增生性组件且另一个编码包括抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域的嵌合抗原受体(CAR)。一般熟练此项技术的人员将能够针对本文公开的方法及组合物,将系统进行配置以利用类似或不
类似的控制组件来将淋巴增生性组件及CAR放在不同的多核苷酸上。熟练的技术人员应认
识到,工程化多肽也可称作重组多肽。
[0172] 胞外域
[0173] 在一些实施例中,工程化信号传导多肽包括胞外域,其为特异性结合对的成员。举例而言,在一些实施例中,胞外域可为细胞因子受体或其突变体或激素受体或其突变体的胞外域。此突变型胞外域在一些实施例中经报导在至少一些细胞类型中表达时为组成性活
性的。在说明性实施例中,此胞外域及跨膜域不包括配位体结合区。据信,这些域在存在于工程化信号传导多肽中且表达于B细胞、T细胞和/或NK细胞中时不结合配位体。这些受体突变体中的突变可发生于胞外近膜区中。不受理论限制,本文提供的工程化信号传导多肽的
至少一些胞外域(及一些胞外-跨膜域)中的突变通过使通常不在一起的活化链集合在一起
而在不存在配位体的情况下负责工程化信号传导多肽的信号传导。关于包含胞外域中的突
变的胞外域的另外的实施例可在例如本文中的淋巴增生性组件章节中找到。
[0174] 在某些说明性实施例中,胞外域包含二聚基元。在一说明性实施例中,二聚基元包含亮氨酸拉链。在一些实施例中,亮氨酸拉链来自jun多肽,例如c-jun。关于包含二聚基元的胞外域的另外的实施例可在例如本文中的淋巴增生性组件章节中找到。
[0175] 在某些实施例中,胞外域为抗原特异性靶向区(ASTR),有时在本文中称为抗原结合域。特异性结合对包括(但不限于)抗原-抗体结合对;配位体-受体结合对;以及类似者。
因此,适用于本发明的工程化信号传导多肽中的特异性结合对的成员包括ASTR,该ASTR为
抗体、抗原、配位体、配位体的受体结合域、受体、受体的配位体结合域,以及亲和抗体。
[0176] 适用于本发明的工程化信号传导多肽中的ASTR可为任何抗原结合多肽。在某些实施例中,ASTR为抗体,诸如全长抗体、单链抗体、Fab片段、Fab’片段、(Fab’)2片段、Fv片段,以及二价单链抗体或双功能抗体。
[0177] 在一些实施例中,ASTR为单链Fv(scFv)。在一些实施例中,重链位于工程化信号传导多肽中的轻链的N端。在其他实施例中,轻链位于工程化信号传导多肽中的重链的N端。在所公开的实施例中的任一者中,重链及轻链可由的接头隔开,如本文中更详细论述。在所公开的实施例中的任一者中,重链或轻链可在工程化信号传导多肽的N端且通常为另一域(诸如信号序列或信号肽)的C端。
[0178] 其他基于抗体的识别域(cAb VHH(骆驼抗体可变域)及人类化版本,IgNAR VH(鲨鱼抗体可变域)及人类化版本,sdAb VH(单一域抗体可变域)及“骆驼化”抗体可变域)适宜与工程化信号传导多肽一起使用且适用于使用本发明的工程化信号传导多肽的方法中。在
一些情况下,也适宜使用基于T细胞(TCR)的识别域,诸如单链TCR(scTv,含有VαVβ的单链两域TCR)。
[0179] 在一些实施例中,ASTR可为多特异性的,例如双特异性抗体。多特异性抗体具有针对至少两个不同位点的结合特异性。在某些实施例中,结合特异性中的一者是针对一种靶标抗原且另一者是针对另一种靶标抗原。在某些实施例中,双特异性抗体可结合至ta靶向
抗原的两个不同的抗原决定基。双特异性抗体也可用于将细胞毒剂定位至表达靶标抗原的
细胞中。双特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段。
[0180] 适用于本发明的工程化信号传导多肽中的ASTR可具有多种抗原结合特异性。在一些情况下,抗原结合域对于由靶标细胞表达(由其合成)的抗原中存在的抗原决定基具有特
异性。在一个实施例中,靶标细胞为癌细胞相关的抗原。癌细胞相关的抗原可为与以下相关的抗原:例如乳癌细胞、B细胞淋巴瘤、霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、间皮瘤、癌细胞(例如,小细胞肺癌细胞)、非霍奇金B细胞淋巴瘤(B-NHL)细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、间皮瘤细胞、肺癌细胞(例如,小细胞肺癌细胞)、黑色素瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、急性淋巴细胞白血病细胞、神经母细胞瘤细胞、神经胶质瘤、神经胶母细胞瘤、神经管胚细胞瘤、结肠癌细胞等。癌细胞相关的抗原也可由非癌细胞表达。
[0181] 工程化信号传导多肽的ASTR可结合的抗原的非限制性实施例包括例如CD19、CD20、CD38、CD30、ERBB2、CA125、MUC-1、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD44表面黏着分子、间皮素、癌胚抗原(CEA)、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFRvIII、血管内皮生长因子受体-2
(VEGFR2)、高分子量黑素瘤相关的抗原(HMW-MAA)、MAGE-Al、IL-13R-a2、GD2、Axl、Ror2,以及类似者。
[0182] 在一些情况下,适用于工程化信号传导多肽中的特异性结合对的成员为受体的配位体的ASTR。配位体包括(但不限于):激素(例如,红细胞生成素、生长激素、瘦素等);细胞因子(例如,干扰素、白细胞介素、某些激素等);生长因子(例如,调节蛋白;血管内皮生长因子(VEGF);以及类似者);整合素结合肽(例如,包含序列Arg-Gly-Asp的肽);以及类似者。
[0183] 当工程化信号传导多肽中的特异性结合对的成员为配位体时,可在特异性结合对的第二成员的存在下使工程化信号传导多肽活化,其中特异性结合对的第二成员为该配位
体的受体。举例而言,当配位体为VEGF时,特异性结合对的第二成员可为包括可溶性VEGF受体的VEGF受体。
[0184] 如上文所提及,在一些情况下,包括在工程化信号传导多肽中的特异性结合对的成员为ASTR,该ASTR为受体,例如配位体的受体、共受体等。该受体可为受体的配位体结合片段。合适受体包括(但不限于):生长因子受体(例如,VEGF受体);杀伤细胞凝集素样受体子家族K;成员1(NKG2D)多肽(MICA、MICB及ULB6的受体);细胞因子受体(例如,IL-13受体;
IL-2受体等);CD27;自然细胞毒性受体(NCR)(例如,NKP30(NCR3/CD337)多肽(HLA-B相关的转录物3(BAT3)及B7-H6)的受体等)等。
[0185] 在包括ASTR的本文提供的方面中的任一者的某些实施例中,可将ASTR定位于连接ASTR与表达与靶细胞上的靶向分子的中间蛋白质。中间蛋白质可经内源性地表达或外源性
地引入,且可为天然地、经工程化或化学修饰的。在某些实施例中,ASTR可为抗标记ASTR,使得至少一个经标记中间物(通常抗标记共轭物)包括于由ASTR识别的标记与靶向分子(通常
为表达于靶细胞上的蛋白质靶标)之间。因此,在这些实施例中,ASTR结合标记且标记共轭至针对靶细胞(诸如癌细胞)上的抗原的抗体。标记的非限制性实施例包括异硫氰酸荧光
(FITC)、链霉亲和素、生物素、组氨酸、二硝基苯酚、多甲藻素叶绿素蛋白复合物、绿色荧光蛋白、藻红蛋白(PE)、辣根过氧化酶、棕榈酰化、亚硝基化、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶以及麦芽糖结合蛋白。由此,ASTR包韩结合标记的分子。
[0186] 柄
[0187] 在一些实施例中,工程化信号传导多肽包括位于工程化信号传导多肽的部分中的柄,该部分位于细胞外部且插入在ASTR与跨膜域之间。在一些情况下,该柄与野生型CD8柄区(TTTPAPRPPTPAPTIASQP LSLRPEACRPAAGG AVHTRGLDFA(SEQ ID NO:79))具有至少85%、
90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性,与野生型CD28柄区(FCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:80))具有至少85%、90%、95%、96%、97%、
98%、99%或100%一致性,或与野生型免疫球蛋白重链柄区具有至少85%、90%、95%、
96%、97%、98%、99%或100%一致性。在工程化信号传导多肽中,所用柄允许抗原特异性靶向区及通常整个工程化信号传导多肽保持与靶标抗原的结合增加。
[0188] 柄区长度可为约4至约50个氨基酸,例如约4个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约25个氨基酸、约25个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约40个氨基酸,或约40个氨基酸至约50个氨基
酸。
[0189] 在一些情况下,工程化信号传导多肽的柄包括至少一个半胱氨酸。举例而言,在一些情况下,柄可包括序列Cys-Pro-Pro-Cys(SEQ ID NO:62)。若存在,第一工程化信号传导多肽的柄中的半胱氨酸可以能够与第二工程化信号传导多肽中的柄形成二硫键。
[0190] 柄可包括此项技术中已知的免疫球蛋白铰链区氨基酸序列;参见例如Tan等人,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:162;及Huck等人(1986)Nucl.Acids Res.14:1779。作为非限制性实施例,免疫球蛋白铰链区可包括与以下氨基酸序列中的任一者的至少10个、
15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、
96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域:DKTHT(SEQ ID NO:63);CPPC(SEQ ID NO:
62);CPEPKSCDTPPPCPR(SEQ ID NO:64);(参见例如Glaser等人(2005)J.Biol.Chem.280:
41494);ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO:65);KSCDKTHTCP(SEQ ID NO:66);KCCVDCP(SEQ ID NO:
67);KYGPPCP(SEQ ID NO:68);EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:69)(人类IgGl铰链);
ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:70)(人类IgG2铰链);ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQ ID NO:71)(人类
IgG3铰链);SPNMVPHAHHAQ(SEQ ID NO:72)(人类IgG4铰链);以及类似者。柄可包括具有人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4铰链区的氨基酸序列的铰链区。柄与野生型(天然存在的)铰链区相比可包括一个或多个氨基酸取代和/或插入和/或缺失。举例而言,人类IgG 1铰链的
His229可经Tyr取代,使得柄包括序列EPKSCDKTYTCPPCP(参见例如Yan等人(2012)
J.Biol.Chem.287:5891)。柄可包括来源于人类CD8的氨基酸序列;例如,该柄可包括氨基酸序列:TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO:73),或其变体。
[0191] 跨膜域
[0192] 本发明的工程化信号传导多肽可包括用于插入至真核细胞膜中的跨膜域。跨膜域可插入在ASTR与共刺激域之间。跨膜域可插入在柄与共刺激域之间,使得嵌合抗原受体自
胺基端(N端)至羧基端(C端)依次包括:ASTR、柄、跨膜域以及活化域。
[0193] 提供将多肽插入至真核(例如,哺乳动物)细胞的细胞膜中的任何跨膜(TM)域适用于本文所公开的方面及实施例。适用于本文提供的方面或实施例中的任一者的TM域的非限
制性实施例包括与以下TM域或经组合柄及TM域中的任一者的至少10个、15个、20个或全部
氨基酸的一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、
99%或100%序列一致性的域:a)CD8αTM(SEQ ID NO:46);b)CD8βTM(SEQ ID NO:47);c)CD4柄(SEQ ID NO:48);d)CD3Z TM(SEQ ID NO:49);e)CD28 TM(SEQ ID NO:50);f)CD134
(OX40)TM(SEQ ID NO:51);g)CD7 TM(SEQ ID NO:52);h)CD8柄及TM(SEQ ID NO:75);及i)CD28柄及TM(SEQ ID NO:76)。
[0194] 作为非限制性实施例,本发明的一方面的跨膜域可与以下具有至少80%、90%或95%的序列一致性:SEQ ID NO:46跨膜域、CD8β跨膜域、CD4跨膜域、CD3ζ跨膜域、CD28跨膜域、CD134跨膜域,或CD7跨膜域。
[0195] 胞内活化域
[0196] 适用于本发明的工程化信号传导多肽中的胞内活化域在活化时通常诱导产生一种或多种细胞因子;增加细胞死亡;和/或增加CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、NKT细胞、γδT细胞和/或嗜中性细胞的增生。活化域也可在本文中称为活化域。活化域可用于本文提供的CAR
中或淋巴增生性组件中。
[0197] 在一些实施例中,胞内活化域包括如下文所描述的至少一个(例如,一个、两个、三个、四个、五个、六个等)ITAM基元。在一些实施例中,胞内活化域可与如下文所描述的CD3Z、CD3D、CD3E、CD3G、CD79A、CD79B、DAP12、FCERlG、FCGR2A、FCGR2C、DAP10/CD28或ZAP70域具有至少80%、90%或95%的序列一致性。
[0198] 适用于本发明的工程化信号传导多肽中的胞内活化域包括含有基于免疫酪氨酸的活化基元(ITAM)的胞内信号传导多肽。ITAM基元为YX1X2L/I,其中X1及X2独立地为任何氨基酸。在一些情况下,工程化信号传导多肽的胞内活化域包括1个、2个、3个、4个或5个ITAM基元。在一些情况下,ITAM基元在胞内活化域中重复两次,其中ITAM基元的第一个例与第二个例彼此由6个至8个氨基酸(例如,(YX1X2L/I)(X3)n(YX1X2L/I),其中n为整数6至8,且6个至
8个X3中的每一者可为任何氨基酸)分隔开。在一些情况下,工程化信号传导多肽的胞内活
化域包括3个ITAM基元。
[0199] 合适的胞内活化域可为含有ITAM基元的部分,该部分来源于含有ITAM基元的多肽。举例而言,合适的胞内活化域可为来自任何含有ITAM基元的蛋白质的含有ITAM基元的
域。因此,合适的胞内活化域不需要含有其源自的整个蛋白质的整个序列。合适的含有ITAM基元的多肽的实例包括(但不限于):CD3Z(CD3ζ);CD3D(CD3δ);CD3E(CD3ε);CD3G(CD3γ);
CD79A(抗原受体复合物相关的蛋白质α链);DAP12;以及FCERlG(Fcε受体Iγ链)。
[0200] 在一些情况下,胞内活化域来源于T细胞表面糖蛋白CD3ζ链(也称为CD3Z、T细胞受体T3ζ链、CD247、CD3-ζ、CD3H、CD3Q、T3Z、TCRZ等)。举例而言,合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段或与以下氨基酸序列(2个同种型)中的任一者的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa或约150aa至约160aa一连续段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域:MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPA
YQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL[YNELQKDKMAEAYSEI]
GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQALPPR(SEQ ID NO:11)或MKWKALFTAAILQAQLPITE
AQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]
DKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]
HMQALPPR(SEQ ID NO:12),其中用括号将ITAM基元括起来。
[0201] 同样,合适的胞内活化域多肽可包括全长CD3ζ氨基酸序列的含有ITAM基元的部分。因此,合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段或与以下氨基酸序列中的任一者的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至
约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa或约150aa至约160aa的一连续段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、
96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域:RVKFSRSADAPAYQQGQNQL
[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMKGERRRGKGHDGL
[YQGLSTATKDTYDAL]HMQALPPR(SEQ ID NO:13);RVKFSRSADAPAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]
DKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]
HMQALPPR(SEQ ID NO:81);NQL[YNELNLGRREEYDVL]DKR(SEQ ID NO:14);EGL
[YNELQKDKMAEAYSEI]GMK(SEQ ID NO:15);或DGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQ(SEQ ID NO:16),
其中用括号将ITAM基元括起来。
[0202] 在一些情况下,胞内活化域来源于T细胞表面糖蛋白CD3δ链(也称为CD3D、CD3-δ、T3D、CD3抗原、δ子单元、CD3δ、CD3d抗原、δ多肽(TiT3复合物)、OKT3、δ链、T细胞受体T3δ链、T细胞表面糖蛋白CD3δ链等)。因此,合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段或与以下氨基酸序列中的任一者的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约
140aa、约140aa至约150aa或约150aa至约160aa的一连续段具有至少50%、60%、70%、
75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域:MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTV
QVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQV
[YQPLRDRDDAQYSHL]GGNWARNK(SEQ ID NO:17)或MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFV
NCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRTADTQALLRNDQV
[YQPLRDRDDAQYSHL]GGNWARNK(SEQ ID NO:18),其中用括号将ITAM基元括起来。
[0203] 同样,合适的胞内活化域多肽可包含全长CD3δ氨基酸序列的含有ITAM基元的部分。因此,合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或
100%序列一致性的域:DQV[YQPLRDRDDAQYSHL]GGN(SEQ ID NO:19),其中用括号将ITAM基
元括起来。
[0204] 在一些情况下,胞内活化域来源于T细胞表面糖蛋白CD3ε链(也称为CD3e、T细胞表面抗原T3/Leu-4ε链、T细胞表面糖蛋白CD3ε链、AI504783、CD3、CD3ε、T3e等)。因此,合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段或与以下氨基酸序列的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa或约150aa至约160aa的一连续
段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域:MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQH
NDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDMSVATIVIVDI
CITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPD[YEPIRKGQRDLYSGL]NQRRI(SEQ 
ID NO:20),其中用括号将ITAM基元括起来。
[0205] 同样,合适的胞内活化域多肽可包含全长CD3ε氨基酸序列的含有ITAM基元的部分。因此,合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或
100%序列一致性的域:NPD[YEPIRKGQRDLYSGL]NQR(SEQ ID NO:21),其中用括号将ITAM基
元括起来。
[0206] 在一些情况下,胞内活化域来源于T细胞表面糖蛋白CD3γ链(也称为CD3G、T细胞受体T3γ链、CD3-γ、T3G、γ多肽(TiT3复合物)等)。因此,合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段或与以下氨基酸序列的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约
130aa至约140aa、约140aa至约150aa或约150aa至约160aa的一连续段具有至少50%、60%、
70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域:MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDP
RGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPND
QL[YQPLKDREDDQYSHL]QGNQLRRN(SEQ ID NO:22),其中用括号将ITAM基元括起来。
[0207] 同样,合适的胞内活化域多肽可包含全长CD3γ氨基酸序列的含有ITAM基元的部分。因此,合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或
100%序列一致性的域:DQL[YQPLKDREDDQYSHL]QGN(SEQ ID NO:23),其中用括号将ITAM基
元括起来。
[0208] 在一些情况下,胞内活化域来源于CD79A(也称为B细胞抗原受体复合物相关的蛋白质α链;CD79a抗原(免疫球蛋白相关的α);MB-1膜糖蛋白;Ig-α;膜结合的免疫球蛋白相关的蛋白质;表面IgM相关的蛋白质等)。因此,合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少
10个、15个、20个或全部氨基酸的一段或与以下氨基酸序列中的任一者的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa或约150aa至约160aa的一连续段具有至少50%、60%、70%、
75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域:MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGED
PNGTLIIQNVNKSHGGIYVCRVQEGNESYQQSCGTYLRVRQPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTL
LLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENL[YEGLNLDDCSMYEDI]SRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP(SEQ ID NO:
24)或MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLH
GNYTWPPEFLGPGEDPNEPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDE
NL[YEGLNLDDCSMYEDI]SRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP(SEQ ID NO:25),其中用括号将ITAM基
元括起来。
[0209] 同样,合适的胞内活化域多肽可包含全长CD79A氨基酸序列的含有ITAM基元的部分。因此,合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或
100%序列一致性的域:ENL[YEGLNLDDCSMYEDI]SRG(SEQ ID NO:26),其中用括号将ITAM基
元括起来。
[0210] 在一些情况下,胞内活化域来源于DAP12(也称为TYROBP;TYRO蛋白质酪氨酸激酶接合蛋白质;KARAP;PLOSL;DNAX活化蛋白质12;KAR相关蛋白质;TYRO蛋白质酪氨酸激酶结合蛋白质;杀伤活化受体相关的蛋白质;杀伤活化受体相关的蛋白质等)。举例而言,合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段或与以下氨
基酸序列(4个同种型)中的任一者的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至约
115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa或约
150aa至约160aa的一连续段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、
97%、98%、99%或100%序列一致性的域:MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQRPYYK
(SEQ ID NO:27)、MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAV
YFLGRLVPRGRGAAEATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQ(SEQ ID NO:28)、MGGLEPCSRLLLL
PLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESP
[YQELQGQRSDVYSDL]NTQRPYYK(SEQ ID NO:29)或MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGI
VMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQRPYYK(SEQ ID 
NO:30),其中用括号将ITAM基元括起来。
[0211] 同样,合适的胞内活化域多肽可包含全长DAP12氨基酸序列的含有ITAM基元的部分。因此,合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或
100%序列一致性的域:ESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQ(SEQ ID NO:31),其中用括号将ITAM基
元括起来。
[0212] 在一些情况下,胞内活化域来源于FCERlG(也称为FCRG;Fcε受体Iγ链;Fc受体γ链;fc-εRI-γ;fcRγ;fceRIγ;高亲和性免疫球蛋白ε受体子单元γ;免疫球蛋白E受体、高亲和性γ链等)。举例而言,合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段或与以下氨基酸序列的约50个氨基酸至约60个氨基酸(aa)、约60aa至约70aa、约70aa至约80aa或约80aa至约88aa的一连续段具有至少50%、60%、70%、75%、
80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域:MIPAVVLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQVRKAAITSYEKSDGV[YTGLSTRNQETYETL]KHEKPPQ(SEQ 
ID NO:32),其中用括号将ITAM基元括起来。
[0213] 同样,合适的胞内活化域多肽可包含全长FCER1G氨基酸序列的含有ITAM基元的部分。因此,合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或
100%序列一致性的域:DGV[YTGLSTRNQETYETL]KHE(SEQ ID NO:33),其中用括号将ITAM基
元括起来。
[0214] 适用于本发明的工程化信号传导多肽中的胞内活化域包括DAP10/CD28型信号传导链。DAP10信号传导链的一实例为氨基酸SEQ ID NO:34。在一些实施例中,合适的胞内活化域可包括与SEQ ID NO:34中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50%、
60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。
[0215] CD28信号传导链的一实例为氨基酸SEQ ID NO:35。在一些实施例中,合适的胞内活化域可包括与SEQ ID NO:35中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少
50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。
[0216] 适用于本发明的工程化信号传导多肽中的胞内活化域包括ZAP70多肽,例如,合适的胞内活化域可包括与SEQ ID NO:36中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段或与
以下氨基酸序列的约300个氨基酸至约400个氨基酸、约400个氨基酸至约500个氨基酸或约
500个氨基酸至约619个氨基酸的一连续段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、
90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。
[0217] 调节域
[0218] 调节域可改变工程化信号传导多肽中的胞内活化域的作用,包括增强或抑制活化域的下游作用或改变反应的性质。适用于本发明的工程化信号传导多肽中的调节域包括共
刺激域。适合于工程化信号传导多肽中的包涵体的调节域的长度可为约30个氨基酸至约70
个氨基酸(aa),例如,调节域的长度可为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约
45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa或约65aa至约
70aa。在其他情况下,调节域的长度可为约70aa至约100aa、约100aa至约200aa,或大于
200aa。
[0219] 共刺激域通常增强和/或改变活化域的反应的性质。适用于本发明的工程化信号传导多肽中的共刺激域通常为衍生自受体的多肽。在一些实施例中,共刺激域同源二聚。个体共刺激域可为跨膜蛋白质的胞内部分(亦即,共刺激域可衍生自跨膜蛋白质)。合适的共
刺激多肽的非限制性实施例包括(但不限于)4-lBB(CD137)、CD27、CD28、用于Lck结合(IC
Δ)缺失的CD28、ICOS、OX40、BTLA、CD27、CD30、GITR及HVEM。举例而言,本发明的方面的共刺激域可与4-lBB(CD137)、CD27、CD28、用于Lck结合(ICΔ)缺失的CD28、ICOS、OX40、BTLA、CD27、CD30、GITR或HVEM的共刺激域具有至少80%、90%或95%序列一致性。举例而言,本发明的方面的共刺激域可与合适的共刺激多肽的非限制性实施例的共刺激域具有至少80%、
90%或95%序列一致性,这些实例包括(但不限于)4-lBB(CD137)、CD27、CD28、用于Lck结合(ICΔ)缺失的CD28、ICOS、OX40、BTLA、CD27、CD30、GITR及HVEM。举例而言,本发明的方面的共刺激域可与4-lBB(CD137)、CD27、CD28、用于Lck结合(ICΔ)缺失的CD28、ICOS、OX40、BTLA、CD27、CD30、GITR或HVEM的共刺激域具有至少80%、90%或95%序列一致性。
[0220] 适合于工程化信号传导多肽中的包涵体的共刺激域的长度可为约30个氨基酸至约70个氨基酸(aa),例如,共刺激域的长度可为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa或约65aa至约70aa。在其他情况下,共刺激域的长度可为约70aa至约100aa、约100aa至约200aa,或大于200aa。
[0221] 在一些情况下,共刺激域衍生自跨膜蛋白质CD137(也称为TNFRSF9;CD137;4-lBB;CDwl37;ILA等)的胞内部分。举例而言,合适的共刺激域可包括与SEQ ID NO:1中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、
95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。在这些实施例中的一些中,共刺激域的长度为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa或约65aa至约70aa。
[0222] 在一些情况下,共刺激域衍生自跨膜蛋白质CD28(也称为Tp44)的胞内部分。举例而言,合适的共刺激域可包括与SEQ ID NO:2中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。在这些实施例中的一些中,共刺激域的长度为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约
65aa或约65aa至约70aa。
[0223] 在一些情况下,共刺激域衍生自为用于Lck结合(ICΔ)所缺失的跨膜蛋白质CD28的胞内部分。举例而言,合适的共刺激域可包括与SEQ ID NO:3中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、
98%、99%或100%序列一致性的域。在这些实施例中的一些中,共刺激域的长度为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa或约65aa至约70aa。
[0224] 在一些情况下,共刺激域衍生自跨膜蛋白质ICOS(也称为AILIM、CD278及CVIDl)的胞内部分。举例而言,合适的共刺激域可包括与SEQ ID NO:4中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、
99%或100%序列一致性的域。在这些实施例中的一些中,共刺激域的长度为约30aa至约
35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约
60aa、约60aa至约65aa或约65aa至约70aa。
[0225] 在一些情况下,共刺激域衍生自跨膜蛋白质OX40(也称为TNFRSF4、RP5-902P8.3、ACT35、CD134、OX-40、TXGPlL)的胞内部分。举例而言,合适的共刺激域可包括与SEQ ID NO:
5中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、
85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。在这些实施例中的一些中,共刺激域的长度为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约
50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa或约65aa至约70aa。
[0226] 在一些情况下,共刺激域衍生自跨膜蛋白质CD27(也称为S152、T 14、TNFRSF7及Tp55)的细胞内部分。举例而言,合适的共刺激域可包括与SEQ ID NO:6中的至少10个、15
个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、
96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。在这些实施例中的一些中,共刺激域的长度为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa。
[0227] 在一些情况下,共刺激域衍生自跨膜蛋白质BTLA(也称为BTLAl及CD272)的胞内部分。举例而言,合适的共刺激域可包括与SEQ ID NO:7中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或
100%序列一致性的域。
[0228] 在一些情况下,共刺激域衍生自跨膜蛋白质CD30(也称为TNFRSF8、DlS166E及Ki-1)的胞内部分。举例而言,合适的共刺激域可包括与SEQ ID NO:8中的约100个氨基酸至约
110个氨基酸(aa)、约110aa至约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa、约150aa至约160aa或约160aa至约185aa的一段具有至少
50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。
[0229] 在一些情况下,共刺激域衍生自跨膜蛋白质GITR(也称为TNFRSF18、RP5-902P8.2、AITR、CD357及GITR-D)的胞内部分。举例而言,合适的共刺激域可包括与SEQ ID NO:9中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。在这些实施例中的一些中,共刺激域的长度为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约
50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa或约65aa至约70aa。
[0230] 在一些情况下,共刺激域衍生自跨膜蛋白质HVEM(也称为TNFRSF14、RP3-395M20.6、ATAR、 CD270、HVEA、HVEM、LIGHTR及TR2)的胞内部分。举例而言,合适的共刺激域可包括与SEQ ID NO:10中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50%、
60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的域。
在这些实施例中的一些中,第一多肽及第二多肽的共刺激域的长度为约30aa至约35aa、约
35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约
60aa至约65aa或约65aa至约70aa。
[0231] 接头
[0232] 在一些情况下,工程化信号传导多肽包括在任何两个相邻域之间的接头。举例而言,接头可在跨膜域与第一刺激域之间。作为另一实例,ASTR可为抗体,且接头可在重链与轻链之间。作为另一实例,接头可在ASTR与跨膜域及共刺激域之间。作为另一实例,接头可在第二多肽的共刺激域与胞内活化域之间。作为另一实例,接头可在ASTR与胞内信号传导
域之间。
[0233] 接头肽可具有多种氨基酸序列中的任一者。蛋白质可通过通常具有柔性性质之间隔肽连接,但不排除其他化学键。接头可为长度在约1个与约100个氨基酸之间,或长度在约
1个与约25个氨基酸之间的肽。这些接头可通过使用合成的编码接头的寡核苷酸偶合这些
蛋白质来产生。可使用具有一定程度柔性的肽接头。连接肽可实际上具有任何氨基酸序列,考虑到合适的接头将具有产生通常柔性肽的序列。较小氨基酸(诸如甘氨酸及丙氨酸)的用
途为用于创建柔性肽。此类序列的创建对于熟悉此项技术人员而言为常规的。
[0234] 合适的接头可易于选择且可为合适的不同长度中的任一者,诸如1个氨基酸(例如Gly)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸,包括4个氨基酸至
10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸、或7个氨基酸至8个氨基酸,且可为1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个氨基酸。
[0235] 例示性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、GSGGSn、GGGSn及GGGGSn,其中n为至少一的整数),甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物,及此项技术中已知的其他柔性接头。甘氨酸及甘氨酸-丝氨酸聚合物引人感兴趣,这是由于这些氨基酸的两者均为相对非结构化的,且因此可作为组分之间的中性链。甘氨酸
聚合物尤其令人感兴趣,这是由于甘氨酸比甚至丙氨酸具有显著更多的phi-psi空间,且比具有较长侧链的残基受到更少限制(参见Scheraga,Rev.Computational Chem.11173-142
(1992))。例示性柔性接头包括(但不限于)GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ  ID  NO:53)、
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:54)、GGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)、
GGSG(SEQ ID NO:56)、GGSGG(SEQ ID NO:57)、GSGSG(SEQ IDNO:58)、GSGGG(SEQ ID NO:
59)、GGGSG(SEQ ID NO:60)、GSSSG(SEQ ID NO:61),以及类似者。一般熟练技术人员将认识到,将肽结合至上文所描述的任何组件的设计可包括为完全或部分柔性的接头,使得接头
可包括柔性接头以及赋予较低柔性结构的一个或多个部分。
[0236] 组合
[0237] 在一些实施例中,通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒提供的多核苷酸具有编码一种或多种工程化信号传导多肽的某些组合的一个或多个转录单元。在本文所提供的一些
方法及组合物中,在通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转录T细胞之后,经基因方式修饰的T细胞包括一种或多种工程化信号传导多肽的组合。将理解,称为“第一多肽”、“第二多肽”、“第三多肽”等是出于方便性,且“第一多肽”上的组件及“第二多肽”上的组件表示这些组件在不同多肽上,这些多肽称为第一或第二以通常在特异性多肽的其他组件或步骤中仅
供参考及为了方便性。
[0238] 在一些实施例中,第一工程化信号传导多肽包括能够结合抗原的胞外抗原结合域,及胞内信号传导域。在其他实施例中,第一工程化信号传导多肽还包括T细胞存活基元和/或跨膜域。在一些实施例中,第一工程化信号传导多肽不包括共刺激域,而在其他实施例中,第一工程化信号传导多肽的确包括共刺激域。
[0239] 在一些实施例中,第二工程化信号传导多肽包括淋巴增生性基因产物及视情况的胞外抗原结合域。在一些实施例中,第二工程化信号传导多肽还包括以下中的一者或多者:
T细胞存活基元、胞内信号传导域,及一个或多个共刺激域。在其他实施例中,当使用两种工程化信号传导多肽时,至少一者为CAR。
[0240] 在一个实施例中,一种或多种工程化信号传导多肽在相同转录物下在T细胞特异性启动子或一般启动子下表达,其中在该转录物中,编码工程化信号传导多肽的核酸由编
码一种或多种内部核糖体进入位点(IRE)或一种或多种蛋白酶裂解肽的核酸分隔开。
[0241] 在某些实施例中,多核苷酸编码两种工程化信号传导多肽,其中第一工程化信号传导多肽包括能够结合第一抗原的第一胞外抗原结合域,及第一胞内信号传导域而非共刺
激域,且第二工程化信号传导多肽包括能够结合VEGF的第二胞外抗原结合域,及第二胞内
信号传导域,诸如共刺激分子的信号传导域。在某一实施例中,第一抗原为PSCA、PSMA或
BCMA。在某一实施例中,第一胞外抗原结合域包含抗体或其片段(例如scFv),例如对PSCA、PSMA或BCMA具有特异性的抗体或其片段。在某一实施例中,结合VEGF的第二胞外抗原结合
域为VEGF的受体,亦即VEGFR。在某些实施例中,VEGFR为VEGFR1、VEGFR2或VEGFR3。在某一实施例中,VEGFR为VEGFR2。
[0242] 在某些实施例中,多核苷酸编码两种工程化信号传导多肽,其中第一工程化信号传导多肽包括胞外肿瘤抗原结合域及CD3ζ信号传导域,且第二工程化信号传导多肽包括抗原结合域(其中该抗原为血管生成或血管原性因子),及一个或多个共刺激分子信号传导
域。血管生成因子可为例如VEGF。一个或多个共刺激分子信号传导基元可包含例如来自
CD27、CD28、OX40、ICOS及4-1BB中的每一者的共刺激信号传导域。
[0243] 在某些实施例中,多核苷酸编码两种工程化信号传导多肽,其中第一工程化信号传导多肽包括胞外肿瘤抗原结合域及CD3ζ信号传导域,第二多肽包含能够结合VEGF的抗原结合域的抗原结合域,及来自CD27、CD28、OX40、ICOS及4-1BB中的每一者的共刺激信号传导域。在另一实施例中,第一信号传导多肽或第二信号传导多肽还具有T细胞存活基元。在一些实施例中,T细胞存活基元为IL-7受体(IL-7R)的胞内信号传导域、IL-12受体的胞内信号传导域、IL-15受体的胞内信号传导域、IL-21受体的胞内信号传导域,或转变生长因子β
(TGFβ)受体或TGFβ诱饵受体(TGF-β——显性-负型受体II(DNRII))的胞内信号传导域或衍生自其等。
[0244] 在某些实施例中,多核苷酸编码两种工程化信号传导多肽,其中第一工程化信号传导多肽包括胞外肿瘤抗原结合域及CD3ζ信号传导域,且第二工程化信号传导多肽包含能够结合VEGF的抗原结合域、IL-7受体胞内T细胞存活基元、及来自CD27、CD28、OX40、ICOS及
4-1BB中的每一者的共刺激信号传导域。
[0245] 在一些实施例中,由多核苷酸编码超过两种信号传导多肽。在某些实施例中,仅工程化信号传导多肽中的一者包括结合至肿瘤相关的抗原或肿瘤特异性抗原的抗原结合域;这些工程化信号传导多肽中的剩余者的每一者包含结合至非肿瘤相关的抗原或非肿瘤特
异性抗原的抗原结合域。在其他实施例中,工程化信号传导多肽中的两者或更多者包括结
合至一种或多种肿瘤相关的抗原或肿瘤特异性抗原的抗原结合域,其中这些工程化信号传
导多肽中的至少一者包含未结合至肿瘤相关的抗原或肿瘤特异性抗原的抗原结合域。
[0246] 在一些实施例中,肿瘤相关的抗原或肿瘤特异性抗原为Her2、前列腺干细胞抗原(PSCA)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、B细胞成熟抗原(BCMA)α-胎蛋白(AFP)、癌胚抗原
(CEA)、癌症抗原-125(CA-125)、CA19-9、视网膜蛋白、MUC-1、上皮膜蛋白(EMA)、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑素瘤相关的抗原(MAGE)、CD34、CD45、CD99、CD117、嗜铬粒蛋白、细胞蛋白、结蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、大囊性疾病流体蛋白(GCDFP-15)、HMB-45抗原、蛋白黑色素A(T淋巴细胞识别的黑素瘤抗原;MART-1)、肌凝蛋白-D1、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经纤毛、神经元特异性烯醇酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶、突触泡蛋白、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、丙酮酸激酶同工酶M2型(肿瘤M2-PK)、CD19、CD22、CD27、CD30、CD70、GD2(神经节苷脂G2)、EphA2、CSPG4、CD138、FAP(纤维母细胞活化蛋白)、CD171、κ整合素、λ整合素、5T4整合素、αvβ6整合素、整合素αvβ3(CD61)、泌乳激素K-Ras(V-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因)、Ral-B、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD20、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、EGFR、EGP2、EGP40、EpCAM、胚胎AchR、FRα、GD3、HLA-A1+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、IL-
11Rα、IL-13Rα2、刘易斯-Y(Lewis-Y)、Muc16、NCAM、NKG2D配位体、NY-ESO-1、PRAME、ROR1、存活素、TAG72、TEMs、VEGFR2、EGFRvIII(表皮生长因子变体III、精子蛋白17(Sp17)、间皮素、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、前列腺卵白、TARP(T细胞受体γ替代读取框蛋白)、Trp-p8、
STEAP1(前列腺1的六跨膜上皮抗原)、异常鼠蛋白或异常p53蛋白。
[0247] 在一些实施例中,第一工程化信号传导多肽包括结合第一抗原的第一胞外抗原结合域,及第一胞内信号传导域;且第二工程化信号传导多肽包括结合第二抗原或结合第二
抗原的受体的第二胞外抗原结合域,及第二胞内信号传导域,其中该第二工程化信号传导
多肽不包含共刺激域。在某一实施例中,第一抗原结合域及第二抗原结合域独立地为受体
的抗原结合部分或抗体的抗原结合部分。在某一实施例中,第二抗原结合域或第二抗原结
合域中的一者或两者为scFv抗体片段。在某些实施例中,第一工程化信号传导多肽和/或第二工程化信号传导多肽额外包含跨膜域。在某一实施例中,第一工程化信号传导多肽或第
二工程化信号传导多肽包含T细胞存活基元,例如本文所描述的T细胞存活基元中的任一
者。
[0248] 在另一实施例中,第一工程化信号传导多肽包括结合HER2的第一胞外抗原结合域,且第二工程化信号传导多肽包括结合MUC-1的第二胞外抗原结合域。
[0249] 在另一实施例中,第二工程化信号传导多肽的第二胞外抗原结合域结合白细胞介素。
[0250] 在另一实施例中,第二工程化信号传导多肽的第二胞外抗原结合域结合损伤相关的分子模式分子(DAMP;也称为警报素(alarmin))。在另一实施例中,DAMP为热休克蛋白质、染色质相关的蛋白质高迁移率组盒1(HMGB1)、S100A8(也称为MRP8或钙粒蛋白A)、S100A9
(也称为MRP14或钙粒蛋白B)、血清淀粉样蛋白A(SAA)、脱氧核糖核酸、三磷酸腺苷、尿酸或硫酸肝素
[0251] 在某些实施例中,该第二抗原为抗体上的抗原,该抗体结合由肿瘤细胞呈递的抗原。
[0252] 在一些实施例中,经由第二工程化信号传导多肽的信号转导活化为非抗原性的,但与低氧有关。在某些实施例中,低氧是通过低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、HIF-1β、HIF-2α、HIF-2β、HIF-3α或HIF-3β的活化诱导的。
[0253] 在一些实施例中,一种或多种工程化信号传导多肽的表达是由在本文中更详细地公开的控制组件调节的。
[0254] 额外序列
[0255] 工程化信号传导多肽(诸如CAR)可进一步包括一种或多种额外多肽域,其中此类域包括(但不限于)信号序列、抗原决定基标记、亲和域,及可例如通过抗体分析法或由于其为产生可检测信号的多肽而检测(可检测标记)其存在或活性的多肽。对于本文所提供的方
面或实施例中的任一者的额外域的非限制性实施例包括与如下文所描述的以下序列中的
任一者具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或
100%序列一致性的域:信号序列、抗原决定基标记、亲和域或产生可检测信号的多肽。
[0256] 适用于个体CAR(例如个体CAR的第一多肽)中的信号序列包括任何真核信号序列,其包括天然存在的信号序列、合成的(例如,人造的)信号序列等。在一些实施例中,举例而言,信号序列可为CD8信号序列MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:74)。
[0257] 合适的抗原决定基标记包括(但不限于)凝血素(HA;例如YPYDVPDYA;SEQ ID NO:37)、FLAG(例如DYKDDDDK;SEQ ID NO:38)、c-myc(例如EQKLISEEDL;SEQ ID NO:39)以及类似者。
[0258] 亲和域包括可与结合搭配物(例如在固体载体上固定的一者)相互作用的适用于识别或纯化的肽序列。编码多个连续的单一氨基酸(例如组氨酸)的DNA序列当与所表达蛋
白质融合时,可用于通过高亲和力结合至树脂柱(诸如琼脂糖凝胶)的重组蛋白质的一步纯
化。例示性亲和域包括His5(HHHHH;SEQ ID NO:40)、HisX6(HHHHHH;SEQ ID NO:41)、c-myc(EQKLISEEDL;SEQ ID NO:39)、Flag(DYKDDDDK;SEQ ID NO:38)、Strep标记(WSHPQFEK;SEQ ID NO:42)、凝血素(例如,HA标记(YPYDVPDYA;SEQ ID NO:37))、GST、硫氧还蛋白、纤维素结合域、RYIRS(SEQ ID NO:43)、Phe-His-His-Thr(SEQ ID NO:44)、甲壳素结合域、S肽、T7肽、SH2域、C端RNA标记、WEAAAREACCRECCARA(SEQ ID NO:45)、金属结合域,例如锌结合域或钙结合域,诸如来自钙结合蛋白质的那些例如钙调蛋白、肌钙蛋白C、钙调神经磷酸酶B、肌球蛋白轻链、恢复蛋白、S调节素、视锥蛋白、VILIP、神经钙蛋白、海马钙结合蛋白、聚集蛋白、钙牵蛋白(caltractin)、钙蛋白酶大亚基、S100蛋白,小白蛋白、钙结合蛋白D9K、钙结合蛋白D28K及钙视蛋白、内含肽、生物素、链霉亲和素、MyoD、Id、亮氨酸拉链序列以及麦芽糖结合蛋白。
[0259] 合适的可检测信号产生蛋白质包括例如荧光蛋白质、催化产生可检测信号作为产物的反应的酶,以及类似者。
[0260] 合适的荧光蛋白质包括(但不限于)绿色荧光蛋白质(GFP)或其变体、GFP的蓝色荧光变体(BFP)、GFP的青色荧光变体(CFP)、GFP的黄色荧光变体(YFP)、增强型GFP(EGFP)、增强型CFP(ECFP)、增强型YFP(EYFP)、GFPS65T、Emerald、Topaz(TYFP)、Venus、Citrine、mCitrine、GFPuv、不稳定的EGFP(dEGFP)、不稳定的ECFP(dECFP)、不稳定的EYFP(dEYFP)、mCFPm、Cerulean、T-Sapphire、CyPet,Ypet、mKO、HcRed、t-HcRed、DsRed、DsRed2、DsRed-单体、J-Red、二聚体2、t-二聚体2(12)、mRFP1、珊瑚、Renilla GFP、Monster GFP、paGFP、Kaede蛋白质及点燃蛋白质、藻胆蛋白及藻胆蛋白偶联物,包括B-藻红蛋白、R-藻红蛋白及别藻蓝蛋白。荧光蛋白质的其他实例包括mHoneydew、mBanana、mOrange、dTomato、tdTomato、
mTangerine、mStrawberry、mCherry、mGrapel、mRaspberry、mGrape2、mPlum(Shaner等人(2005)Nat.Methods 2:905-909),以及类似者。适宜使用来自Anthozoan物种的多种荧光及有色蛋白质中的任一者,如例如Matz等人(1999)Nature Biotechnol.17:969-973中所描
述。
[0261] 合适的酶包括(但不限于)辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶(GAL)、葡萄糖-6-磷酸去氢酶、β-N-乙酰胺基葡糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、转化酶、黄嘌呤氧化酶、萤火虫荧光素酶、葡萄糖氧化酶(GO),以及类似者。
[0262] 识别域和/或消除域
[0263] 本文所提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的任一者可包括编码识别域或消除域的核酸,该识别域或消除域作为编码本文所提供的工程化信号传导多肽中的任一者
的核酸的部分或与其隔开。因此,本文所提供的工程化信号传导多肽中的任一者可包括识
别域或消除域。举例而言,本文所公开的CAR中的任一者可包括识别域或消除域。此外,识别域或消除域可与本文所公开的淋巴增生性组件中的任一者一起表达,或甚至与其融合。识
别域或消除域在T细胞和/或NK细胞上表达,但不在复制缺陷型重组反转录病毒颗粒上表
达。
[0264] 在一些实施例中,识别域或消除域可来源于单纯疱疹病毒衍生的酶胸苷激酶(HSV-tk)或诱导型半胱天冬酶9。在一些实施例中,识别域或消除域可包括经修饰之内源细胞表面分子,例如如美国专利8,802,374中所公开。经修饰之内源细胞表面分子可为任何细胞表面相关的受体、配位体、糖蛋白、细胞黏着分子、抗原、整合素或经修饰的分化簇(CD)。
在一些实施例中,经修饰之内源细胞表面分子为经截短的酪氨酸激酶受体。在一个方面中,经截短酪氨酸激酶受体为表皮生长因子受体(EGFR)家族中的成员,例如ErbB1、ErbB2、
ErbB3、ErbB4。在一些实施例中,识别域可为由抗体识别的多肽,该抗体识别EGFR成员的胞外域。在一些实施例中,识别域可为EGFR家族成员的至少20个连续氨基酸,或在例如EGFR家族成员的20个与50个连续氨基酸之间。举例而言,SEQ ID NO:78为由识别EGFR成员的胞外
域的抗体结合且在适当条件下识别的例示性多肽。此类胞外EGFR抗原决定基有时在本文中
称为eTag。在说明性实施例中,此类抗原决定基由可市购抗EGFR单克隆抗体识别。
[0265] 也称为EGFR、ErbB1及HER1的表皮生长因子受体为胞外配位体的表皮生长因子家族的成员的细胞表面受体。EGFR活性的改变已涉及某些癌症。在一些实施例中,编码包括人类表皮生长因子受体(EGFR)的EGFR多肽的基因是由移除编码包括膜远程EGF结合域及细胞
质信号传导尾的多肽但保留由抗EGFR抗体识别的胞外膜近端抗原决定基的核酸序列来构
筑的。较佳地,抗体为已知可市购的抗EGFR单克隆抗体,诸如西妥昔单抗(cetuximab)、马妥珠单抗(matuzumab)、尼西珠单抗(necitumumab)或帕尼单抗(panitumumab)。
[0266] 其他已显示,生物素标记的西妥昔单抗结合抗生物素微珠应用于免疫磁选择成功地丰富T细胞,该T细胞已用含有EGFRt的构建体自低至2%的群体慢病毒转导至大于90%的
纯度,而对细胞制剂无可观测毒性。此外,其他已显示,此惰性EGFR分子的组成性表达不影响T细胞表型或如由协调表达的嵌合抗原受体(CAR),CD19R引导的效应功能。此外,其他已显示,经由流式细胞术分析,EGFR成功地用作小鼠中的T细胞移植的体内的追踪标记物。此外,已通过 介导的抗体依赖型细胞毒性(ADCC)路径论证EGFR具有自杀基因潜力。本
发明的发明者已使用慢病毒载体在PBMC中成功地表达eTag,且已发现暴露于西妥昔单抗的
PBMC在活体外表达eTag,提供一种PBMC的有效的消除机制。因此,EGFR可用作具有免疫治疗潜力的转导性T细胞的非免疫基因选择工具、追踪标记物及自杀基因。EGFR核酸也可通过此项技术中熟知的方法来检测。
[0267] 在本文所提供的一些实施例中,EGFR表达为还包括CAR的单一多肽的部分或表达为包括淋巴增生性组件的单一多肽的部分。在一些实施例中,可通过裂解信号和/或核糖体跳跃序列将编码EGFR识别域的氨基酸与编码嵌合抗原受体的氨基酸隔开。核糖体跳跃和/
或裂解信号可为此项技术中已知的任何核糖体跳跃和/或裂解信号。不受理论限制,核糖体跳跃序列可为例如具有氨基酸序列GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:77)的T2A(也称为
2A-1)。不受理论限制,裂解信号及核糖体跳跃序列的其他实例包括FMDV2A(F2A)、马A型鼻病毒2A(简称E2A)、猪捷申病毒1 2A(P2A)及扁刺蛾属(Thoseaasigna)病毒2A(T2A)。在一些实施例中,编码识别域的多核苷酸序列可与CAR或淋巴增生性组件在相同的转录物上,但通过内部核糖体进入位点与编码CAR或淋巴增生性组件的多核苷酸序列隔开。
[0268] 在如本文中例示性列举的其他实施例中,识别域可表达为与淋巴增生性组件融合的融合多肽的部分。此类构建体与单独的多肽相比提供,尤其结合本文中提供的其他“空间节省”组件,在RNA基因组上占用更少的基因组空间的优势。在一个说明性实施例中,eTag表达为与IL7Rα突变体融合的融合多肽,如在本文中实验地论证。
[0269] 嵌合抗原受体
[0270] 在本发明的一些方面中,工程化信号传导多肽为嵌合抗原受体(CAR)或编码CAR的多核苷酸,为简单起见,其在本文称为“CAR”。本发明的CAR包括:a)至少一个抗原特异性靶向区(ASTR);b)跨膜域;及c)胞内活化域。在说明性实施例中,CAR的抗原特异性靶向区为抗体针对靶标抗原的scFv部分。在说明性实施例中,胞内活化域来自CD3z。
[0271] 本发明的CAR可存在于真核细胞(例如,哺乳动物细胞)的质膜中,其中合适的哺乳动物细胞包括(但不限于)细胞毒性细胞、T淋巴细胞、干细胞、干细胞的子代、祖细胞、祖细胞的子代及NK细胞、NK-T细胞及巨噬细胞。当存在于真核细胞的质膜中使,本发明的CAR在存在一个或多个靶标抗原(在某些条件下,结合ASTR)下经活化。靶标抗原为特异性结合对
的第二成员。特异性结合对的靶标抗原可为可溶性(例如,未结合至细胞)因子;存在于诸如靶标细胞等细胞的表面上的因子;存在于实体表面上的因子;存在于脂质双层上的因子;以及类似者。当ASTR为抗体,且特异性结合对的第二成员为抗原时,抗原可为可溶性(例如,未结合至细胞)抗原;存在于诸如靶标细胞等细胞的表面上的抗原;存在于实体表面上的抗
原;存在于脂质双层上的抗原;以及类似者。
[0272] 在一些情况下,本发明的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种靶标抗原活化时,使细胞中的至少一个核酸的表达增加。举例而言,在一些情况下,本发明的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种靶标抗原活化时,与在不存在一种或多种靶
标抗原下的核酸的转录水平相比,使细胞中的至少一个核酸的表达增加至少约10%、至少
约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约75%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍,或大于10倍。
[0273] 作为一实例,本发明的CAR可包括含有基于免疫受体酪氨酸的活化基元(ITAM)的胞内信号传导多肽。
[0274] 在一些情况下,本发明的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种靶标抗原活化时,可使得细胞产生一种或多种细胞因子增加。举例而言,本发明的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种靶标抗原活化时,与在不存在一种或多种靶标抗原下
细胞所产生的细胞因子量相比,可使得细胞产生细胞因子增加至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约75%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍,或大于10倍。其产量可增加的细胞因子包括(但不限于)干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-a)、IL-2、IL-15、IL-12、IL-4、IL-5、IL-10;趋化因子;生长因子;以及类似者。
[0275] 在一些情况下,本发明的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种靶标抗原活化时,可导致细胞中的核酸的转录增加及细胞产生细胞因子增加两者。
[0276] 在一些情况下,本发明的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种靶标抗原活化时,产生细胞朝向靶标细胞的细胞毒性活性,该靶标细胞在其细胞表面上表达抗
原,该抗原与CAR的第一多肽的抗原结合域结合。举例而言,当真核细胞为细胞毒性细胞(例如,NK细胞或细胞毒性T淋巴细胞)时,本发明的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种靶标抗原活化时,使细胞朝向靶标细胞的细胞毒性活性增加,该靶标细胞在其细胞
表面上表达一种或多种靶标抗原。举例而言,当真核细胞为NK细胞或T淋巴细胞时,本发明的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种靶标抗原活化时,与在不存在一种或
多种靶标抗原下的细胞的细胞毒性活性相比,使得细胞的细胞毒性活性增加至少约10%、
至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约75%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍,或大于10倍。
[0277] 在一些情况下,本发明的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种靶标抗原活化时,可产生与其他CAR活化相关的事件,诸如增生及扩增(由于细胞分裂或抗凋亡
反应增强)。
[0278] 在一些情况下,本发明的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种靶标抗原活化时,可产生与其他CAR活化相关的事件,诸如胞内信号传导调节、胞分化或细胞死亡。
[0279] 在一些情况下,本发明的CAR受微环境限制。此特性通常为CAR的ASTR域的受微环境限制性质的结果。因此,本发明的CAR可具有较低结合亲和力或,在说明性实施例中,在微环境的条件下比在正常生理环境的条件下可具有针对一种或多种靶标抗原的更高结合亲
和力。
[0280] 淋巴增生性组件
[0281] 尽管细胞连续增加,但周边T淋巴细胞数在整个成年期间维持非常稳定的水平,这是由于自胸腺移出及响应于抗原遭遇(antigen encounter)的增生,及由于在抗原清除之
后去除抗原特异性效应的细胞的损耗(Marrak,P.等人.2000.Nat Immunol 1:107-111;
Freitas,A.A.等人.2000.Annu Rev Immunol 18:83-111)。周边T细胞区室的尺寸由影响增
生及存活两者的多个因素来调节。然而,在淋巴细胞减少的环境下,T淋巴细胞独立于同源抗原分裂,这是由于维持周边T细胞区室的尺寸的“急性恒定增生”机制。已通过活体内增生T细胞且将其等引入至淋巴消耗的个体中而在过继细胞疗法期间的个体或患者中建立淋巴
细胞减少症的条件,从而导致经转移T细胞的植入及抗肿瘤功能增强。然而,个体的淋巴消耗是不希望的,这是由于其可引起严重的副作用,包括免疫紊乱及死亡。
[0282] 研究已显示,淋巴消耗移除作为稳定细胞因子的细胞槽之内源性淋巴细胞,从而释放细胞因子以诱导过继转移的细胞的存活及增生。已知一些诸如IL-7及IL-15的细胞因
子介导T细胞的抗原非依赖性增生且因此能够在非淋巴细胞减少的环境中诱发稳定增生。
然而,这些细胞因子及其受体具有在稳态下防止淋巴增生性疾病的固有控制机制。
[0283] 本文提供的许多方面包括淋巴增生性组件,或编码其的核酸,通常作为工程化信号传导多肽的部分。因此,在本发明的一些方面中,工程化信号传导多肽为淋巴增生性组
件,诸如嵌合淋巴增生性组件(CLE)。通常,CLE含有胞外域、跨膜域及驱动增生的至少一个胞内信号传导域。CLE不包含ASTR及活化域两者。在本文的说明性实施例中,通常通过用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或静息NK细胞而将一种或多种淋巴增生
性组件引入至静息T细胞和/或静息NK细胞中,这些反转录病毒颗粒的基因组编码作为工程
化信号传导多肽的部分的淋巴增生性组件。淋巴增生性组件可包括信号传导胞内域或可包
括多于一个胞内域。在某些说明性实施例中,淋巴增生性组件包括两个胞内域。本文提供及实施例17及实施例18所论述的表7至表23提供使用本文中的实验方法鉴别的具有一个胞内
域的CLE及具有两个胞内域的CLE,这些实验方法测试包括表6中所鉴别的胞外域及胞内域
的不同组合的候选嵌合多肽。
[0284] 在一些说明性实施例中,淋巴增生性组件可为或可包含细胞因子,或在另外的说明性实施例中,细胞因子受体,或包括其信号传导域的片段,其活化STAT3路径、STAT4路径,或甚至在另外的说明性实施例中,Jak/STAT5路径。由此,在非限制性实施例中,淋巴增生性组件可为细胞因子受体或包括其信号传导域的活性片段,诸如白细胞介素受体,或包括活
化STAT5的其信号传导域的活性片段。因此,淋巴增生性组件为促进增生且视情况存活(抗
凋亡)并视情况提供增强淋巴细胞的分化状态、增生潜能或对细胞死亡的抗性的共刺激信
号的多肽。在说明性实施例中,淋巴增生性组件为诱导T细胞和/或NK细胞的增生的多肽。说明性淋巴增生性组件通过活化STAT5诱导增生。因此,此淋巴增生性组件的片段在说明性实施例中保留通过活化STAT5诱导T细胞和/或NK细胞的增生的能力。
[0285] 在说明性实施例中,当存在于经基因方式修饰的PBMC、淋巴细胞或经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞中时,淋巴增生性组件能够促进淋巴细胞增生/扩增且在细胞至细
胞因子(诸如IL-15、IL-7,且在说明性实施例中,IL-2)及在培养6天、7天、14天、21天或35天期间通过细胞表达的CAR的ASTR的靶标的暴露的缺失下视情况离体或活体外存活于培养物
中。
[0286] 在本文所呈现的方法及组合物中的一些中,淋巴增生性组件用于促进经基因方式修饰的T细胞活体内的增生或扩增而不必使个体淋巴消耗。由此,可进行本文所提供的方法(包括通常通过转导此类T细胞和/或NK细胞而将淋巴增生性组件插入至个体的静息T细胞
和/或NK细胞中)的非限制性说明实施例,而不在进行该方法之前、期间和/或之后使个体淋巴消耗,或不在进行此方法之前自个体收集血液之前、期间和/或之后使个体淋巴消耗,或不离体以基因方式修饰来自个体的T细胞和/或NK细胞之前、期间和/或之后,和/或在将这
些经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞再引入至个体中之前、期间和/或之后使个体淋巴
消耗。促进T细胞活体内的增生的因子包括细胞因子及其受体,其中受体通常包括配位体结合域及信号传导域。在一些实施例中,用于本文所公开的方法及组合物中的淋巴增生性组
件为细胞因子和/或细胞因子受体。细胞因子可为白细胞介素,且细胞因子受体可为白细胞介素受体。淋巴增生性组件可为细胞因子的功能性片段和/或细胞因子受体的功能性片段
(诸如其信号传导域),其中该片段能够例如通过活化STAT5来促进T细胞的增生。
[0287] 在一些实例中,本文中的方法及组合物中的细胞因子淋巴增生性组件包括以下中的一者或多者:白细胞介素-7(IL-7)或其受体(IL-7R),或其信号传导域;白细胞介素-12
(IL-12)或其受体(IL-12R),或其信号传导域;白细胞介素-23(IL-23)或其由IL-12Rβ1及
IL-23R组成的受体,或其信号传导域;白细胞介素-27(IL-27)或其受体(IL-27R),或其信号传导域;白细胞介素-15(IL-15)或其受体(IL-15R),或其信号传导域;白细胞介素-21(IL-
21)或其受体(IL-21R),或其信号传导域;或转变生长因子β(TGFβ)或其受体(TGFβR)或其信号传导域;或TGFβ诱饵受体(TGF-β——显性-负型受体II(DNRII))。在一些实施例中,淋巴增生性组件为IL-12R或TGFβ诱饵受体(TGF-β-显性负型受体II(DNRII))。
[0288] IL-7结合至IL-7受体(一种由IL-7Rα及常见的γ链组成的杂二聚体)。结合产生对于胸腺内的T细胞发育及周边内的存活至关重要的信号级联。已知IL-7与IL-7受体的结合
使Jak/STAT5路径活化。
[0289] IL-12涉及原生T细胞分化成Th1细胞(Hsieh CS等人.1993.Science.260(5107):547-9)且称为T细胞刺激因子。IL-12结合至IL-12受体(其为由IL-12R-β1及IL-12R-β2形成的杂二聚体受体)。IL12可通过活化STAT4而起作用,但经显示同样活化T细胞中的STAT5
(Ahn,H.等人.1998.J.Immun.161:5893-5900)。IL-12家族由细胞因子IL-12、IL-23及IL-27组成。IL-23的受体由IL-12Rβ1及IL-23R组成。IL-27为由两种不同基因(Epstein-Barr病毒诱导的基因3(EBI3)及IL-27p28)组成的杂二聚体细胞因子。IL-27与IL-27受体相互作用。
[0290] IL-15为结构及功能上类似于IL-2的T细胞及NK细胞刺激因子。两种细胞因子均诱导T细胞的增生;且认为其共享功能是由使用IL-2/IL-15Rβ及常见γ链的两种受体产生的。
IL-15的信号传导路径通过与IL-15Rα受体结合,且随后向其细胞表面上带有IL-15Rβγc复合物的周围细胞呈递来开始。在结合IL-15β后,子单元即活化詹纳斯激酶1(Janus kinase 
1;Jak1)及γc子单元詹纳斯激酶3(Jak3),该γc子单元詹纳斯激酶3导致STAT3及STAT5的
酸化及活化。
[0291] IL-21在经活化的人类CD4+T细胞及NK T细胞中表达,且IL-21表达在T辅助细胞的Th2及Th17子集中经上调。IL-21受体(IL-21R)在T细胞、B细胞及NK细胞的表面上表达且在
结构上类似于如同IL-2R或IL-15的其他I型细胞因子的受体。IL-21R需要与常见γ链(γc)
二聚合以便结合IL-21。当结合至IL-21时,IL-21受体经由Jak/STAT路径起作用,从而活化STAT1、STAT3及STAT5。
[0292] TGFβ诱饵受体(TGF-β—显性-负型受体II(DNRII))通过与天然受体竞争TGFβ结合来阻断TGFβ信号传导。TGFβ-DNRII为激酶失活的截短形式的RII,其含有RII的胞外TGFβ结合域及跨膜域。TGFβ-DNRII结合配位体但并不使RI磷酸化及活化,此从而减少或消除Smad磷酸化。
[0293] 已在患有B细胞及T细胞急性淋巴母细胞白血病(B-ALL及T-ALL)的个体中鉴别出IL-7Rα的功能性增加的突变(Zenatti PP等人.2011.Nat Genet 43:932-939;Snochat,C.
等人.2011.J Exp Med 208:901-908;McElroy,C.A.等人.2012.PNAS 109(7):2503-2508)。
突变包括在IL-7RαTMD的N端区中的插入及缺失,其中几乎所有的序列均含有额外的Cys残
基,及S165至C165突变。半胱氨酸导致受体的组成性活化。所有T群组中的突变中的一些使JAK1活化。这些功能性增加的IL-7R突变体可在本文所提供的方面中的任一者中用作淋巴
增生性组件中的一者。
[0294] 因此,在一些实施例中,淋巴增生性组件为经突变的IL-7受体。在其他实施例中,经突变的IL-7受体为组成性活性的,从而在不存在细胞因子配位体的情况下使JAK-STAT5路径活化。在又其他实施例中,经突变的IL-7受体包含在237与254之间的位置处的1个至10个氨基酸插入,该插入包括半胱氨酸残基,该半胱氨酸残基包括组成性活化STAT5路径的能力。在一些实施例中,经突变的IL-7受体为IL-7Rα-insPPCL(由SEQ ID NO:82表示)。此外,在本文提供的一些嵌合淋巴增生性组件(CLE)实施例中,域中的一个或多个(但并非所有)
来自IL-7Rα-insPPCL。
[0295] 在一些实施例中,淋巴增生性组件为嵌合细胞因子受体,诸如但不限于连接至其受体的细胞因子,该受体通常组成性活化与对应经活化野生型细胞因子受体(诸如STAT3、
STAT4,以及在说明性实施例中,STAT5)相同的STAT路径。在一些实施例中,嵌合细胞因子受体为白细胞介素或其片段,该白细胞介素或其片段经由接头连接至或共价连接至其同源受
体。在一些实施例中,嵌合细胞因子受体为连接至IL-7Rα的IL-7。在其他实施例中,嵌合细胞因子受体为连接至IL-7Rα域的IL-7,诸如IL-7Rα的胞外域和/或IL-7Rα的跨膜域。在一些实施例中,淋巴增生性组件为未连接至细胞因子的细胞因子受体,且实际上在一些实施例
中,本文所提供的淋巴增生性组件为未连接至细胞因子的组成性活性的细胞因子受体。这
些嵌合IL-7受体在表达时通常组成性活化STAT5。
[0296] 在本文提供的包括淋巴增生性组件的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中,其中淋巴增生性组件为细胞因子或细胞因子受体多肽或其包含信号传导域的片段,淋
巴增生性组件可包含经由接头共价连接至其同源白细胞介素受体多肽的部分。通常,同源
白细胞介素受体的此部分包括能够结合白细胞介素细胞因子的胞外域及跨膜域的功能性
部分。在一些实施例中,胞内域为同源白细胞介素受体的胞内部分。在一些实施例中,胞内域为能够促进淋巴细胞增生的不同细胞因子受体的胞内部分。在一些实施例中,淋巴增生
性组件为经由接头共价连接至其全长同源白细胞介素受体多肽的白细胞介素多肽。
[0297] 在一些实施例中,淋巴增生性组件可包括细胞因子受体或包括其信号传导域的片段。在一些实施例中,细胞因子受体可为CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF2RB、CSF3R、EPOR、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、IFNLR1、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RG、IL2RB、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL6ST、IL7RA、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL12RB1、IL13RA2、IL15RA、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RE、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL20RB、IL21R、IL22RA1、IL23R、IL27R、IL31RA、LEPR、LIFR、MPL、OSMR、PRLR、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF14或TNFRSF18。在实施例17及实施例18中测试包括以上所列的细胞因子受体的功能
性胞内域的嵌合细胞因子受体的例示性实施例以确认包括这些功能性胞内域的嵌合细胞
因子受体可起淋巴增生性组件的作用。
[0298] 在某些说明性实施例中,淋巴增生性组件包含细胞因子受体或包括活化Jak/STAT5路径的信号传导域的其片段。举例而言,此淋巴增生性组件可包括IL21R、IL27R、
IL31RA、LIFR及OSMR的胞内域。如实施例17及实施例18的实验及表7至表17中所显示,在候选嵌合多肽中发现包括这些基因的胞内域的嵌合淋巴增生性组件,这些候选嵌合多肽在不
存在诸如IL-2的外源性细胞因子的情况下培养的PBMC中诱导最高程度的增生。
[0299] 在一些实施例中,淋巴增生性组件可包含为白细胞介素或白细胞介素受体且为在实施例17及18(表7至17)中的库1A、1.1A、2B、2.1B、3A、3.1A、3B、3.1B、4B和/或4.1B中识别的最优构建体的部分的胞内域。在一些实施例中,淋巴增生性组件可包含为细胞因子受体
且为在实施例17及18(表7至17)中的库1A、1.1A、2B、2.1B、3A、3.1A、3B、3.1B、4B和/或4.1B中识别的最优构建体的部分的胞内域。在一些实施例中,淋巴增生性组件可包含包括至少
一个ITAM基元且为在实施例17及18(表7至17)中的库1A、1.1A、2B、2.1B、3A、3.1A、3B、3.1B、
4B和/或4.1B中识别的最优构建体的部分的胞内域。
[0300] 在说明性实施例中,淋巴增生性组件可包含来自IL7R、IL12RB1、IL15RA或IL27RA的胞内域,其存在于如实施例17及18(表19至23)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤
其值得注意的富集(亦即,引起最高程度的增生)的构建体中。
[0301] 在说明性实施例中,淋巴增生性组件可包含来自以下细胞因子受体的胞内域:CD27、CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCER1G、FCGR2A、FCGR2C、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR2、IL1R1、IL1RL1、IL2RA、IL2RG、IL3RA、IL5RA、IL6R、IL7R、IL9R、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17RB、IL18R1、IL18RAP、IL20RB、IL22RA1、IL27RA、IL31RA、LEPR、MPL、OSMR、PRLR、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF14或TNFRSF18,其存在于如实施例17及18(表19至23)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤其值得注意的富集
(亦即,引起最高程度的增生)的构建体中。
[0302] 在说明性实施例中,淋巴增生性组件可包含来自CD3D、CD3E、CD3G、CD79A、CD79B、FCER1G、FCGR2A或FCGR2C的胞内域,其包括至少一个ITAM基元且存在于如实施例17及18(表19至23)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤其值得注意的富集(亦即,引起最高程度
的增生)的构建体中。
[0303] 在一些实施例中,此段落中的淋巴增生性组件(其在实施例17及18中显示在具有仅单一胞内域的构建体中具有活性)可为具有两个或更多个胞内域,或在说明性实施例中
具有单一胞内域(亦即,该淋巴增生性组件不包含两个或更多个胞内域)的淋巴增生性组件
的胞内域。在说明性实施例中,淋巴增生性组件中的胞内域包含来自以下的域:CD40、
CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCGR2A、IFNAR2、IFNGR2、IL1R1、IL3RA、IL7R、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL13RA2、IL18RAP、IL31RA、MPL、MYD88、TNFRSF14或TNFRSF18,其存在于如在作为单一胞内信号传导域的实施例18(表22及23)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤其
值得注意的富集(亦即,引起最高程度的增生)的构建体中。在说明性实施例中,淋巴增生性组件中的胞内域包含来自IL7R或IL12RB1的域,其存在于如实施例18(表22及23)中详述的
在初始筛选及重复筛选中显示尤其值得注意的富集(亦即,引起最高程度的增生)的构建体
中。在一些实施例中,具有单一胞内域的淋巴增生性组件中的胞内域可为细胞因子受体。在说明性实施例中,具有单一胞内域的淋巴增生性组件中的细胞因子受体包含来自以下的
域:CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCGR2A、IFNAR2、IFNGR2、IL1R1、IL3RA、IL7R、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL13RA2、IL18RAP、IL31RA、MPL、TNFRSF14或TNFRSF18,其存在于如实施例
18(表22及23)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤其值得注意的富集(亦即,引起最
高程度的增生)的构建体中。在一些实施例中,淋巴增生性组件中的胞内域可包括至少一个ITAM基元。在说明性实施例中,包括至少一个ITAM基元的淋巴增生性组件中的胞内域包含
来自FCGR2A的域,其存在于如实施例18(表22)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤其
值得注意的富集(亦即,引起最高程度的增生)的构建体中。
[0304] 在说明性实施例中,淋巴增生性组件可包含来自CD27、CD28、OX40(也称为TNFRSF4)、GITR(也称为TNFRSF18)或HVEM(也称为TNFRSF14)的共刺激域,其存在于如实施
例17及18(表19至23)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤其值得注意的富集(亦即,
引起最高程度的增生)的构建体中。
[0305] 在一些实施例中,淋巴增生性组件可为以下构建体中的一者:M024-S190-S047、M025-S050-S197、M036-S170-S047、M012-S045-S048、M049-S194-S064、M025-S190-S050、M025-S190-S05、E013-T041-S186-S051、E013-T028-S186-S051、E014-T015-S186-S051、
E011-T016-S186-S050、E011-T073-S186-S050或E013-T011-S186-S211,其全部如实施例21(图35及36)中所示在转导之后刺激静息淋巴细胞的增生。在某些实施例中,淋巴增生性组
件包含来自CSF3R、IL3RA、ICOS、CRLF、CSF2RA、LIFR或CD40的胞外域;来自MyD88、CD40或MPL的第一胞内域,和/或来自CD27或MyD88的第二胞内域。
[0306] 在一些实施例中,淋巴增生性组件可为构建体E013-T041-S186-S051,其如实施例22(图38A及图38B)中所显示及分析在用显示UCHT1scFvFc-GPI的复制缺陷型重组反转录病
毒颗粒之后刺激静息淋巴细胞的增生。在其他实施例中,淋巴增生性组件为IL7-IL7RA-
IL2RB,如实施例22中所示出且分析。
[0307] 如实施例17中详述,对于库1A及1.1A,具有来自细胞因子受体CD27、IL1RL1、IL6R、IL31RA、TNFRSF4或TNFRSF18的域的构建体在库1A及1.1A(表19)中皆显示尤其值得注意的富集(亦即,引起最高程度的增生)。
[0308] 如实施例17中详述,对于库2B及2.1B,具有来自细胞因子受体CD40、FCER1G、FCGR2C、IFNGR2、GHR、IL10RB、IL11RA、IL13RA2、IL17RB、IL22RA1、TNFRSF14或TNFRSF9的域的构建体在库2B及2.1B(表20)中皆显示尤其值得注意的富集(亦即,引起最高程度的增
生)。
[0309] 如实施例18中详述,对于库3A及3.1A,具有来自细胞因子受体CD27、CD40、CSF2RA、FCGR2A、MPL、OSMR、TNFRSF4或TNFRSF18的域的构建体在库3A及3.1A(表21)中皆显示尤其值得注意的富集(亦即,引起最高程度的增生)。
[0310] 如实施例18中详述,对于库3B及3.1B,具有来自细胞因子受体CD27、CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCER1G、FCGR2A、FCGR2C、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR2、IL1RL1、IL2RG、IL3RA、IL5RA、IL6R、IL7R、IL9R、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL18RAP、IL20RB、IL27RA、IL31RA、LEPR、MPL、OSMR、PRLR、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF14或TNFRSF18的域的构建体在库3B及3.1B(表22)中皆显示尤其值得注意的富集(亦即,引起最高程度的增生)。
[0311] 如实施例18中详述,对于库4B及4.1B,具有来自细胞因子受体CD27、CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCGR2A、FCGR2C、IFNAR2、IFNGR2、IL1R1、IL2RA、IL3RA、IL2RG、IL6R、IL7R、IL10RB、IL11RA、IL31RA、IL13RA1、IL13RA2、IL18R1、MPL、OSMR、TNFRSF4、TNFRSF9或TNFRSF18的域的构建体在库4B及4.1B(表23)中皆显示尤其值得注意的富集(亦即,引起最高程度的增生)。
[0312] 在某些说明性实施例中,淋巴增生性组件包含CD40、MPL及IL2Rb的胞内域,其在本文中的实施例中经证实以促进PBMC增生。
[0313] 在一些实施例中,淋巴增生性组件可不为细胞因子受体。在一些实施例中,除细胞因子受体以外的淋巴增生性组件可包括来自以下的胞内信号传导域:CD2、CD3D、CD3G、CD3Z、CD4、CD8RA、CD8RB、CD28、CD79A、CD79B、FCER1G、FCGR2A、FCGR2C或ICOS。在实施例17及实施例18及其中引用的表中提供包括这些所叙述基因的嵌合淋巴增生性组件的例示性实
施例。
[0314] 在一些实施例中,CLE不为连接至IL-2/IL-15受体的IL-15。
[0315] 在本文所公开的方法及组合物的一些中,淋巴增生性组件的表达是通过化合物与控制组件(如本文其他地方所论述)的结合来诱导且甚至可依赖于该结合,该控制组件在非
限制性实施例中为核糖开关。在一些实施例中,淋巴增生性组件由在T细胞和/或NK细胞中
具有活性的启动子表达。对于本文所提供的方法及组合物,熟练技术人员将认识到,启已知动子在T细胞和/或NK细胞中具有活性且可用于表达第一工程化信号传导多肽或第二工程
化信号传导多肽,或其任何组分。在说明性实施例中,此启动子在包装细胞系(诸如本文所公开的包装株)中为无活性的。在一些实施例中,启动子为EF1α启动子或鼠干细胞病毒
(MSCV)启动子(Jones等人,Human Gene Therapy(2009)20:630-40)。在说明性实施例中,启动子为T细胞特异性CD3ζ启动子。
[0316] 在一些实施例中,淋巴增生性组件受微环境限制。举例而言,淋巴增生性组件可为在异常条件相对于生理条件下差异性结合其各别细胞因子的突变受体。举例而言,可使用在肿瘤环境下比在正常生理环境下可更强烈地结合IL7的IL-7R。
[0317] 在一些实施例中,淋巴增生性组件融合至识别域或消除域。在本文中更详细地公开此类识别域或消除域。此融合提供了,尤其在使用经截短或其他突变的淋巴增生性组件
时,在反转录病毒基因组中需要更少的多核苷酸的优势。此在本文所提供的说明性实施例
中为重要的,这是由于其有助于允许编码功能性组件的更多核酸包括于反转录病毒基因组
中且由于其添加了机制,若不再需要其的增生或其的增生对有机体有害,则可通过该机制
杀灭表达淋巴增生性组件的细胞。
[0318] 在一些实施例中,淋巴增生性组件(包括CLE)包含如上文所公开的胞内活化域。在一些说明性实施例中,淋巴增生性组件为包含胞内活化域的CLE,该胞内活化域包含含ITAM域。由此,CLE可包含胞内活化域,该胞内活化域与本文所提供的CD3Z、CD3D、CD3E、CD3G、CD79A、CD79B、DAP12、FCERlG、FCGR2A、FCGR2C、DAP10/CD28或ZAP70域具有至少80%、90%、
95%、98%或100%序列一致性。在某些说明性实施例中,胞内活化域为来自以下的含ITAM域:CD3D、CD3G、CD3Z、CD79A、CD79B、FCER1G、FCGR2A或FCGR2C。包含胞内活化域的CLE在证实于本文中的实施例17及实施例18及相关表18至表23中,其在不存在外源性细胞因子(诸如
外源性IL-2)的情况下在培养物中离体促进PBMC的增生时为有效的。在一些实施例中,本文提供包含来自以下的胞内域的CLE:CD3D、CD3G、CD3Z、CD79A、FCER1G。
[0319] 在一些实施例中,淋巴增生性组件的一个或多个域融合至CAR的共刺激域和/或胞内活化域。如本文所公开的嵌合淋巴增生性组件不为嵌合抗原受体(CAR),这是由于其不包含ASTR。然而,在一些实施例中,淋巴增生性组件的一个或多个胞内域可为与CAR相同的多肽的部分或可融合或视情况功能性地连接至CAR的一些组分。举例而言,淋巴增生性组件可融合至抗原特异性靶向区(ASTR)且通过将ASTR结合至其抗原进行活化。在又其他实施例
中,工程化信号传导多肽可包括ASTR、胞内活化域(诸如CD3ζ信号传导域)、共刺激域及淋巴增生性域。关于共刺激域、胞内活化域、ASTR及其他CAR域的其他细节公开于本文中的其他地方中。
[0320] 在本文的说明性实施例中,通常通过用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或静息NK细胞而将T细胞和/或NK细胞存活组件引入至静息T细胞和/或静息NK细
胞中,该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的基因组编码作为工程化信号传导多肽的部分的
T细胞和/或NK细胞存活组件。在一些实施例中,淋巴增生性组件也为T细胞和/或NK细胞存
活组件。如上文所论述,淋巴增生性组件中的一些不仅促进增生,而且其同样促进细胞存
活。在一些实施例中,T细胞和/或NK细胞存活基元不为淋巴增生性组件。在一些实施例中,T细胞和/或NK细胞存活基元可为CD28 T细胞存活基元或CD137细胞存活基元。这些T细胞存
活基元可在包括ASTR(诸如scFv)的工程化信号传导多肽中找到。在一说明性实施例中,T细胞存活基元为经由CD8a跨膜域或CD28跨膜域连接至scFv的CD28 T细胞存活基元或CD137基
元。在某些实施例中,该胞内信号传导域包含多肽序列,该多肽序列包含基于免疫受体酪氨酸的活化基元(ITAM)。在某一实施例中,该多肽序列为CD3ζ信号传导域。
[0321] 在一些实施例中,淋巴增生性组件不为多肽,相反包含抑制性RNA。在一些实施例中,根据本文中的任何方面的过程的方法、用途、组合物及产物包括包含抑制性RNA的淋巴增生性组件及为工程化信号传导多肽的淋巴增生性组件。在淋巴增生性组件为抑制性RNA
的实施例中,该抑制性RNA可为通常通过利用使SOCS路径中的负调节子降解或下调而增强
STAT5的活化来刺激STAT5路径的miRNA。在一些实施例中,miRNA是指编码影响增生的蛋白
质的mRNA,诸如但不限于ABCG1、SOCS1、TGFbR2、SMAD2、cCBL及PD1。在说明性实施例中,如本文所例示,此抑制性RNA(例如miRNA)可定位于包装细胞和/或复制缺陷型重组反转录病毒
颗粒基因组和/或反转录病毒载体中之内含子中,且通常通过在T细胞和/或NK细胞中具有
活性的启动子驱动来表达。不受理论的限制,认为转录单元中之内含子的包涵体导致转录
物的更高表达和/或稳定性。由此,将miRNA置放于反转录病毒基因组之内含子中的能力增
加了本发明的教示,该教示克服了先前技术中试图使最大活性达到反转录病毒(诸如慢病
毒基因组)的大小限制的挑战。在一些实施例中,1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个miRNA(在说明性实施例中,2个与5个之间的(例如4个)miRNA(其中的一者或多者各
自结合编码ABCG1、SOCS1、TGFbR2、SMAD2、cCBL及PD1中的一者或多者的核酸))可包括于重组反转录病毒基因组中且使用本文所提供的方法传递至靶标细胞,例如T细胞和/或NK细
胞。实际上,如本文所提供,1个、2个、3个或4个miRNA可传递于单个内含子(诸如EF1a内含子)中。
[0322] ABCG1为对胸腺细胞及周边淋巴细胞增生进行负调节的ATP结合卡匣转运蛋白(Armstrong等人.2010.J Immunol 184(1):173-183)。
[0323] SOCS1为抑制Jak/Stat路径(诸如STAT5)的细胞因子信号转导的负调节子的SOCS(细胞因子信号传导的抑制因子)家族的成员。SOCS1也称为JAB(Janus激酶结合蛋白质)、
SSI-1(Stat诱导的Stat抑制剂-1)及TIP3(Tec相互作用蛋白质)。
[0324] TGFbR2为丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶家族的成员,该丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶家族结合TGF-β,从而形成使蛋白质磷酸化的复合物,随后进入细胞核且调节与增生相关的基因的转录。
[0325] SMAD2介导转变生长因子(TGF)-β的信号且调节多个细胞过程,诸如细胞增生、凋亡及分化。
[0326] cCBL为通过使ZAP-70去磷酸化且失活且经由TCR之内化来抑制TCR信号传导的E3泛素连接酶。
[0327] PD1(CD279)为在T细胞及ProB细胞上表达的细胞表面受体。PD-1结合两种配位体,PD-L1及PD-L2。经由PD-1进行信号传导起防止细胞活化的作用。
[0328] 在一些实施例中,本文中的淋巴增生性组件为包含表18的基因中的任一者胞内区的多肽。在一些实施例中,淋巴增生性组件包含或为在表18的嵌合多肽中所鉴别的胞内域。
在这些实施例中,淋巴增生性组件可为多肽,该多肽为嵌合多肽(参加下文CLE),或不为
CLE,但包含或为在表18的P3(第一胞内域)位置中所鉴别的基因的胞内域。表18鉴别在第7
天与第二胞内域不存在于构建体上只最后一天之间促进PBMC的增生的CLE构建体。在此实
施例的一些子实施例中,在具有或不具有包含二聚基元的胞外域的情况下,淋巴增生性组
件为包括跨膜域及胞内域的组合的嵌合多肽(亦即CLE,参见下文)。
[0329] 在一些实施例中,淋巴增生性组件包含MPL或为MPL或其变体或片段,包括在具有或不具有MPL的跨膜域和/或胞外域的情况下包括至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、
97%、98%、99%或100%的MPL的胞内域,和/或在具有或不具有MPL的跨膜域和/或胞外域的情况下与MPL的胞内域具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或
100%序列一致性的变体或片段,其中变体和/或片段保留促进PBMC(且在一些实施例中,T
细胞)的细胞增生的能力。在一些实施例中,包括于本文中的组合物及方法中的MPL片段具
有和/或保留JAK-2结合域。在一些实施例中,包括于本文中的MPL片段具有或保留活化STAT的能力。MPL的全胞内域为SEQ ID NO:491(表7至表18中的部分S186)。MPL为促血小板生成
素的受体。诸如促血小板生成素及EPO的若干细胞因子在文献及本文中称作激素或细胞因
子。
[0330] 在一些实施例中(其提供本发明的单独方面),本文提供为嵌合淋巴增生性组件(CLE)的嵌合多肽以及经分离多核苷酸及编码其的核酸序列。例示性CLE说明于图30至图33
中。本文中的CLE促进T细胞和/或NK细胞的增生且可视情况还促进T细胞和/或NK细胞的存
活。一些CLE促进增生且视情况还促进其他类型的PBMC(例如B细胞)的存活。包括编码CLE及CAR的核酸序列的本文所提供的实施例在本文中称作出于设计方便的CLE CAR多核苷酸实
施例。在一些实施例中,CLE可包括跨膜域及第一胞内域。此外,在说明性实施例中,如图30至图33所显示,CLE包括胞外域和/或第二胞内域(且在另外的实施例中,第三胞内域、第四胞内域等等)。本文中的嵌合多肽为嵌合的,这是由于至少一个域来自与其他域中的至少一者不同的多肽且此嵌合体在无人类干预的情况不能自然地在有机体中找到。一些CLE包括
受体的配位体且一些CLE不包括受体的配位。
[0331] 不受理论限制,这些CLE经设计以组成性方式(亦即,不需要用于活化的配位体结合)促进B细胞、NK细胞和/或T细胞的增生及视情况细胞存活。CLE中无一者可在自然中找
到,且许多CLE具有通常不在B细胞、T细胞和/或NK细胞中活体内表达的组分,和/或一些候选CLE不通常已知用于特异性地促进B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生和/或细胞存活
信号传导。举例而言,MPL通常不在B细胞、T细胞和/或NK细胞中表达。出人意料地,如实施例
17及实施例18中所阐述通过筛选大量候选嵌合多肽所鉴别的新CLE促进PBMC细胞增生。这
些CLE有助于满足鉴别刺激B细胞、T细胞和/或NK细胞的增生以及视情况存活的机制的长期
需求,诸如对重要的临床相关技术而言将为有益的,诸如以基因方式工程化以表达所定义
TCR的CAR-T及T细胞。由此,据信一些CLE将向T细胞和/或NK细胞提供活体内扩增且无需使
宿主淋巴消耗的能力。
[0332] 本文所提供的嵌合淋巴增生性组件及经分离多核苷酸及编码其的核酸可包括于包括淋巴增生性组件的本文所提供的任何方面中。举例而言,第一工程化信号传导多肽可
为或可包括本文所提供的方面中的CLE,该CLE包括编码由控制组件调节的第一工程化信号
传导多肽的一个或多个转录单元。此外,提供本发明的单独方面,其特异性地包括CLE。举例而言,这些方面包括经分离嵌合淋巴增生性多肽、经分离多核苷酸及编码其的核酸,以及载体,这些载体包括质粒、病毒及反转录病毒载体(包括这些核酸序列或经分离多核苷酸)。这些方面进一步包括用于用经分离多核苷酸及包含其的载体转导或转染PBMC(诸如B细胞,或
特定而言T细胞及NK细胞)的方法。这些细胞可为经分离未更改的细胞,或其可为经修饰的
细胞,诸如经基因方式修饰诸如以表达所定义TCR或CAR-T细胞的细胞。
[0333] 在一些实施例中,CLE包括来自相同部分(在说明性实施例中,相同受体)的胞外部分及跨膜部分两者,其中的一者在说明性实施例中为突变体,因此形成胞外域及跨膜域。这些域可来自细胞因子受体或其突变体,或激素受体或其突变体,在一些实施例中,当在至少一些细胞类型中表达时,其经报导为组成性活性的。在说明性实施例中,此胞外域及跨膜域不包括配位体结合区。据信,这些域在存在于CLE中并表达于B细胞、T细胞和/或NK细胞中时不结合配位体。这些受体突变体中的突变可发生于跨膜区中或胞外近膜区中。不受理论限
制,本文提供的CLE的至少一些胞外-跨膜域中的突变通过使通常不在一起的活化链集合在
一起或通过改变经连接跨膜域和/或胞内域的确认而在不存在配位体的情况下负责CLE的
信号传导。
[0334] 本文所提供的利用受体突变体的这些跨膜域的一个方面为包含一种或多种核酸序列的经分离多核苷酸,其中:
[0335] 该一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码在胺基至羧基取向中包含以下的嵌合多肽,
[0336] (a)来自细胞因子受体或激素受体的胞外域及跨膜域,其中胞外域及跨膜域中的至少一者包含在细胞因子受体的组成性活性突变体上发现的突变,且其中胞外序列不结合
细胞因子受体的配位体;及
[0337] (b)选自具有表7至表11中所鉴别的经选择多肽的第一胞内域且视情况第二胞内域的基因的胞内域的第一胞内域,其中该嵌合多肽促进B细胞、T细胞和/或NK的细胞增生。
[0338] 这些实施例中的此胞外域及跨膜域的胞外区通常足够长以形成接头,在说明性实施例中,跨膜域与另一功能性肽区之间的柔性接头,诸如间隙域,其在一些实施例中连接至胞外区的胺基端。因此,胞外区在存在以形成胞外域及跨膜域时长度可在1个氨基酸与1000个氨基酸之间,且通常在4个氨基酸与400个氨基酸之间,在4个氨基酸与200个氨基酸之间,在4个氨基酸与100个氨基酸之间,在4个氨基酸与50个氨基酸之间,在4个氨基酸与25个氨
基酸之间或在4个氨基酸与20个氨基酸之间。在一个实施例中,胞外区为针对本发明的此方面的胞外域及跨膜域的GGGS。
[0339] 如以下更详细论述,无论作为包括胞外域及跨膜域的实施例的部分(作为例如如实施例17的库1A、1.1A、1.1B、2B及2.1B所显示的一个部分)或作为包括胞外二聚基元的实施例的部分(如例18的库3A、3B、3.1A、3.1B、4B及4.1B所显示),跨膜域通常至少足够长以穿过质膜。因此,跨膜域或胞外域及跨膜域的跨膜区可在10个氨基酸与250个氨基酸之间,且更通常长度为至少15个氨基酸,且可例如在15个氨基酸与100个氨基酸之间,15个氨基酸与
75个氨基酸之间、在15个氨基酸与50个氨基酸之间,在15个氨基酸与40个氨基酸之间或在
15个氨基酸与30个氨基酸之间。
[0340] 包括这些域(在说明性实施例中,胞外域)的实施例的CLE的例示性胞外域及跨膜域通常少于来自经报导为组成性的突变体受体的膜近端胞外域连同跨膜域的30个氨基酸,
其不需要用于活化相关胞内域的配位体结合。在说明性实施例中,这些胞外域及跨膜域包
括IL7RA Ins PPCL、CRLF2 F232C、CSF2RB V449E、CSF3R T640N、EPOR L251C I252C、GHR E260C I270C、IL27RA F523C以及MPL S505N。此胞外域及跨膜域的另外的非限制性实施例
在表6中提供且在实施例17及对应表中例示出。在一些实施例中,胞外域及跨膜域不包含在序列中与IL7RA或其突变体的胞外域和/或跨膜域的部分相同的多于10、20、25、30或50个组成性氨基酸。在一些实施例中,胞外域及跨膜域不为IL7RA Ins PPCL。在一些实施例中,胞外域及跨膜域不包含在序列中与IL15R的胞外域和/或跨膜域的部分相同的多于10、20、25、
30或50个组成性氨基酸。
[0341] 在实施例18中提供额外例示性跨膜域。说明性实施例中的这些跨膜域来自类型I跨膜蛋白。
[0342] 因此,本文在一个方面提供包含一种或多种核酸序列的经分离多核苷酸,其中:
[0343] 该一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码在胺基至羧基取向中包含以下的嵌合多肽,
[0344] a)来自类型I跨膜蛋白的跨膜域;及
[0345] b)选自具有表12至表17中所鉴别的经选择多肽的第一胞内域的基因的胞内域的第一胞内域,其中该嵌合多肽促进B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生。
[0346] 在说明性实施例中,该嵌合多肽促进PBMC(例如B细胞和/或NK细胞,和/或在说明性实施例中,T细胞)的细胞增生。如实施例18所显示,这些嵌合多肽能够在培养期间(例如在添加IL-2至表达编码嵌合多肽的核酸的PBMC(例如B细胞、T细胞或NK细胞)的培养培养基
的缺失下)在PBMC至外源性细胞因子(诸如IL-2、IL-15或IL-7)的暴露的缺失下促进PBMC的
细胞增生。如实施例18所说明,对于这些实施例,可在转导PBMC期间,但不在后续培养中添加IL-2。举例而言,本文公开的嵌合多肽为淋巴增生性组件,这是由于其能够促进PBMC(且在说明性实施例中,T细胞)的细胞增生及视情况细胞存活,且无需在视情况用编码嵌合淋
巴增生性组件的核酸转导PBMC后,在培养第1天、第2天、第3天、第4天、第5天或第7天后的培养PBMC(亦即,T细胞)期间添加IL-2实施例21提供可用于鉴别且分析淋巴增生性组件的方
法的另一实例。此分析可包括例如量测此淋巴增生性组件的相关淋巴增生性活性,例如通
过分析由与不表达这些淋巴增生性组件的对照淋巴细胞相比表达这些淋巴增生性组件的
经基因方式修饰的淋巴细胞所提供的富集幅度。
[0347] 在此方面的一个实施例中,第一核酸序列进一步编码胞外域,且在说明性实施例中,胞外域包含二聚基元。在此方面的说明性实施例中,胞外域包含亮氨酸拉链。在一些实施例中,亮氨酸拉链来自jun多肽,例如c-jun。在某些实施例中,c-jun多肽为ECD-11的c-jun多肽区。
[0348] 在其中跨膜域为类型I跨膜蛋白的这些方面中的任一者的实施例中,跨膜域可为类型I生长因子受体、激素受体、T细胞受体或TNF家族受体。在其中嵌合多肽包含胞外域且其中胞外域包含二聚基元的方面及实施例中的任一者的一实施例中,跨膜域可为类型I细
胞因子受体、激素受体、T细胞受体或TNF家族受体。
[0349] 例示性跨膜域包括用于实施例18中的任何跨膜域。在一些实施例中,跨膜域来自CD4、CD8RB、CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCGR2C、GHR、ICOS、IFNAR1、IFNGR1、IFNGR2、IL1R1、IL1RAP、IL2RG、IL3RA、IL5RA、IL6ST、IL7RA、IL10RB、IL11RA、IL13RA2、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RE、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL22RA1、IL31RA、LEPR、PRLR及TNFRSF8或在这些突变体存在于实施例18中所提供的构建体中时已知促进某些细胞类型中的信号
传导活性的其突变体。在一些实施例中,跨膜域来自CD40、ICOS、FCGR2C、PRLR、IL3RA或IL6ST。在一些实施例中,跨膜域为针对表12至表17中的任何一者或多者的构建体中的这些基因所提供的特定跨膜域或来自那些表之前50个、25个或10个所列构建体中的构建体中的
任一者的跨膜域。在说明性实施例中,跨膜域来自CD40或ICOS(作为非限制性实施例,针对这些基因的跨膜域在表6中提供)或保留跨膜的能力的其片段,和/或已知促进某些细胞类
型中的组成性信号传导活性的其突变体。
[0350] 来自此方面的例示性跨膜域显示为表12至表17中的P2。对于库3A,当本文中发现的候选嵌合多肽组件的跨膜域位置(P2)处时,来自CD40、CD8B、CRLF2、CSF2RA、GCGR2C、ICOS、IFNAR1、IFNGR1、IL10RB、IL18R1、IL18RAP、IL3RA、LEPR及PRLR的跨膜域(P2)或当这些突变体存在于实施例18中所提供的构建体中时已知促进某些细胞类型中的组成性信号传
导活性的其突变体,在以组合方式考虑具有来源于该基因的跨膜域的所有构建体的数据
时,在第7天与最后一天之间促进PBMC的增生。在实施例17及实施例18中提供的筛选中,用含有库的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导细胞且接着馈入PBMC或不馈入PBMC,如实施
例17及实施例18中所论述。在库数字后用“A”鉴别其中细胞馈入PBMC的筛选,例如库1A,在库数字后用“B”鉴别其中细胞不馈入PBMC的筛选,例如库1.1B。此外,以相同方式进行鉴别为含有“.1”的库(例如,库1.1A)的筛选以筛选不具有“.1”的对应库,例如,库1.1A为库1A的重复筛选。对于库3B,来自CD40、ICOS、CSF2RA、IL18R1、IL3RA及TNFRSF14的跨膜域或当这些突变体存在于实施例18中所提供的构建体中时已知促进某些细胞类型中的组成性信号传
导活性的其突变体最能够促进细胞增生。对于库4B,来自IL3RA、CSFR2RA、IL18R1、CD8B、CD40、ICOS的跨膜域或当这些突变体存在于实施例18中所提供的构建体中时已知促进某些
细胞类型中的组成性信号传导活性的其突变体最能够促进细胞增生。在说明性实施例中,
本文提供的CLE中的跨膜域为来自CD40及ICOS的跨膜域。跨膜域或存在于针对库3A、3B、
3.1A、3.1B、4B及4.1B促进细胞增生的构建体中的其部分和/或突变体的实例在实施例18中所提供的表中提供。
[0351] 在本文中的任何方面的一些实施例中,嵌合多肽包含除CSF2RB的跨膜域突变体V449E以外的在显示于表12至表17中的构建体中的任一者中所鉴别的跨膜域。
[0352] 在一些实施例中,胞外域及跨膜域为病毒蛋白LMP1或其突变体和/或片段。LMP1为已知在靶向脂质筏时或在融合至CD40时独立于配位体活化细胞信号传导的多跨跨膜蛋白
(Kaykas等人,EMBO J.20:2641(2001))。LMP1的片段通常足够长以跨越质膜且活化所连接
胞内域。举例而言,LMP1可在15个氨基酸与386个氨基酸之间、15个氨基酸与200个氨基酸之间、15个氨基酸与150个氨基酸之间、15个氨基酸与100个氨基酸之间、18个氨基酸与50个氨基酸之间、18个氨基酸与30个氨基酸之间、20个氨基酸与200个氨基酸之间、20个氨基酸与
150个氨基酸之间、20个氨基酸与50个氨基酸之间、20个氨基酸与30个氨基酸之间、20个氨基酸与100个氨基酸之间、20个氨基酸与40个氨基酸之间或20个氨基酸与25个氨基酸之间。
LMP1的突变体和/或片段在包括于本文提供的CLE中时保留其活化胞内域的能力。此外,若
存在,胞外域包括至少1个,但通常至少4个氨基酸且其通常连接至另一个功能性多肽,诸如间隙域,例如eTag。
[0353] 在本文提供的CLE的其他实施例中,胞外域包括二聚部分。文中所公开的许多不同二聚部分可用于这些实施例中。在说明性实施例中,二聚部分能够同源二聚。不受理论限
制,二聚部分可对经由跨膜域连接至其的胞内域提供活化功能。此活化可在例如二聚部分
的二聚之后提供,其可使得改变经由跨膜域连接至其的胞内域的定向,或其可使得胞内域
接近。具有二聚部分的胞外域还可充当将识别标记连接至表达CLE的细胞的功能。在一些实施例中,二聚剂可位于胞内而非胞外。在一些实施例中,可使用多于一个或多个二聚域。
[0354] 其中胞外域具有二聚基元的实施例的胞外域足够长以形成二聚物,诸如亮氨酸拉链二聚物。由此,包括二聚部分的胞外域可为15个氨基酸至100个氨基酸、20个氨基酸至50个氨基酸、30个氨基酸至45个氨基酸或35个氨基酸至40个氨基酸,在说明性实施例中为表6中所提供的c-Jun胞外域的c-Jun部分。包括二聚部分的多肽的胞外域可不保留其他功能
性。举例而言,对于亮氨酸拉链二聚物,这些亮氨酸拉链能够形成二聚物,这是由于其保留沿着α隔开7个残基的亮氨酸的基元。然而,本文提供的CLE的某些实施例的亮氨酸拉链部分可或可不保留其的DNA结合功能。
[0355] 此类型的一个例示性胞外域为来自Jun部分(诸如c-Jun)的亮氨酸拉链域。举例而言,胞外域可为出现于NM_002228_3(表6)中的c-Jun的变体。此胞外域用于实施例18中所论述的构建体中。
[0356] 1个丙氨酸与4个丙氨酸之间的间隔子可包括于具有二聚部分的胞外域与跨膜域之间的CLE中。不受理论限制,据信,丙氨酸间隔子通过改变胞内域的定向来影响经由跨膜域连接至亮氨酸拉链胞外区的胞内域的信号传导。
[0357] 本文提供的CLE的第一胞内域及第二胞内域为已知在至少一些细胞类型中的基因的胞内信号传导域,以促进增生、存活(抗凋亡)和/或提供增强分化状态、增生潜能或对细胞死亡的抗性的共刺激信号。由此,这些胞内域可为来自淋巴增生性组件的胞内域及本文
提供的共刺激域。已知候选嵌合多肽的胞内域中的一些可活化JAK1/JAK2信号传导及
STAT5。出现于第一胞内域中的基因及其胞内域与第二胞内域相同,除若第一胞内域及第二胞内域相同,则至少一个且通常跨膜域及胞外域两者不来自相同基因以外。
[0358] 例示性胞内域包括来自表7至表11中所列的构建体的那些。来自经经验上判定为在实施例17的实验中为活性的这些基因的例示性胞内域提供于实施例17中所提供的表的
第一胞内域(P3)及第二胞内域(P4)位置中且如以下此章节中进一步列举。在针对实施例17
筛选的热中所鉴别的说明性胞内域包括CD40、CSF2RA、IFNAR1、IL1RAP、IL4R、IL6ST、IL11RA、IL12RB2、IL17RA、IL17RD、IL17RE、IL18R1、IL21R、IL23R、MPL及MyD88。在针对实施例18筛选的热门中所鉴别的说明性胞内域包括CD40、LEPR、MyD88、IFNAR2、MPL、IL18R1、IL13RA2、IL10RB、IL23R或CSF2RA。在某些说明性实施例中,第一胞内域为MPL、LEPR、MyD88或IFNAR2。对于这些某些说明性实施例,非限制性例示性第二胞内域(P4)域为连接至提供
于表12至表17中的对应MPL、LEPR、MyD88、IFNAR2、CD40、CD79B或CD27第一胞内域(P3)的基因的那些,在一些非限制实施例中包括这些表中所提供的那些基因的第一胞内域和/或第
二胞内域。对于这些某些说明性实施例,其他非限制例示性第二胞内域(P4)域为连接至实
施例18中所提供的表中的对应MPL、LEPR、MYD88、IFNAR2、CD40、CD79B或CD27第一胞内域,包括(作为非限制性实施例)这些表中所提供的那些基因的第一胞内域和/或第二胞内域。在
一些实施例中,嵌合淋巴增生性组件可为实施例17及实施例18的表19至表23中的多肽中的
任一者。
[0359] 在某些说明性实施例中,第二胞内域来自CD3D、CD3G、CD27、CD40、CD79A、CD79B、FCER1G、FCGRA2、ICOS、TNFRSF4及TNFRSF8,或当这些突变体存在于实施例18中所提供的构建体中时已知促进某些细胞类型中的信号传导活性的其突变体。在某些说明性实施例中,第二胞内域来自CD40、CD79B、TNFRSF4、TNFRSF9、TNFRSF14、FCGRA2、CD3G或CD27,在说明性实施例中包括CD40、CD79B及CD27的胞内域。对于这些某些说明性实施例,非限制性例示性第一胞内域(P3)为连接至CD40、CD79B、TNFRSF4、TNFRSF9、TNFRSF14、FCGRA2、CD3G或CD27的基因的那些,在说明性实施例中包括表12至表17中的CD40、CD79B或CD27的胞内域,包括(作为非限制性实施例)这些表中所提供的那些基因的第一胞内域和/或第二胞内域。对于这些
某些说明性实施例,其他非限制性例示性第一胞内(P3)域为连接至CD40、CD79B、TNFRSF4、TNFRSF9、TNFRSF14、FCGRA2、CD3G或CD27的基因的那些,在说明性实施例中包括作为实施例
18中所提供的P3的这些基因的表中的CD40、CD79B及CD27第二胞内域的胞内域,包括(作为
非限制性实施例)这些表中所提供的那些基因的第一胞内域和/或第二胞内域。
[0360] 关于促进细胞存活及增生的构建体内的实施例17及实施例18中所鉴别的以上基因的例示性胞内域的详细信息(包括序列信息)在表6中提供。可包括于本文提供的CLE实施
例中的胞内域包括所述基因的胞内域的突变体和/或片段,其限制条件为这些突变体和/或
片段保留促进增生、存活(抗凋亡)和/或提供增强分化状态、增生潜能或对细胞死亡的抗性的共刺激信号的能力。由此,胞内域可例如在10个氨基酸与1000个氨基酸之间、10个氨基酸与750个氨基酸之间、10个氨基酸与500个氨基酸之间、10个氨基酸与250个氨基酸之间以及
10个氨基酸与100个氨基酸之间。
[0361] 在一些实施例中,CLE的所有域不为IL-7受体或其突变体,和/或具有IL-7受体的至少10个、15个、20个或25个连续氨基酸的其片段,或不为IL-15受体或其突变体,和/或具有IL-15受体的至少10个、15个、20个或25个连续氨基酸的其片段。在一些实施例中,CLE不包含CD40及MyD88的第一胞内域及第二胞内域的组合。
[0362] 在说明性实施例中,CLE包括识别域和/或消除域。关于识别域和/或消除域的细节在本文中的其他章节中提供。本文提供的识别域和/或消除域中的任一者可为CLE的部分。
通常,识别域连接至胞外域的N端。不受理论限制,在一些实施例中,胞外域包括提供接头(在说明性实施例中,柔性接头)的功能,从而将识别域连接至表达CLE的细胞。
[0363] 在说明性实施例中,如图30及图32所说明,本文提供的CLE与可根据本文提供的CAR实施例中的任一者设计或此项技术中另外已知的CAR共表达。
[0364] 本文提供的一些实施例为经分离多核苷酸及编码本文提供的CLE中的任一者的核酸序列,如图30至图33中所例示。这些经分离多核苷酸可包括此项技术中已知的任何组件,以用于提供转录物(诸如编码CLE的转录物)的表达。举例而言,经分离多核苷酸可包括在B
细胞、T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子组件。对于这些实施例而言为合适的这些启
动子在此项技术中为已知的,其中的一些在本发明的其他章节中鉴别。举例而言,熟练的技术人员将如实施例17及实施例18中更详细论述所理解,如何涉及经分离多核苷酸及含有其
的载体,以用于表达本文提供的CLE实施例中的任一者。举例而言,在一些实施例中,在编码CLE或位于相同转录单元上的CLE上游的CAR的胺基端氨酸的ATG起始位点上游的10个核苷
酸内提供Kozak序列。因此,在包含编码本文提供的CLE的核酸的多核苷酸实施例中,多核苷酸可进一步包含Kozak相关序列、WPRE组件及多个终止序列中的一者或多者,例如二重终止序列或三重终止序列。
[0365] 此外,包括编码本文提供的CLE的核酸序列的多核苷酸通常还包含信号序列以直接表达质膜。例示性信号序列在本文中于其他章节中提供。可在转录物上提供组件,使得
CAR及CLE两者自相同转录物表达。此构建体在比这些组件自不同转录物表达时需要更少的
核酸方面为有利的,其为使得这些构建体存在于载体(诸如反转录病毒基因组)中的重要特
征,例如用于转染或转导B细胞T细胞和/或NK细胞。
[0366] 众多嵌合多肽候选物经涉及且鉴别为本文中的实施例17及实施例18中的淋巴增生性组件。对于库1A(其包括编码嵌合多肽及CAR的构建体),172个顶部候选嵌合多肽经鉴
别(参见表7),在不存在IL-2的情况下培养时,在第7天与最后一天之间促进PBMC增生。对于库2B(其包括编码嵌合多肽但不包括CAR的构建体),167个顶部候选嵌合多肽经鉴别(参见
表8),在不存在IL-2的情况下培养时,在第7天与最后一天之间促进PBMC增生。某些说明性CLE以及多核苷酸以及编码其的核酸序列,以及包括这些中的任一者的方法包括在表7至表
11中所提供的构建体上的来自具有经匹配域的基因(例如,跨膜基因及第一胞内基因及视
情况第二胞内基因)的胞内域以及(在非限制性实施例中)在这些表上提供的特定经匹配
域,其中的一些阐述于本文中的例示性实施例章节中。在说明性实施例中,可使用在具有相同P1至P2、P3及P4域(例如,库1A及1.1A)的首次筛选及重复筛选中具有尤其值得注意的富
集度的构建体上的来自具有经匹配域的CLE(例如,跨膜基因及第一胞内基因及视情况第二
胞内基因)的胞内域,如表7至表11中所显示。对于库1A及1.1A,构建体M001-S116-S044、
M024-S192-S045、M001-S047-S102、M048-S195-S043、M012-S216-S211及M030-S170-S194在两次筛选中具有尤其值得注意的富集度。
[0367] 在表19中提供关于在对库1A及库1.1A两者的筛选中的具有尤其值得注意的富集度的构建体中的第一及第二胞内域的其他信息,包括第一及第二胞内域来源的基因,第一
和/或第二胞内域是否为细胞因子受体,且第一和/或第二胞内域是否具有至少一个ITAM基
元。如实施例17中所显示,具有来自IL6R、MYD88、CD27、MYD88、TNFRSF18或IL31RA的胞内域的构建体(当存在于第一胞内域(P3)时)及具有来自CD8B、IL1RL1、CD8A、TNFRSF4或MYD88的胞内域的构建体(当存在于第二胞内域(P4)时),在库1A及1.1A两者中显示尤其值得注意的
富集度(表19)。具有来自细胞因子受体IL6R、CD27、TNFRSF18或IL31RA的结构域的构建体存在于第一胞内域(P3)时,且具有来自细胞因子受体IL1RL1或TNFRSF4的结构域的构建体存
在于第二胞内域(P4)时,在库1A及1.1A两者中显示尤其值得注意的富集度(表19)。
[0368] 对于库2B及2.1B,构建体M007-S049-S051、M007-S050-S039、M012-S050-S043、M012-S161-S213、M030-S142-S049、M001-S145-S130、M018-S085-S039、M018-S075-S053、M012-S135-S074及M007-S214-S077在两个筛选中具有尤其值得注意的富集度。出于重复筛
选的目的,具有尤其值得注意的富集度的构建体为具有log2((在最后一天的标准化计数数
据+1)/(在第7天的标准化计数数据+1))值大于2的那些构建体。
[0369] 在表20中提供关于在对库2B及库2.1B两者的筛选中的具有尤其值得注意的富集度的构建体中的第一及第二胞内域的其他信息,包括第一及第二胞内域来源的基因,第一
和/或第二胞内域是否为细胞因子受体,且第一和/或第二胞内域是否具有至少一个ITAM基
元。具有来自CD28、CD40、IL22RA1、IL13RA2、IL17RB、IFNGR2、FCGR2C、IL11RA或TNFRSF14的胞内域的构建体存在于第一胞内域(P3)时,且具有来自CD40、CD3G、CD8A、TNFRSF9、CD28、IL10RB、CD79B、FCER1G或GHR的胞内域的构建体存在于第二胞内域(P4)时,在库2B及2.1B两者中显示尤其值得注意的富集度(表20)。具有来自细胞因子受体CD40、IL22RA1、IL13RA2、IL17RB、IFNGR2、FCGR2C、IL11RA或TNFRSF14的结构域的构建体存在于第一胞内域(P3)时,且具有来自细胞因子受体TNFRSF9、IL10RB、FCER1G、GHR或CD40的结构域的构建体存在于第二胞内域(P4)时,在库2B及2.1B两者中显示尤其值得注意的富集度(表20)。具有含有
FCGR2C的ITAM基元的结构域的构建体存在于第一胞内域(P3)时,且具有含有CD3G、CD79B或FCER1G的ITAM基元的结构域的构建体存在于第二胞内域(P4)时,在库2B及2.1B两者中显示
尤其值得注意的富集度(表20)。
[0370] 在一初始中期分析中,对于库3A(其包括编码嵌合多肽及CAR的构建体),126个顶部候选嵌合多肽经鉴别(参见表12),在不存在IL-2的情况下培养时,如实施例18中所阐述
在用未经转导的PBMC刺激的经转导PBMC的第7天与最后一天之间促进PBMC增生。对于库3B
(其包括编码嵌合多肽及CAR的构建体)的初始中期分析,127个顶部候选嵌合多肽经鉴别
(参见表13),在不存在IL-2的情况下培养时,如实施例18中所阐述在未用未经转导的PBMC
刺激的经转导PBMC的第7天与最后一天之间促进PBMC增生。对于库4B(其包括编码嵌合多肽
而非CAR的构建体),154个顶部候选嵌合多肽经鉴别(参见表16),在不存在IL-2的情况下培养时,如实施例18中所阐述在未用未经转导的PBMC刺激的经转导PBMC的第7天与最后一天
之间促进PBMC增生。
[0371] 在进一步解码之后(其提供深度解码),在库3A及3B中,其包括编码嵌合多肽及CAR及补充有(库3A)或未补充有(库3B)新鲜经转导PBMC的经转导PBMC的构建体,在第21天对于
库3A鉴别到134个顶部候选物,在第35天对于库3A鉴别到124个顶部候选物,且第21天对于
库3B鉴别到131个顶部候选物(分别参见表12及表13)在不存在IL-2(亦即,在初始转导后的
培养期间不将IL-2添加至培养培养基)、IL-7或任何其他外源性细胞因子的情况下培养时,在第7天与最后一天之间促进PBMC增生。
[0372] 某些说明性CLE以及多核苷酸以及编码其的核酸序列以及包括这些中的任一的方法包括在表12至表17中所提供的构建体上的来自具有经匹配域的基因(例如,跨膜基因及
第一胞内基因及视情况第二胞内基因)的胞内域以及(在非限制性实施例中)在这些表上提
供的特定经匹配域,其中的一些阐述于本文中的例示性实施例章节中。在例示性CLE实施例中设想,来自第一胞内域或第二胞内域位置的在实施例17及实施例18中所提供的数据中所
鉴别的胞内域可互换地作为第一胞内域或第二胞内域。在说明性实施例中,可使用在具有
相同P1、P2、P3及P4域(例如,库3A及3.1A)的首次筛选及重复筛选中具有尤其值得注意的富集度的构建体上的来自具有经匹配域的基因(例如,跨膜基因及第一胞内基因及视情况第
二胞内基因)的胞内域。对于库3A及3.1A,构建体E008/E013-T041-S186-S050、E006/E011-T077-S186-S211、E007/E012-T021-S186-S051、E009/E014-T041-S186-S053、E007/E012-
T073-S186-S053、E006/E011-T017-S186-S051、E006/E011-T031-S186-S211、E006/E011-
T011-S186-S050、E006/E011-T011-S186-S047、E007/E012-T001-S186-S050、E006/E011-
T041-S186-S051、E008/E013-T028-S186-S076、E009/E014-T029-S199-S053、E009/E014-
T062-S186-S216、E007/E012-T006-S058-S051、E009/E014-T076-S186-S211及E007/E012-
T001-S186-S047在两个筛选中均具有尤其值得注意的富集度,其中通过此处的斜杠间隔开
的P1部分包括如表6、12及14中所示的库3A及3.1A的不同标签。出于重复筛选的目的,具有尤其值得注意的富集度的构建体为具有log2((在最后一天的标准化计数数据+1)/(在第7
天的标准化计数数据+1))值大于2的那些构建体。
[0373] 在表21中提供关于在对库3A及库3.1A两者的筛选中的具有尤其值得注意的富集度的构建体中的第一及第二胞内域的其他信息,包括第一及第二胞内域来源的基因,第一
和/或第二胞内域是否为细胞因子受体,且第一和/或第二胞内域是否具有至少一个ITAM基
元。具有来自MPL、OSMR或CSF2RA的胞内域的构建体存在于第一胞内域(P3)时,且具有来自CD40、TNFRSF4、CD79B、CD27、FCGR2A或TNFRSF18的胞内域的构建体存在于第二胞内域(P4)时,在库3A及3.1A两者中显示尤其值得注意的富集度(表21)。具有来自细胞因子受体MPL、OSMR或CSF2RA的结构域的构建体存在于第一胞内域(P3)时,且具有来自细胞因子受体
CD40、TNFRSF4、CD27、FCGR2A或TNFRSF18的结构域的构建体存在于第二胞内域(P4)时,在库
3A及3.1A两者中显示尤其值得注意的富集度(表21)。具有含有MPL或OSMR的ITAM基元的结
构域的构建体存在于第二胞内域(P4)时,在库3A及3.1A两者中显示尤其值得注意的富集度
(表21)。
[0374] 对于3B及3.1B,构建体E007/E012-T017-S186-S051、E007/E012-T073-S186-S053、E008/E013-T028-S186-S047、E006/E011-T011-S186-S047、E007/E012-T082-S176-S214、E006/E011-T046-S186-S052、E008/E013-T029-S186-S052、E009/E014-T011-S186-S053、
E008/E013-T032-S186-S039、E007/E012-T034-S186-S051、E007/E012-T041-S192-S213、
E006/E011-T014-S069-S213、E006/E011-T022-S186-S053、E006/E011-T023-S115-S075、
E006/E011-T029-S106-S213、E006/E011-T032-S155-S080、E006/E011-T041-S186-S216、
E006/E011-T057-S135-S080、E006/E011-T072-S191-X002、E006/E011-T077-S186-S216、
E006/E011-T080-S141-S080、E007/E012-T001-X001-S214、E007/E012-T007-S059-S211、
E007/E012-T016-S186-S052、E007/E012-T031-S186-S053、E007/E012-T044-S102-S052、
E007/E012-T044-S142-X002、E007/E012-T055-S069-S053、E007/E012-T063-S176-S216、
E007/E012-T065-S157-S075、E008/E013-T008-S085-X002、E008/E013-T011-S085-S048、
E008/E013-T021-S109-X002、E008/E013-T021-S168-S211、E008/E013-T032-S064-S214、
E008/E013-T037-S170-S215、E008/E013-T038-S176-S048、E008/E013-T039-S137-S216、
E008/E013-T041-S141-S053、E008/E013-T045-S177-S048、E008/E013-T048-S109-S074、
E008/E013-T073-S199-S075、E009/E014-T001-S157-S074、E009/E014-T005-S196-S049、
E009/E014-T011-S130-X002、E009/E014-T013-S155-X002、E009/E014-T017-S186-S076、
E009/E014-T021-S142-S080、E009/E014-T023-S082-S076、E009/E014-T038-S196-S037、
E009/E014-T055-S186-S052、E009/E014-T060-S175-S053、E009/E014-T070-S085-S212、
E008/E013-T026-S054-S213、E009/E014-T007-S120-S053、E007/E012-T045-S186-S211、
E008/E013-T073-S186-X002、E008/E013-T074-S186-X002、E007/E012-T055-S186-S053、
E008/E013-T036-S186-S053、E007/E012-T017-S058-S053、E008/E013-T030-S189-S080、
E006/E011-T029-S081-S047、E009/E014-T044-S194-S050、E006/E011-T028-S121-X002、
E008/E013-T028-S186-S053、E009/E014-T078-S142-S213、E009/E014-T041-S186-S051、
E008/E013-T006-S186-S050、E006/E011-T028-S186-S075、E006/E011-T040-S120-S038、
E007/E012-T044-S115-S211、E009/E014-T039-S176-S075、E007/E012-T028-S186-S050、
E008/E013-T031-S202-S050、E007/E012-T072-S192-S053、E006/E011-T065-X001-S051、
E007/E012-T030-S062-X002、E007/E012-T073-S186-X002、E009/E014-T056-S186-S053、
E008/E013-T046-S137-X002、E006/E011-T016-S136-S076、E007/E012-T032-S142-S037、
E007/E012-T065-S120-S215、E009/E014-T077-S186-S047、E009/E014-T001-S126-S051、
E006/E011-T030-S121-S039、E008/E013-T006-S176-S213、E009/E014-T032-S130-S215、
E008/E013-T041-S186-S039、E009/E014-T021-S186-S047、E008/E013-T026-S137-S214、
E007/E012-T029-S116-S075、E008/E013-T026-S106-S049以及E007/E012-T032-S168-S075
在两次筛选中具有尤其值得注意的富集度,其中由此处的斜线隔开的P1部分包括库3B及
3.1B的不同标记,如表6、表13及表15中所显示。出于重复筛选的目的,具有尤其值得注意的富集度的构建体为具有log2((在最后一天的标准化计数数据+1)/(在第7天的标准化计数
数据+1))值大于2的那些构建体。
[0375] 在表22中提供关于在对库3B及库3.1B两者的筛选中的具有尤其值得注意的富集度的构建体中的第一及第二胞内域的其他信息,包括第一及第二胞内域来源的基因,第一
和/或第二胞内域是否为细胞因子受体,且第一和/或第二胞内域是否具有至少一个ITAM基
元。具有来自MPL、LEPR、MYD88、EPOR、IL5RA、IL2RG、IL18RAP、IL11RA、IL13RA1、CSF2RA、IL1RL1、IL13RA2、IL20RB、IFNGR2、IL3RA、IL27RA、CSF3R、IL31RA、IL12RB1、OSMR、IL10RB、IFNAR2、CRLF2、IL7R、IFNAR1、PRLR、IL9R、IL6R或IL15RA的胞内域的构建体存在于第一胞内域(P3)时,且具有来自CD40、CD79B、CD27、TNFRSF14、CD79A、CD3G、TNFRSF9、FCGR2C、ICOS、TNFRSF18、TNFRSF4、CD28、FCER1G、FCGR2A、CD3D、TNFRSF8或CD3E的胞内域的构建体存在于第二胞内域(P4)时,在库3B及3.1B两者中显示尤其值得注意的富集度(表22)。具有来自
MPL、LEPR、EPOR、IL5RA、IL2RG、IL18RAP、IL11RA、IL13RA1、CSF2RA、IL1RL1、IL13RA2、IL20RB、IFNGR2、IL3RA、IL27RA、CSF3R、IL31RA、IL12RB1、OSMR、IL10RB、IFNAR2、CRLF2、IL7R、IFNAR1、PRLR、IL9R、IL6R或IL15RA的胞内域的构建体存在于第一胞内域(P3)时,且具有来自CD40、CD27、TNFRSF14、TNFRSF9、FCGR2C、TNFRSF18、TNFRSF4、FCER1G、FCGR2A或TNFRSF8的胞内域的构建体存在于第二胞内域(P4)时,在库3B及3.1B两者中显示尤其值得
注意的富集度(表22)。具有含有CD79B、CD79A、CD3G、FCGR2C、FCER1G、FCGR2A、CD3D或CD3E的ITAM基元的结构域的构建体存在于第二胞内域(P4)时,在库3B及3.1B两者中显示尤其值得
注意的富集度(表22)。
[0376] 对于库4B及4.1B,构建体E007/E012-T078-S154-S047、E008/E013-T062-S186-X002、E008/E013-T055-S186-S050、E009/E014-T057-S186-S050、E007/E012-T077-S054-
S053、E007/E012-T034-S135-S211、E009/E014-T071-X001-S216、E009/E014-T011-S141-
S037、E008/E013-T041-S186-S037、E006/E011-T038-S106-S039、E006/E011-T011-S121-
X002、E007/E012-T007-S085-S215、E006/E011-T041-S186-S050、E007/E012-T008-S064-
S051、E006/E011-T041-S186-S047、E008/E013-T045-S186-S051、E008/E013-T003-S104-
S216、E006/E011-T019-S186-S053、E008/E013-T071-S064-S080、E006/E011-T021-S054-
X002、E006/E011-T003-S135-X002、E009/E014-T020-S199-S213、E008/E013-T027-S121-
S211、E009/E014-T032-S195-X002、E009/E014-T050-S171-X002、E008/E013-T069-S083-
X002、E008/E013-T026-S116-S038、E009/E014-T072-S195-X002、E007/E012-T047-S058-
S211、E008/E013-T046-S142-S080、E006/E011-T065-S186-S076、E006/E011-T062-S069-
X002、E007/E012-T047-S098-X002、E009/E014-T069-S099-S048、E008/E013-T039-S141-
S050、E006/E011-T052-S130-S052、E008/E013-T041-S186-X002、E007/E012-T019-S120-
X002、E008/E013-T045-S186-S053、E006/E011-T003-S170-S039、E007/E012-T047-S058-
S051、E007/E012-T069-S109-X002、E009/E014-T019-S130-S075以及E006/E011-T047-
S054-S053在两次筛选中具有尤其值得注意的富集度,其中由此处的斜线隔开的P1部分包
括库4B及4.1B的不同标记,如表6、表16及表17中所显示。出于重复筛选的目的,具有尤其值得注意的富集度的构建体为具有log2((在最后一天的标准化计数数据+1)/(在第7天的标
准化计数数据+1))值大于2的那些构建体。在表23中提供关于在对库4B及库4.1B两者的筛
选中的具有尤其值得注意的富集度的构建体中的第一及第二胞内域的其他信息,包括第一
及第二胞内域来源的基因,第一和/或第二胞内域是否为细胞因子受体,且第一和/或第二
胞内域是否具有至少一个ITAM基元。具有来自IL18R1、MPL、CRLF2、IL11RA、IL13RA1、IL2RG、IL7R、IFNGR2、CSF3R、IL2RA、OSMR、MYD88、IL31RA、IFNAR2、IL6R、CSF2RA、IL13RA2、EPOR、IL1R1、IL10RB或IL3RA的胞内域的构建体存在于第一胞内域(P3)时,且具有来自CD27、
CD40、CD79B、TNFRSF4、TNFRSF18、CD3D、CD3G、CD27、ICOS、TNFRSF9、CD3E、FCGR2A、CD28、CD79A或FCGR2C的胞内域的构建体存在于第二胞内域(P4)时,在库4B及4.1B两者中显示尤
其值得注意的富集度(表23)。具有来自IL18R1、MPL、CRLF2、IL11RA、IL13RA1、IL2RG、IL7R、IFNGR2、CSF3R、IL2RA、OSMR、IL31RA、IFNAR2、IL6R、CSF2RA、IL13RA2、EPOR、IL1R1、IL10RB或IL3RA的胞内域的构建体存在于第一胞内域(P3)时,且具有来自CD27、CD40、TNFRSF4、
TNFRSF18、TNFRSF9、FCGR2A或FCGR2C的胞内域的构建体存在于第二胞内域(P4)时,在库4B及4.1B两者中显示尤其值得注意的富集度(表23)。具有含有CD79B、CD3D、CD3G、CD3E、
FCGR2A、CD79A或FCGR2C的ITAM基元的结构域的构建体存在于第二胞内域(P4)时,在库4B及
4.1B两者中显示尤其值得注意的富集度(表23)。
[0377] 在说明性实施例中,CLE包含来自表19至表23的构建体中的任一者中的胞内域。在一些说明性实施例中,CLE包含来自仅具有单个胞内域(其他P3或P4为接头或终止)的表19
至表23的构建体中的任一者中的胞内域。
[0378] 关于本文提供的各种例示性CLE域的信息可在表6中找到。举例而言,表7中所鉴别的第一CLE为M008-S212-S075。对于此CLE,胞外域及跨膜域(P1-2)为M008,第一胞内域(P3)为S212,且第二胞内域(P4)为S075。当考虑编码其的核酸时,例如M008,关于这些域及模的鉴别的详细信息可在表6中找到。表6论述M008为ECDTM-8且更特定而言此为具有PPCL拆
入的白细胞介素7受体α(IL7RA)突变体且构建体包括eTag。
[0379] 对于库1A,当出现于候选嵌合多肽的第一胞内域位置(P3)处时,来自CD3D、CD3E、CD8A、CD27、CD40、CD79B、IFNAR1、IL2RA、IL3RA、IL13RA2、TNFRSF8及TNFRSF9的胞内域或具有信号传导活性的其突变体,在以组合方式考虑具有来源于该基因的第一胞内域(P3)的所有构建体的数据时,在第7天与最后一天之间促进PBMC的增生。因此,本文提供的CLE的例示性实施例具有来自CD3D、CD3E、CD8A、CD27、CD40、CD79B、IFNAR1、IL2RA、IL3RA、IL13RA2、TNFRSF8及TNFRSF9的胞内域,包括作为第二胞内域(或在说明性实施例中,第一胞内域)保
留信号传导活性的其突变体。
[0380] 对于库1A,当出现于候选嵌合多肽的第二胞内域位置(P4)处时,来自CD3D、CD3G、CD8A、CD8B、CD27、CD40、CD79B、CRLF2、FCGR2C、ICOS、IL2RA、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、TNFRSF9及TNFRSF18的胞内域或已知具有信号传导活性的其突变体,在以组合方式考虑具有来源于该基因的第二胞内域(P4)的所有构建体的数据时,在第7天与最后一天之间促进
PBMC的增生。存在于促进细胞增生的构建体中的第二胞内域或其部分和/或突变体的实例
提供于实施例17中的表中。因此,本文提供的CLE的例示性实施例具有来自CD3D、CD3G、
CD8A、CD8B、CD27、CD40、CD79B、CRLF2、FCGR2C、ICOS、IL2RA、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、TNFRSF9及TNFRSF18的胞内域,包括作为第一胞内域(或在说明性实施例中,第二胞内域)保留信号传导活性的其突变体。
[0381] 对于库3A,当出现于本文中的候选嵌合多肽组件的第一胞内域(P3)处时,来自CSF2RA、IFNAR1、IL1RAP、IL4R、IL6ST、IL11RA、IL12RB2、IL17RA、IL17RD、IL17RE、IL18R1、IL21R、IL23R、MPL及MyD88的第一胞内(P3)域或当这些突变体存在于实施例18中所提供的
构建体中时已知促进某些细胞类型中的信号传导活性的其突变体,在以组合方式考虑具有
来源于该基因的第一胞内域的所有构建体的数据时,在第7天与最后一天之间或第7天与第
21天之间促进PBMC的增生。此结论基于混合培养的PBMC细胞群体中的构建体的序列计数的
富集,使得当针对一个基因将所有构建体的结果组合时,对于库3A,以表上指示的最后一天的标准化计数加一与第7天的标准化计数加一之间的比率的以2为底的对数计算的富集度
为至少2。对于库3B,当以此方式进行分析时,来自CSF2RB、IL4R及MPL的第一胞内域或当这些突变体存在于实施例18中所提供的构建体中时已知促进某些细胞类型中的信号传导活
性的其突变体为最佳进行者。在表12及表15中提供了存在于针对库3A、3B、3.1A及3.1B促进细胞增生的构建体中的第一胞内域或其部分和/或突变体的实例。
[0382] 对于库3A,当出现于本文中的候选嵌合多肽组件的第二胞内域(P4)处时,来自CD3D、CD3G、CD27、CD40、CD79A、CD79B、FCER1G、FCGRA2、ICOS、TNFRSF4及TNFRSF8的第二胞内(P4)域或当这些突变体存在于实施例18中所提供的构建体中时已知促进某些细胞类型中
的信号传导活性的其突变体,在以组合方式考虑具有来源于该基因的第二胞内域的所有构
建体的数据时,在表上所指示的第7天与第21天之间或第7天与最后一天之间促进PBMC的增
生。此结论基于混合培养的PBMC细胞群体中的构建体的序列计数的富集,使得当针对一个
基因将所有构建体的结果组合时,对于库3A,以表上指示的最后一天的标准化计数加一与
第7天的标准化计数加一之间的比率的以2为底的对数计算的富集度为至少2。在表12及表
17中提供了存在于针对库3A及3B促进细胞增生的构建体中的第二胞内域或其部分和/或突
变体的实例。
[0383] 在一初始中期解码分析后,对于库3A,当出现于本文中的候选嵌合多肽组件的第一胞内域(P3)处时,来自IL17RD、IL17RE、IL1RAP、IL23R及MPL的第一胞内(P3)域或已知促进某些细胞类型中的信号传导活性的其突变体,在以组合方式考虑具有来源于该基因的第
一胞内域的所有构建体的数据时,在第7天与第21天之间促进PBMC的增生。对于库3B,当以此方式进行分析时,来自IL21R、MPL或OSMR的第一胞内域或已知促进某些细胞类型中的信
号传导活性的其突变体为最佳进行者。在实施例18中的表中提供了存在于针对库3A及3B促
进细胞增生的构建体中的第一胞内域或其部分和/或突变体的实例。因此,本文提供的CLE
的例示性实施例具有来自IL17RD、IL17RE、IL1RAP、IL23R及MPL F9的胞内域,包括作为第二胞内域(或在说明性实施例中,第一胞内域)保留信号传导活性的其突变体。
[0384] 在一初始解码分析后,对于库3A,当出现于本文中的候选嵌合多肽组件的第二胞内域(P4)处时,来自CD27、CD3G、CD40及CE79B的第二胞内(P4)域或已知促进某些细胞类型中的信号传导活性的其突变体,在以组合方式考虑具有来源于该基因的第二胞内域的所有
构建体的数据时,在表上所指示的第7天与最后一天之间促进PBMC的增生。对于库3B,当以此方式进行分析时,来自CD40的第二胞内域或已知促进某些细胞类型中的信号传导活性的
其突变体为最佳进行者。因此,本文提供的CLE的例示性实施例具有来自CD27、CD3G、CD40及CE79B的胞内域,包括作为第一胞内域(或在说明性实施例中,第二胞内域)保留信号传导活性的其突变体。
[0385] 如表12至表17所显示,当出现于本文中的候选嵌合多肽的第一胞内域(P3)处时,来自MPL、LEPR、MYD88、IFNAR2的第一胞内(P3)域或在一些情况中保留信号传导活性的其突变体,在考虑最频繁出现在顶部候选构建体中的第一胞内域时,在第7天与实验结束之间促进PBMC的增生。存在于针对库3A、3B、3.1A、3.1B、4B及4.1B促进细胞增生的构建体中的第一胞内域或其部分和/或突变体的实例提供于实施例18中的表中。因此,本文提供的CLE的例
示性实施例具有来自MPL、LEPR、MYD88、IFNAR2的胞内域,包括作为第二胞内域(或在说明性实施例中,第一胞内域)保留信号传导活性的其突变体。
[0386] 如表12至表17所显示,当出现于本文中的候选嵌合多肽的第二胞内域(P4)处时,来自CD40、CD79B、CD27的第二胞内(P4)域或在一些情况中保留信号传导活性的其突变体,在考虑最频繁出现在顶部候选构建体中的第一胞内域时,在第7天与表上所指示的最后一
天之间促进PBMC的增生。存在于针对库3A、3B、3.1A、3.1B、4B及4.1B促进细胞增生的构建体中的第一胞内域或其部分和/或突变体的实例提供于实施例18中的表中。因此,本文提供的CLE的例示性实施例具有来自CD40、CD79B、CD27的胞内域,包括作为第一胞内域(或在说明性实施例中,第二胞内域)保留信号传导活性的其突变体。
[0387] 在经分离多肽中的任一者的值得注意的实施例或包含编码促进PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞(亦即,CLE)的细胞增生的嵌合多肽的第一核酸序列及编码包含抗原特异性
靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域的嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列的本文提供的
载体方面及实施例中,第一核酸序列及第二核酸序列可由核糖体跳跃序列隔开。在一些实
施例中,核糖体跳跃序列为F2A、E2A、P2A或T2A。
[0388] 如本文公开,淋巴增生性组件(如在本文中与CLE一起例示)在一些说明性实施例中可包括二聚基元,以有助于增强和/或调节其活性,例如以影响细胞中的信号,诸如影响蛋白质活性或基因表达的信号。此二聚基元通常为其部分或整个胞外域。在一些实施例中,二聚部分可连接至本文中的CLE的胞外域的识别及间隙序列。实际上,在一些实施例中,淋巴增生性组件可包括来自一种蛋白质的整个淋巴增生性组件,除胞外域包括二聚部分以
外。
[0389] 在包括二聚剂及多核苷酸及编码其的核酸的淋巴增生性组件及CLE的一些实施例中,二聚基元可包括来自作为同源二聚物天然地存在的跨膜同源二聚多肽的氨基酸序列。
举例而言,二聚基元可为亮氨酸拉链多肽,例如Jun,如本文中实施例18所例示。在一些实施例中,这些跨膜同源二聚多肽可包括早期活化抗原CD69(CD69)、转移受体蛋白1(CD71)、B细胞分化抗原(CD72)、T细胞表面蛋白触觉(CD96)、内皮因子(Cd105)、杀伤细胞凝集素样受体子族B成员1(Cd161)、P-选凝素糖蛋白配位体1(Cd162)、谷胺酰基胺基肽酶(Cd249)、肿瘤坏死因子受体超家族成员16(CD271)、钙黏蛋白-1(上皮钙黏蛋白)(Cd324)或其活性片段。在
一些实施例中,二聚基元可包括来自在配位体(在本文中也称为二聚物或二聚剂)结合后二
聚的跨膜蛋白的氨基酸序列。在一些实施例中,二聚基元及二聚物可包括(其中二聚物在二聚物结合对后的圆括号里):FKBP及FKBP(雷帕霉素(rapamycin));GyrB及GyrB(香豆霉素
(coumermycin));DHFR及DHFR(甲胺喋呤(methotrexate));或DmrB及DmrB(AP20187)。如上文所提及,雷帕霉素可用作二聚物。替代地,可使用雷帕霉素衍生物或类似物(参见例如
WO96/41865、WO 99/36553、WO 01/14387;及Ye等人(1999)Science 283:88-91)。举例而言,类似物、同源物、衍生物及结构上与雷帕霉素相关的其他化合物(“雷帕霉素类似物”)除此的外包括具有一个或多个与雷帕霉素相关的以下修饰的雷帕霉素的变体:在C7、C42和/或
C29处去甲基化、消除或替换甲氧基;在C13、C43和/或C28处消除、衍生或替换羟基;在C14、C24和/或C30处还原、消除或衍生酮;用5员脯胺酰基环替换6员甲基呱啶环;且对环己基环进行替代取代或用经取代环戊基环替换环己基环。额外信息呈现于例如美国专利第5,525,
610号、第5,310,903号、第5,362,718号及第5,527,907号中。描述了C-28羟基的选择性差向异构(参见例如WO 01/14387)。适用作雷帕霉素的替代物的额外合成二聚剂包括描述于美
国专利公开案第2012/0130076号中的那些。如以上所提及,香豆霉素可用作二聚剂。替代
地,可使用香豆霉素类似物(参见例如Farrar等人(1996)Nature 383:178-181;及美国专利第6,916,846号)。如以上所提及,在一些情况中,二聚剂为甲胺喋呤,例如无细胞毒性、同源双功能性甲胺喋呤二聚物(参见例如美国专利第8,236,925号)。
[0390] 在一些实施例中,当存在于真核细胞的质膜中时,包括二聚基元的淋巴增生性组件(在一说明性实施例中,CLE)可在不存在二聚剂的情况下为活性的。举例而言,包括含亮氨酸拉链的二聚基元或包括来自跨膜同源二聚多肽的二聚基元的淋巴增生性组件可在不
存在二聚剂的情况下为活性的,这些跨膜同源二聚多肽包括CD69、CD71、CD72、CD96、Cd105、Cd161、Cd162、Cd249、CD271、Cd324、其活性突变体和/或其活性片段。在一些实施例中,当存在于真核细胞的质膜中时,包括二聚基元的淋巴增生性组件可在二聚剂的存在下为活性
的。举例而言,包括来自FKBP、GyrB、DHFR或DmrB的二聚基元的淋巴增生性组件可分别在个别二聚剂或其类似物(例如,雷帕霉素、香豆霉素、甲胺喋呤及AP20187)的存在下为活性的。
[0391] 在包括淋巴增生性组件(例如,CLE)(其包括用于二聚包含二聚基元的多肽的二聚物)的方法实施例中,可使用能够产生所需效果的便利手段向宿主(个体)施用二聚物。因
此,可将二聚物并入至多种调配物种以供施用。更特定而言,可通过与合适医药学上可接受的载剂或稀释剂组合将二聚物调配为医药组合物,且可调配为呈固体、半固体、液体或气态形式的制剂,诸如锭剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、药膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂及气雾剂。
[0392] 熟练的技术人员将容易理解,剂量水平可根据特定二聚物、症状的严重程度及个体对副作用的敏感性而变化。可利用多种手段通过熟练此项技术人员来容易地确定给定化
合物的较佳剂量。
[0393] 使用适用于药物递送的任何可用方法及途径向受试者施用二聚物,包括活体内剂离体方法以及全身性及局部施用途径。
[0394] 在其中CLE的胞外域包含二聚基元的任何方面或实施例中,二聚基元可选自由以下组成的群:含亮氨酸拉链基元的多肽、CD69、CD71、CD72、CD96、Cd105、Cd161、Cd162、Cd249、CD271及Cd324,以及其保留二聚能力的突变体和/或活性片段。在其中CLE的胞外域包含二聚基元的方面或实施例中的任一者中,二聚基元可需要二聚剂,且二聚基元及相关
二聚剂可选自由以下组成的群:FKBP及雷帕霉素或其类似物、GyrB及香豆霉素或其类似物、DHFR及甲胺喋呤或其类似物或DmrB及AP20187或其类似物,以及保留二聚能力的所述二聚
蛋白的突变体和/或活性片段。
[0395] 在其中CLE的胞外域包含二聚基元的任何方面或实施例的说明性实施例中,胞外域可包含亮氨酸拉链基元。在一些实施例中,亮氨酸拉链基元来自jun多肽,例如c-jun。在某些实施例中,c-jun多肽为ECD-11的c-jun多肽区。
[0396] 在包括淋巴增生性组件的本文所提供的方面或实施例中的任一者中,淋巴增生性组件可为包含膜靶向区、二聚(多聚)域、第一胞内域及视情况选用的第二胞内域及另外视
情况选用的第三胞内域及视情况选用的第四胞内域的多肽,其中第一胞内域及视情况选用
的第二胞内域、第三胞内域及第四胞内域来自具有表7至表17中所鉴别的胞内域的任何基
因,或选自表7至表17中所鉴别的第一胞内域及第二胞内域中的任一者,且其中该内部二聚和/或多聚淋巴增生性组件促进PBMC(且在说明性实施例中,B细胞、T细胞和/或NK细胞)的
细胞增生。此多肽可在本文中称作内部二聚和/或多聚淋巴增生性组件。在某些实施例中,可将接头添加在域中的任一者之间。在某些实施例中,第一胞内域及第二胞内域不为MyD88及CD40。在一些实施例中,胞内域为MPL或保留促进PBMC细胞增生的能力的其胞内片段。在一些实施例中,胞内域不为MPL或保留促进PBMC细胞增生的能力的其胞内片段。在一些实施例中,胞内域不为MyD88或保留促进PBMC细胞增生的能力的其胞内片段。
[0397] 说明性实施例中的此内部二聚和/或多聚多肽淋巴增生性组件的二聚域位于膜靶向区与第一胞内域之间。在某些实施例中,二聚(或多聚)域包含多聚或二聚配位体结合位
点,诸如FKBP区,例如FKBP12。在一些实施例中,多肽可包含胞外域,诸如本文提供的胞外域中的任一者,例如在实施例17的表7至表11中或在实施例18的表12至表17中,其具有或不具有识别域及间隙域。在某些实施例中,膜靶向区选自由豆蔻酰化区、棕榈酰化区、异戊二烯化区及受体的跨膜序列组成的群。在某些实施例中,膜靶向区为豆蔻酰化区。内部二聚和/或多聚淋巴增生性组件通常经由膜靶向区连接至质膜,例如连接至具有N端肉豆蔻酸盐的
膜。在说明性实施例中,FKBP区结合FK506。
[0398] 一个实施例中之内部二聚和/或多聚淋巴增生性组件为使用脂质可渗透二聚免疫抑制剂药物FK506的类似物的系统的整体部分,其损失其正常生物活性,同时获得交联以基因方式融合至FK506结合蛋白FKBP12的分子的能力。通过将一个或多个FKBP及豆蔻酰化序
列融合至靶受体的胞质信号传导域,可以二聚物药物依赖型但配位体及胞外域独立型方式
刺激信号传导。此为系统提供时间控制、使用单体药物类似物的可逆性,且增强特异性。第三代AP20187/AP1903二聚物药物对于其结合域FKBP12的高亲和力允许活体内特异性活化
重组受体,且无需经由内源性FKBP12诱导非特异性副作用。也可使用与二聚物药物结合的
具有氨基酸取代及缺失的FKBP12变体(诸如FKBP12V36)。另外,合成配位体对蛋白酶分解具有抗性,使得其在活体内活化受体时比大多数所递送蛋白剂更有效。
[0399] 假型组件
[0400] 本文所提供的方法及组合物中的多者包括假型组件。具有异源包膜糖蛋白的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的假型化通常改变病毒的向性且有助于宿主细胞的转导。如本
文所使用的假型组件可包括:“结合多肽”,其包括识别且结合靶标宿主细胞的一种或多种多肽(通常糖蛋白);及一种或多种“促融合多肽”,其介导反转录病毒与靶标宿主细胞膜融合,从而使反转录病毒基因组进入靶标宿主细胞。在本文所提供的一些实施例中,假型组件提供为多肽/蛋白质,或提供为编码多肽/蛋白质的核酸序列。
[0401] 在一些实施例中,假型组件为猫内源性病毒(RD114)包膜蛋白质、双嗜性包膜蛋白质、嗜亲性包膜蛋白质、疱疹性口腔病毒包膜蛋白质(VSV-G),和/或副黏液麻疹包膜蛋白质H及F。
[0402] 在一些实施例中,假型组件包括结合多肽及来源于不同蛋白质的融合多肽。举例而言,本文所公开的方法及组合物中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可通过麻疹病毒
(MV)的融合(F)多肽及凝血素(H)多肽来假型化,作为非限制性实施例,MV的临床野生型菌
株,及包括埃德蒙斯顿菌株(Edmonston strain;MV-Edm)或其片段的疫苗菌株。不受理论限制,认为凝血素(H)及融合(F)多肽两者均可在进入宿主细胞中发挥作用,其中该H蛋白质在靶标细胞上将MV与受体CD46、SLAM及Nectin-4结合,且F介导反转录病毒及宿主细胞膜的融合。在一说明性实施例中,尤其在靶标细胞为T细胞和/或NK细胞时,结合多肽为麻疹病毒H多肽,且融合多肽为麻疹病毒F多肽。
[0403] 在一些研究中,经截短F及H多肽假型化的慢病毒颗粒在效价及转导效率上显著增大(Funke等人.2008.Molecular  Therapy.16(8):1427-1436)、(Frecha等人
.2008.Blood.112(13):4843-4852)。在F胞质尾区被30个残基(也称为MV(Ed)-FΔ30(SEQ 
ID NO:105))截短时获得最高效价。针对H变体,在缺失18个或19个残基(MV(Ed)-HΔ18(SEQ ID NO:106)或(MV(Ed)-HΔ19))时出现最佳截短,但具有24个残基的截短的变体在缺失残
基经丙氨酸置换下及未置换下(MV(Ed)-HΔ24(SEQ ID NO:235)及MV(Ed)-HΔ24+A)也产生
最佳效价。
[0404] 在一些实施例中,包括针对转导T细胞和/或NK细胞的那些,本文公开的方法及组合物中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒经麻疹病毒融合(F)多肽及凝血素(H)多肽的突
变或变异版本(在说明性实施例中,麻疹病毒F及H多肽的胞质域缺失变体)假型化。在一些
实施例中,经突变F及H多肽为“经截短H”或“经截短F”多肽,其的胞质部分已经截短,亦即,氨基酸残基(或编码蛋白质的对应核酸分子的编码核酸)已经缺失。“HΔY”及“FΔX”分别表示此类经截短H及F多肽,其中“Y”是指已自胺基端缺失的1个至34个残基,且“X”是指已自胞质域的羧基端缺失的1个至35个残基。在另一实施例中,“经截短F多肽”为FΔ24或FΔ30和/或“经截短H蛋白质”选自由以下组成的群:HΔ14、HΔ15、HΔ16、HΔ17、HΔ18、HΔ19、HΔ
20、HΔ21+A、HΔ24及HΔ24+4A,更佳地HΔ18或HΔ24。在一说明性实施例中,经截短F多肽为MV(Ed)-FΔ30,且经截短H多肽为MV(Ed)-HΔ18。
[0405] 在一些实施例中,融合多肽包括表达为一种多肽的多种组件。在一些实施例中,结合多肽及融合多肽自相同的转录物但自单独的核糖体结合位点翻译;在其他实施例中,结合多肽及融合多肽由裂解肽位点(其不受理论限制,在翻译之后裂解,如文献中常见)或核
糖体跳跃序列隔开。在一些实施例中,结合多肽及融合多肽自分离的核糖体结合位点的翻
译产生比结合多肽更高量的融合多肽。在一些实施例中,融合多肽与结合多肽的比率为至
少2:1、至少3:1、至少4:1、至少5:1、至少6:1、至少7:1或至少8:1。在一些实施例中,融合多肽与结合多肽的比率在1.5:1、2:1或3:1的范围的低值端点与3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、
9:1或10:1的范围的高值端点之间。
[0406] 活化组件
[0407] 本发明的方法及组合物方面中的多者包括活化组件(在本文中也称作T细胞活化组件),或编码活化组件的核酸。与慢病毒(LV)转导进入静息T细胞中相关的限制归因于一
系列进入前及进入后障壁以及细胞限制因子(Strebel等人2009.BMC Medicine 7:48)。一
个限制为包膜假型化LV颗粒不能识别潜在受体并介导与细胞膜融合。然而,在某些条件下,静息T细胞经基于HIV-1的慢病毒载体的转导最可能在T细胞受体(TCR)CD3复合物及CD28共
刺激后(Korin及Zack.1998.Journal of Virology.72:3161-8,Maurice等人.2002.Blood 
99:2342-50),以及经由暴露于细胞因子(Cavalieri等人2003)。
[0408] 免疫系统的细胞(诸如T淋巴细胞)经由受体或受体复合物识别特异性抗原并与其相互作用,在识别或与此类抗原相互作用时,使得细胞在体内活化并扩增。此受体的实例为抗原特异性T淋巴细胞受体复合物(TCR/CD3)。T细胞受体(TCR)在T淋巴细胞的表面上表达。
一种组分(CD3)负责在TCR由配位体占据之后的胞内信号传导。针对抗原CD3复合物(TCR/
CD3)的T淋巴细胞受体识别通过主要组织兼容性复合物(MHC)的蛋白质呈递至其的抗原性
肽。MHC及肽的复合物在抗原呈现细胞及其他T淋巴细胞标靶的表面上表达。TCR/CD3复合物的刺激导致T淋巴细胞的活化及随后的抗原特异性免疫反应。TCR/CD3复合物在免疫系统的
效应功能及调节上发挥重要作用。因此,本文提供的活化组件通过与T细胞受体相关复合物的一种或多种组分结合,例如通过与CD3结合来活化T细胞。在一些情况中,活化组件可单独活化。在其他情况中,活化需要经由TCR受体复合物活化,以便进一步活化细胞。
[0409] T淋巴细胞还需要第二、共刺激信号以变得完全活性。在无此信号下,T淋巴细胞对结合至TCR的抗原无反应,或变得无变应性。此共刺激信号例如由CD28、在产生抗原细胞上与CD80及CD86相互作用的T淋巴细胞蛋白质提供。如本文所使用,CD80的功能性胞外片段保留其与CD28相互作用的能力。ICOS(诱导性共刺激剂)(另一种T淋巴细胞蛋白质)在结合至ICOS配位体时提供共刺激信号。
[0410] T细胞受体(TCR)CD3复合物的活化及经CD28的共刺激可通过离体暴露于用抗CD3及抗CD28涂布的固体表面(例如,珠粒)上来发生。在本文所公开的方法及组合物中的一些
实施例中,静息T细胞通过暴露于用抗CD3及抗CD28离体涂布的固体表面上来活化。在其他
实施例中,静息T细胞或NK细胞(说明性实施例中,T细胞)通过暴露于可溶性抗CD3抗体(例
如,呈50ng/ml至150ng/ml,或75ng/ml至125ng/ml,或100ng/ml)来活化。在此实施例中,其可为用于以基因方式修饰或转导(在说明性实施例中无需预先活化)的方法的部分,可进行
此活化和/或接触例如8小时或更少、4小时或更少,或2小时与8小时之间、2小时与4小时之间,或2小时与3小时之间。
[0411] 在本文所提供的方法及组合物的某些说明性实施例中,能够结合CD3和/或CD28的多肽在本文所公开的方法及组合物中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上呈现为
“活化组件”,其亦为本发明的方面。结合CD3和/或CD28的多肽称为“活化组件”,这是由于其活化静息T细胞的能力。
[0412] 在一些实施例中,活化组件为能够结合CD3的多肽。在一些实施例中,能够结合CD3的多肽为抗CD3抗体,或其保留结合至CD3的能力的片段。在说明性实施例中,抗CD3抗体或其片段为单链抗CD3抗体,诸如但不限于抗CD3scFv。在另一说明性实施例中,能够结合至CD3的多肽为抗CD3scFvFc。
[0413] 大量抗人类CD3单克隆抗体及其抗体片段为可用的,且可用于本发明,包括(但不限于)UCHT1、OKT-3、HIT3A、TRX4、X35-3、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT31、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII46、XIII-
87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW24B6、OKT3D、M-T301、SMC2及F101.01。
[0414] 在一些实施例中,活化组件为能够结合至CD28的多肽。在一些实施例中,能够结合至CD28的多肽为抗CD28抗体,或其保留结合至CD28的能力的片段。在其他实施例中,能够结合至CD28的多肽为CD80、CD86,或其能够结合CD28且诱导CD28介导的Akt的活化的片段,诸如CD80的外部片段。在本文中的一些方面中,CD80的外部片段表示通常存在于保留结合至CD28的能力的CD80的标准细胞位置中的细胞外部的片段。在说明性实施例中,抗CD28抗体
或其片段为单链抗CD28抗体,诸如但不限于抗CD28scFv。在另一说明性实施例中,能够结合至CD28的多肽为CD80,或CD80的片段,诸如CD80的外部片段。
[0415] 抗CD28抗体在此项技术中为已知的且可包括作为非限制性实施例的单克隆抗体9.3、IgG2a抗体(Dr.Jeffery Ledbetter,Bristol Myers Squibb Corporation,Seattle,
Wash.)、单克隆抗体KOLT-2(IgG1抗体)、15E8(IgG1抗体)、248.23.2(IgM抗体)及EX5.3D10(IgG2a抗体)。
[0416] 在一说明性实施例中,活化组件包括两种多肽,能够结合至CD3的多肽及能够结合至CD28的多肽。
[0417] 在某些实施例中,能够结合至CD3或CD28的多肽为抗体(单链单克隆抗体)或抗体片段(例如单链抗体片段)。因此,抗体片段可为例如单链片段可变区(scFv)、抗体的抗体结合(Fab)片段、单链抗原结合片段(scFab)、无半胱氨酸的单链抗原结合片段(scFabΔC)、片段可变区(Fv)、对抗原的相邻抗原决定基具有特异性的结构(CRAb)或单域抗体(VH或VL)。
[0418] 在本文所公开的实施例中的任一者中,活化组件或编码其的核酸可包括二聚或更高级多聚基元。二聚或多聚基元在此项技术中已知且熟练的技术人员将理解如何将其并入
至多肽中以供有效二聚或多聚。举例而言,在一些实施例中,包括二聚基元的活化组件可为能够与CD3和/或CD28结合的一个或多个多肽。在一些实施例中,能够与CD3结合的多肽为抗CD3抗体或保留与CD3结合的能力的其片段。在说明性实施例中,抗CD3抗体或其片段为单链抗CD3抗体,诸如(但不限于)抗CD3 scFv。在另一说明性实施例中,能够与CD3结合的多肽为抗CD3scFvFc,其在一些实施例中被视为具有二聚基元但不具有任何额外二聚基元的抗
CD3,这是由于已知抗CD3scFvFc构建体能够在不需要单独二聚基元的情况下二聚。
[0419] 在一些实施例中,二聚或多聚基元或编码其的核酸序列可为来自作为同源二聚物或多聚物天然地存在的跨膜多肽的氨基酸序列。在一些实施例中,二聚或多聚基元或编码
其的核酸序列可为来自天然蛋白质或经工程化蛋白质的片段的氨基酸序列。在一个实施例
中,同源二聚多肽为含亮氨酸拉链基元的多肽(亮氨酸拉链多肽)。举例而言,亮氨酸拉链来源于c-JUN,其的非限制性实施例经公开与本文中的嵌合淋巴增生性组件(CLE)有关。
[0420] 在一些实施例中,这些跨膜同源二聚多肽可包括早期活化抗原CD69(CD69)、转移受体蛋白1(CD71)、B细胞分化抗原(CD72)、T细胞表面蛋白触觉(CD96)、内皮因子(Cd105)、杀伤细胞凝集素样受体子族B成员1(Cd161)、P-选凝素糖蛋白配位体1(Cd162)、谷胺酰基胺基肽酶(Cd249)、肿瘤坏死因子受体超家族成员16(CD271)、钙黏蛋白-1(上皮钙黏蛋白)
(Cd324)或其活性片段。在一些实施例中,二聚基元及编码其的核酸可包括来自在配位体
(在本文中也称为二聚物或二聚剂)结合后二聚的跨膜蛋白的氨基酸序列。在一些实施例
中,二聚基元及二聚物可包括(其中二聚物在二聚物结合对后的圆括号里):FKBP及FKBP(雷帕霉素);GyrB及GyrB(香豆霉素);DHFR及DHFR(甲胺喋呤);或DmrB及DmrB(AP20187)。如上文所提及,雷帕霉素可用作二聚物。替代地,可使用雷帕霉素衍生物或类似物(参见例如
WO96/41865、WO 99/36553、WO 01/14387;及Ye等人(1999)Science 283:88-91)。举例而言,类似物、同源物、衍生物及结构上与雷帕霉素相关的其他化合物(“雷帕霉素类似物”)除此的外包括具有一个或多个与雷帕霉素相关的以下修饰的雷帕霉素的变体:在C7、C42和/或
C29处去甲基化、消除或替换甲氧基;在C13、C43和/或C28处消除、衍生或替换羟基;在C14、C24和/或C30处还原、消除或衍生酮;用5员脯胺酰基环替换6员甲基呱啶环;且对环己基环进行替代取代或用经取代环戊基环替换环己基环。额外信息呈现于例如美国专利第5,525,
610号、第5,310,903号、第5,362,718号及第5,527,907号中。描述了C-28羟基的选择性差向异构(参见例如WO 01/14387)。适用作雷帕霉素的替代物的额外合成二聚剂包括描述于美
国专利公开案第2012/0130076号中的那些。如以上所提及,香豆霉素可用作二聚剂。替代
地,可使用香豆霉素类似物(参见例如Farrar等人(1996)Nature 383:178-181;及美国专利第6,916,846号)。如以上所提及,在一些情况中,二聚剂为甲胺喋呤,例如无细胞毒性、同源双功能性甲胺喋呤二聚物(参见例如美国专利第8,236,925号)。
[0421] 在一些实施例中,当存在于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上时,包括二聚基元的活化组件可在不存在二聚剂的情况下为活性的。举例而言,包括来自跨膜同源二
聚多肽的二聚基元的活化组件可在不存在二聚剂的情况下为活性的,这些跨膜同源二聚多
肽包括CD69、CD71、CD72、CD96、Cd105、Cd161、Cd162、Cd249、CD271、Cd324、其活性突变体和/或其活性片段。在一些实施例中,活化组件可为抗CD3单链片段且包括选自由以下组成的群的二聚基元:CD69、CD71、CD72、CD96、Cd105、Cd161、Cd162、Cd249、CD271、Cd324、其活性突变体和/或其活性片段。
[0422] 在一些实施例中,当存在于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上时,包括二聚基元的活化组件可在二聚剂的存在下为活性的。举例而言,包括来自FKBP、GyrB、DHFR或DmrB的二聚基元的活化组件可分别在个别二聚剂或其类似物(例如,雷帕霉素、香豆霉素、甲胺喋呤及AP20187)的存在下为活性的。在一些实施例中,活化组件可为针对抗CD3或抗
CD28的单链抗体片段或结合CD3或CD28的另一分子,且二聚基元及二聚剂可选自由以下组
成的群:FKBP及雷帕霉素或其类似物、GyrB及香豆霉素或其类似物、DHFR及甲胺蝶呤或其类似物,或DmrB及AP20187或其类似物。
[0423] 在一些实施例中,活化组件与异源信号序列和/或异源膜黏附序列融合,其中的两者帮助将活化组件引导至膜上。异源信号序列将活化组件靶向内质网,其中异源膜黏附序
列共价连接至一种或多种脂肪酸(也称为翻译后脂质修饰)使得与异源膜黏附序列融合的
活化组件锚定在质膜的脂质筏中。在一些实施例中,翻译后脂质修饰可经由豆蔻酰化、棕榈酰化或GPI锚定来发生。豆蔻酰化为对应于14-碳饱和脂肪酸(肉豆蔻酸)与真核或病毒蛋白
质的N端甘氨酸的共价连接的翻译后蛋白质修饰。棕榈酰化为对应于C16酰基链与半胱氨
酸,且较少地与蛋白质的丝氨酸及苏氨酸残基的共价连接的翻译后蛋白质修饰。GPI锚定是指在翻译后修饰期间糖基磷脂酰肌醇或GPI与蛋白质C端的连接。
[0424] 在一些实施例中,异源膜连接序列为GPI锚定连接序列。异源GPI锚定连接序列可来源于任何已知的经GPI锚定的蛋白质(评论于Ferguson MAJ,Kinoshita  T,Hart 
GW.Glycosylphosphatidylinositol Anchors.In:Varki A,Cummings RD,Esko JD等人编
.Essentials of Glycobiology.第2版.Cold Spring Harbor(NY):Cold Spring Harbor 
Laboratory Press;2009.第11章)。在一些实施例中,异源GPI锚定连接序列为来自CD14、CD16、CD48、CD55(DAF)、CD59、CD80及CD87的GPI锚定连接序列。在一些实施例中,异源GPI锚定连接序列来源于CD16。在说明性实施例中,异源GPI锚定连接序列来源于Fc受体Fcγ
RIIIb(CD16b)或衰变加速因子(DAF),另外称为补体衰变加速因子或CD55。
[0425] 在一些实施例中,活化组件中的一者或两者包括帮助将活化组件引导至细胞膜的表达的异源信号序列。可使用在包装细胞系中具有活性的任何信号序列。在一些实施例中,信号序列为DAF信号序列。在说明性实施例中,活化组件与在其N端的DAF循环序列及在其C
端的GPI锚定连接序列融合。
[0426] 在一说明性实施例中,活化组件包括与来源于CD14的GPI锚定连接序列融合的抗-CD3 scFvFc,及与来源于CD16b的GPI锚定连接序列融合的CD80;且两者表达于本文所提供
的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上。在一些实施例中,抗CD3 scFvFc与其N端的
DAF信号序列及其C端的来源于CD14的GPI锚定连接序列融合,且CD80与其N端的DAF信号序
列及其C端的来源于CD16b的GPI锚定连接序列融合;且两者皆表达于本文所提供的复制缺
陷型重组反转录病毒颗粒的表面上。在一些实施例中,DAF信号序列包括DAF蛋白质的氨基
酸残基1-30。
[0427] 膜结合的细胞因子
[0428] 本文所提供的方法及组合物方面中的一些实施例包括膜结合细胞因子,或编码膜结合细胞因子的多核苷酸。细胞因子通常但不总为分泌性蛋白质。天然分泌的细胞因子可
经工程化为膜结合的融合蛋白质。膜结合细胞因子融合多肽包括在本文所公开的方法及组
合物中,且也为本发明的方面。在一些实施例中,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒具有在其表面上的能够结合T细胞和/或NK细胞且促进其增生及/存活的膜结合细胞因子融合多肽。
通常地,将膜结合多肽并入至复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的膜中,且在细胞通过复制
缺陷型重组反转录病毒颗粒转导时,反转录病毒及宿主细胞膜的融合产生结合至经转导细
胞的膜的多肽。
[0429] 在一些实施例中,细胞因子融合多肽包括IL-7、IL-15或其活化片段。膜结合细胞因子融合多肽通常为与异源信号序列和/或异源膜连接序列融合的细胞因子。在一些实施
例中,异源膜连接序列为GPI锚定连接序列。异源GPI锚定连接序列可来源于任何已知的经
GPI锚定的蛋白 质(评论于Ferguson  MAJ ,Kinoshita  T ,Hart 
GW.Glycosylphosphatidylinositol Anchors.In:Varki A,Cummings RD,Esko JD等人编
.Essentials of Glycobiology.第2版.Cold Spring Harbor(NY):Cold Spring Harbor 
Laboratory Press;2009.第11章)。在一些实施例中,异源GPI锚定连接序列为来自CD14、CD16、CD48、CD55(DAF)、CD59、CD80及CD87的GPI锚定连接序列。在一些实施例中,异源GPI锚定连接序列来源于CD16。在一些实施例中,异源GPI锚定连接序列来源于Fc受体FcγRIIIb
(CD16b)。在一些实施例中,GPI锚定为DAF的GPI锚定。
[0430] 在说明性实施例中,膜结合细胞因子为与DAF融合的细胞因子的融合多肽。已知DAF积聚在并入至自包装细胞萌芽的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的膜中的脂质筏中。
因此,不受理论限制,认为DAF融合蛋白质较佳靶向包装细胞的膜的部分,该包装细胞将变成重组反转录病毒膜的部分。
[0431] 在非限制说明性实施例中,细胞因子融合多肽为IL-7,或其与DAF融合的活性片段。在一特定非限制说明性实施例中,融合细胞因子多肽依次包括:DAF信号序列(DAF的残基1-31)、无其信号序列的IL-7,及DAF的残基36-525。
[0432] 核糖开关控制组件
[0433] 核糖开关
[0434] 本文所提供的组合物及方法中的一些包括一种或多种核糖开关或包括一种或多种核糖开关的多核苷酸,其本身形成本发明的不同方面。核糖开关为调节基因表达的细菌
中的常见特征,且为实现对生物功能的RNA控制的手段。核糖开关为可存在于mRNA的5’非翻译区中的多核苷酸且经由结合小分子配位体而允许对基因表达的调节控制,该小分子配位
体诱导或抑制核糖开关活性。通常地,核糖开关控制涉及产生小分子配位体的基因产物,由此形成反馈环。核糖开关通常以顺式方式作用,尽管核糖开关已经鉴别以反式方式作用。天然核糖开关由两个域组成:经由三维折叠RNA结构结合配位体的适体域及基于不存在或存
在配位体诱导或抑制核糖开关的活性的功能切换域。因此,核糖开关存在两种配位体敏感
构形,表示开状态及关状态(Garst等人,2011)。功能切换域可通过调节以下来影响多核苷酸的表达:内部核糖体进入位点、反转录病毒基因构建体中易得到之前mRNA剪接供体、前
mRNA剪接、翻译、转录终止、转录物降解、miRNA表达,或shRNA表达(Dambach及Winkler 
2009)。适体域及功能切换域可用作模块化组件,允许合成RNA器件控制基因表达,作为自筛选随机RNA库所识别的天然适体、突变/经进化的天然适体,或全合成适体(McKeague等人
2016)。
[0435] 嘌呤核糖开关家族表示发现超过500个序列的最大家族的一者(Mandal等人2003;US20080269258及WO2006055351)。嘌呤核糖开关与中间环/接合组件(J1-2、L2、J2-3、L3、J3-1)共享由三个保守螺旋组件/茎结构(P1、P2、P3)组成的类似结构。由于序列改变,核糖开关的嘌呤家族的适体域在其与不同嘌呤化合物(诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、腺苷、鸟苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷(图5))的亲和力/调节上自然不同(Kim等人2007)。
[0436] 在一个方面中,本文提供用于调节靶多核苷酸的表达的经分离多核苷酸,包括:编码可操作连接至启动子及核糖开关的靶多核苷酸的多核苷酸,其中该核糖开关包括:a)能够结合核苷类似物抗病毒药物且相对于核苷类似物抗病毒药物与鸟嘌呤或2’-脱氧鸟苷结
合减少的适体域;及b)能够调节靶多核苷酸的表达的功能切换域,其中核苷类似物与适体
域的结合诱导或抑制功能切换域的表达调节活性,从而调节靶基因的表达。在一些实施例
中,靶多核苷酸可为多肽编码区、miRNA或shRNA。在一非限制性实施例中,核糖开关可操作连接至具有活体内活性(例如在治疗疾病时有效)的编码多肽、miRNA或shRNA的核酸。举例
而言,在此非限制性实施例中,核糖开关可操作连接至编码嵌合抗原受体的核酸。在本文所提供的非限制说明性实施例中,靶多核苷酸编码包括在本发明的多种其他方面中的一种或
多种工程化信号传导多肽。在这些非限制说明性实施例中,核糖开关及编码一种或多种工
程化信号传导多肽的靶多核苷酸可出现于包装细胞的基因组中、复制缺陷型重组反转录病
毒颗粒中、T细胞和/或NK细胞中。
[0437] 在一些实施例中,适体域可在30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个及70个核苷酸的长度范围的低值端点与35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个及100个核苷酸的长度范围的高值端点之间,例如长度在45个与80个核苷酸之间,长度在45个与60个核苷酸之间或长度在45个与58个核苷酸之间。在说明性实施例中,核苷类似抗病毒药物可为医药配位体阿昔洛韦(acyclovir)(也称为阿昔洛韦及非球
蛋白)或喷昔洛韦(penciclovir)(图5)。在一些实施例中,适体域对核苷类似抗病毒药物的结合亲和力可比对核苷或核苷酸的结合亲和力大(例如)至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。
[0438] 在一些实施例中,控制组件(例如核糖开关)可操作连接至靶基因且可控制靶基因活体内和/或活体外表达,促进活体内经截短T细胞的扩增。在一些实施例中,扩增取决于控制组件的存在。然而,在其他实施例中,经截短T细胞的扩增可通过其他因素(诸如个体中的白细胞介素的存在)及重组T细胞上的CAR的ASTR与其配位体的结合来至少部分驱动。
[0439] 在一些实施例中,在PBL自血液分离之前、期间和/或之后且在T细胞和/或NK细胞与诱导控制组件的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之前将核苷类似抗病毒药物(例如
阿昔洛韦或喷昔洛韦)施用个体,该控制组件在说明性非限制性实施例中为结合至核苷类
似抗病毒药物且调节一种或多种靶多核苷酸的表达的核糖开关。一种或多种靶多核苷酸可
编码一种或多种多肽,这些多肽在非限制说明性实施例中为一种或多种工程化信号传导多
肽,其中的至少一者编码至少一种淋巴增生性组件。在一些实施例中,在PBL自血液分离之前或在T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之前,在5分钟、10分钟、
15分钟、30分钟与60分钟的范围的低值端点与1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、
8小时、12小时、24小时、48小时或72小时的范围的高值端点之间将核苷类似抗病毒药物(例如阿昔洛韦及喷昔洛韦)施用个体。在一些实施例中,在PBL自血液分离之后或在T细胞和/
或NK细胞与本文所提供的方法中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之后,在1.5小时、
2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时或24小时的范围的低值端点与1/2天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天或28天的范围的高值端点之间将核苷类似抗病毒药物(例如阿昔洛韦及喷昔洛韦)施用个体。在一些实施例中,在PBL自血液分离之后或在T细胞和/或NK细胞与本文所提供的方法中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之
后的至少1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时或24小时,或至少2天、
3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天或28天将核苷类似抗病毒药物(例如阿昔洛韦及喷昔洛韦)施用个体。在一些实施例中,在PBL已再融合至个体之后的至少1天、2天、3天、4天、5天、7天、10天、14天、21天、28天、30天、60天、90天或120天,或5个月、6个月、9个月、12个月、
24个月、36个月、48个月、60个月、72个月、84个月、96个月、120个月或无限期将核苷类似抗病毒药物(例如阿昔洛韦及喷昔洛韦)施用个体。在本文所公开的实施例中的任一者中,可
在PBL的再融合之前和/或期间和/或PBL已再融合之后施用核苷类似抗病毒药物。在一些实
施例中,施用核苷类似抗病毒药物直至个体不再经历靶多核苷酸相关的疾病症状,或不再
罹患该疾病。
[0440] 在一些实施例中,相对于阿昔洛韦或替代地另一抗病毒剂,适体域可优先结合喷昔洛韦,使得可利用伴随的抗病毒疗法而不影响核糖开关。在一些实施例中,适体域可结合喷昔洛韦,且结合亲和力比该适体域结合阿昔洛韦或另一抗病毒剂大(例如)至少2倍、3倍、
4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。
在一些实施例中,相对于喷昔洛韦或替代地另一抗病毒剂,适体域可优先结合阿昔洛韦,使得可利用伴随的抗病毒疗法而不影响核糖开关。在一些实施例中,适体域可结合阿昔洛韦,且结合亲和力比该适体域结合喷昔洛韦或另一抗病毒剂大(例如)至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。在一些实施例中,可向个体给予喷昔洛韦(泛昔洛韦)及阿昔洛韦(伐昔洛韦)的口服前药。
[0441] 在一些实施例中,经分离多核苷酸的适体域可与序列SEQ ID NO:87至SEQ ID NO:93中的任一者共享至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或
99%序列一致性或与其一致,且保留结合阿昔洛韦的能力及相对于核苷类似抗病毒药物结
合鸟嘌呤或2′-脱氧鸟苷的减小的能力,且其中该适体域在被阿昔洛韦结合时仍保留诱导
或抑制功能切换域的表达调节活性的能力。在一些实施例中,经分离多核苷酸的适体域可
与SEQ ID NO:94至SEQ ID NO:100的适体域共享至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、
94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性或与其一致,且保留结合喷昔洛韦的能力及相对于核苷类似抗病毒药物结合鸟嘌呤或2′-脱氧鸟苷的减小的能力,且其中该适体域在
被喷昔洛韦结合时仍保留诱导或抑制功能切换域的表达调节活性的能力。在一些实施例
中,经分离多核苷酸的区或核糖开关的区可与序列SEQ ID NO:87至SEQ ID NO:100中的任
一者共享至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性或与其一致。
[0442] 在一些实施例中,含有经分离多核苷酸的适体域的区的DNA序列可与序列SEQ ID NO:108至SEQ ID NO:221中的任一者共享至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、
95%、96%、97%、98%或99%序列一致性或与其一致。在一些实施例中,经分离多核苷酸的区可与序列SEQ ID NO:108至SEQ ID NO:221中的任一者共享至少80%、85%、90%、91%、
92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性或与其一致。
[0443] 在一些实施例中,含有经分离多核苷酸的适体域的区的DNA序列可与SEQ ID NO:108共享至少80%、85%、90%、91.84%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性或与其一致。在一些实施例中,含有经分离多核苷酸的适体域的区的DNA序列可与SEQ ID NO:147共享至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.83%、96%、
97%、98%或99%序列一致性或与其一致。在一些实施例中,含有经分离多核苷酸的适体域的区的DNA序列可与SEQ ID NO:164共享至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、93.88%、
94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性或与其一致。在一些实施例中,含有经分离多核苷酸的适体域的区的DNA序列可与SEQ ID NO:183共享至少80%、85%、90%、91%、
92%、93%、94%、95%、95.83%、96%、97%、98%或99%序列一致性或与其一致。在一些实施例中,含有经分离多核苷酸的适体域的区的DNA序列可与SEQ ID NO:198共享至少80%、
85%、90%、91%、91.84%、92%、93%、94%、95%、95.83%、96%、97%、98%或99%序列一致性或与其一致。
[0444] 一些实施例中,经分离多核苷酸的区可包括共有序列SEQ ID NO:222至SEQ ID NO:226中的任一者。在一些实施例中,经分离多核苷酸的区可与序列SEQ ID NO:222至SEQ ID NO:226中的任一者共享至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.83%、
96%、97%、98%或99%序列一致性或与其一致。
[0445] 在本文所公开的实施例中的任一者中,经分离多核苷酸可保留结合阿昔洛韦和/或喷昔洛韦的能力。在本文所公开的实施例中的任一者中,经分离多核苷酸可为序列SEQ 
ID NO:87至SEQ ID NO:100或SEQ ID NO:108至SEQ ID NO:221中的任一者的反向补体。在
本文所公开的实施例中的任一者中,经分离多核苷酸可为DNA序列SEQ ID NO:108至SEQ ID NO:221或与SEQ ID NO:108至SEQ ID NO:221互补的DNA序列的转录物或RNA版本。在本文所
公开的实施例中的任一者中,经分离多核苷酸可为RNA序列SEQ ID NO:87至SEQ ID NO:100
中的任一者的反向转录物或DNA版本或与RNA序列SEQ ID NO:87至SEQ ID NO:100中的任一
者的反向转录物互补的DNA链。
[0446] 在本文提供的一些实施例中,核糖开关支架可用于突变分析或分子进化。针对突变分析或分子进化所选择的核糖开关可来自任何已知的组织,例如细菌。在一些实施例中,来自Mesoplasma florum的I-A类脱氧鸟苷核糖开关可用于分子进化。在一些实施例中,衍
生的适体域可与来自Mesoplasma florum的I-A类脱氧鸟苷核糖开关的适体域至少50%、
60%、70%、75%、80%、85%、90%或95%一致(SEQ ID NO:237)。在其他实施例中,可使用来自枯草芽孢杆菌的xpt核糖开关。在一些实施例中,衍生的适体域可与来自枯草芽孢杆菌的xpt核糖开关的适体域至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%或95%一致(SEQ ID NO:243)。
[0447] 适体域可用作分子组件且与功能切换域中的任一者组合以影响RNA转录。在本文公开的实施例中的任一者中,核糖开关可通过调节以下活性中的任一者来影响RNA转录:内部核糖体进入位点(IRES)、前mRNA剪接供体可及性、前mRNA剪接、翻译、转录终止、转录降解、miRNA表达,或shRNA表达。在一些实施例中,功能转换域可控制抗IRES与IRES的结合(参见例如Ogawa,RNA(2011),17:478-488,其公开内容以全文引用的方式并入本文中)。在本文公开的实施例中的任一者中,小分子配位体的存在或不存在可使得核糖开关影响RNA转录。
在一些实施例中,核糖开关可包括核糖核酸酶。具有核糖核酸酶的核糖开关可在存在小分
子配位体的情况下抑制或增强对靶多核苷酸的转录降解。在一些实施例中,核糖核酸酶可
为手枪类核糖核酸酶,锤头类核糖核酸酶、扭曲类核糖核酸酶、斧头类核糖核酸酶,或HDV(丁型肝炎病毒)核糖核酸酶。
[0448] 在本文公开的实施例中的任一者中,核糖开关可定位于相对于靶多核苷酸的不同位置中,如通常对于核糖开关已知。在一些实施例中,核糖开关可调节前mRNA剪接供体可及性或前mRNA剪接且定位于靶多核苷酸之前。在一些实施例中,核糖开关可调节poly(A)尾部之内含物且定位于靶多核苷酸之后。在一些实施例中,核糖开关可调节抗IRES且可定位于
IRES的上游。在非限制性说明性实施例中,本文提供的核糖开关可定位于相对于编码本文
提供的一个或多个工程化信号传导多肽的核酸的这些位置中的任一者中。
[0449] 在包括多核苷酸(包括核糖开关)的本文公开的实施例中的任一者中,该多核苷酸可进一步包括Kozak类型序列、WPRE组件及二重终止密码子或三重终止密码子中的一者或
多者,其中二重终止密码子或三重终止密码子的一个或多个终止密码子定义自一个或多个
转录单元的至少一者的读取终止。在某些实施例中,多核苷酸包括选自以下的Kozak类型序列:CCACCAUG(G)(SEQ ID NO:515)、CCGCCAT/UG(G)(SEQ ID NO:516)、GCCGCCGCCAT/UG(G)(SEQ ID NO:517)或GCCGCCGCCAT/UG。在某些实施例中,与第一核酸序列的起始密码子有关的-3及+4核苷酸两者包括G。在其他实施例中,其可与包括Kozak类型序列之前述实施例和/或包括三重终止密码子的以下实施例组合,多核苷酸包括WPRE组件。在一些实施例中,WPRE组件位于一个或多个转录单元的终止密码子的3’及多核苷酸的3’LTR的5’处。在另一实施例中,其可与前述实施例(亦即,其中多核苷酸包括Kozak类型序列的实施例和/或其中多核苷酸包括WPRE的实施例)组合,一个或多个转录单元经二重终止密码子或三重终止密码子
的一个或多个终止密码子终止。
[0450] 在一些实施例中,核糖开关可在高于37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃,或40℃的温度下不稳定,从而使得核糖开关不再对配位体具有反应性。在一些实施例中,分子进化可用以选择在高于37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃,或40℃的温度下不稳定的核糖开关。
[0451] 在一些实施例中,靶多核苷酸可编码miRNA、shRNA,和/或多肽,其中靶多核苷酸可操作地连接至启动子。在一些实施例中,靶多核苷酸可编码淋巴增生性组件。在一些实施例中,靶多核苷酸可为miRNA或shRNA。在一些实施例中,miRNA或shRNA可增强STAT5路径或抑制SOCS路径。在一些实施例中,miRNA或shRNA可靶向SOCS1、SMAD2、TGFb,或PD-1的转录物。在一些实施例中,miRNA为miR-115。在一些实施例中,靶多核苷酸编码多肽且该多肽可包括包括抗原特异性靶向区的CAR、跨膜域,及胞内活化域。
[0452] 在另一方面中,本文提供用于调节靶多核苷酸的表达的经分离多核苷酸,包括:编码可操作连接至启动子及核糖开关的靶多核苷酸的多核苷酸,其中该核糖开关包括:a)能够结合核苷类似抗病毒药物的适体域,且结合亲和力比适体域结合鸟嘌呤或2’-脱氧鸟苷
的亲和力大至少两倍;及b)能够调节靶多核苷酸的表达的功能切换域,其中核苷类似物与
适体域的结合诱导或抑制功能切换域的表达调节活性。在一些实施例中,适体域可结合核
苷类似抗病毒药物,且结合亲和力比该适体域结合鸟嘌呤或2’-脱氧鸟苷的亲和力大(例
如)至少3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。在一些实施例中,适体域可在范围的低值端点长度为30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个及70个核苷酸与在范围的高值端点长度为35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个及100个核苷酸之间,例如长度在45个与
80个核苷酸之间或长度在45个与58个核苷酸之间。在说明性实施例中,核苷类似抗病毒药
物可为医药配位体阿昔洛韦(也称为阿昔洛韦及非球蛋白)或喷昔洛韦(penciclovir)。在
一些实施例中,适体域可具有比对核苷或核苷酸的结合亲和力大(例如)至少2倍、3倍、4倍、
5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍的对核苷类似抗病毒药物的结合亲和力。在一些实施例中,核苷类似物与适体域的结合可诱导核
糖开关中的活性。
[0453] 在一些实施例中,适体域可对于喷昔洛韦具有特异性且对阿昔洛韦或替代地另一抗病毒剂缺乏反应性,使得可利用伴随抗病毒治疗而不影响核糖开关。在一些实施例中,适体域可结合喷昔洛韦,且结合亲和力比该适体结合阿昔洛韦或另一抗病毒剂大(例如)至少
2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。在一些实施例中,适体域可对于阿昔洛韦具有特异性且对喷昔洛韦或替代地另一抗病毒剂缺乏反应性,使得可利用伴随抗病毒治疗而不影响核糖开关。在一些实施例中,适体域可结合阿昔洛韦,且结合亲和力比该适体结合喷昔洛韦或另一抗病毒剂大(例如)至少
2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。在一些实施例中,可向个体给予喷昔洛韦(泛昔洛韦)及阿昔洛韦(伐昔洛韦)的口服前药。在一些实施例中,衍生的适体结构域可与来自Mesoplasma florum的I-A类脱氧鸟
苷核糖开关的适体结构域至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%一致。在一些实施例中,衍生的适体域可与来自枯草芽孢杆菌的xpt核糖开关的适体结构域至少50%、
60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%一致。在本文公开的实施例中的任一者中,核糖开关可通过调节以下活性中的任一者来影响RNA转录:内部核糖体进入位点、反转录病毒基因构建体中之前mRNA剪接供体可及性、前mRNA剪接、翻译、转录终止、转录降解、miRNA表达,或shRNA表达。在一些实施例中,功能切换域可控制抗IRES与IRES的结合。在本文公开的实施例中的任一者中,小分子配位体的存在或不存在可使得核糖开关影响RNA转录。在一些实施例中,核糖开关可包括核糖核酸酶。具有核糖核酸酶的核糖开关可在存在小分子配位体的
情况下抑制或增强对相关基因的转录降解。在一些实施例中,核糖核酸酶可为手枪类核糖
核酸酶、锤头类核糖核酸酶、扭曲类核糖核酸酶、斧头类核糖核酸酶,或HDV(丁型肝炎病毒)核糖核酸酶。在一些实施例中,核糖开关可在高于37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃,或40℃的温度下不稳定,从而使得核糖开关不再对配位体具有反应性。在一些实施例中,分子进化可用以选择在高于37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃,或40℃的温度下不稳定的核糖开关。在一些实施例中,靶多核苷酸可编码miRNA、shRNA,和/或多肽,其中靶多核苷酸可操作地连接至启动子。在一些实施例中,靶多核苷酸可编码淋巴增生性组件。在一些实施例中,靶多核苷酸可为miRNA,且视情况,miRNA可刺激STAT5路径或抑制SOCS路径。在一些实施例中,miRNA可靶向SOCS1、SHP、SMAD2、TGFb,或PD-1的转录物。在这些实施例中,miRNA为miR-
115。在一些实施例中,靶多核苷酸编码多肽且该多肽可包括包括抗原特异性靶向区的CAR、跨膜域,及胞内活化域。CAR的其他实施例公开于本文的其他处。
[0454] 在一些实施例中,适体的进化可经由使用SELEX(配位体指数富集的系统进化)方法自随机化天然嘌呤或鸟嘌呤适体库进行适体选择来进行,该方法包括(但不限于)在选择
过程及筛选中采用氧化石墨烯的那些方法。在其他实施例中,诸如易错PCR的随机突变方法可用以进化适体构建体或核糖开关构建体,其中该适体通过在活体外或在哺乳动物细胞内
筛选来并入本文所描述的核糖开关活性中的任一者的内容中。在其他实施例中,核苷酸的
随机库可用于核糖开关的进化中。在本文所公开的实施例中的任一者中,可通过在活体外
或在哺乳动物细胞内筛选此类库来识别核糖开关。
[0455] 在一些实施例中,进化或衍生的适体域可增强对天然配位体的类似物的结合且减弱对天然配位体的结合。在一些实施例中,适体域可经配置以增强对天然配位体的类似物
的结合且减弱对天然配位体的结合。在一些实施例中,适体域可衍生自嘌呤核糖开关家族。
在一些实施例中,天然配位体可为核苷或核苷酸且类似物可为核苷类似物或核苷酸类似
物。在一些实施例中,核苷类似物为抗病毒药物。在说明性实施例中,适体域可衍生自2’-脱氧鸟苷及鸟嘌呤核糖开关骨架且衍生的适体域可显示相对于野生型核糖开关的对2’-脱氧
鸟苷及鸟嘌呤的降低的结合。
[0456] 在一些实施例中,核糖开关可调节反转录病毒基因构建体中的前mRNA剪接供体可及性,其中该反转录病毒构建体在一般启动子或T细胞特异性启动子下自反向链驱使CAR基
因或其他相关基因。在其他实施例中,核糖开关可调节反转录病毒基因构建体中的IRES,其中该反转录病毒构建体驱使CAR基因或其他相关基因的翻译。在其他实施例中,核糖开关可控制RNA、miRNA的转录终止或基因转录,或可控制转录的翻译。在其他实施例中,可将核苷类似物核糖开关与核糖核酸酶整合以在核苷类似物的存在下抑制或增强CAR基因或其他相
关基因的转录降解。
[0457] 在一些实施例中,用于调节靶多核苷酸的表达的经分离多核苷酸为分子克隆载体,该靶多核苷酸包括编码可操作地连接至启动子的靶多核苷酸的多核苷酸及结合核苷类
似抗病毒药物的核糖开关。分子克隆载体可为此项技术中已知的任何类型的分子克隆载
体。作为非限制性实施例,载体可为质粒、病毒、复制缺陷型病毒颗粒、反转录病毒、或复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其中的任一者可为表达载体。此表达载体可编码在上文所提
供的靶多核苷酸中的任一者。一个或多个限制和/或多个克隆位点可包括于分子克隆载体
5’或3’至本文所提供的核糖开关上,从而使得该核糖开关可操作地连接至插入至该限制
和/或多个克隆位点中的靶多核苷酸。
[0458] 分子伴侣
[0459] 在一个方面中,本文中提供一种用于以基因方式修饰及扩增个体的淋巴细胞的方法,其包含:
[0460] A.使个体的静息T细胞和/或NK细胞(通常不需要先前离体刺激)与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒离体接触,该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含:
[0461] i.在其表面上的假型组件,该假型组件能够与T细胞和/或NK细胞结合且有助于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒至其上的膜融合;及
[0462] ii.多核苷酸,其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中活化的启动子的一个或多个转录单元,其中该一个或多个转录单元编码由控制组件调节的第一工程化信号传
导多肽,其中该第一工程化信号传导多肽包含至少一个淋巴增生性组件和/或嵌合抗原受
体,
[0463] 其中该接触有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞中的至少一些,从而产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞;
[0464] B.将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞引入至个体中;及
[0465] C.使经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞活体内暴露于充当控制组件的化合物以影响第一工程化信号传导多肽的表达且促进淋巴细胞在活体内的扩增,从而基因方式修
饰且扩增个体的淋巴细胞。
[0466] 在说明性实施例中,在无需离体刺激的情况下进行转导。在说明性实施例中,该化合物为分子伴侣,诸如小分子分子伴侣。在说明性实施例中,分子伴侣与淋巴增生性组件和/或CAR组分的结合增强淋巴增生性组件和/或CAR的增生活性。可在收集血液之前、在接
触期间和/或在将T细胞和/或NK细胞引入至个体中之后将分子伴侣施用至个体。此方面的
一些实施例包括自个体收集血液。在这些实施例中,引入为将在再引入之前经收集且经基
因方式修饰的细胞再引入。说明性实施例中,整个过程为比先前技术方法更短的过程,如对于本文的其他方面而言。举例而言,整个过程可在少于48小时、少于24小时,或少于12小时内完成。在其他实施例中,整个过程可在范围的低值端点为2小时、4小时、6小时,或8小时内完成,且在范围的高值端点为12小时、24小时、36小时或48小时内完成。
[0467] 因此,在本文所提供的方法及组合物的一些实施例中,控制组件为分子伴侣。如与本文中具有其他活体内控制组件(诸如通常结合化合物以影响本文中的第一或第二工程化信号传导多肽的淋巴增生性组件或其他组分的核糖开关)的其他实施例相比,分子伴侣为
作为控制组件的化合物,且因此通过结合至本文中的第一或第二工程化信号传导多肽的淋
巴增生性组件或其他组分来直接影响其活性。在包括施用分子伴侣的本文的方法的此类实
施例的说明性实施例中,淋巴增生性组件、膜结合细胞因子,和/或CAR组分可为较低活性或非活性的淋巴增生性组件、膜结合细胞因子,和/或CAR组分,其由分子伴侣结合以增加其活性。因此,由分子伴侣结合的靶标通常为靶向多肽。在一些实施例中,如所指示,多肽可为第一工程化信号传导多肽和/或第二工程化信号传导多肽,或其多肽组分,其活性通过结合至分子伴侣受影响,其在说明性实施例中为小分子分子伴侣。在一些实施例中,多肽可包括活性经调节的淋巴增生性组件,在说明性实施例中其活性经分子伴侣(较佳地为小分子分子
伴侣)上调。本文所提供的方法中的分子伴侣可为结合至突变淋巴增生性组件和/或非活性
CAR组分,由此使其活化的化合物。
[0468] 在其他实施例中,淋巴增生性组件或其他信号传导域已经突变以仅在存在小分子合成伴侣的情况下允许输送至质膜。在其他实施例中,伴侣作为增强剂促进淋巴增生性组
件或其他信号传导域或蛋白质的稳定性及半衰期
[0469] 将理解,本发明的方面及实施例包括本文详细提供的相同步骤及组合物中的多者。因此,将理解,贯穿本说明书的关于这些共同组件的教示适用于将分子伴侣用作控制组件的方面及实施例,除本文提供的其他体内控制组件(诸如核糖开关)的外或替代地,该分
子伴侣通常直接结合淋巴增生性组件或其他靶分子,该分子伴侣通常利用结合核糖开关的
分子,诸如药物。
[0470] 在一些实施例中,分子伴侣为可调节靶向物的子细胞定位的化合物,例如将诸如淋巴增生性组件和/或CAR的组分的靶向蛋白质自内质网恰当地折叠且输送至质膜或其表
面上的半衰期。在其他实施例中,分子伴侣可促进功能失调靶向物的功能构造,因此充当增强剂。充当天然突变蛋白质的伴侣或增强剂的分子的实例包括鲁玛卡托(lumacaftor)及依
伐卡托(ivacaftor)。这些蛋白质对诸如G551D或F508del的突变CFTR氯通道变体起作用。依伐卡托增强G551D或F508del突变离子通道的活性,而鲁玛卡托促进突变体氯通道的稳定化
及依伐卡托之后续增强。此类伴随依赖性蛋白质可由天然功能性蛋白质产生且仅在存在分
子伴侣的情况下筛选功能活性。因此,此类蛋白质仅在伴侣存在时具有活性。可针对特异性伴侣活性进行筛选的此类分子的实例包括对正常人类蛋白质显示无活性的小分子抗病毒
剂或抗感染剂。因此,在一个实施例中,用于本文的方法中的分子伴侣为对正常人类蛋白质显示无活性的小分子抗病毒化合物或抗感染化合物。
[0471] 在一些实施例中,可暴露经基因方式修饰的淋巴细胞且/或可向个体施用分子伴侣。在一些实施例中,在将PBL自血液分离之前、期间和/或之后及在使T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之前将化合物施用个体。在此类实施例中,复制缺陷
型重组反转录病毒颗粒包括较低活性或非活性的淋巴增生性组件和/或结合至分子伴侣化
合物且由该分子伴侣化合物调节的CAR组分。
[0472] 对于本文所提供的用于修饰及扩增淋巴细胞的实施例中的任一者(其可为过继性细胞疗法方法的一部分),可在PBL自血液分离之前或在使T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型
重组反转录病毒颗粒接触之前,化合物可在范围的低值端点为5分钟、10分钟、15分钟、30分钟及60分钟与在范围的高值端点为1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时,或24小时之间施用个体。在一些实施例中,在PBL自血液分离之后或在T细胞和/或NK细胞与本文所提供的方法中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之后,化合物在范围的
低值端点为1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时或24小时与在范围的高值端点为1/2天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天或28天之间施用个体。在一些实施例中,在PBL自血液分离之后或在T细胞和/或NK细胞与本文所提供的方法中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之后的至少1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时或24小时,或至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天或28天将化合物施用个体。在一些实施例中,在PBL已再融合至个体之后的至少1天、2天、3天、4天、
5天、7天、10天、14天、21天、28天、30天、60天、90天或120天,或5个月、6个月、9个月、12个月、
24个月、36个月、48个月、60个月、72个月、84个月、96个月、120个月或无限期将化合物施用个体。在本文所公开的实施例中的任一者中,可在PBL的再融合之前和/或期间和/或PBL已
再融合之后施用化合物。
[0473] 对于本文所提供的实施例中的任一者,分子伴侣不在化合物所结合的控制组件中,该化合物调节和/或活化这些控制组件。分子伴侣为作为控制组件且调节淋巴增生性组件和/或CAR的功能性组分的活性的化合物,较佳地小分子化合物。
[0474] 制造重组反转录病毒颗粒的包装细胞系/方法
[0475] 本发明提供产生复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的哺乳动物包装细胞及包装细胞系。产生复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的这些细胞系在本文中也称作包装细胞系。本
文的实施例7中提供此方法的一非限制性实施例。包装细胞系的细胞可为黏着细胞或悬浮
细胞。在说明性实施例中,包装细胞系可为悬浮细胞系,亦即在生长期间不黏着至表面的细胞系。这些细胞可在化学上定义的培养基和/或无血清培养基中生长。在一些实施例中,包装细胞系可为来源于黏着细胞系的悬浮细胞系,例如HEK293可在根据此项技术中已知的方
法产生适应悬浮的HEK293细胞系的条件下生长。包装细胞系通常在化学上定义的培养基中
生长。在一些实施例中,包装细胞系培养基可包括血清。在一些实施例中,包装细胞系培养基可包括血清替代物,如此项技术中已知。在说明性实施例中,包装细胞系培养基可为无血清培养基。此培养基可为按照美国食品及药物管理局(US  Food  and  Drug 
Administration;FDA)的现行药品优良制造实践(Current Good Manufacturing 
Practice;CGMP)条例制造的化学上定义的无血清调配物。包装细胞系培养基可为无异源的及完整的。在一些实施例中,包装细胞系培养基由管理机构清除以用于离体细胞处理,诸如FDA 510(k)清除装置。在本文中(其中陈述培养基包括基底培养基与包括培养基补充物的
目录编号诸如A1048501或A1048503的培养基补充物的组合物)应理解,所述组合物意在表
示培养基与所添加补充物的组合物。通常,培养基及补充物的制造提供关于所添加补充物
的量的说明。
[0476] 因此,在一个方面中,本文提供一种制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法,其包括:A.在含悬浮液的无血清培养基中培养包装细胞,其中该包装细胞包含编码复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的可包装RNA基因组、REV蛋白质、gag多肽、pol多肽及假型组件的核酸序列;及B.自无血清培养基采集复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。在另一方面中,本文提供一种用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导淋巴细胞的方法,其包含:A.在含悬浮液
的无血清培养基中培养包装细胞,其中该包装细胞包含编码复制缺陷型重组反转录病毒颗
粒的可包装RNA基因组、REV蛋白质、gag多肽、pol多肽及假型组件的核酸序列;B.自无血清培养基采集复制缺陷型重组反转录病毒颗粒;及C.使淋巴细胞与复制缺陷型重组反转录病
毒颗粒接触,其中进行该接触少于24小时、20小时、18小时、12小时、8小时、4小时或2小时(或在范围的低值端点为1小时、2小时、3小时或4小时与范围的高值端点为4小时、6小时、8小时、12小时、18小时、20小时或24小时之间),由此转导淋巴细胞。
[0477] 在另一个方面中,本文提供反转录病毒包装系统,其包括:哺乳动物细胞,其包括:a)第一反式激活因子,其由组成性启动子表达且能够结合第一配位体及第一可诱导启动子
以在存在与不存在第一配位体的情况下影响可操作地连接至其的核酸序列的表达;b)第二
反式激活因子,其能够结合第二配位体及第二可诱导启动子,且在存在与不存在第二配位
体的情况下影响可操作地连接至其的核酸序列的表达;及c)反转录病毒颗粒的可包装RNA
基因组,其中该第一反式激活因子调节该第二反式激活因子的表达,且其中该第二反式激
活因子调节包含于病毒包装中的反转录病毒多肽的表达,该反转录病毒多肽为诸如gag多
肽、pol多肽和/或假型组件及视情况可选的将并入复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中或并
入复制缺陷型重组反转录病毒颗粒上且被认为对包装细胞系具有毒性的其他多肽,例如
HEK-293。在某些方面中,第二反式激活因子自身对于包装细胞系具有细胞毒性。假型组件通常能够结合至靶细胞的细胞膜且有助于其融合,如本文所详细论述。因此,不受理论限
制,系统提供积聚无法抑制或无法实质上抑制或被认为无法抑制哺乳动物细胞的增生或存
活的某些多肽/蛋白质(例如非毒性蛋白质)的能力,同时培养哺乳动物细胞种群持续数天
或无限期,且控制期望用于反转录病毒产物但对哺乳动物细胞的存活和/或增生具有抑制
性或可具有抑制性或已经报道具有抑制性的多肽(例如毒性多肽)的诱导,直至接近将产生
并采集复制缺陷型重组反转录病毒颗粒时的较晚时间。可包装RNA基因组通常由可操作地
连接至启动子(出于方便起见有时在本文中称为第三启动子)的多核苷酸编码,其中该第三
启动子通常可由第一反式激活因子抑或第二反式激活因子诱导。在说明性实施例中,可包
装RNA基因组由可操作地连接至第三启动子的多核苷酸编码,其中该第三启动子由第二反
式激活因子诱导。因此,可包装RNA基因组可在接近将采集复制缺陷型重组反转录病毒颗粒时的较晚时间点处产生。
[0478] 熟练此项技术人员将理解,许多不同的反式激活因子、配位体,及可诱导启动子可用于反转录病毒包装系统中。此类可诱导启动子可分离且来源于许多生物,例如真核生物及原核生物。对用于第二生物中的来源于第一生物的可诱导启动子(例如第一原核生物及
第二真核生物、第一真核生物及第二原核生物,等)的修饰为此项技术中已知的。此类可诱导启动子,及基于此类可诱导启动子但也包括其他控制蛋白质的系统包括(但不限于)醇调
节的启动子(例如醇脱氢酶I(alcA)基因启动子、对醇反式激活因子蛋白质具有反应性的启
动子(AlcR)等)、四环素调节的启动子(例如包括TetActivators、TetON、TetOFF等的启动子系统)、类固醇调节的启动子(例如大鼠糖皮质激素受体启动子系统、人类雌性激素受体启
动子系统、类视黄素启动子系统、甲状腺启动子系统、蜕皮激素启动子系统、米非司酮启动子系统等)、金属调节的启动子(例如金属硫蛋白启动子系统等)、相关病原调节的启动子
(例如水杨酸调节的启动子、乙烯调节的启动子、苯并噻二唑调节的启动子等)、温度调节的启动子(例如热休克可诱导启动子(例如HSP-70、HSP-90、大豆热休克启动子等))、光调节的启动子、合成可诱导启动子,及类似者。在一些实施例中,可使用米非司酮调节的系统。在一些实施例中,可使用具有自动调节反馈环路的米非司酮可诱导系统。在一些实施例中,GAL4调节融合蛋白质由也含有转座子端重复位点及lox位点及FRT位点的一个构建体表达。在一
些实施例中,GAL4调节融合蛋白质控制反向tet反式激活因子(rtTA)及BiTRE的表达。在一
些实施例中,具有lox位点及FRT位点的另一构建体含有GAL4上游活化序列(UAS)及驱动如
mCherry的报道子的E1b TATA盒启动子。在一些实施例中,GAL4调节融合蛋白在控制GAL4调节融合蛋白的表达的启动子及控制靶多核苷酸的表达的启动子两者上结合GAL4上游活化
序列(UAS)。在一些实施方案中,米非司酮、多西环素及嘌呤霉素将用于包装细胞系的诱导及选择。
[0479] 在一些实施例中,反式激活因子中的任一者或两者可以分成两个或更多个多肽。在一些实施例中,该两个或更多个多肽可包括DNA结合域及能够刺激单独多肽上的转录的
活化域。此“活化域”不与“活化组件”混淆,诸如结合CD3的多肽,其能够活化T细胞和/或NK细胞,且在与此T细胞和/或NK细胞接触时通常将其活化,如本文所详细论述。分离的多肽可进一步包括具有能够通过添加配位体而二聚的多肽的融合物。在一些实施例中,活化域可
为p65活化域或其功能片段。在本文的包装系统的说明性实施例中,DNA结合域可为来自
ZFHD1的DNA结合域或其功能片段。在一些实施例中,一个多肽可为具有FKBP或其功能突变
体和/或其片段或多个FKBP的融合物,且另一多肽可为具有mTOR的FRB域或其功能突变体
和/或其片段的融合物,且配位体可为雷帕霉素或功能性雷帕类似物。在一些实施例中,FRB含有突变体K2095P、T2098L和/或W2101F。在一些实施例中,分离的多肽可为FKBP或其功能片段,及CalcineurinA或其功能片段,且二聚剂可为FK506。在一些实施例中,分离的多肽可为FKBP或其功能片段,及CyP-Fas或其功能片段,且二聚剂可为FKCsA。在一些实施例中,分离的多肽可为GAI或其功能片段,及GID1或其功能片段,且二聚剂可为赤霉素。在一些实施例中,分离的多肽可为Snap-tag及HaloTag或其功能片段且二聚剂可为HaXS。在一些实施例中,分离的多肽可包括相同的多肽。举例而言,DNA结合域及活化结构域可表达为具有FKBP或GyrB的融合蛋白,且二聚剂可分别为FK1012或香豆霉素。在一些实施例中,可诱导启动子可为DNA结合域通常结合的DNA序列。在一些实施例中,可诱导启动子可不同于DNA结合域通常结合的DNA序列。在一些实施例中,反式激活因子可为rtTA,配位体可为四环素或多西环素,且可诱导启动子可为TRE。在说明性实施例中,第一反式激活因子为融合至FRB的p65活化域及融合至三个FKBP多肽的ZFHD1 DNA结合域,且第一配位体为雷帕霉素。在其他说明性实施例中,第二反式激活因子可为rtTA,第二配位体可为四环素或多西环素,且可诱导启动子可为TRE。
[0480] 在一些实施例中,第一反式激活因子可调节组件的表达以控制含有共有序列的转录物的核输出,诸如HIV Rev,且该共有序列可为Rev反应组件。在说明性实施例中,靶细胞为T细胞。
[0481] 在一些实施例中,假型组件为反转录病毒包膜多肽。假型组件通常包括用于将靶细胞与病毒膜结合并促进靶细胞与病毒膜的膜融合的结合多肽及融合多肽,如本文更详细
地论述。在一些实施例中,假型组件为猫内源性病毒(RD114)包膜蛋白质、肿瘤反转录病毒双嗜性包膜蛋白质、肿瘤反转录嗜亲性包膜蛋白质和/或水泡性口炎病毒包膜蛋白质(VSV-
G)。在说明性实施例中,假型组件包括结合多肽及衍生自不同蛋白质的融合多肽,如本文进一步详细论述。举例而言,在说明性实施例中,尤其在靶细胞为T细胞和/或NK细胞时,结合多肽为麻疹病毒的凝血素(H)多肽(例如麻疹病毒的埃德蒙斯顿菌株(Edmonston strain))
或其细胞质域缺失变体,且其他融合多肽为麻疹病毒的融合(F)多肽(例如麻疹病毒的埃德
蒙斯顿菌株)或其细胞质域缺失变体。在一些实施例中,融合多肽可包括表达为一个多肽的多个组件。在一些实施例中,结合多肽及融合多肽可翻译自同一转录物,但翻译自不同核糖体结合位点,或在翻译后使用肽裂解信号或核糖体跳过序列来裂解多肽,如本文其他处所
公开,以产生结合多肽及融合多肽。在一些实施例中,当结合多肽为麻疹病毒H多肽或其细胞质域缺失,且融合多肽为麻疹病毒F多肽或其细胞质域缺失时,F多肽及H多肽自分离的核糖体结合位点的翻译产生比H多肽更高量的F多肽。在一些实施例中,F多肽(或其细胞质域
缺失)与H多肽(或其细胞质域缺失)的比率为至少2:1、至少3:1、至少4:1、至少5:1、至少6:
1、至少7:1,或至少8:1。
[0482] 在一些实施例中,第一反式激活因子可调节能够结合并活化靶细胞(诸如T细胞或NK细胞)的活化组件的表达。可表达本文所公开的任何活化组件。举例而言,在这些实施例中,活化组件可包括:a.)能够结合并活化CD3的膜结合多肽;和/或b.)能够结合并活化CD28的膜结合多肽。在一些实施例中,能够结合至且活化CD3的膜结合多肽可为抗CD3抗体。在其他实施例中,抗CD3抗体可为抗CD3 scFvFc。在一些实施例中,能够结合并活化CD28的膜结合多肽为CD80、CD86或其功能片段,诸如CD80的细胞外域。
[0483] 在一些实施例中,第二反式激活因子可调节可包装RNA基因组的表达,该可包装RNA基因组可包括编码一种或多种靶标多肽的RNA,作为非限制性实施例包括本文公开的工
程化信号传导多肽中的任一者和/或一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子。应注
意,可预见反转录病毒包装系统方面及制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法方面不
限于制备用于转导T细胞和/或NK细胞的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,而也适用于可通
过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导的任何细胞类型。在一些说明性实施例中,可包装
RNA基因组经设计以表达一种或多种靶标多肽,作为非限制性实施例包括本文所公开的工
程化信号传导多肽中的任一者和/或一种或多种(例如两种或更多种)与诸如gag及pol的反
转录病毒组分相反定向(例如,在相反链上且在相反方向上编码)的抑制性RNA分子。举例而言,可包装RNA基因组包括5’至3’:5’长末端重复或其活性截短片段;编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件的核酸序列;编码第一靶标多肽及视情况存在的第二靶标多肽的核酸序
列,靶标多肽为诸如但不限于呈相反定向的工程化信号传导多肽,其可相对于5’长末端重复及顺式作用RNA包装组件以此相反方向驱动启动子,该启动子在一些实施例中仅出于方
便起见称为“第四”启动子(且有时在本文中称为在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动
子),其在诸如T细胞和/或NK细胞的靶细胞中具有活性,但在说明性实施例中,在包装细胞中不具有活性,或在包装细胞中仅具有诱导性或最小活性;及3’长末端重复或其活性截短片段。在一些实施例中,可包装RNA基因组可包括中枢聚嘌呤区域(cPPT)/中枢终止序列
(CTS)组件。在一些实施例中,反转录病毒顺式作用RNA包装组件可为HIV Psi。在一些实施例中,反转录病毒顺式作用RNA包装组件可为Rev反应组件。在例示性实施例中,由与5’长末端重复相反定向的启动子驱动的工程化信号传导多肽为本文所公开的一种或多种工程化
信号传导多肽,且可视情况表达如本文更详细公开的一种或多种抑制性RNA分子。
[0484] 应理解,诸如第一启动子、第二启动子、第三启动子、第四启动子等的启动子编号仅出于方便起见。除非明确地叙述其他启动子,否则称为“第四”启动子的启动子不应被视为暗示存在任何其他启动子,诸如第一启动子、第二启动子或第三启动子。应注意,这些启动子中的每一者能够驱动转录物以适当细胞类型表达,且此类转录物形成转录单元。
[0485] 在一些实施例中,工程化信号传导多肽可包括第一淋巴增生性组件。适合的淋巴增生性组件公开于本文中的其他部分中。作为非限制性实施例,淋巴增生性组件可表达为
具有识别域的融合物,诸如eTag,如本文所公开。在一些实施例中,可包装RNA基因组可进一步包括编码第二工程化多肽的核酸序列,包括编码本文所提供的任何CAR实施例的嵌合抗
原受体。举例而言,第二工程化多肽可包括第一抗原特异性靶向区、第一跨膜域,及第一胞内活化域。抗原特异性靶向区、跨膜域及胞内活化域的实例公开于本文其他处。在靶细胞为T细胞的一些实施例中,在靶细胞中具有活性的启动子在T细胞中具有活性,如本文其他处
所公开。
[0486] 在一些实施例中,工程化信号传导多肽可包括CAR,且核酸序列可编码本文所提供的任何CAR实施例。举例而言,工程化多肽可包括第一抗原特异性靶向区、第一跨膜域及第一胞内活化域。抗原特异性靶向区、跨膜域及胞内活化域的实例公开于本文其他处。在一些实施例中,可包装RNA基因组可进一步包括编码第二工程化多肽的核酸序列。在一些实施例中,第二工程化多肽可为淋巴增生性组件。在其中靶细胞为T细胞或NK细胞的一些实施例
中,在靶细胞中具有活性的启动子在T细胞或NK细胞中具有活性,如本文其他处所公开。
[0487] 在一些实施例中,可包装RNA基因组可进一步包括核糖开关,如本文其它部分所论述。在一些实施例中,编码工程化信号传导多肽的核酸序列可呈反向定向。在其他实施例
中,可包装RNA基因组可进一步包括核糖开关,且视情况该核糖开关可呈反向定向。在本文所公开的实施例中的任一者中,包括这些组件中的任一者的多核苷酸可包括引物结合位
点。在说明性实施例中,转录阻断剂或polyA序列可置放于基因附近以防止或减少未经调节的转录。在本文所公开的实施例中的任一者中,编码Vpx的核酸序列可位于第二转录单元上或视情况存在的第三转录单元上,或位于可操作地连接至第一可诱导启动子的额外转录单
元上。
[0488] 在本文中的另一方面中提供一种包含复制缺陷型反转录病毒颗粒的可包装RNA基因组的哺乳动物包装细胞系,其中该可包装RNA基因组包含:
[0489] a.5’长末端重复或其活化片段;
[0490] b.编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件的核酸序列;
[0491] c.多核苷酸,其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列,其中一种或多种核酸中的第一核酸序列编码针对一种或多种RNA靶
标的一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子,且一种或多种核酸中的第二核酸序
列编码嵌合抗原受体(CAR),该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域;及
[0492] d.3’长末端重复或其活化片段。
[0493] 以上方面中的抑制性RNA分子可包括在本公开的其它部分中所提供的抑制性RNA分子中的任一者,作为非限制性实施例,shRNA或miRNA。
[0494] 在哺乳动物包装细胞系方面的一些实施例中,(c)的多核苷酸可与编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件(b)、5’长末端重复(a)和/或3’长末端重复(d)的核酸序列呈相反定向。
[0495] 在哺乳动物包装细胞系方面的一些实施例中,可包装RNA基因组的表达通过在哺乳动物包装细胞系中具有活性的诱导型启动子驱动。
[0496] 在说明性实施例中,在驱动上文紧接着提供的这些方面中的可诱导RNA及CAR的表达的T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子,在包装细胞系中不具有活性或仅具有最小活
性或可诱导活性。在说明性实施例中,在T细胞和/或NK细胞中具有活性的此启动子位于编
码一(例如两种)或多种可诱导RNA及CAR及3’LTR的核酸之间的可包装RNA基因组上。
[0497] 在涉及编码针对一种或多种RNA靶向物的一种或多种抑制性RNA分子的可包装细胞或细胞系的方面中的任一者中,至少一种抑制性RNA分子及在一些实施例中,所有抑制性RNA分子可包括彼此部分地或完全互补的5’链及3’链,其中该5’链及该3’链能够形成18个至25个核苷酸RNA双螺旋体。在一些实施例中,5’链长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸,且3’链长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施例中,5’链及3’链长度可相同或不同。在一些实施例中,RNA双螺旋可包括一个或多个错配。在替代实施例中,RNA双螺旋不具有错配。
[0498] 在上文针对本文的编码针对一种或多种RNA靶向物的抑制性RNA分子的可包装细胞或细胞系所提供的方面中的任一者中,抑制性RNA分子可为miRNA或shRNA。在一些实施例中,抑制性分子可为miRNA之前体,诸如Pri-miRNA或Pre-miRNA,或shRNA之前体。在一些实施例中,一种或多种抑制性RNA分子可为人工衍生的miRNA或shRNA。在其他实施例中,抑制性RNA分子可为经处理成siRNA的dsRNA(经转录或人工引入)或siRNA本身。在一些实施例
中,抑制性RNA分子可为miRNA或shRNA,其具有在自然界中未发现的序列,或具有在自然界中未发现的至少一个功能区段,或具有在自然界中未发现的功能区段的组合。在说明性实
施例中,抑制性RNA分子中的至少一者或全部为miR-155。
[0499] 在上文针对本文的编码针对一种或多种RNA靶向物的抑制性RNA分子的可包装细胞或细胞系所提供的方面中的任一者中,该一种或多种抑制性RNA分子在一些实施例中可
包含自5’至3’定向:5’臂、5’茎、环、与该5’茎部分或完全互补的3’茎,及3’臂。在一些实施例中,两种或更多种抑制性RNA分子中的至少一者具有此排列。在其他实施例中,两个或更多个抑制性RNA分子的全部均具有此排列。在一些实施例中,5’茎长度可为18、19、20、21、
22、23、24或25个核苷酸。在一些实施例中,3’茎长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施例中,环长度可为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、
21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。在一些实施例中,5’臂、3’臂或两者均衍生自天然存在的miRNA。在一些实施例中,5’臂、3’臂或两者均衍生自天然存在的miRNA,该miRNA选自以下组成的群:miR-155、miR-30、miR-17-92、miR-
122及miR-21。在说明性实施例中,5’臂、3’臂或两者均衍生自miR-155。在一些实施例中,5’臂、3’臂或两者均衍生自小家鼠miR-155或智人miR-155。在一些实施例中,5’臂具有SEQ ID NO:256中所阐述的序列或为其功能变体,诸如与SEQ ID NO:256长度相同,或为SEQ ID NO:
256的长度的95%、90%、85%、80%、75%,或50%,或为100个核苷酸或更少、95个核苷酸或更少、90个核苷酸或更少、85个核苷酸或更少、80个核苷酸或更少、75个核苷酸或更少、70个核苷酸或更少、65个核苷酸或更少、60个核苷酸或更少、55个核苷酸或更少、50个核苷酸或更少、45个核苷酸或更少、40个核苷酸或更少、35个核苷酸或更少、30个核苷酸或更少,或25个核苷酸或更少;且与SEQ ID NO:256至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、
90%或95%一致的序列。在一些实施例中,3’臂具有SEQ ID NO:260中所阐述的序列或为其功能变体,例如与SEQ ID NO:260相同的长度,或为SEQ ID NO:206的长度的95%、90%、
85%、80%、75%,或50%,或为100个核苷酸或更少、95个核苷酸或更少、90个核苷酸或更少、85个核苷酸或更少、80个核苷酸或更少、75个核苷酸或更少、70个核苷酸或更少、65个核苷酸或更少、60个核苷酸或更少、55个核苷酸或更少、50个核苷酸或更少、45个核苷酸或更少、40个核苷酸或更少、35个核苷酸或更少、30个核苷酸或更少,或25个核苷酸或更少;且与SEQ ID NO:260至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%一致的序列。在一些实施例中,3’臂包含小家鼠BIC的核苷酸221至283。
[0500] 在另一方面中,本文提供用于制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法,其包括:培养包装细胞群以积聚第一反式激活因子,其中这些包装细胞包括由组成性启动子表
达的第一反式激活因子,其中该第一反式激活因子能够结合第一配位体及第一可诱导启动
子,以在存在与不存在第一配位体的情况下影响可操作地连接至其上的核酸序列的表达,
且其中第二反式激活因子的表达由第一反式激活因子调节;在第一配位体的存在下培育包
括积聚的第一反式激活因子的包装细胞群以积聚第二反式激活因子,其中第二反式激活因
子能够结合第二配位体及第二可诱导启动子,以在存在与不存在第二配位体的情况下影响
可操作地连接到其上的核酸序列的表达;且在第二配位体的存在下培育包括积聚的第二反
式激活因子的包装细胞群,从而诱导涉及病毒包装的反转录病毒多肽的表达,诸如gag多
肽、pol多肽和/或假型组件,及视情况存在的被认为抑制哺乳动物细胞增生或存活的其他
多肽,其将并入复制缺陷型重组反转录病毒中或并入其上,从而制得复制缺陷型重组反转
录病毒颗粒。在说明性实施例中,可包装RNA基因组由可操作地连接至启动子(出于方便起
见有时称作“第三”启动子)的多核苷酸编码,其中该第三启动子具有组成性活性或可由第一反式激活因子或在说明性实施例中由第二反式激活因子诱导,从而制得复制缺陷型重组
反转录病毒颗粒。假型组件通常能够结合靶细胞的细胞膜且促进靶细胞膜与复制缺陷型重
组反转录病毒颗粒膜的融合。假型组件可为此项技术中已知的任何包膜蛋白质。在一些实
施例中,包膜蛋白质可为水泡性口炎病毒包膜蛋白质(VSV-G)、猫内源性病毒(RD114)包膜
蛋白质、肿瘤反转录病毒双嗜性包膜蛋白质和/或肿瘤反转录嗜亲性包膜蛋白质。熟练此项技术这将理解,多种不同反式激活因子、配位体,及可诱导启动子可用于制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法中。适合的反式激活因子、配位体,及可诱导启动子公开于本文中其他处,包括上文中。熟练的业内人士将进一步理解,与本文提供的反转录病毒包装系统方面相关的上述教示也适用于制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法,且反之亦
然。
[0501] 在一些实施例中,第一反式激活因子可调节组件的表达以控制含有共有序列的转录物的核输出,诸如HIV Rev,且共有序列可为Rev反应组件(RRE)。在说明性实施例中,靶细胞通常为T细胞。在一些实施例中,HIV RRE及编码HIV Rev的多核苷酸区域可分别由HIV-
2RRE及编码HIV-2Rev的多核苷酸区域替代。在一些实施例中,HIV RRE及编码HIV Rev的多
核苷酸区域可分别由SIV RRE及编码SIV Rev的多核苷酸区域替代。在一些实施例中,HIV 
RRE及编码HIV Rev的多核苷酸区域可分别由RemRE及编码β反转录病毒Rem的多核苷酸区域
替代。在一些实施例中,HIV RRE及编码HIV Rev的多核苷酸区域可分别由δ反转录病毒
RexRRE及编码δ反转录病毒Rex的多核苷酸区域替代。在一些实施例中,不需要Rev类蛋白质且PRE可由诸如组成性转运组件(CTE)的顺式作用RNA组件替代。
[0502] 在一些实施例中,假型组件为病毒包膜蛋白质。假型化分析组件通常包括用于将病毒与靶细胞膜结合并促进病毒与靶细胞膜的膜融合的结合多肽及融合多肽。在一些实施
例中,假型组件可为猫内源性病毒(RD114)包膜蛋白质、肿瘤反转录病毒双嗜性包膜蛋白
质、肿瘤反转录嗜亲性包膜蛋白质和/或水泡性口炎病毒包膜蛋白质(VSV-G)。在说明性实
施例中,假型组件包括结合多肽及衍生自不同蛋白质的融合多肽,如本文进一步详细论述。
举例而言,在一说明性实施例中,尤其在靶细胞为T细胞和/或NK细胞时,结合多肽可为麻疹病毒H多肽的细胞质域缺失变体且融合多肽可为麻疹病毒F多肽的细胞质域缺失变体。在一
些实施例中,融合多肽可包括表达为一个多肽的多个组件。在一些实施例中,结合多肽及融合多肽可翻译自同一转录物且翻译自不同核糖体结合位点,或可在翻译后使用肽裂解信号
或核糖体跳过序列来裂解多肽,如本文其他处所公开,以产生结合多肽及融合多肽。在一些实施例中,结合多肽及融合多肽自分离的核糖体结合位点的翻译产生比结合多肽更高量的
融合多肽。在一些实施例中,融合多肽与结合多肽的比率为至少2:1、至少3:1、至少4:1、至少5:1、至少6:1、至少7:1,或至少8:1。
[0503] 在一些实施例中,第一反式激活因子可调节能够结合并活化诸如T细胞的靶细胞的活化组件的表达。在这些实施例中,活化组件可包括:a.)能够结合并活化CD3的膜结合多肽;和/或b.)能够结合并活化CD28的膜结合多肽。在一些实施例中,能够结合并活化CD28的膜结合多肽为CD80、CD86或其功能片段。在一些实施例中,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可包括反转录病毒膜上的活化组件及核衣壳内的反转录病毒RNA,从而制得复制缺陷型重
组反转录病毒颗粒。
[0504] 在一些实施例中,第二反式激活因子可调节包括自5’至3’的RNA的表达:5’长末端重复或其活性截短片段;编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件的核酸序列;编码第一靶标多肽及视情况存在的第二靶标多肽(作为非限制性实施例,一或两种工程化信号传导多肽)的核酸序列;在靶细胞中具有活性的启动子;及3’长末端重复或其活性截短片段。在一些实施例中,RNA可包括cPPT/CTS组件。在一些实施例中,RNA可包括引物结合位点。在一些实施例中,反转录病毒顺式作用RNA包装组件可为HIV Psi。在一些实施例中,反转录病毒顺式作用RNA包装组件可为Rev反应组件。在本文公开的实施例中的任一者中,RNA上的反转录病毒组分(包括RRE及Psi)可位于任何位置,如熟练此项技术人员将理解。在说明性实施例中,工程化信号传导多肽为本文所公开的工程化信号传导多肽中的一者或多者。
[0505] 在一些实施例中,工程化信号传导多肽可包括第一淋巴增生性组件。适合的淋巴增生性组件公开于本文中的其他部分中。在一些说明性实施例中,淋巴增生性组件为融合
至识别域的IL-7受体突变体,诸如eTag。在一些实施例中,可包装RNA基因组可进一步包括编码第二工程化多肽的核酸序列,包括编码本文所提供的任何CAR实施例的嵌合抗原受体。
举例而言,第二工程化多肽可包括第一抗原特异性靶向区、第一跨膜域,及第一胞内活化
域。抗原特异性靶向区、跨膜域及胞内活化域的实例公开于本文其他处。在靶细胞为T细胞的一些实施例中,在靶细胞中具有活性的启动子在T细胞中具有活性,如本文其他处所公
开。
[0506] 在一些实施例中,可包装RNA基因组可进一步包括核糖开关,如本文其它部分所论述。在一些实施例中,编码工程化信号传导多肽的核酸序列可呈反向定向。在其他实施例
中,可包装RNA基因组可进一步包括核糖开关,且视情况该核糖开关可呈反向定向。在本文所公开的实施例中的任一者中,包括这些组件中的任一者的多核苷酸可包括引物结合位
点。在说明性实施例中,转录阻断剂或polyA序列可置放于基因附近以防止或减少未经调节的转录。在本文所公开的实施例中的任一者中,编码Vpx的核酸序列可位于第二转录单元上或视情况存在的第三转录单元上,或位于可操作地连接至第一可诱导启动子的额外转录单
元上。
[0507] 在用于制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的包装系统或方法的一些实施例中,编码的RNA可以包括内含子,其可例如转录自用于表达靶标多肽的相同启动子。在某些说明性实施例中,此类内含子可编码1种、2种、3种,或4种miRNA。在用于制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的包装系统或方法的这些及其他实施例中,可包装RNA基因组大
小为11,000KB或更小,且在一些实例中为10,000KB或更小。
[0508] 在一些实施例中,第一反式激活因子可影响一种或多种非毒性多肽的表达。在一些实施例中,第二反式激活因子可影响一种或多种毒性多肽的表达。举例而言,第一反式激活因子可诱导除了将转运至包装细胞的细胞膜的多肽的外的反转录病毒蛋白质Rev及Vpx
的表达,且第二反式激活因子可诱导反转录病毒蛋白质GAG、POL、MV(Ed)-FΔ30以及MV
(Ed)-HΔ18或MV(Ed)-HΔ24的表达以及慢病毒基因组的表达。在一些实施例中,第一反式
激活因子可影响一种或多种毒性多肽的表达且/或第二反式激活因子可影响一种或多种非
毒性多肽的表达。
[0509] 在另一方面中,本文提供哺乳动物包装细胞,其包括:a)哺乳动物包装细胞的基因组中的第一转录单元,其包括编码第一反式激活因子的核酸序列,其中该第一转录单元可操作地连接至组成性启动子,且其中该反式激活因子能够结合第一可诱导启动子且在存在
与不存在第一配位体的情况下影响可操作地连接至其上的核酸序列的表达,且其中该第一
反式激活因子能够结合该第一配位体;b)哺乳动物包装细胞的基因组中的第二转录单元及
视情况存在的第三转录单元,其包括编码反转录病毒REV蛋白质的核酸序列及编码第二反
式激活因子的核酸序列,该第二反式激活因子能够结合第二可诱导启动子且在存在与不存
在第二配位体的情况下影响可操作地连接至其上的核酸序列的表达,其中该第二反式激活
因子能够结合该第二配位体,且其中该第二转录单元及视情况存在的第三转录单元可操作
地连接至该第一可诱导启动子;c)哺乳动物包装细胞的基因组中的第四转录单元及视情况
存在的第五转录单元,其包括编码反转录病毒gag多肽及反转录病毒pol多肽的核酸序列,
以及能够结合并促进靶细胞膜与反转录病毒膜的融合的结合多肽和融合多肽,其中该第四
转录单元及视情况存在的第五转录单元可操作地连接至该第二可诱导启动子;以及d)哺乳
动物包装细胞的基因组中的第六转录单元,其自5’至3’包括5’LTR或其活性截短片段、编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件的核酸序列、cPPT/CTS组件、编码工程化信号传导多肽的核酸序列的反向互补、内含子、在靶细胞中具有活性的启动子,以及3’LTR或其活性截短片段,其中该第六转录单元可操作地连接至该第二可诱导启动子。
[0510] 在另一方面中,本文提供用于制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法,其包括:1.)培养包装细胞群以积聚第一反式激活因子,其中这些包装细胞包括:a)哺乳动物包装细胞的基因组中的第一转录单元,其包括编码第一反式激活因子的核酸序列,其中该第
一转录单元可操作地连接至组成性启动子,且其中该反式激活因子能够结合第一可诱导启
动子且在存在与不存在第一配位体的情况下影响可操作地连接至其上的核酸序列的表达,
且其中该第一反式激活因子能够结合该第一配位体;b)哺乳动物包装细胞的基因组中的第
二转录单元及视情况存在的第三转录单元,其包括编码反转录病毒REV蛋白质的核酸序列
及编码第二反式激活因子的核酸序列,该第二反式激活因子能够结合第二可诱导启动子且
在存在与不存在第二配位体的情况下影响可操作地连接至其上的核酸序列的表达,其中该
第二反式激活因子能够结合该第二配位体,且其中该第二转录单元及视情况存在的第三转
录单元可操作地连接至该第一可诱导启动子;c)哺乳动物包装细胞的基因组中的第四转录
单元及视情况存在的第五转录单元,其包括编码反转录病毒gag多肽及反转录病毒pol多肽
的核酸序列,以及能够结合并促进反转录病毒膜与靶细胞膜的融合的结合多肽和融合多
肽,其中该第四转录单元及视情况存在的第五转录单元可操作地连接至该第二可诱导型启
动子;以及d)哺乳动物包装细胞的基因组中的第六转录单元,其自5’至3’包括5’LTR或其活性截短片段、引物结合位点(PBS)、编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件的核酸序列、
cPPT/CTS组件、编码工程化信号传导多肽的核酸序列的反向互补、内含子、在靶细胞中具有活性的靶细胞启动子,以及3’LTR或其活性截短片段,其中该第五转录单元可操作地连接至该第二可诱导启动子;及2)在该第一配位体的存在下培育包括该第一反式激活因子的包装
细胞群以积聚该第二反式激活因子及反转录病毒REV蛋白质;及3)在该第二配位体的存在
下培育包括该第二反式激活因子及反转录病毒REV蛋白质的包装细胞群,从而诱导反转录
病毒gag多肽、反转录病毒pol多肽、结合多肽、融合多肽及反转录病毒RNA(自5’至3’包括5’LTR或其活化片段的反转录病毒RNA、PBS、反转录病毒顺式作用RNA包装组件、编码工程化信号传导多肽的核酸序列的反向互补、靶细胞启动子,以及3’LTR或其活性截短片段)的表达,其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒由包装细胞形成并释放,且其中该复制缺陷型重组反
转录病毒颗粒包括反转录病毒膜上的结合多肽和/或融合多肽以及核衣壳内的反转录病毒
RNA,从而制得复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。
[0511] 在本文所提供的一方面中,反转录病毒包装系统可包括哺乳动物细胞,其包括:1.)第一反式激活因子,其由组成性启动子表达且能够结合第一配位体及第一可诱导启动
子来在存在与不存在第一配位体的情况下影响可操作地连接至其上的核酸序列的表达;
2.)第二反式激活因子,其能够结合第二配位体及第二可诱导启动子,且在存在与不存在第二配位体的情况下影响可操作地连接至其上的核酸序列的表达;及3.)反转录颗粒的可包
装RNA基因组,其中该第一反式激活因子调节该第二反式激活因子、HIV REV、IL7 GPI DAF及活化组件的表达,且其中该第二反式激活因子调节gag多肽、pol多肽、反转录病毒顺式作用RNA包装组件,及一种或多种包膜多肽的表达。在说明性实施例中,第一反式激活因子可为融合至p65活化域的FRB域及融合至ZFHD1 DNA结合域的一个或多个FKBP域,第一配位体
可为雷帕霉素,且第一可诱导启动子可为一个或多个ZFHD1结合位点。在说明性实施例中,第二反式激活因子可为rtTA蛋白质,第二配位体可为四环素或多西环素,且第二可诱导启
动子可为TRE启动子或双向TRE启动子。在说明性实施例中,反转录病毒顺式作用RNA包装组件可为HIV Psi。在说明性实施例中,一种或多种包膜蛋白质包括麻疹病毒的F多肽及H多肽的细胞质域缺失变体。在说明性实施例中,转录阻断剂或polyA序列可置放于基因附近以防止或减少未经调节的转录。在一些实施例中,可使用具有核糖开关的雷帕霉素-多西环素可诱导慢病毒基因组(SEQ ID NO:83)。在一些实施例中,可使用雷帕霉素-多西环素可诱导
GAG POL ENV(SEQ ID NO:84)。在一些实施例中,可使用雷帕霉素可诱导TET活化子(SEQ ID NO:85)。在一些实施例中,可使用雷帕霉素诱导子可诱导REV srcVpx(SEQ ID NO:86)。
[0512] 本发明的一些方面包括细胞或为细胞,在说明性实施例中为用作包装细胞以制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的哺乳动物细胞,诸如用于转导T细胞和/或NK细胞的慢病
毒颗粒。可选择广泛多种细胞中的任一者来在体外产生病毒或病毒颗粒,诸如根据本发明
的复位向重组反转录病毒颗粒。通常使用真核细胞,尤其哺乳动物细胞,包括人类细胞,猿类细胞,犬类细胞,猫类细胞,马类细胞及啮齿动物细胞。在说明性实施例中,细胞为人类细胞。在其他说明性实施例中,细胞无限地增生,且因此永生。可有利地用于本发明的细胞的实例包括NIH 3T3细胞、COS细胞、Madin-Darby犬肾细胞、人类胚胎293T细胞及衍生自此类细胞的任何细胞,诸如gpnlslacZ 细胞,其衍生自293T细胞。可使用高度可转染细胞,诸
如人胚胎肾293T细胞。“高度可转染”是指细胞的至少约50%、较佳地至少约70%、最佳地至少约80%可表达引入的DNA的基因。
[0513] 适合的哺乳动物细胞包括原代细胞及永生化细胞系。适合的哺乳动物细胞系包括人类细胞系、非人类灵长类细胞系、啮齿动物(例如小鼠、大鼠)细胞系,及类似者。适合的哺乳动物细胞系包括(但不限于)HeLa细胞(例如美国模式培养物保藏所(ATCC)第CCL-2号)、
CHO细胞(例如ATCC第CRL9618号、第CCL61号、第CRL9096号)、293细胞(例如ATCC第CRL-1573号)、Vero细胞、NIH 3T3细胞(例如ATCC第CRL-1658号)、Huh-7细胞、BHK细胞(例如ATCC第CCLlO号)、PC12细胞(ATCC第CRL1721号)、COS细胞、COS-7细胞(ATCC第CRL1651号)、RATl细胞、小鼠L细胞(ATCC第CCLI.3号)、人类胚胎肾(HEK)细胞(ATCC第CRL1573号)、HLHepG2细
胞、Hut-78、Jurkat、HL-60、NK细胞系(例如NKL、NK92及YTS),及类似者。
[0514] 在本文所公开的实施例中的任一者中,制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法可包括使哺乳动物包装细胞生长至50%、60%、70%、80%、90%或95%汇合,或生长至
25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的峰值细胞密度,且接着分裂或稀释细胞。在一些实施例中,可使用搅拌槽反应器来使细胞生长。在一些实施例中,可使用熟练的业内人士将理解的方法将细胞分裂至少约1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:
12、1:15,或1:20。在一些实施例中,可将细胞稀释至25%、30%、40%、50%、60%、70%、
80%、90%或95%的峰值细胞密度。在一些实施例中,在分裂或稀释细胞之后,可在添加第一配位体之前使细胞生长持续1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、10小时,或16小时,或1天、2天、3天、4天、5天、6天,或7天。在一些实施例中,在存在第一配位体的情况下使细胞生长持续1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、21天,或28天,在说明性实施例中,该第一配位体可为雷帕霉素或雷帕类似物。在一些实施例中,可添加第二配位体且使细胞生长持续1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、
9天、10天、11天、12天、13天、14天、21天,或28天,在说明性实施例中,该第二配位体可为四环素或多西环素。培养条件将取决于所用的细胞及配位体,且方法为此项技术中已知的。用于培养且诱导HEK293S细胞的条件的特定实例显示于实施例8中。
[0515] 如本文所公开,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒为用于基因递送的常用工具(Miller,Nature(1992)357:455-460)。复制缺陷型重组反转录病毒颗粒将未经排列的核酸序列递送至广泛范围的啮齿动物、灵长类动物及人类体细胞中的能力使得复制缺陷型重组
反转录病毒颗粒较适用于将基因转移至细胞。在一些实施例中,复制缺陷型重组反转录病
毒颗粒可衍生自α反转录病毒属,β反转录病毒属,γ反转录病毒属,δ反转录病毒属,ε反转录病毒属,慢病毒属或泡沫病毒属。存在许多种适用于本文中所公开的方法的反转录病毒。
举例而言,可使用鼠白血病病毒(MLV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、马感染性贫血病毒
(EIAV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、富士纳肉瘤病毒(FuSV)、莫罗尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫罗尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、贝森鼠白血病病毒(Abelson murine leukemia virus)(A-MLV)、禽骨髓细胞病变病毒-29(MC29)
及禽红细胞增生病毒(AEV)。反转录病毒的详细列表可见于Coffin等人的
(“Retroviruses”,1977,Cold Spring Harbor Laboratory Press版:J M Coffin,S M Hughes,H E Varmus,第758至763页)。可在此项技术中找到关于一些反转录病毒的基因组
结构的细节。举例而言,可自NCBI Genbank(亦即Genome Accession第AF033819号)中找到
关于HIV的细节。
[0516] 在说明性实施例中,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可衍生自慢病毒属。在一些实施例中,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可衍生HIV、SIV或FIV。在其他说明性实施例中,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可衍生自慢病毒属中的人类免疫缺陷病毒(HIV)。慢病毒
为复杂的反转录病毒,除常见的反转录病毒基因gag、pol及env外,还含有具有调节或结构功能的其他基因。较高复杂性使得慢病毒能够在潜伏感染过程中调节其生命周期。典型的
慢病毒为人类免疫缺陷病毒(HIV),AIDS的病原体。在体内,HIV可感染极少分裂的终末分化的细胞,诸如淋巴细胞及巨噬细胞。
[0517] 在说明性实施例中,本文提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒含有Vpx多肽。Vpx多肽可在其基因组中整合Vpx编码核酸后在包装细胞系中表达,例如作为并入至反转录
病毒膜中的细胞膜结合蛋白质(Durand等人,J.Virol.(2013)87:234-242)。可通过病毒蛋
白酶的处理顺序构建反转录病毒膜结合Vpx,使得游离Vpx一旦并入病毒颗粒中即被释放。
具有此功能的Vpx融合物的此实例为Src-Flag-Vpx,其包括c-Src之前11个氨基酸的膜靶向
域(MGSSKSKPKDP)(SEQ ID NO:227),随后为病毒蛋白酶裂解域KARVLAEA(SEQ ID NO:228),随后为Flag-tagged Vpx。
[0518] 不受理论的限制,Vpx多肽通过降解限制因子SAMHD1来刺激反转录过程的效率,而有助于静息细胞的转导。因此,认为在本文提供的方法中,其中Vpx存在于用以转导T细胞
和/或NK细胞的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中,Vpx在通过含有Vpx的复制缺陷型重组
反转录病毒颗粒转导细胞之后经释放至静息T细胞或静息NK细胞的细胞质中。Vpx接着降解
SAMHD1,其使得游离dNTP增加,此进而刺激反转录病毒基因组的反转录。
[0519] 在一些实施例中,本文提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含和/或含有Vpu多肽。Vpu多肽可在其基因组中整合Vpu编码核酸后自质粒或包装细胞系表达为例如被并入
反转录病毒膜中的病毒膜蛋白。由Vpu与针对人类中的表达优化的其序列密码子形成的重
组可经构筑及表达,使得可将游离Vpu并入至病毒颗粒中。Vpu为出现于HIV-1及一些HIV-1
相关的猿猴免疫缺陷病毒(SIV)分离物(诸如SIVcpz、SIVgsn及SIVmon)中但并非HIV-2或大
多数SIV分离物中的辅助蛋白。Vpu蛋白参与CD4的下调及束缚蛋白的拮抗以供颗粒释放。更重要地,Vpu与病毒孔蛋白且特定而言来自流感病毒A(IAV)的病毒孔蛋白M2共享结构相似
性,由此,Vpu经显示形成阳离子选择性离子信道且在多种模型中渗透膜。已显示,IAV-M2有助于酸化颗粒且因此有利于自用于进入之内体途径早期释放,从而减少尽头传输产物的
量。
[0520] 本文的实施例20表明,通过反转录病毒颗粒转导静息PBMC由反转录病毒颗粒中的Vpu的存在来加强。不受理论限制,Vpu多肽通过加速慢病毒假型的酸化辅助静息细胞的转
导,从而允许更多衣壳更快的到达胞质。酸化病毒内部导致削弱病毒结构蛋白之间的静电
相互作用,且因此有助于分解衣壳及核糖核酸蛋白(RNP)复合物。因此,据信在本文提供的方法中(其中Vpu存在于用于转导T细胞和/或NK细胞的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒膜
中),在通过含有Vpu的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导细胞后,Vpu加速慢病毒颗粒在内体途径中的酸化,且有利于将衣壳释放至静息T细胞和/或NK细胞的胞质中。因此,在一些实施例中,其中包括Vpu多肽,其包含或为Vpu的片段,该Vpu片段保留促进静息PBMC(且在一些实施例中,静息T细胞)的转导的能力。该片段可包含与野生型Vpu具有至少75%、80%、
85%、90%、95%、98%、99%或100%一致性的75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、
98%、99%或100%的Vpu的片段。在一些实施例中,Vpu多肽包括保留促进慢病毒颗粒在内体途径中的酸化的能力的Vpu片段。
[0521] 反转录病毒基因组大小
[0522] 在本文提供的方法及组合物中,重组反转录病毒基因组(在非限制性说明性实施例中为慢病毒基因组)对可包装至病毒颗粒中的多核苷酸的数量具有限制。在本文提供的
一些实施例中,由多核苷酸编码区编码的多肽可为保留功能活性的截短或其它缺失,使得
多核苷酸编码区由比野生型多肽的多核苷酸编码区更少的核苷酸编码。在一些实施例中,
由多核苷酸编码区编码的多肽可为可由一个启动子表达的融合多肽。在一些实施例中,融
合多肽可具有裂解信号以由一个融合多肽及一个启动子产生两个或更多个功能性多肽。此
外,在初始离体转导之后不需要的一些功能不包括于反转录病毒基因组中,而经由包装细
胞膜存在于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上。这些不同策略在本文用于使包装于
复制缺陷型重组反转录病毒颗粒内的功能性组件最大化。
[0523] 在一些实施例中,待包装的重组反转录病毒基因组可在范围的低值端点为1,000个、2,000个、3,000个、4,000个、5,000个、6,000个、7,000个及8,000个核苷酸与范围的高值端点为2,000个、3,000个、4,000个、5,000个、6,000个、7,000个、8,000个、9,000个、10,000个及11,000个核苷酸之间。待包装的反转录病毒基因组包括编码如本文所详细公开的第一
及第二工程信号传导多肽的一个或多个多核苷酸区。在一些实施例中,待包装的反转录病
毒基因组可少于5,000个、6,000个、7,000个、8,000个、9,000个、10,000个,或11,000个核苷酸。本文其他处所讨论的可包装的功能包括用于反转录病毒装配及包装所需的反转录病毒
序列,诸如反转录病毒rev、gag及pol编码区,以及5’LTR及3’LTR或其活性截短片段,编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件的核酸序列及cPPT/CTS组件。此外,在说明性实施例中,本文中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可包括以下中的任何一者或多者或全部(在一些实
施例中呈这些反转录病毒功能区的相反取向):编码第一及第二工程信号传导多肽的一个
或多个多核苷酸区,其中的至少一者包括至少一个淋巴组织增生组件且可进一步包括
ASTR;可包括嵌合抗原受体的第二工程化信号多肽;通常调节第一和/或第二工程化信号传导多肽表达的控制组件,诸如核糖开关;识别域、内含子、在靶细胞中具有活性的启动子,诸如T细胞,2A裂解信号和/或IRES。
[0524] 重组反转录病毒颗粒
[0525] 重组反转录病毒颗粒公开于本文提供的方法及组合物中,例如用以转导T细胞和/或NK细胞以制备经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞。重组反转录病毒颗粒自身为本发明
的方面。通常,包括于本文提供的方面中的重组反转录病毒颗粒为复制缺陷型的,表示重组反转录病毒颗粒在其离开包装细胞时即无法复制。在说明性实施例中,重组反转录病毒颗
粒为慢病毒颗粒。
[0526] 在一些方面中,本文提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒以用于转导细胞,通常淋巴细胞且在说明性实施例中T细胞和/或NK细胞。复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可
包括本文其他处论述的假型组件中的任一者。在一些实施例中,复制缺陷型重组反转录病
毒颗粒可包括本文其他处论述的活化组件中的任一者。在一个方面中,本文提供包括多核
苷酸的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,该多核苷酸包括:A.可操作地连接至在T细胞和/
或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元,其中该一个或多个转录单元编码嵌
合抗原受体(CAR);及B.在其表面上的假型组件及T细胞活化组件,其中该T细胞活化组件不由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码。在一些实施例中,T细胞活化组件可为本文其他处论述的活化组件中的任一者。在说明性实施例中,T细胞活化组件可为抗CD3 scFvFc。在另一方面中,本文提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其包括多核苷酸,该多核苷酸包括可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个
转录单元,其中该一个或多个转录单元编码包括嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽及包括淋
巴增生性组件的第二多肽。在一些实施例中,淋巴增生性组件可为嵌合淋巴增生性组件。在说明性实施例中,淋巴增生性组件不包含连接至IL-7受体α链或其片段的IL-7。在一些实施例中,淋巴增生性组件不包含连接至IL-2/IL-15受体β链的IL-15。
[0527] 在一些方面中,本文提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其包含多核苷酸,该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元,其中该一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽及包含嵌
合淋巴增生性组件(例如组成性活性嵌合淋巴增生性组件)的第二多肽。在说明性实施例
中,嵌合淋巴增生性组件不包含连接至其同源受体或连接至其同源受体的片段的细胞因
子。
[0528] 在一些方面中,本文提供一种重组反转录病毒颗粒,其包括(i)假型组件,其能够结合T细胞和/或NK细胞并促进重组反转录病毒颗粒的膜融合;(ii)多核苷酸,其具有可操
作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元,其中该一个
或多个转录单元编码具有嵌合抗原受体(包括抗原特异性靶向区、跨膜域及胞内活化域)的
第一工程化信号传导多肽,以及包含至少一种淋巴组织增生性组件的第二工程化信号传导
多肽;其中该第一工程化信号传导多肽和/或该第二工程化信号传导多肽的表达由体内控
制组件调节;及(iii)在其表面上的活化组件,其中该活化组件能够结合至T细胞和/或NK细胞,且不由重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码。在一些实施例中,在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子在包装细胞系中不具有活性,或仅以可诱导的方式在包装细胞系中具
有活性。在本文公开的实施例中的任一者中,第一及第二工程化信号传导多肽中的一者可
具有嵌合抗原受体且另一工程化信号传导多肽可具有至少一种淋巴增生性组件。
[0529] 贯穿本发明提供包括于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的各种组件及组件的组合,诸如假型组件、活化组件及膜结合细胞因子,以及包括于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的基因组中的核酸序列,诸如但不限于编码CAR的核酸;编码淋巴增生性组件的核酸;
编码控制组件(诸如核糖开关)的核酸;启动子,尤其在T细胞中具有组成型活性或可诱导的启动子;及编码抑制性RNA分子的核酸。此外,本文提供的各种方面(诸如制备重组反转录病毒颗粒的方法、进行过继细胞治疗的方法,以及转导T细胞的方法)产生和/或包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。此类方法中产生和/或包括的复制缺陷型重组反转录病毒自身形
成作为本发明的独立方面的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒组合物,这些组合物可呈分离
形式。此类组合物可呈干燥(例如冻干)形式,或者可呈此项技术已知的适合的溶液或培养
基形式以用于储存且使用反转录病毒颗粒。
[0530] 因此,作为非限制性实施例,在另一方面中,本文提供一种在其基因组中具有多核苷酸的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,该多核苷酸具有可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列,在一些情况下,该核酸序列包括编码针
对一种或多种RNA靶标的一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子的第一核酸序列
及编码嵌合抗原受体或CAR的第二核酸序列,如本文所描述。在其他实施例中,存在编码本文先前所描述的不为抑制性RNA分子的至少一种淋巴增生性组件的第三核酸序列。在某些
实施例中,多核苷酸包括如本文所提及的一个或多个核糖开关,这些核糖开关可操作地连
接至第一核酸序列、第二核酸序列和/或第三核酸序列(若存在)。在此构建体中,一种或多种抑制性RNA、CAR和/或不为抑制性RNA的一种或多种淋巴增生性组件的表达由核糖开关控
制。在一些实施例中,两种至10种抑制性RNA分子由第一核酸序列编码。在其他实施例中,两种至六种抑制性RNA分子由第一核酸序列编码。在说明性实施例中,4种抑制性RNA分子由第一核酸序列编码。在一些实施例中,第一核酸序列编码一种或多种抑制性RNA分子且位于内含子内。在某些实施例中,内含子包括启动子的全部或部分。启动子可为Pol I、Pol II,或Pol III启动子。在一些说明性实施例中,启动子为Pol II启动子。在一些实施例中,内含子邻近在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子且位于该启动子的下游。在一些实施例中,
内含子为EF1-α内含子A。
[0531] 本文的重组反转录病毒颗粒实施例包括其中反转录病毒颗粒包含基因组的那些,该基因组包括编码一种或多种抑制性RNA分子的一种或多种核酸。编码可包括于反转录病
毒颗粒的基因组中的抑制性RNA分子的此类核酸的各种替代实施例(包括此类核酸与编码
除抑制性RNA分子的外的CAR或淋巴增生性组件的其他核酸的组合)包括于例如本文提供的
抑制性RNA部分以及包括于组合这些实施例的各种其他段落中。此外,此类复制缺陷型重组反转录病毒的各种替代物可通过在本文中所公开的包装细胞系方面内公开的例示性核酸
识别。熟练的业内人士将认识到,包括编码一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子的基因组的重组反转录病毒颗粒的此部分的公开内容可与本文其他部分所提供的编码抑
制性RNA分子的此类核酸的各种替代物组合。此外,熟练的业内人士将认识到,编码一种或多种抑制性RNA分子的此类核酸可与本文所提供的各种其他功能性核酸组件组合,例如本
文中侧重于抑制性RNA分子及编码这些分子的核酸的部分所公开。此外,在本文其他部分中提供的特异性抑制性RNA分子的各种实施例可用于本发明的重组反转录病毒颗粒方面中。
[0532] 诸如慢病毒载体的重组反转录病毒载体的必需元素为是此项技术中已知的。这些元素包括于包装细胞系部分中,及在实施例部分中所提供的用于制备重组反转录病毒颗粒
的细节中。举例而言,慢病毒颗粒通常包括包装组件REV、GAG及POL,其可经由一种或多种包装质粒递送至包装细胞系;假型分型组件,本文提供的各种实施例,其可经由假型化质粒递送至包装细胞系;及基因组,其由经由转移质粒递送至宿主细胞的多核苷酸产生。此多核苷酸通常包括病毒LTR及psi包装信号。5’LTR可为与异源启动子融合的嵌合5’LTR,其包括不依赖于Tat反式活化的5’'LTR。转移质粒可自失活,例如通过移除3’LTR的U3区。在一些非限制性实施例中,对于包括反转录颗粒的本文提供的任何组合物或方法方面及实施例,将包
括(但不限于)Src-FLAG-Vpu的Vpu(诸如包含Vpu的多肽(本文中有时称为“Vpu多肽”))包装于反转录病毒颗粒内。在一些非限制性实施例中,将Vpx(诸如Src-FLAG-Vpx)包装于反转录病毒颗粒内。不受理论限制,在转导T细胞后,Vpx进入细胞的胞液且促进SAMHD1的降解,从而使得可用于反向转录胞质dNTP库增加。在一些非限制性实施例中,对于包括本文提供的
反转录颗粒的任何组合物或方法方面及实施例,将Vpu及Vpx包装于反转录病毒颗粒内。
[0533] 包括于本发明的各种方面中的反转录病毒颗粒(例如慢病毒颗粒)在说明性实施例中为非复制型,尤其出于对于包括将用此类反转录病毒颗粒转导的细胞引入个体的实施
例的安全原因。当复制缺陷型反转录病毒颗粒用于转导细胞时,反转录病毒颗粒并非由转
导的细胞产生。对反转录病毒基因组的修饰为此项技术中已知的,以确保包括该基因组的
反转录病毒颗粒为复制缺陷型的。然而,应理解,在一些实施例中,针对本文所提供的方面中的任一者,可使用复制胜任型重组反转录病毒颗粒。
[0534] 熟练的业内人士将认识到,可使用不同类型的载体(诸如表达载体)将本文所论述的功能组件递送至包装细胞和/或至T细胞。本发明的说明性方面利用反转录病毒载体,及
(在一些特定说明性实施例中)慢病毒载体。其他适合的表达载体可用于实现本文的某些实
施例。此类表达载体包括(但不限于)病毒载体(例如基于以下的病毒载体:痘苗病毒;脊髓灰质炎病毒;腺病毒(参见例如Li等人,Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549,1994;
Borras等人,Gene Ther 6:515 524,1999;Li及Davidson,PNAS 92:7700 7704,1995;
Sakamoto等人,H Gene Ther 5:1088 1097,1999;WO 94/12649,WO 93/03769;WO 93/
19191;WO 94/28938;WO 95/11984and WO 95/00655);腺相关病毒(参见例如Ali等人,Hum Gene Ther 9:81 86,1998,Flannery等人,PNAS 94:6916 6921,1997;Bennett等人,Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863,1997;Jomary等人,Gene Ther 4:683 690,1997,
Rolling等人,Hum Gene Ther 10:641 648,1999;Ali等人,Hum Mol Genet 5:591594,
1996;WO 93/09239中的Srivastava,Samulski等人,J.Vir.(1989)63:3822-3828;
Mendelson等人,Virol.(1988)166:154-165;及Flotte等人,PNAS(1993)90:10613-10617);
SV40;单纯疱疹病毒;或反转录病毒载体(例如,小鼠白血病病毒、脾坏死病毒及衍生自诸如罗斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)、哈维肉瘤病毒(Harvey Sarcoma Virus)、禽白血病
病毒、人类免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒及乳腺肿瘤病毒的反转录病毒的载体),例如γ反转录病毒;或人类免疫缺陷病毒(参见例如Miyoshi等人,PNAS 94:1031923,1997;
Takahashi等人,J Virol 73:7812 7816,1999);及类似者。
[0535] 在说明性实施例中,反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒。此类反转录病毒颗粒通常包括位于病毒包膜内的衣壳内的反转录病毒基因组。
[0536] 在一些实施例中,利用含DNA的病毒颗粒代替重组反转录病毒颗粒。此类病毒颗粒可为腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、痘病毒、牛痘病毒、流感病毒、水泡性口炎病毒(VSV),或辛德毕斯病毒(Sindbis virus)。熟练的业内人士将理解如何修改本文公开
的用于不同病毒及反转录病毒或反转录病毒颗粒的方法。在使用包括DNA基因组的病毒颗
粒时,熟练的业内人士将理解,这些基因组中可包括功能单元以诱导将病毒颗粒的全部或
部分DNA基因组整合至用此类病毒转导的T细胞的基因组中。
[0537] 在一些实施例中,HIV RRE及编码HIV Rev的多核苷酸区可由N端RGG盒RNA结合基元及编码ICP27的多核苷酸区替代。在一些实施例中,编码HIV Rev的多核苷酸区可由编码
腺病毒E1B 55-kDa及E4 Orf6的一个或多个多核苷酸区替代。
[0538] 在一个方面中,本发明提供容器(诸如商业容器或包装)或包含其的试剂盒,包含根据本文提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面中的任一者的经分离复制缺陷型重
组反转录病毒颗粒。此外,在另一方面中,本文提供容器(诸如商业容器或包装)或包含其的试剂盒,包含根据本文提供的包装细胞和/或包装细胞系方面中的任一者的经分离包装细
胞,在说明性实施例中,来自包装细胞系的经分离包装细胞。在一些实施例中,试剂盒包括额外容器,该额外容器包括额外试剂,诸如用于本文提供的方法中的缓冲液或试剂。此外,在某些方面中,本文提供任何方面中的本文提供的任何复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在
制造用于以基因方式修饰根据本文提供的任何方面的T细胞或NK的试剂盒中的用途。此外,在某些方面中,本文提供任何方面中的本文提供的任何包装细胞和/或包装细胞系在制造
用于产生根据本文提供的任何方面的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的用途。
[0539] 在一个方面中,本文提供含有复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的商用容器及使用来治疗个体的肿瘤生长的说明书,其中该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其基因组中包
含多核苷酸,该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的
一种或多种核酸序列。在一些实施例中,一种或多种核酸序列中的一核酸序列可编码嵌合
抗原受体(CAR),该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。在一些实施例中,一种或多种核酸序列中的一核酸序列可编码针对一个或多个RNA靶标的一
个或多个抑制性RNA分子。
[0540] 含有重组反转录病毒颗粒的容器可为用于储存重组反转录病毒颗粒的管、小瓶,孔板,或其他容器。试剂盒可包括两个或更多个容器,其中第二或其他容器可包括例如用于转导T细胞和/或NK细胞的溶液或培养基,和/或第二或其他容器可包括pH调节药用试剂。这些容器中的任一者可具有工业强度及等级。包括试剂盒及编码抑制性RNA分子的核酸的此
类方面中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可为本文所提供的此类复制缺陷型重组反转
录病毒颗粒的实施例中的任一者,其包括本文所提供的抑制性RNA的实施例中的任一者。
[0541] 在另一方面中,本文提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在制造用于以基因方式修饰T细胞和/或NK细胞的试剂盒中的用途,其中试剂盒的用途包括:使T细胞或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒离体接触,其中该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包括
表面上的假型组件及表面上的T细胞活化组件,其中该接触有助于通过复制缺陷型重组反
转录病毒颗粒转导T细胞或NK细胞,由此产生经基因方式修饰的T细胞或NK细胞。在一些实
施例中,T细胞或NK细胞可来自个体。在一些实施例中,T细胞活化组件可经膜结合。在一些实施例中,该接触可进行范围的低值端点为1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时或8小时与范围的高值端点为4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、10小时、12小时、15小时、18小时、21小时及24小时之间,例如1小时与12小时之间。用于制造试剂盒的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可包括本文其他处论述的方面、实施例或子实施例中的任一者。
[0542] 经基因方式修饰的T细胞及NK细胞
[0543] 在本文的方法及组合物的实施例中,产生本身为本发明的单独方面的经基因方式修饰的淋巴细胞。此类经基因方式修饰的淋巴细胞可为经转导的淋巴细胞。在一个方面中,本文提供经基因方式修饰的T细胞或NK细胞,其中T细胞或NK细胞经经基因方式修饰以表达
第一工程化信号传导多肽。在一些实施例中,第一工程化信号传导多肽可为淋巴增生性组
件或包括抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域的CAR。在一些实施例中,T细胞或NK细胞可进一步包括可为CAR或淋巴增生性组件的第二工程化信号传导多肽。在一些实施
例中,淋巴增生性组件可为嵌合淋巴增生性组件。在一些实施例中,T细胞或NK细胞可进一步包括表面上的假型组件。在一些实施例中,T细胞或NK细胞可进一步包括表面上的活化组件。经基因方式修饰的T细胞或NK细胞的CAR、淋巴增生性组件、假型组件及活化组件可包括本文公开的方面、实施例或子实施例中的任一者。在说明性实施例中,活化组件可为抗CD3 scFvFc。
[0544] 本文提供的一些方面包括根据方法通过转导静息T细胞和/或静息NK细胞制成的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞,该方法包含使静息T细胞和/或静息NK细胞与复制缺陷
型重组反转录病毒颗粒离体接触,其中该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上
的假型组件及在其表面上的膜结合T细胞活化组件,其中该接触有助于通过复制缺陷型重
组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞,由此产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK
细胞,且其中该接触进行范围的低值端点为1小时、2小时、3小时、4小时或6小时与范围的高值端点为4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、18小时、20小时或24小时之间,例如1小时与
12小时之间。
[0545] 在一些实施例中,经基因方式修饰的淋巴细胞为已经基因方式修饰以表达包含至少一种淋巴增生性组件的第一工程化信号传导多肽和/或包含嵌合抗原受体的第二工程化
信号传导多肽的淋巴细胞,诸如T细胞或NK细胞,该嵌合抗原受体包括抗原特异性靶向区
(ASTR),跨膜域及胞内活化域。在本文方面中的任一者的一些实施例中,NK细胞为NKT细胞。
NKT细胞为表达CD3且通常共表达αβT细胞受体且还表达通常与NK细胞相关的多种分子标记物(NK1.1或CD56)的子组。
[0546] 本发明的经基因方式修饰的淋巴细胞具有已通过重组DNA方法引入至淋巴细胞中的异源核酸序列。举例而言,在用于转导本文所提供的淋巴细胞的方法期间将说明性实施
例中的异源序列插入至淋巴细胞中。在淋巴细胞内发现异源核酸,且在一些实施例中经整
合或未整合至经基因方式修饰的淋巴细胞的基因组中。
[0547] 在说明性实施例中,将异源核酸整合至经基因方式修饰的淋巴细胞的基因组中。在说明性实施例中,使用利用重组反转录病毒颗粒的本文所提供的用于转导淋巴细胞的方
法来产生此类淋巴细胞。此类重组反转录病毒颗粒可包括编码嵌合抗原受体的多核苷酸,
该嵌合抗原受体通常包括至少一个抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。在本
发明的其他部分中,本文提供复制缺陷型重组反转录病毒颗粒及在复制缺陷型反转录病毒
颗粒的基因组中编码的多核苷酸的各种实施例,该复制缺陷型反转录病毒颗粒可用以产生
本身形成本发明的另一方面的经基因方式修饰的淋巴细胞。
[0548] 本发明的经基因方式修饰的淋巴细胞可在体外分离。举例而言,此类淋巴细胞可出现于如本文所提供的用于离体转导的培养基及其他溶液中。淋巴细胞可以未经基因方式
修饰的形式存在于以本文所提供的方法自个体收集的血液中,接着在转导方法期间经基因
方式修饰。经基因方式修饰的淋巴细胞可在其经基因方式修饰之后在其经引入或再引入至
个体之后出现于个体内部。经基因方式修饰的淋巴细胞可为静息T细胞或静息NK细胞,或经基因方式修饰的T细胞或NK细胞可以主动分裂,尤其在其表达在如本文所公开的转导之后
经插入至T细胞或NK细胞中的核酸中所提供的功能组件中的一些之后。
[0549] 在一个方面中,本文提供经转导和/或经基因方式修饰的T细胞或NK细胞,其包含重组多核苷酸,该重组多核苷酸在其基因组中包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中
具有活性的启动子的一个或多个转录单元,这些转录单元表达本发明的方面及实施例中的
任一者中提供的功能组件中的一者或多者。举例而言,一个或多个转录元可表达CAR,其可包括本文所提供的CAR组件中的任一者,诸如ASTR(作为非限制性实施例,为MBR-ASTR)、跨膜域及胞内信号传导域,且可以进一步包括作为非限制性实施例的调节域。此外,本文提供在经转导和/或经基因方式修饰的T细胞或NK细胞内表达的一个或多个功能组件、淋巴增生
性组件中的一者或多者,例如组成性活性IL-7受体突变体或不为抑制性RNA分子(例如
miRNA或shRNA)的其他淋巴增生性组件、识别域和/或消除域。
[0550] 在一个方面中,本文提供经基因方式修饰的T细胞或NK细胞,其包含:
[0551] a.针对一种或多种RNA靶标的一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子;及
[0552] b.嵌合抗原受体(CAR),其包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域,
[0553] 和/或编码针对一种或多种RNA靶标的抑制性RNA分子及CAR的核酸,其中该一种(例如两种)或更多种抑制性RNA分子及CAR或编码其的核酸编码由T细胞和/或NK细胞的基
因修饰的核酸序列编码或为T细胞和/或NK细胞的基因修饰的核酸序列。
[0554] 经基因方式修饰的T细胞或NK细胞可为经基因方式修饰的T细胞群和/或NK细胞群,其包括针对一种或多种RNA靶标的一种(例如两种)或更多种抑制性RNA分子;及CAR。
[0555] 在紧接以上T细胞或NK细胞包含一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子及CAR或编码其的核酸的方面的一些实施例中,针对可包括作为CAR的一部分或可与淋巴增
生性组件一起表达或用以控制淋巴增生性组件的组件,可包括本文所提供的具体实施例中
的任一者。
[0556] 在紧接以上T细胞或NK细胞包含一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子及CAR或编码其的核酸的方面的一些实施例中,CAR为微环境限制性生物(MRB)-CAR和/或经
基因方式修饰的T细胞或NK细胞可进一步包括不为抑制性RNA分子的至少一种淋巴增生性
组件和/或编码淋巴增生性组件的核酸。在此类实施例中,淋巴增生性组件由对T细胞和/或NK细胞的基因修饰的核酸序列编码。在此类实施例中,可使用和/或编码本文所公开的淋巴增生性组件中的任一者。举例而言,至少一种淋巴增生性组件可为组成性活性的IL-7受体。
[0557] 在紧接以上T细胞或NK细胞包含一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子及CAR或编码其的核酸的方面的一些实施例中,该抑制性RNA分子为miRNA或shRNA的前体。
在此方面的一些实施例中,该一种(例如两种)或更多种抑制性RNA分子为多顺反子的。在此方面的一些实施例中,该一种(例如两种)或更多种抑制性RNA分子针对相同的或(在说明性
实施例中)不同的RNA靶标。在此方面的一些实施例中,该一种(例如两种)或更多种抑制性
RNA分子中的大部分或全部降低了内源性TCR的表达。
[0558] 在紧接以上T细胞或NK细胞包含一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子及CAR或编码其的核酸的方面的一些实施例中,该RNA靶标为自选自由以下组成的群的基因
转录的mRNA:PD-1、CTLA4、TCRα、TCRβ、CD3ζ、SOCS、SMAD2、miR-155靶标、IFNγ、cCBL、TRAIL2、PP2A,及ABCG1。在此方面的一些实施例中,该一种(例如两种)或更多种抑制性RNA分子中的至少一者为miR-155。
[0559] 在紧接以上T细胞或NK细胞包含一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子及CAR或编码其的核酸的方面的一些实施例中,CAR的ASTR为MRB ASTR和/或CAR的ASTR结合
至与肿瘤相关的抗原。此外,在以上方面的一些实施例中,第一核酸序列可操作地连接至核糖开关,该核糖开关例如能够结合核苷类似物,且在说明性实施例中为抗病毒药物,例如阿昔洛韦。
[0560] 在本文公开的方法及组合物中,工程化信号传导多肽的表达由控制组件调节,且在一些实施例中,该控制组件为包含核糖开关的多核苷酸。在某些实施例中,核糖开关能够结合核苷类似物,且当核苷类似物存在时,表达工程化信号传导多肽中的一者或两者。
[0561] 本文所公开的经基因方式修饰的淋巴细胞也可在其表面上具有多肽,这些多肽在本文所提供的转导方法期间为复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的融合的残留物。此类多肽
可包括活化组件、假型组件和/或包括细胞因子的一种或多种融合多肽。
[0562] 在一个方面中,本文提供表达针对一种或多种RNA靶标一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子及嵌合抗原受体或CAR的经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞,如本
文所公开。在一些实施例中,经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞进一步表达本文所公开
的不为抑制性RNA分子的至少一种淋巴增生性组件。在某些实施例中,经基因方式修饰的T
细胞和/或NK细胞还表达控制一种或多种抑制性RNA分子、CAR和/或不为抑制性RNA分子的
至少一种淋巴增生性组件的表达的一种或多种核糖开关。在一些实施例中,经基因方式修
饰的T细胞和/或NK细胞表达两种至10种抑制性RNA分子。在其他实施例中,经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞表达两种至六种抑制性RNA分子。在说明性实施例中,经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞表达四种抑制性RNA分子。
[0563] 核酸
[0564] 本发明提供编码本发明的多肽的核酸。在一些实施例中,核酸将为DNA,包括例如重组性表达载体。在一些实施例中,核酸将为RNA,例如体内合成的RNA。
[0565] 在一些情况下,核酸提供例如在哺乳动物细胞中产生本发明的多肽。在其他情况下,个体核酸提供编码本发明的多肽的核酸的扩增。
[0566] 编码本发明的多肽的核苷酸序列可操作地连接至转录控制组件,例如启动子及增强子等。
[0567] 适合的启动子及增强子组件为此项技术中已知的。为在细菌细胞中表达,适合的启动子包括(但不限于)lacl、lacZ、T3、T7、gpt、λP及trc。为在真核细胞中表达,适合的启动子包括(但不限于)轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子及增强子组件;巨细胞病毒立即
早期启动子;单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子;早期及晚期SV40启动子;反转录病毒的长末端重复中存在的启动子;小鼠金属硫蛋白-I启动子;及此项技术中已知的各种组织特异性启
动子。
[0568] 适合的可逆启动子(包括可逆诱导型启动子)为此项技术中已知的。此类可逆启动子可分离且衍生自许多生物体,例如真核生物及原核生物。对用于第二生物中的衍生自第
一生物(例如第一原核生物及第二真核生物、第一真核生物及第二原核生物,等)的可逆启
动子的修饰为此项技术中已知的。此类可逆启动子,及基于此类可逆启动子但也包含其他
控制蛋白质的系统包括(但不限于)醇调节启动子(例如醇去氢酶I(alcA)基因启动子、对醇
反式激活因子蛋白质具有反应性的启动子(AlcR)等)、四环素调节的启动子(例如包括
TetActivators、TetON、TetOFF等的启动子系统)、类固醇调节的启动子(例如大鼠糖皮质激素受体启动子系统、人类雌性激素受体启动子系统、类视黄素启动子系统、甲状腺启动子系统、蜕皮激素启动子系统、米非司酮启动子系统等)、金属调节的启动子(例如金属硫蛋白启动子系统等)、相关病原调节的启动子(例如水杨酸调节的启动子、乙烯调节的启动子、苯并噻二唑调节的启动子等)、温度调节在启动子(例如热休克可诱导启动子(例如HSP-70、HSP-
90、大豆热休克启动子等))、光调节的启动子、合成可诱导启动子,及类似者。
[0569] 在一些情况下,含有适合的启动子的基因座或构建体或转基因经由对可诱导系统的诱导来进行不可逆转换。用于诱导不可逆转换的适合的系统为此项技术中公知的,例如,不可逆转换的诱导可利用Cre-lox介导的重组(参见例如Fuhrmann-Benzakein等人,PNAS
(2000)28:e99,其公开内容以引用的方式并入本文)。此项技术中已知的重组酶、内切核酸酶、连接酶、重组位点等的任何适合的组合可用于产生不可逆转换的启动子。本文其他处描述的用于进行位点特异性重组的方法、机制及要求用于产生不可逆转换的启动子且为此项
技术中所熟知的,参见例如Grindley等人(2006)Annual Review of Biochemistry,567-
605及Tropp(2012)Molecular Biology(Jones&Bartlett Publishers,马萨诸塞州萨德伯
里),其公开内容以引用的方式并入本文中。
[0570] 在一些情况下,启动子为CD8细胞特异性启动子、CD4细胞特异性启动子、嗜中性粒细胞特异性启动子或NK特异性启动子。举例而言,可使用CD4基因启动子,参见例如Salmon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7739及Marodon等人(2003)Blood 101:3416。作为另一实例,可使用CD8基因启动子。NK细胞特异性表达可通过使用Neri(第46页)启动子来实现;参见例如Eckelhart等人(2011)Blood 117:1565。
[0571] 在一些实施例中,例如,为在酵母细胞中表达,适合的启动子为组成性启动子,诸如ADH1启动子、PGK1启动子、ENO启动子、PYK1启动子及类似者;或为可调节启动子,诸如GALI启动子、GAL10启动子、ADH2启动子、PH05启动子、CUP1启动子、GAL7启动子、MET25启动子、MET3启动子、CYC1启动子、HIS3启动子、ADH1启动子、PGK启动子、GAPDH启动子、ADC1启动子、TRP1启动子、URA3启动子、LEU2启动子、ENO启动子、TP1启动子及AOX1(例如用于毕赤酵母中)。对合适的载体及启动子的选择在熟练此项技术人员的水平之内。
[0572] 用于原核宿主细胞中的适合的启动子包括(但不限于)噬菌体T7RNA聚合酶启动子、trp启动子、lac操作子启动子、杂合启动子(例如lac/tac杂合启动子、tac/trc杂合启动子、trp/lac启动子、T7/lac启动子);trc启动子;tac启动子及类似者;araBAD启动子;经体内调节的启动子,诸如ssaG启动子或相关启动子(参见例如美国专利公开案第20040131637
号)、pagC启动子(Pulkkinen及Miller,J.Bacterial.,1991:173(1):86-93;Alpuche-
Aranda等人,PNAS,1992;89(21):10079-83)、nirB启动子(Harborne等人(1992)
Mal.Micro.6:2805-2813),及类似者(参见例如Dunstan等人(1999)Infect.Immun.67:
5133-5141;McKelvie等人(2004)Vaccine 22:3243-3255;及Chatfield等人(1992)
Biotechnol.10:888-892);σ70启动子,例如共有σ70启动子(参见例如Genome Accession第AX798980号、第AX798961号及第AX798183号);固定相启动子,例如dps启动子、spv启动子及类似者;衍生自致病岛SPI-2的启动子(参见例如WO96/17951);actA启动子(参见例如
Shetron-Rama等人(2002)Infect.Immun.70:1087-1096);rpsM启动子(参见例如Valdivia
及Falkow(1996).Mal.Microbial.22:367);tet启动子(参见例如Hillen,W.及Wissmann,A.
(1989)In Saenger,W.及Heinemann,U.(编),Topics in Molecular and Structural 
Biology,Protein-Nucleic Acid Interaction.Macmillan,London,UK,第10卷,第143至
162页);SP6启动子(参见例如Melton等人(1984)Nucl.Acids Res.12:7035);及类似者。用于诸如大肠杆菌的原核生物的适合的强启动子包括(但不限于)Trc、Tac、T5、T7及Pλ。用于细菌宿主细胞的操作子的非限制性实施例包括乳糖启动子操作子(当与乳糖接触时,Laci
抑制蛋白改变构象,从而防止Laci抑制蛋白与操作子结合)、色氨酸启动子操作子(当与色
氨酸复合时,TrpR抑制蛋白具有结合操作子的构象;在不存在色氨酸的情况下,TrpR抑制蛋白具有不结合操作子的构象)及tac启动子操作子(参见例如deBoer等人(1983)
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:21-25)。
[0573] 编码本发明的多肽的核苷酸序列可存在于表达载体和/或克隆载体中。编码两个单独多肽的核苷酸序列可在相同或不同的载体中克隆。表达载体可包括选择性标记、复制
源及提供载体的复制和/或维持的其他部件。适合的表达载体包括例如质粒、病毒载体,及类似者。
[0574] 大量适合的载体及启动子为熟练此项技术人员已知;许多在商业上可用于产生个体重组构建体。借助于实例提供以下细菌载体:pBs、phagescript、PsiXl74、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene,La Jolla,CA,USA);pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540,及pRIT5(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。借助于实例提供以下真核生物载体:pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXRl、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG,及pSVL(Pharmacia)。
[0575] 表达载体通常具有位于启动子序列附近的方便限制位点,以提供编码异源蛋白质的核酸序列的插入。可存在在表达宿主中操作的可选择标记。
[0576] 如上所述,在一些实施例中,编码本发明的多肽的核酸在一些实施例中将为RNA,例如体外合成的RNA。体外合成RNA的方法为此项技术中已知的;可使用任何已知的方法来
合成包括编码本发明的多肽的核苷酸序列的RNA。将RNA引入至宿主细胞中的方法为此项技
术中已知的。参见例如Zhao等人(2010)Cancer Res.15:9053。将包括编码本发明的多肽的
核苷酸序列的RNA引入至宿主细胞中可在体外或离体或体内进行。举例而言,可通过包含编码本发明的多肽的核苷酸序列的RNA对宿主细胞(例如,NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞等)进
行体外或离体电穿孔。
[0577] 包括多核苷酸、核酸序列和/或转录单元和/或包括其的载体的各种方面及实施例进一步包括Kozak类型序列、土拨鼠肝炎病毒转录后调节组件(WPRE)及二重终止密码子或
三重终止密码子中的一者或多者,其中二重终止密码子或三重终止密码子的一个或多个终
止密码子定义自一个或多个转录单元的至少一者的读取终止。在某些实施例中,多核苷酸、核酸序列和/或转录单元和/或包括其的载体进一步包括在一个或多个转录单元中的至少
一者的起始密码子上游的10个核苷内具有5’核苷酸的Kozak类型序列。在一个实施例中,
Kozak类型序列为或包括CCACCAT/UG(G)(SEQ ID NO:515)、CCGCCAT/UG(G)(SEQ ID NO:
516)、GCCGCCGCCAT/UG(G)(SEQ ID NO:517)或GCCGCCACCAT/UG(G)(SEQ ID NO:515)(其中
圆括号中的核苷酸表示视情况选用的核苷酸及指示该位置处的不同可能的核苷酸的由斜
线隔开的核苷酸,例如视核酸是否为DNA或RNA而定)。在包括AU/TG起始密码子的这些实施
例中,可将A视为位置0。在某些说明性实施例中,-3及+4处的核苷酸相同,例如-3及+4可为G。在另一实施例中,Kozak类型序列包括ATG上游的第3位置中的A或G,其中ATG为起始密码子。在另一实施例中,Kozak类型序列包括AUG上游的第3位置中的A或G,其中AUG为起始密码子。在一说明性实施例中,Kozak类型序列为(GCC)GCCRCCATG,其中R为嘌呤(A或G)。在一说明性实施例中,Kozak类型序列为GCCGCCACCAUG(SEQ ID NO:518)。在另一实施例中,其可与包括Kozak类型序列的前述实施例和/或包括三重密码子的以下实施例组合,多核苷酸包括
WPRE组件。WPRE表征于技术(参见例如(Higashimoto等人,Gene Ther.2007;14:1298))中且例示于本文的实施例17及实施例18中。在一些实施例中,WPRE组件位于一个或多个转录单
元的终止密码子的3’及多核苷酸的3’LTR的5’处。在另一实施例中,其可与前述实施例(亦即,其中多核苷酸包括Kozak类型序列的实施例和/或其中多核苷酸包括WPRE的实施例)中
的一者或两者组合,一个或多个转录单元经二重终止密码子或三重终止密码子的一个或多
个终止密码子终止,其中二重终止密码子包括第一读取框中的第一终止密码子及第二读取
框中的第二终止密码子或具有第二终止密码子的框中的第一终止密码子,且其中三重终止
密码子包括第一读取框中的第一终止密码子、第二读取框中的第二终止密码子及第三读取
框中的第三终止密码子或具有第二终止密码子或第三终止密码子的框中的第一终止密码
子。
[0578] 本文的三重终止密码子包括三个终止密码子,一个在各读取框中,在彼此的10个核苷酸内,且较佳具有重叠序列,或在相同读取框中的三个终止密码子,较佳在连续密码子处。二重终止密码子表示两个终止密码子,各自在不同读取框中,在彼此的10个核苷酸内,且较佳具有重叠序列,或在相同读取框中的两个终止密码子,较佳在连续密码子处。
[0579] 在本文公开的方法及组合物中的一些中,使用不利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法进行DNA至PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞中的引入及视情况DNA至宿主细胞基因组中的并入。举例而言,可利用其他病毒载体,诸如来源于腺病毒、腺病毒相关病毒或1型单纯疱疹病毒的那些,作为非限制实施例。
[0580] 在一些实施例中,本文提供的方法可包括用非病毒载体转染和/或转导靶细胞。在利用非病毒载体转染靶细胞的本文公开的实施例中的一者中,可使用包括电穿孔、核转染、脂质体调配物、脂质、树状体、阳离子聚合物(诸如聚(乙烯亚胺)(PEI)及聚(l-赖氨酸)
(PLL))、纳米颗粒、细胞穿透肽、显微注射和/或未整合慢病毒载体的方法将非病毒载体(包括裸DNA)引入至靶细胞(诸如PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞)中。在一些实施例中,可将DNA引入至具有脂质体及鱼精蛋白的复合物中的靶细胞(诸如PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞)中。可用于本文提供的方法的实施例中的用于离体转染和/或转导T细胞和/或NK细胞的
其他方法在此项技术中已知(参见例如Morgan及Boyerinas,Biomedicines.2016年4月20
日;4(2).pii:E9,其以全文引用的方式并入本文中)。
[0581] 在本文提供的方法的一些实施例中,可通过将靶DNA共转染、共核转染或共电穿孔为在所关注基因的5’及3’末端含有转座子ITR片段的质粒或将转座酶载体系统共转染、共核转染或共电穿孔为DNA或mRNA或蛋白质或位点特异性丝氨酸重组酶(诸如将所关注基因
整合至人类基因组中的假attP位点的phiC31)而使用基于转座子的载体系统将DNA整合至
基因组中,在此情况下,DNA载体可含有34bp至40bp attB位点,其为重组酶的识别序列
(Bhaskar Thyagarajan等人.Site-Specific Genomic Integration in Mammalian Cells 
Mediated by Phage  Integrase,Mol Cell Biol.2001年6月;21(12):3926–3934)且经
重组酶共转染。对于T细胞和/或NK细胞,可用于本文提供的某些方法中的基于转座子的系
统利用呈DNA、mRNA或蛋白质形式的Sleeping Beauty DNA载体系统(参见例如美国专利第
6,489,458号及美国专利申请第15/434,595号,其以全文引用的方式并入本文中)、
PiggyBac DNA载体系统(参见例如Manuri等人,Hum Gene Ther.2010年4月;21(4):427-37,其以全文引用的方式并入本文中)或Tol2转座子系统(参见例如Tsukahara等人,Gene 
Ther.2015年2月;22(2):209–215,其以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施例中,基于转座子的载体系统的转座子和/或转座酶在引入至T细胞和/或NK细胞中之前可经产生作
为微环DNA载体(参见例如Hudecek等人,Recent Results Cancer Res.2016;209:37-50及
Monjezi等人,Leukemia.2017年1月;31(1):186-194,其以全文引用的方式并入本文中)。也可通过添加与靶位点的整合5’及3’同源的50bp至1000bp同源臂使用CRISPR或TALEN介导的整合将CAR或淋巴增生性组件整合至基因组中的所定义及特异性位点中(Jae Seong Lee等
人.Scientific Reports 5,文章编号:8572(2015),由CRISPR/Cas9及同源定向的DNA修复
路径介导的CHO细胞中的位点特异性整合)。CRISPR或TALEN提供特异性及基因靶向的裂解
且构建体将经由同源介导末端接合整合(Yao X等人.Cell Res.2017年6月;27(6):801-
814.doi:10.1038/cr.2017.76.2017年5月19日电子版)。CRISPR或TALEN可经靶质粒转染为
DNA、mRNA或蛋白质。
[0582] 包装细胞
[0583] 本发明提供包装细胞及为包装细胞系的哺乳动物细胞系,其产生以基因方式修饰靶标哺乳动物细胞及其的哺乳动物细胞系的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。在说明性实
施例中,包装细胞包含核酸序列,其编码复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的可包装RNA基因组、REV蛋白、gag多肽、pol多肽及假型组件。
[0584] 适合的哺乳动物细胞包括原代细胞及永生化细胞系。适合的哺乳动物细胞系包括人类细胞系、非人类灵长类细胞系、啮齿动物(例如小鼠、大鼠)细胞系,及类似者。适合的哺乳动物细胞系包括(但不限于)HeLa细胞(例如,美国模式培养物保藏所(ATCC)第CCL-2号)、CHO细胞(例如ATCC第CRL9618号、第CCL61号、第CRL9096号)、HEK293细胞(例如,ATCC第CRL-
1573号)、适应悬浮的HEK293细胞、Vero细胞、NIH 3T3细胞(例如,ATCC第CRL-1658号)、Huh-
7细胞、BHK细胞(例如,ATCC第CCLlO号)、PC12细胞(ATCC第CRL1721号)、COS细胞、COS-7细胞(ATCC第CRL1651号)、RATl细胞、小鼠L细胞(ATCC第CCLI.3号)、人类胚胎肾(HEK)细胞(ATCC第CRL1573号)、HLHepG2细胞、Hut-78、Jurkat、HL-60、NK细胞系(例如,NKL、NK92及YTS),及类似者。
[0585] 在一些情况下,细胞并非永生化细胞系,而是自受试者获得的细胞或离体细胞(例如,原代细胞)。举例而言,在一些情况下,细胞为自受试者获得的免疫细胞。作为另一实例,细胞为自受试者获得的干细胞或祖细胞。在包括B细胞、T细胞或NK细胞的本文提供的实施
例及方面中的任一者中,细胞可为自体细胞或其可为异体细胞(在本文中也称为异源细
胞)。在一些实施例中,异源细胞可为以基因方式工程化的异源细胞。异体细胞(诸如异源T细胞)及用于以基因方式工程化异体细胞的方法在此项技术中已知。在一些实施例中,异体细胞可为永生化细胞。在其中异体细胞为T细胞的一些实施例中,T细胞经基因方式工程化,使得其T细胞受体链中的至少一者不起作用或其至少部分缺失。在一些实施例中,异体细胞可经修饰,使得其缺失所有或部分B2微小球蛋白。在其中异体细胞用于本文的方法中的一
些实施例中,淋巴增生性组件和/或CLE可起作用以减少为实践本发明所必需的细胞数且可
有助于自个体的T细胞、B细胞或NK细胞的细胞制造。
[0586] 活化免疫细胞的方法
[0587] 本发明提供体外、体内或离体活化免疫细胞(在说明性实施例中,淋巴细胞)的方法。该方法通常涉及使免疫细胞(体外、体内或离体)与活化组件或与一种或多种靶标抗原
接触,其中该免疫细胞经基因方式修饰以产生本发明的微环境受限的CAR。在一种或多种靶标抗原的存在下,微环境受限的CAR活化免疫细胞,由此产生经活化免疫细胞。免疫细胞包括例如细胞毒性T淋巴细胞、NK细胞、CD4+ T细胞、T调节(Treg)细胞,γδT细胞、NK-T细胞、嗜中性粒细胞等。在其他实施例中,使T细胞与T细胞活化剂接触,活化T细胞。这些方法提供于本文中且论述于本文的活化组件章节中。
[0588] 将经基因方式修饰的免疫细胞(例如T淋巴细胞、NK细胞)与一种或多种靶标抗原接触可使由免疫细胞产生的细胞因子与在不存在一种或多种靶标抗原时由免疫细胞所产
生的细胞因子的量相比增加至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约
30%、至少约40%、至少约50%、至少约75%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约
10倍,或大于10倍。产量可增加的细胞因子包括但不限于IL-2及IFN-γ。
[0589] 将经基因方式修饰的免疫细胞(例如细胞毒性T淋巴细胞)与AAR接触可使细胞毒性细胞的细胞毒性活性与在不存在一种或多种靶标抗原时细胞毒性细胞的细胞毒性活性
相比增加至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约75%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍,或大于10倍。
[0590] 将经基因方式修饰的免疫细胞(例如细胞毒性T淋巴细胞)与一种或多种靶标抗原接触可使细胞毒性细胞的细胞毒性活性与在不存在一种或多种靶标抗原时细胞毒性细胞
的细胞毒性活性相比增加至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约75%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍,或大于10倍。
[0591] 在其他实施例中,例如,取决于宿主免疫细胞,使经基因方式修饰的宿主细胞与抗原接触可增加或减少细胞增生、细胞存活、细胞死亡,及类似者。
[0592] 用于制备微环境受限的抗原特异性靶向区的方法
[0593] 在一些实施例中,CAR的抗原结合域(本文中也称作“抗原特异性靶区”或“ASTR”)组成性地结合其同源抗原。在其他实施例中,ASTR可受微环境限制,较佳地或仅在某些异常条件下结合其同源抗原,例如存在于肿瘤微环境中的那些,如本文更详细地公开。较佳地或仅在肿瘤微环境的异常条件下结合的微环境受限的ASTR可减少靶向肿瘤外效应,这是因为在正常生理条件下与抗原结合减少,在一些情况下减少至低于通过免疫测定检测的位准。
在某些方面中,本文所提供的CAR包括特异性结合靶蛋白的微环境受限的ASTR,其中该ASTR为包括重链可变区域及轻链可变区域的scFv片段。
[0594] 本文所公开的方面的某些说明性实施例,例如本文所公开的方法、细胞、细胞系、复制缺陷型重组反转录病毒颗粒、多核苷酸或载体,包括CAR,该CAR包括微环境受限的抗原特异性靶向区。
[0595] 因此,在一个方面中,本文提供用于结合靶标抗原的嵌合抗原受体,其包括:
[0596] a)微环境受限的抗原特异性靶向区,与正常生理环境相比在异常条件下其呈现出与靶标抗原的结合增加,其中该抗原特异性靶向区结合至该靶标;
[0597] b)跨膜域;及
[0598] c)胞内活化域。
[0599] 在另一方面中,本文提供用于结合靶标抗原的嵌合抗原受体,其包括:
[0600] a)至少一个微环境受限的抗原特异性靶向区,其通过淘选多肽库且在与正常生理条件相比的异常条件下在靶标抗原结合测定中活性增加而经选择;
[0601] b)跨膜域;及
[0602] c)胞内活化域。
[0603] 在本文公开的任何方面的一些实施例中,嵌合抗原受体中的任一者可为微环境受限的,使得与正常生理条件相比在异常状态下其表达出增加的结合活性。在本文公开的任
何方面的一些说明性实施例中,自初始多肽库识别微环境受限的ASTR,而无需在筛选/进化之前突变/进化库的成员和/或无需在视情况存在的重复轮次筛选期间或之间突变。例示性
跨膜域及胞内活化域可为本文针对CAR所公开的那些中的任一者。
[0604] 在一个方面中,本文提供一种用于选择微环境受限的ASTR的方法,其包含通过以下步骤淘选多肽显示库:
[0605] a.使多肽显示库的多肽在正常生理条件下进行靶标抗原结合测定,且在异常条件下进行靶标抗原结合测定;及
[0606] b.选择在与生理条件相比的异常条件下显示出靶标抗原结合活性增加的多肽,从而选择微环境受限的抗原特异性靶区。
[0607] 在另一方面中,本文提供一种用于分离微环境受限的ASTR的方法,其包括通过以下步骤淘选多肽显示库:
[0608] 在异常条件下使多肽库与结合至固体载体的靶标抗原接触,其中表达与结合靶标抗原的多肽的纯系仍经由靶标抗原结合至固体载体;
[0609] 在生理条件下使固体载体与结合多肽一起培育;及
[0610] 收集在生理条件下自固体载体溶离的纯系,从而分离微环境受限的抗原特异性靶向区。
[0611] 在本文公开的任何方面的一些说明性实施例中,自初始多肽库筛选识别微环境受限的抗原特异性靶向区,而无需在筛选之前突变/进化库的成员和/或无需在视情况存在的
重复轮次筛选或淘选期间或之间突变/进化。
[0612] 正常生理条件可包括针对个体而言被认为在给药位点或在作用位点的组织或器官处的正常范围内的温度、pH、渗透压、重量渗透摩尔浓度、氧化应力及电解质浓度的那些。
异常条件为偏离正常可接受范围的条件。在一个方面中,微环境受限的抗原特异性靶向区
(即多肽)在正常条件下实际上无活性,但在除正常条件以外在与正常条件相同或更好的位
准下具有活性。举例而言,在一个方面中,微环境受限的抗原特异性靶向区在体温下实际上无活性,但在更低温度下具有活性。在另一方面中,在正常条件下使微环境受限的抗原特异性靶向区可逆地或不可逆地失活。在另一方面中,微环境受限的抗原特异性靶向区为治疗
性蛋白质。在另一方面中,将微环境受限的抗原特异性靶向区用作药物或治疗剂。在又一方面中,微环境受限的抗原特异性靶向区在高度充氧的血液中(诸如在通过肺之后或在肾脏
中发现的较低pH环境中)或多或少具有活性。
[0613] 在一些实施例中,进行单轮选择以获得微环境受限的抗原特异性靶向区。在某些实施例中,在识别在异常条件下结合抗原并且在生理条件下不结合的游离多肽或表达具有
这些性质的测试多肽的细胞或通过在初始或上一轮中具有此类性质的测试多肽涂覆的噬
菌体之后重复筛选或淘选方法。在一些方法中,收集的噬菌体用于感染也可通过辅助噬菌
体感染的细胞,以便扩增收集的噬菌体。在测试细胞表面上的多肽的其他方法中,可使收集的细胞生长以通过扩增编码多肽的细胞中的多核苷酸来“扩增”由细胞表达的多肽。在一些实施例中,通过生长表达所识别的多肽的细胞来完成扩增,而无需进行处理以在各轮之间
突变编码所识别的多肽的多核苷酸。因此,通过扩增含有编码这些收集的多肽的多核苷酸
的细胞来富集前一轮中收集的多肽。
[0614] 淘选或筛选方法可进行单次,或重复1次至1000次。在说明性实施例中,淘选重复1次至20次或2次至10次或2次至5次。
[0615] 在其他方法中,在各轮淘选之间使用一轮或多轮突变/进化来进行针对相关抗原(即靶标抗原)的微环境受限的ASTR。在一个方法中,例如通过产生多肽或蛋白质库并筛选
该多肽或蛋白质库得到具有对靶标抗原的所要结合亲和力的多肽或蛋白质来识别野生型
蛋白质。在野生型蛋白质为抗体的一些实施例中,可通过产生及筛选多株或单克隆抗体库
(包括噬菌体显示抗体库,例如噬菌体显示人源化抗体库)发现野生型抗体。
[0616] 可通过使野生型蛋白质或编码野生型蛋白质的核酸序列进行突变诱发处理以产生突变多肽群来产生进化的ASTR,这些突变多肽可经筛选以识别在肿瘤环境和/或体外肿
瘤替代测定条件中具有与正常生理环境相比增加的活性(例如与靶标抗原的结合亲和力增
强)的ASTR。此类方法的实例提供于WO2016033331(“CONDITIONALLY ACTIVE CHIMERIC 
ANTIGEN RECEPTORS FOR MODIFIED T CELLS”)或美国专利第8709755号中,这些专利的全
部内容以引用的方式并入本文中。产生微环境受限的抗体的此方法在本文中以全文引用的
方式并入本文中。
[0617] 在其他实施例中,可通过在异常条件及生理条件下筛选初始多肽库且自初始多肽库识别在异常条件下及生理条件下优先地或专有地结合的测试多肽,来识别微环境受限的
抗原特异性多肽(即靶向区,例如抗体)。在一些实例中,在初始多肽库筛选中,自初始多肽库识别的经识别且分离的微环境受限的抗原特异性多肽(即靶向区,例如抗体)在异常条件
下及生理条件下优先地或专有地结合其同源抗原。在此类情况中,不进行突变/进化的轮
次。因此,进行说明性实施例中的方法而无需在筛选轮次(例如,淘选轮次)之间使编码经分离微环境限制性抗原特异性靶向区的多肽突变,或在异常条件及生理条件下仅针对单个结
合测定进行以分离且识别微环境受限的抗原特异性多肽(即靶向区,例如抗体)。该方法可
通过在筛选和/或淘选轮次之间培养、高保真扩增和/或稀释编码抗原特异性靶向区的多核
苷酸或包括其的宿主生物体来进行而无需任何突变/进化。此外,该方法可在无需重复筛选和/或淘选的情况下进行,且可在微环境受限的抗原特异性多肽(即靶向区,例如抗体)经分离之后进行而无需使编码经分离的微环境受限的抗原特异性靶向区的多核苷酸突变/进
化。
[0618] 用于本文所提供的用以检测多肽与同源结合配偶体的结合的方法的测定包括基于细胞的测定,且尤其使用细胞表面显示系统(诸如哺乳动物细胞表面显示系统)进行的测
定。在例示性方法中,可将编码多肽或变异多肽库(包括经修饰的多肽库)的核酸引入至适
于在细胞(诸如哺乳动物细胞)中表达的载体中。接着通过载体转染细胞,且由这些细胞表
达一种或多种多肽。可使含有表面表达多肽的细胞库与含有可溶性或表面结合的同源结合
配偶体的溶液接触。可使用可检测对细胞的表面的结合的任何测定法来检测结合活性。也
可通过评估多肽的功能活性或多肽来评估活性。熟练的业内人士已知的任何基于细胞的测
定均被考虑用于本文所提供的方法,包括细胞增生测定、细胞死亡测定、流式细胞术、细胞分离技术、荧光活化细胞分选(FACS)、相位显微镜、荧光显微镜、受体结合测定、细胞信号传导测定、免疫细胞化学及报道子基因测定。在一些实例中,测定为荧光活化细胞分选(FACS)测定。
[0619] 多肽或蛋白质可由哺乳动物细胞表达为分泌的可溶性分子、细胞表面分子或胞内抗体。在例示性方法中,可在大部分或全部细胞显示锚定于细胞表面上的蛋白质库的成员
的条件下通过蛋白质库来转染细胞。视情况,可使用表达系统,其中大多数哺乳动物细胞转染体在其基因组中仅具有一个质粒。因此,大多数(即,至少约70%或约80%或约90%)的转染子表达一种多肽中的一种或多种分子。此可通过例如分离且培养受试者转染子且对表达
的序列进行扩增及测序以确定其是否具有单个序列来验证。
[0620] 在本文所提供的方法的一些实例中,多肽为显示于哺乳动物细胞表面上的抗体。本文所描述的任何抗体可在哺乳动物细胞的表面上表达,包括全长二价功能性抗体,诸如
IgG抗体。抗体可为片段,例如Fab片段或scFv片段。抗体可以包括Fc区,诸如scFv-Fc或包含两个重链及两个轻链的全长抗体。熟练的业内人士可选择适合的抗体片段。举例而言,在哺乳动物细胞中制备的ScFv-Fcs及全长抗体可具有优于scFv’s或Fab片段的若干优点。
[0621] 可用于本文所提供的结合测定中的固体载体包括能够与多肽的结合配偶体(例如配位体,受体或抗原)附着的任何载体。为促进高通量筛选,通常将同源结合配偶体附着至固体载体。在本文所提供的方法中用作固体载体的载体的实例包括(但不限于)玻璃、聚苯
乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然纤维素及改质纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂及磁性固体载体,诸如包括磁矿的固体载体。固体载体可为此项技术中已知的一种或
多种珠粒或颗粒、微球、管或板的表面、过滤膜,及其他固体载体。例示性固体载体系统包括(但不限于)由例如玻璃、、金属、尼龙、纤维素、塑料或复合材料(包括多孔板或膜)构成的平坦表面;或可呈珠粒的形式,诸如硅胶、受控孔玻璃、磁性或纤维素珠粒。此外,此类方法可适用于悬浮液或以柱的形式使用。在一些实施例中,通过生物淘选具有永生化靶标抗原
的噬菌体显示或酵母表面显示(Colby等人,“Engineering Antibody Affinity by Yeast Surface Display”,Meth.Enzym.388,26(2004))的抗体(例如人源化抗体)库来识别及分离
微环境受限的抗原特异性多肽(亦即靶向区域,例如抗原)。举例而言,可使用本文中的噬菌体显示或酵母表面显示方法来淘选天然人源化抗体库或合成的人源化抗体库。在一些实施
例中,初始噬菌体显示过程可将噬菌体纯系转移至哺乳动物载体并用于哺乳动物细胞表面
筛选方法(参见例如Yoon等人,BMC Biotechnology 12:62;1472-6750(2012))。在实施例2
中提供用于进行噬菌体显示以分离微环境受限抗原特异性靶区的例示性方法。
[0622] 使用本文提供的方法识别的微环境受限的ASTR可为抗体、抗原、配位体、配位体的受体结合域、受体、受体的配位体结合域或亲和体。在微环境受限的ASTR为抗体的实施例中,其可为全长抗体、单链抗体、Fab片段、Fab’片段、(Fab’)2片段、Fv片段,及二价单链抗体或双功能抗体。其中该抗原特异性靶向区包含来自抗体的重链及轻链。在一些实施例中,微环境受限的ASTR为单链可变片段。此类单链可变片段可具有由接头隔开的重链及轻链,其
中该接头长度在6个至100个氨基酸之间。在一些实施例中,重链位于嵌合抗原受体上的轻
链的N端。在其他实施例中,轻链位于重链的N端。微环境受限的ASTR可为双特异性ASTR。
[0623] 使用本文提供的方法识别的微环境受限的ASTR通常为多肽,且更具体而言为多肽抗体,且在说明性实施例中为单链抗体。这些多肽可在异常条件及正常条件下以更高或更
低亲和力结合至同源抗原,但在说明性实施例中在异常条件下以比正常条件下更高的亲和
力结合。在一些实施例中,这些多肽在异常条件下可以与生理(即正常)条件相比高10%、
20%、25%、50%、75%、90%、95%或99%的亲和力来结合至其同源抗原。在一些实施例中,使用本文提供的方法识别的ASTR在正常生理条件下不结合至同源抗原达到其使用阴性对
照(诸如阴性对照抗体)获得的背景位准以上的任何可检测位准。
[0624] 通过本文提供的方法分离的编码微环境受限的ASTR的核苷酸序列可通过对表达微环境受限的抗原特异性靶向的收集细胞的核苷酸进行测序来测定。接着可通过产生编码
包含微环境受限的抗原特异性靶向区(MRB-ASTR)、跨膜域及胞内活化域的多肽的多核苷酸
来将此核苷酸序列信息用于制备微环境受限的生物嵌合抗原受体(MRB-CAR)。微环境受限
的抗原特异性靶向区可经克隆至CAR构建体表达系统中,其可用以在其基因组中产生包括
CAR的重组慢病毒,且接着重组慢病毒可用于转导T细胞来在与生理条件相比的肿瘤选择性
环境中测试表达靶细胞杀伤的CAR介导的肿瘤抗原。
[0625] 条件性活性的条件
[0626] 在本文提供的方法中,在两组不同条件下筛选或测试一种或多种多肽(例如单链抗体)的活性,该两组条件模拟两种不同生理环境中的一个或多个条件,诸如病态微环境及非病态微环境的正常生理条件。通常,这些条件为可在体外模拟或复制的条件。一组条件可包括用以模拟与疾病相关的微环境的一个或多个条件。疾病可改变细胞内平衡及细胞外平
衡。举例而言,病变微环境可模拟肿瘤微环境或癌症微环境中的一个或多个条件。通常,两组条件下的活性差异可产生分子的条件性活性。因此,与第二组条件(例如正常环境或非疾病环境中的模拟条件)相比,在第一组条件(例如模拟肿瘤微环境中的条件)下显示更高活
性的分子经识别为微环境受限的候选分子。
[0627] 可选择两组条件以改变在两种生理环境中不同的一个或多个参数,诸如本文所描述或熟练此项技术人员已知的,包括但不限于化学条件、生物条件,或身体状况。可在两组条件之间变化的参数可包括选自以下的一个或多个条件:压力、温度、pH、离子强度、渗透压、重量渗透摩尔浓度、氧化应力、浊度,暴露域光(包括UV、红外线或可见光)、一种或多种溶质(诸如电解质)的浓度、葡萄糖浓度、透明质酸浓度、乳酸或乳酸盐浓度、白蛋白浓度、腺苷含量、R-2-羟基戊二酸含量、丙酮酸浓度、氧浓度和/或氧化剂、还原剂或辅助因子的存在。通过改变校准溶液中的电解质及缓冲体系,可将诸如pH、缓冲能力、离子环境、温度、葡萄糖浓度及离子强度的生理条件调节至待模拟的生物环境的那些生理条件。通过本文所描
述的一个或多个条件,可将模拟正常生理环境的该组条件选择为与模拟病变微环境(诸如
肿瘤微环境)的该组条件不同。
[0628] 举例而言,如以下所论述,与非肿瘤微环境相比,肿瘤微环境的各种参数不同,包括但不限于氧浓度、压力、辅助因子的存在、pH、透明质酸浓度、乳酸浓度、白蛋白浓度、腺苷含量、R-2-羟基戊二酸含量及丙酮酸浓度。与在非肿瘤环境或正常环境中存在的条件相比,这些参数中的任一者可在体外复制以模拟存在于肿瘤或癌症环境中的一种或多种条件。可模拟的正常生理条件包括在身体的任何位置处的健康或非疾病组织(诸如胃肠道、皮肤、脉管系统、血液及细胞外基质)中发现的环境。通常,在本文的分析中,生理条件可通过选择用于评估蛋白质活性的缓冲液来在体外进行模拟。举例而言,可通过用以评估测定中的活性
的测定缓冲液中的差异来模拟病变微环境(诸如肿瘤微环境)及非病变环境的任何一个或
多个条件。因此,在本文中用以识别微环境受限的多肽的方法中,使测定缓冲液的一种或多种组分或一种或多种特征改变或在用以在第一条件下测试活性的第一测定中与用以在第
二个条件下测试活性的第二测定中不同。举例而言,如本文所论述,肿瘤微环境的各种参数与非肿瘤环境相比不同,包括但不限于氧、压力、辅助因子的存在、pH、透明质酸浓度(诸如提高或降低的透明质酸浓度)、乳酸盐浓度(诸如提高或降低的乳酸盐浓度)、白蛋白浓度
(诸如提高或降低的白蛋白浓度)、腺苷含量(诸如提高或降低的腺苷含量)、R-2-羟基戊二
酸含量(诸如提高或降低的R-2-羟基戊二酸含量)及丙酮酸盐浓度(包括提高或降低的丙酮
酸浓度)。更具体而言,肿瘤微环境中的条件可包括与非肿瘤微环境相比较低的pH、较高浓度的透明质酸、较高浓度的乳酸盐及丙酮酸盐、较高浓度的白蛋白、增加的腺苷含量,增加的R-2-羟基戊二酸含量、低氧、较低浓度的葡萄糖及略微较高的温度。举例而言,微环境限受限的ASTR在正常体温下实际上无活性,但在肿瘤微环境中在较高温度下具有活性。在又
一方面中,微环境受限的抗体在正常氧合血液中具有较低活性,但在存在于肿瘤中的较少
氧合环境下具有较高活性。在又一方面中,微环境受限的抗体在正常生理pH 7.2至7.8中具有较低活性,但在肿瘤微环境中存在的酸性pH 5.8至7.0或6.0至6.8下具有较高活性。举例而言,微环境受限的抗体在6.7的pH下比在pH 7.4下具有更高活性。在熟练此项技术人员已知的肿瘤微环境中存在也可用作本发明的条件的其他条件,在这些条件下条件活性ASTR具
有不同的结合亲和力。模拟这些体内肿瘤条件的体外测定条件在本文中称作体外肿瘤替代
测定条件。
[0629] 可通过选择特定测定缓冲液来在体外模拟这些条件中的任一者或多者。仿真病变微环境的测定缓冲液的组合物可选择为与模拟正常环境的测定缓冲液的组合物相同,除本
文已知或描述的在病变微环境中改变的一个或多个条件的外。此外,在筛选或识别一种或
多种多肽在两组不同条件下的活性时,通常仅在测定中变化的条件与模拟体内微环境的缓
冲条件相关。测定的其他条件(诸如时间、温度及培育条件)对于两组条件可相同。通常,在模拟病变微环境的该组条件及模拟正常微环境的条件中使用相同的碱性缓冲液,但缓冲组
合物的设计可在诸如以下的一个或多个参数上不同,诸如pH、氧、压力、辅助因子的存在、pH、透明质酸浓度(诸如提高或降低的透明质酸浓度)、乳酸盐浓度(诸如提高或降低的乳酸浓度)、白蛋白浓度(诸如提高或降低的透明质酸浓度)和/或丙酮酸浓度(包括提高或降低
的丙酮酸浓度)。在模拟病变微环境的条件及模拟正常微环境的条件下,可使用熟练此项技术人员已知的任何碱性缓冲液。
[0630] 产生微环境受限的细胞的方法
[0631] 本发明提供一种产生微环境受限的细胞的方法。该方法大体上包括通过表达载体(例如质粒或反转录病毒载体)或包括编码本发明的微环境受限的CAR的核苷酸序列的RNA
(例如体外转录的RNA)来以基因方式修饰哺乳动物细胞。经基因方式修饰的细胞在一种或
多种靶标抗原的存在下受微环境限制。基因修饰可在体内、体外或离体进行。细胞可为免疫细胞(例如T淋巴细胞、T辅助细胞或NK细胞)、干细胞、祖细胞等。
[0632] 在一些情况下,离体进行基因修饰。举例而言,自受试者获得T淋巴细胞、干细胞、T辅助细胞或NK细胞;且将自受试者获得的细胞进行基因方式修饰以表达本发明的CAR。经基因方式修饰的细胞在一种或多种靶标抗原的存在下可受微环境限制。在一些情况下,经基因方式修饰的细胞经离体活化。在其他情况下,将经基因方式修饰的细胞引入受试者(例如自其获得细胞的受试者);且经基因方式修饰的细胞在体内活化。举例而言,当一个或多个靶标抗原存在于受试者的细胞表面上时,不需要施用抗原。经基因方式修饰的细胞与存在
于受试者的细胞表面上的抗原接触,且将经基因方式修饰的细胞活化。举例而言,当经基因方式修饰的细胞为T淋巴细胞时,经基因方式修饰的细胞可对于在CAR结合的其表面上表达
一种或多种靶标抗原的细胞展现细胞毒性。
[0633] 用于通过改变pH来调节MRB CAR表达T细胞和/或NK细胞活性的方法
[0634] 在某些方面中,本文提供通过在微环境(包括靶向组织内或一个或多个非靶向(例如健康/正常)组织内的靶细胞)内产生pH变化或偏移,通过调节MRB-CAR与这些靶细胞上的
同源抗原的结合来调节表达MRB CAR的T细胞和/或NK细胞与靶细胞的结合及产生靶细胞的
裂解/杀伤的方法。此类方法通常包括在微环境中使诸如哺乳动物细胞(例如人细胞)的靶
细胞与表达MRB CAR的T细胞和/或NK细胞接触,且接着通过降低或更通常地提高pH来改变
微环境的pH。微环境可为靶标微环境,例如肿瘤或脱靶微环境,其中脱靶结合可产生副作
用。在一些实施例中,此类方法可提供短暂降低的对肿瘤微环境敏感的CAR-T靶向结合。
[0635] 因此,在一个方面中,本文提供用于调节微环境受限的表达生物嵌合抗原受体(MRB-CAR)的T细胞或NK细胞与表达个体中的MRB-CAR的同源抗原的细胞的结合的方法,该
方法包括以下:
[0636] a.将包含编码MRB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞引入至个体中,其中在引入之后(且视情况和/或在其期间),包含编码MRB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞表达MRB-CAR
且结合至在个体中表达同源抗原的细胞;及
[0637] b.将医药试剂以充足量施用至个体以增加血液pH和/或组织的pH和/或微环境的pH,其中该给药在引入之前、期间或之后进行,且其中血液、组织和/或微环境的增加的pH介导表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞与表达具有增加pH的血液、组织或微环境中的同源抗
原的细胞的结合。
[0638] 在包括施用本发明的pH调节药用试剂的步骤的方面中,pH的变化/偏移可通过将靶向或非靶向细胞/组织暴露于pH调节药用试剂来实现,例如通过向个体施用pH调节药用
试剂。本文提供pH调节药用试剂的非限制性实施例。在某些方面中,本文提供在用于调节
MRB-CAR与其同源抗原结合或用于调节MRB CAR表达的T细胞和/或NK细胞与表达其同源抗
原的细胞结合或用于减少或减轻个体中靶向肿瘤外毒性的方法中使用的药用试剂。在某些
实施例中,此类方面关于治疗肿瘤生长、癌症、增生或细胞增生性疾病。
[0639] 在其他方面中,本文提供pH调节药用试剂的用途,其用于制备用于控制经基因方式工程化的T细胞和/或NK细胞与个体中的靶标哺乳动物细胞在活体内的结合的药物或试
剂盒中。在其他方面中,本文提供一种试剂盒,其包括含有复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的容器及其用于进行治疗肿瘤生长的方法的说明书,其中该说明书指示通过调节pH来控制
T细胞和/或NK细胞与靶标哺乳动物细胞的结合的方法。此类方法可为本文此部分提供的用
于通过改变pH来调节表达MRB CAR的T细胞和/或NK细胞结合和/或活性的方法中的任一者。
含有重组反转录病毒颗粒的容器可为用于储存重组反转录病毒颗粒和/或pH调节药用试剂
的管、小瓶,孔板,或其他容器。这些容器中的任一者可具有工业强度及等级。在某些实施例中,该试剂盒可包括两个或更多个容器。一个容器(container/vessel)可包括重组反转录
病毒颗粒且另一容器可包括pH调节药用试剂。在此类方法中,药用试剂以足够的量经递送/施用以提高血液pH和/或组织pH和/或微环境pH以调节表达MRB-CAR的经修饰/重组T细胞
和/或NK细胞的MRB-CAR与具有增加的pH的血液和/或组织中的同源抗原的结合。本文提供
用于以足够量施用pH调节药用试剂且持续足够时间的非限制性例示性细节。
[0640] 在将MRB-CAR引入至个体中之后,无论相对于组织靶向或脱靶的靶细胞,均可与诸如pH调节药用试剂的pH调节剂接触。因此,本文提供的用于调节表达MRB CAR的T细胞的结
合和/或细胞毒性活性(例如用于减轻靶向肿瘤外活性和/或用于抑制诸如肿瘤细胞增生的
靶细胞增生)的例示性方面可包括以下步骤:
[0641] a.将包含编码MRB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞引入至个体中,其中在引入之后,包含编码MRB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞表达MRB-CAR,且视情况结合至在个体中
表达同源抗原的细胞;及
[0642] b.以足够量将药用试剂施用至个体以提高血液pH和/或组织pH和/或微环境pH以调节表达MRB CAR的T细胞和/或NK细胞与表达具有增加的pH的血液、组织或微环境中的MRB CAR的同源抗原的细胞的结合。将理解,取决于用以将编码MRB-CAR的核酸引入至T细胞和/
或NK细胞中的具体方法,T细胞和/或NK细胞可或可不在其经引入至个体中之前表达MRB-
CAR。然而,在引入至个体中之后的一些时间点下,例如,2小时、4小时、8小时、12小时、1天、2天、4天和/或7天或更长时间,包括编码MRB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞表达MRB-CAR。
接着此类细胞通常结合至表达MRB-CAR的同源抗原的靶细胞。
[0643] 本文提供的用于以基因方式修饰及视情况扩增个体的淋巴细胞的方法可用于将编码MRB-CAR的核酸序列引入至个体的T细胞和/或NK细胞的基因组中以产生能够表达MRB 
CAR的T细胞和/或NK细胞,且接着将能够表达MRB CAR的T细胞和/或NK细胞引入至个体中,
其中在引入之后,T细胞和/或NK细胞表达MRB CAR,以便使MRB-CAR与靶细胞/组织接触。本发明提供如何进行这些方法以及用于修饰及扩增淋巴细胞的各种替代方案的细节,其中的
任一者可用于本发明的方面,包括改变pH以调节表达MRB CAR的T细胞和/或NK细胞与表达
MRB-CAR的同源抗原的靶细胞的结合。
[0644] 用于以基因方式修饰及扩增淋巴细胞的此类方法通常涉及使T细胞和/或NK细胞(在说明性实施例中可为静息细胞)与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触以转导这些T细
胞和/或NK细胞。此类接触通常在自个体移除淋巴细胞之后离体进行。接着将T细胞和/或NK细胞引入/再引入至通常已移除其的个体中。复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包括具有编
码MRB-CAR的多核苷酸的基因组。关于此类复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的许多替代实
施例及其他细节提供在本文其他部分中,且可用于本文提供的方法中,该方法以取决于pH
的方式通过调节表达由MRB-CAR识别的同源靶标多肽的细胞的微环境中的pH来调节MRB-
CAR的结合及产生其的裂解/杀伤。
[0645] 包括此类组合物的特定说明性方面可包括用于调节本文中其他部分提供的表达MRB CAR的T细胞的结合、细胞杀伤活性和/或存活的其他组件。在包括pH的变化的方法以及本文提供的其他实施例中可与MRB CAR表达组合的此类控制组件包括核糖开关及消除域,
因此,本文提供的此类方法及组合物的组合形成一种强大的多方面途径来确保在将表达
CAR的T细胞(包括表达MRB CAR的T细胞)施用个体之后的个体的安全性。
[0646] 用于通过表达MRB CAR的T细胞和/或NK细胞调节靶细胞的结合的此类方法可用以例如通过增加个体内的血液和/或非肿瘤组织的pH来降低靶向肿瘤外毒性。举例而言,在个体内的“正常”组织pH变得瞬间降低的情况下,可以正常组织的pH增加同时肿瘤的pH保持较低且仍处于表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞结合靶标肿瘤细胞的pH下的方式来递送pH调
节剂。在这些实施例中,可以较低浓度或以靶向方式将pH调节剂递送至正常组织。
[0647] 在一些实施例中,此可完成同时使肿瘤微环境内的pH保持足够低以使MRB-CAR T细胞和/或NK细胞与肿瘤内的其同源靶标表达细胞结合。在本文所提供的方法的说明性方
面中,组织的pH保持在表达MRB CAR的T细胞和/或NK细胞与其靶标结合一段时间的pH下,该时间足以使表达MRB CAR的T细胞和/或NK细胞接触且结合表达其同源抗原的细胞(例如2小
时、4小时、8小时、12小时或24小时,或2天、4天、7天、14天、28天或30天,或1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、12个月、24个月,或更长时间),且接着使pH偏移/改变,例如通过使组织的pH提高至一程度以影响表达MRB CAR的T细胞和/或NK细胞与靶细胞的结合。
[0648] 因此,在一个方面中,本文提供一种经由药物改变血管及组织pH来瞬时降低肿瘤微环境敏感性CAR-T细胞靶结合的方法。在不同条件下具有不同结合性的肿瘤微环境敏感
性CAR-T细胞的靶结合部分也称为微环境受限生物学、微环境受限、微环境受控或条件活
性,且可指示整个CAR或其任何靶结合域,例如ASTR、scFv或scFvFc。CAR-T细胞中的这些微环境受控的ASTR提供额外位准的保护以避免靶向肿瘤外毒性,需要肿瘤局部环境条件实现
T细胞接合。尽管对于一些单克隆抗体疗法具有吸引力,但过继性细胞疗法可产生对其CAR-T靶标瞬时容许的局部环境。举例而言,在具有低pH的组织中活化的CAR-T细胞可进一步降
低微环境的pH,取决于CAR构建体中存在的细胞质域。在其他情况下,与过继性细胞治疗相关的细胞因子释放综合征及其他病状可导致血液的碳酸氢盐缓冲能力损失,从而引起乳酸
性酸中毒。已确立通过静脉内输注施用的过继性细胞疗法产生暂时性肺压迫。对于一些细
胞疗法,输注速率需要持续监测溶解氧(Fischer等人Stem Cells Dev.2009年6月;18(5):
683–691)。肺压迫程度取决于细胞大小、活化状态、细胞剂量及输注速率。Cruz等人
(Cytotherapy.2010年10月;12(6):743–749)报道来自超过300个T细胞输注的不良发现,低剂量及缓慢输注可减少肺压迫。然而,通过某些高效CAR-T细胞,甚至以低含量存在于肺内皮上的靶标,诸如Her2(Morgan等人Mol Ther.2010年4月;18(4):843–851),可产生不可控制的立即毒性,且由于输注后肺中的初始高CAR-T细胞浓度以及这些组织中T细胞靶标的存
在而使得患者急剧恶化。在其他情况下,T细胞靶标在诸如胆管的其他目标组织中的存可能产生不可控制的靶向肿瘤外毒性(Lamers Mol Ther.2013年4月;21(4):904-12)且在可使
用诸如类固醇的其他试剂或细胞消除抗原决定基之前产生严重器官毒性。尽管静脉及动脉
血浆对酸中毒具有强缓冲能力,但呼吸性酸中毒、休克、代谢性酸中毒及缺血性酸中毒的条件可发生于通过过继性细胞疗法治疗的癌症患者中。
[0649] 在本文提供的一些方面中,MRB-CAR在个体中的结合可通过向个体施用药用试剂来调节,以提高或降低血液、组织和/或微环境的pH。在一些方面中,可通过向个体施用药用试剂以提高或降低血液pH和/或组织的pH和/或微环境的pH来在个体中减轻靶向肿瘤外毒
性。在一些方面中,T细胞和/或NK细胞与靶标哺乳动物细胞的结合可通过引入药剂以提高
或降低血液pH和/或组织的pH和/或微环境的pH来控制。在一些方面中,可通过向个体施用
pH调节药用试剂来控制个体活体内的经基因工程化的T细胞和/或NK细胞与靶标哺乳动物
细胞的结合。在说明性实施例中,药用试剂可提高血液pH和/或组织的pH和/或微环境的pH。
在一些实施例中,微环境可为活体内微环境。在说明性实施例中,微环境可为肿瘤微环境。
在一些实施例中,微环境可包括靶标哺乳动物细胞,其中靶标哺乳动物细胞在其表面上表
达靶标抗原。在一些实施例中,向个体施用药用试剂可将血液、组织和/或微环境的pH自小于5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8或6.9的pH增加至至少6.6、6.7、6.8、
6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6的pH,其中血液、组织和/或微环境的pH在施用药用试剂之前低于施用药用试剂之后。在一些实施例中,向个体施用药用试剂可将血液、组织和/或微环境的pH自高于6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6的pH降低至低于
5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0的pH,其中血液、组织和/或微环境的pH在施用药用试剂之前高于施用药用试剂之后。在一些实施例中,向个体施用药用
试剂可在个体的血液、组织和/或微环境中产生pH偏移。在一些实施例中,pH偏移可为在任一方向上的至少0.1pH单位、0.2pH单位、0.3pH单位、0.4pH单位、0.5pH单位、0.6pH单位、
0.7pH单位、0.8pH单位、0.9pH单位、1.0pH单位、1.1pH单位、1.2pH单位、1.3pH单位、1.4pH单位、1.5pH单位、1.6pH单位、1.7pH单位或1.8pH单位,即在施用药用试剂之后的pH相对于施用药用试剂之前的pH提高或降低。在说明性实施例中,pH偏移为pH增加。
[0650] 本发明的MRB-CAR可在一个pH下而非不同pH下减少与其同源抗原的结合。在针对MRB-CAR的差异性结合的说明性pH值未曾提供于广泛方面中的说明性实施例中及替代地对
于代替用于此类方面的那些值的其他实施例中,MRB-CAR可在较高pH下而非较低pH下减少
结合。举例而言,MRB-CAR可在高于7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5的pH下而非低于6.4、6.5、
6.6、6.7、6.8、6.9或7.0的pH下减少与其同源抗原的结合。在其他实施例中,MRB-CAR可在较高pH下而非较低pH下减少结合。举例而言,MRB-CAR可在低于6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或
7.0的pH下而非高于7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5的pH下减少与其同源抗原的结合。在一些说明性实施例中,相比于在pH 7.4至7.6下,MRB-CAR在6.5至6.7的pH下展现增加的结合。在其他说明性实施例中,相比于在7.4的pH下,MRB-CAR在6.7的pH下展现增加的结合。在其他实施例中,相比于在血液的pH下,MRB-CAR在肿瘤的pH下展现增加的结合。在一些实施例中,MRB-CAR可包括抗原特异性靶向区、柄及胞内活化域。在一些实施例中,MRB-CAR也可包括共刺激域。在一些实施例中,MRB-CAR可与肿瘤相关的抗原结合。
[0651] 在包括调节血液、组织或微环境的pH的方法中,可将微环境的pH自低于7.0的pH增加至高于7.0的pH。举例而言,pH可自低于6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0的pH增加至高于
7.0、7.1、7.2、7.3或7.4的pH。在一些实施例中,MRB-CAR可在引入药用试剂之前在增加的pH下而非微环境的pH下与同源抗原结合。在某些实施例中,pH可自低于7.0增加7.1至8.0的
pH、或至7.1至7.8的pH、或至7.2至7.8的pH、或至7.2至7.6的pH、或至7.3至7.6的pH、或至
7.4至7.8的pH、或至7.4至7.6的pH。视施用的药用试剂的类型及剂量而定,此pH的增加可发生少于1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时或24小时,或多于1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时或24小时。在某些实施例中,施用药用试剂,使得pH在靶标组织(诸如肿瘤)中,及例如在靶标组织(例如,肿瘤)微环境的至少一个表面中,在靶标组织(例如,肿瘤)微环境的至少一部分中以及在说明性实施例中在整个靶标组织(例如,肿瘤)微环境中保持
高于7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5;或在7.0、7.1、7.2、7.3的范围的低值端点与7.4、7.5、
7.6、7.7或7.8的范围的高值端点之间。微环境可为活体内微环境,诸如肿瘤、组织、非肿瘤组织、正常组织或经历瞬时pH偏移的组织。举例而言,通常经历短暂pH变化的组织包括厌氧条件中的肌肉组织或经历锻炼的肌肉组织或已发炎组织或正经历发炎的组织。在包括靶标
哺乳动物细胞的一些实施例中,靶标哺乳动物细胞可为肿瘤细胞或非肿瘤细胞或正常细
胞。
[0652] 在一些方面中,提供用于瞬时提高血管pH以降低微环境受控的MRB-CAR对其抗原的亲和力的方法。血液pH的0.4U偏移可使形成MRB-CAR的一部分的某些scFv对其同源抗原
的亲和力降低超过10倍。在一些实施例中,可经由各种药用试剂的IV或口服施用途径来实
现治疗性pH控制。举例而言,在一些实施例中,可通过碳酸氢盐或碳酸氢钠来实现结合亲和力的失活。在其它实施例中,可使用三羟甲基胺基甲烷(也称为缓血酸胺(tromethamine/
trometamol)及THAM)和/或CarbicarbTM(碳酸氢钠和碳酸钠的等摩尔高渗溶液)可以足以减
轻靶向肿瘤外毒性的量来提高血液中的pH。在又其他实施例中,可使用小分子质子抑制
剂以足以减轻靶向肿瘤外毒性的量来提高血液pH和/或组织pH。可用于包括调节pH的方法
中的质子泵抑制剂包括(但不限于)埃索美拉唑(esomeprazole)(Nexium)、埃索美拉唑及
普生(naproxen)(Vimovo)、兰索拉唑(lansoprazole)(Prevacid)、奥美拉唑(omeprazole)
(Prilosec及Zegerid)及雷贝拉唑(rabeprazole)(Aciphex)。质子泵抑制剂的施用可在更
长的时间内有效地用于调节抗原结合域与其同源抗原的结合亲和力持续在数天,数周,数
月或数年。在其他实施例中,抗原结合域对其同源抗原的亲和力可通过控制转运体及泵的
转录、翻译、膜表达及稳定性来改变血液pH和/或组织pH来调节。经改变表达可调节pH的此类转运体及泵的实例包括(但不限于)质子泵、钠质子交换家族(NHE)、碳酸盐转运体家族
(BCT)及单羧酸转运体家族的成员。
[0653] 在某些实施例中,在输注患者的表达微环境受限生物ASTR(例如scFv或scFvFcs)的CAR-T细胞之前或同时施用pH调节药用试剂,诸如碳酸氢盐、THAM或CaricarbTM。此类治疗将减轻另外与CAR-T细胞输注的暂时性肺压迫相关的实时细胞毒性。因此,在某些方面中,本文提供通过向个体施用足以提高血液pH和/或组织pH和/或微环境pH的量的药用试剂;且
同时或随后(例如之后1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时或24小时,或1天、2天、3天、4天或7天)将表达MRB CAR的T细胞或NK细胞引入至个体中来减少对个体的正常、健康组织造成的细胞毒性的方法。在某些实施例中,在此类引入之后的目标时间(例如之后1小时、
2小时、4小时、6小时、8小时、12小时或24小时,或1天、2天、3天、4天或7天),持续在一段时间内或无限期终止施用药用试剂,以便改变个体的血液、组织或微环境的pH并调节表达MRB 
CAR的T细胞的结合/活性。
[0654] 可以使用各种有效的给药方案来施用能够调节pH的药用试剂(例如提高个体的血液pH值和/或组织pH和/或微环境pH),如熟练的业内人士将理解。在本文中,给药可指示给予个体药用试剂,包括经由IV将药用试剂注射至个体中,或向个体或服用药用试剂的个体
提供口服剂量的药用试剂。药用试剂可施用至个体或患者持续各种时间长度,例如至少1
天、2天、3天、4天、5天或6天;1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或11周;3个月、
4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、12个月、15个月或18个月;或2年、2.5年、
3年、3.5年、4年、4.5年或5年或无限期。在一些实施例中,药用试剂可为碳酸氢盐、碳酸氢钠(NaHCO3)或碳酸氢钠及碳酸钠的溶液,且肠胃外或IV剂量可为:0.2×个体体重(kg)×个体
的碱缺失;所需HCO3(mEq)=0.5×重量(kg)×[24-血清HCO3(mEq/L)];或2mEq/kg至5mEq/kg IV输注持续4小时至8小时。在一些实施例中,可取决于酸中毒的严重程度使用碳酸氢盐、碳酸氢钠及碳酸氢钠溶液的标准给药方案。举例而言,可经由IV以1公升/小时至1.5公升/小
时的速率来施用稀释于1L的含5%右旋糖的水中的50mEq至150mEq碳酸氢盐。在其他非限制
性实施例中,可经由IV以1公升/小时至1.5公升/小时的速率来施用稀释于1L的含5%右旋
糖的水中的90mEq至180mEq碳酸氢盐。在其中药用试剂为碳酸氢盐或碳酸氢钠(NaHCO3)的
一些实施例中,肠内或口服剂量可为例如给予个体的325mg至2000mg碳酸氢钠1次/天至4
次/天。
[0655] 在一些实施例中,药用试剂可为三羟甲基胺基甲烷(也称为缓血酸胺(tromethamine/trometamol)和THAM),且胃肠外或IV剂量可估计为:所需缓血酸胺溶液
(0.3M的mL)=体重(kg)×碱缺失(毫克当量/公升)×1.1。在一些实施例中,可自借助于
Siggaard-Andersen列线图测定的mEq/L的细胞外液的缓冲液碱缺失(以mEq/L为单位)来估
计三羟甲基胺基甲烷的IV剂量。在一些实施例中,初始剂量可为通过缓慢IV输注至多
1000mL来注射的500ml(150mEq)三羟甲基胺基甲烷,其中最大剂量为500mg/kg(227mg/lb)
持续不少于一小时的时间。
[0656] 在一些实施例中,药用试剂可为小分子质子泵抑制剂,且可施用持续延长的治疗长度。举例而言,可施用小分子质子泵抑制剂持续至少1天、2天、3天、4天、5天或6天;1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或11周;3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、12个月、15个月或18个月;或2年、2.5年、3年、3.5年、4年、4.5年或5年或无限期。在一些实施例中,质子泵抑制剂可为埃索美拉唑(Nexium),且可每天一次或两次经口施用20mg或40mg埃索美拉唑。在一些实施例中,质子泵抑制剂可为埃索美拉唑(Nexium)
与萘普生(Vimovo)的组合,且可每天一次或两次经口施用20mg埃索美拉唑与375mg至500mg
萘普生。在一些实施例中,质子泵抑制剂可为兰索拉唑(Prevacid),且可每天一次或两次经口施用15mg、30mg或60mg兰索拉唑。在一些实施例中,可通过IV每天一次历经30分钟注射
30mg兰索拉唑来施用兰索拉唑并持续至多7天。接着个体可切换至口服兰索拉唑并继续治
疗。在一些实施例中,质子泵抑制剂可为奥美拉唑(Prilosec及Zegerid),且可每天一次或两次经口施用10mg、20mg或40mg奥美拉唑。在一些实施例中,质子泵抑制剂可为雷贝拉唑
(Aciphex),且可每天一次或两次经口施用20mg或60mg雷贝拉唑或可每天一次经口施用
100mg雷贝拉唑。在本文所公开的实施例中的任一者中,药用试剂可彼此组合使用。
[0657] 在本文所公开的实施例中的任一者中,可在施用药用试剂之前、期间或之后量测个体的血液、组织和/或微环境的pH。在一些实施例中,向个体施用或继续施用药用试剂以提供或降低pH的决定可基于个体的血液、组织和/或微环境的pH量测值。用于量测个体的血液pH和/或血液的碳酸氢盐含量的方法为此项技术中熟知的。在一些实施例中,可使用正电子发射断层摄影法(PET)、磁共振光谱(MRS)、磁共振成像(MRI)及光学成像来量测微环境中的体内pH,例如肿瘤中(关于测量肿瘤pH的细节,参见:Zhang X,Lin Y,Gillies RJ.Tumor pH and its measurement.J Nucl Med.2010年8月;51(8):1167-70)。
[0658] 在另一方面中,本文提供一种减轻个体的靶向肿瘤外毒性的方法,其包括以下:
[0659] a.将编码微环境受限的生物嵌合抗原受体(MRB-CAR)的多核苷酸引入至个体的T细胞或NK细胞中以产生能够表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞;
[0660] b.将能够表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞引入至个体中,其中T细胞和/或NK细胞在个体中表达MRB-CAR;及
[0661] c.将药用试剂以充足量施用至个体以增加血液pH和/或组织的pH和/或微环境的pH以介导MRB-CAR与其具有增加的pH的血液、组织和/或微环境中的同源抗原的结合,由此
减轻个体中的靶向肿瘤毒性。
[0662] 在引入步骤中,T细胞或NK细胞能够表达MRB-CAR,这是因为其经基因方式修饰以含有编码MRB-CAR的核酸。此基因修饰可为在通过转染或转导而引入T细胞或NK细胞内的载
体上存在MRB-CAR编码序列。在说明性实施例中,编码MRB-CAR的核酸经整合至T细胞或NK细胞的基因组中。
[0663] 设想此项技术中已知的用于将多核苷酸引入T细胞和/或NK细胞的各种方法可与本文提供的方法一起用于包括使用诸如pH调节药用试剂来改变pH以影响MRB-CAR T细胞或
NK细胞与细胞上的其同源抗原结合的方面(在本文中有时称为“pH切换方面”)。通常,载体(在说明性实施例中为表达载体)用于递送多核苷酸。此类载体可包括此项技术中已知的用
于向T细胞和/或NK细胞递送核酸的各种载体。本发明的说明性方面利用反转录病毒载体及
反转录病毒颗粒,及(在一些特别说明性实施例中)慢病毒载体及(在说明性实施例中)重组
慢病毒颗粒。
[0664] 其他适合的表达载体可用于本文提供的pH切换方面。此类表达载体包括(但不限于)病毒载体(例如基于以下的病毒载体:痘苗病毒;脊髓灰质炎病毒;腺病毒(参见例如Li等人,Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549,1994;Borras等人,Gene Ther 6:515 
524,1999;Li及Davidson,PNAS 92:7700 7704,1995;Sakamoto等人,H Gene Ther 5:1088 
1097,1999;WO 94/12649、WO 93/03769、WO 93/19191、WO 94/28938、WO 95/11984及WO 95/
00655);腺相关病毒(参见例如Ali等人,Hum Gene Ther 9:81 86,1998,Flannery等人,
PNAS 94:6916 6921,1997;Bennett等人,Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863,
1997;Jomary等人,Gene Ther 4:683 690,1997,Rolling等人,Hum Gene Ther 10:641 
648,1999;Ali等人,Hum Mol Genet 5:591594,1996;WO 93/09239中的Srivastava,
Samulski等人,J.Vi(1989)63:3822-3828;Mendelson等人,Virol.(1988)166:154-165;及
Flotte等人,PNAS(1993)1 90:10613-10617);SV40;单纯疱疹病毒;或反转录病毒载体(例如,小鼠白血病病毒、脾坏死病毒及衍生自诸如罗斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒及乳腺肿瘤病毒的反转录病毒的载体),例如γ反转录病毒;或人类免疫缺陷病毒(参见例如Miyoshi等人,PNAS 94:10319 23,1997;
Takahashi等人,J Virol 73:7812 7816,1999);及类似者。
[0665] 在一些实施例中,利用含DNA的病毒颗粒代替重组反转录病毒颗粒。此类病毒颗粒可为腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、痘病毒、牛痘病毒、流感病毒、水泡性口炎病毒(VSV),或辛德毕斯病毒。熟练的业内人士将理解如何修改本文公开的用于不同病毒及反转录病毒或反转录病毒颗粒的方法。在使用包括DNA基因组的病毒颗粒时,熟练的业内人士将理解,这些基因组中可包括功能单元以诱导将病毒颗粒的全部或部分DNA基因组整合
至用此类病毒转导的T细胞和/或NK细胞的基因组中。替代地,功能性DNA可经递送至在细胞中表达但不整合至T细胞和/或NK细胞的基因组中的T细胞和/或NK细胞。
[0666] 在说明性实施例中,在本发明的pH切换方面中使用的载体为重组反转录病毒颗粒,且在某些实施例中为重组慢病毒颗粒。此类反转录病毒颗粒通常包括位于病毒包膜内
的衣壳内的反转录病毒基因组。在本文的各个部分中的本发明提供重组反转录病毒颗粒的
各种实施例,其公开可包含于重组反转录病毒颗粒的表面上或在重组反转录病毒颗粒的基
因组内和/或中的组件。这些重组反转录病毒颗粒实施例中的任一者可用于本文所提供的
pH切换方面中。
[0667] 抑制性RNA分子
[0668] 在某些实施例中,本文提供的本发明的方法包括抑制在T细胞和/或NK细胞中表达的一种或多种内源基因的表达。本文提供的方法说明制备重组反转录病毒颗粒的能力,这
些重组反转录病毒颗粒表达一种或多种(且在说明性实施例中,两种或更多种)抑制性RNA
分子,诸如可用于此类方法的miRNA或shRNA。事实上,本文提供的方法说明此类抑制性RNA分子可在包括例如Ef1a内含子的内含子内经编码。此利用本方法教示以使可包括于可包装
反转录病毒基因组中的功能组件最大化,以克服先前教示的缺点,且使此类重组反转录病
毒颗粒在过继性T细胞疗法中的有效性最大化。
[0669] 在一些实施例中,抑制性RNA分子包括与彼此部分或完全互补的5’链及3’链(在一些实例中,有义链及反义链),使得该两个链能够在细胞环境内形成18至25个核苷酸的RNA双螺旋。5’链长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸,且3’链长度可为18、19、20、
21、22、23、24或25个核苷酸。5’链及3’链可为相同或不同的长度,且RNA双螺旋可包括一个或多个错配。替代地,RNA双螺旋不具有错配。
[0670] 包括于本文所提供的组合物及方法中的抑制性RNA分子在某些说明性实施例中不存在于和/或不天然表达在其插入其基因组的T细胞中。在一些实施例中,抑制性RNA分子为miRNA或shRNA。在一些实施例中,当在本文或优先权申请中提及编码siRNA的核酸,尤其在核酸为基因组的一部分的上下文中,将理解,此类核酸能够在由DICER处理的细胞中形成诸如miRNA或shRNA的siRNA前体,以形成通常与RISK复合物相互作用或成为RISK复合物的一
部分的双链RNA。在一些实施例中,本发明的一实施例中的抑制性分子可为miRNA的前体(诸如Pri-miRNA或Pre-miRNA),或shRNA的前体。在一些实施例中,miRNA或shRNA为人工衍生的(亦即人工miRNA或siRNA)。在其他实施例中,抑制性RNA分子为经处理成siRNA的dsRNA(经
转录或人工引入)或siRNA本身。在一些实施例中,miRNA或shRNA具有在自然界中未发现的
序列,或具有在自然界中未发现的至少一个功能区段,或具有在自然界中未发现的功能区
段的组合。
[0671] 在一些实施例中,抑制性RNA分子以一连串或多重排列方式置于第一核酸分子中,使得多个miRNA序列同时自单个多顺反子miRNA转录物表达。在一些实施例中,抑制性RNA分子可利用非功能性接头序列直接或间接地与彼此连接。在一些实施例中,接头序列长度可
在5个核苷酸与120个核苷酸之间,且在一些实施例中可在10个核苷酸与40个核苷酸之间,
作为非限制性实施例。在说明性实施例中,编码一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA的第一核酸序列及编码CAR(例如MRB-CAR)的第二核酸序列可操作地连接至具有组成型活
性或可在T细胞或NK细胞中诱导的启动子。因此,这些抑制性RNA分子(例如miRNA)以及CAR
以多顺反子的方式表达。另外,功能性序列可自同一转录物表达。举例而言,本文所提供的并非抑制性RNA分子的淋巴增生性组件中的任一者可自与CAR及一种或多种(例如两种或更
多种)抑制性RNA分子相同的转录物表达。
[0672] 在一些实施例中,抑制性RNA分子为天然存在的miRNA,诸如但不限于miR-155。替代地,可产生人造miRNA,其中能够形成杂交/互补的茎结构且针对靶标RNA的序列置于包括用于微小RNA处理的微小RNA侧翼序列及环的miRNA框架中,且可视情况衍生自与茎序列之
间的侧翼序列相同的天然存在的miRNA。因此,在一些实施例中,抑制性RNA分子自5’至3’定向包括:5’微小RNA侧翼序列、5’茎、环、与该5’茎部分或完全互补的3’茎,及3’微小RNA侧翼序列。在一些实施例中,5’茎(本文中也称为5’臂)长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施例中,3’茎(本文中也称为3’臂)长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施例中,环的长度为3至40、10至40、20至40或20至30个核苷酸,且在说明性实施例中,环的长度可为18、19、20、21或22个核苷酸。在一些实施例中,一个茎比另一茎长两个核苷酸。较长茎可为5’茎或3’茎。
[0673] 在一些实施例中,5’微小RNA侧翼序列、3’微小RNA侧翼序列或两者均衍生自天然存在的miRNA,诸如但不限于miR-155、miR-30、miR-17-92、miR-122及miR-21。在某些实施例中,5’微小RNA侧翼序列、3’微小RNA侧翼序列或两者均衍生自miR-155,例如来自小家鼠或智人的miR-155。将合成的miRNA茎环插入至miR-155框架(亦即5’微小RNA侧翼序列、3’微小RNA侧翼序列及miRNA 5’茎与3’茎之间的环)为此项技术中的一般技术人员已知的(Chung,K.等人2006.Nucleic Acids Research.34(7):e53;US7,387,896)。SIBR(合成抑制性BIC衍生的RNA)序列(Chung等人.2006,同前文献)例如具有由小家鼠BIC非编码mRNA(Genbank ID AY096003.1)的核苷酸134至161(SEQ ID NO:256)组成的5’微小RNA侧翼序列及由小家鼠BIC非编码mRNA(Genbank ID AY096003.1)的核苷酸223至283组成的3’微小RNA侧翼序列。
在一项研究中,SIBR序列经修饰(eSIBR)以增强miRNA的表达(Fowler,D.K.等人
.2015.Nucleic acids Research 44(5):e48)。在本发明的一些实施例中,miRNA可置于
SIBR或eSIBR miR-155框架中。在本文的说明性实施例中,miRNA置于miR-155框架中,其包括由SEQ ID NO:256显示的miR-155的5’微小RNA侧翼序列,由SEQ ID NO:260显示的3’微小RNA侧翼序列(小家鼠BIC非编码mRNA的核苷酸221至265);及经修饰的miR-155环(SEQ ID 
NO:258)。因此,在一些实施例中,miR-155的5’微小RNA侧翼序列为SEQ ID NO:256或其功能性变体,诸如与SEQ ID NO:256相同的长度,或为SEQ ID NO:256的长度的95%、90%、85%、
80%、75%或50%或长度为100个核苷酸或更少、95个核苷酸或更少、90个核苷酸或更少、85个核苷酸或更少、80个核苷酸或更少、75个核苷酸或更少、70个核苷酸或更少、65个核苷酸或更少、60个核苷酸或更少、55个核苷酸或更少、50个核苷酸或更少、45个核苷酸或更少、40个核苷酸或更少、35个核苷酸或更少、30个核苷酸或更少,或25个核苷酸或更少;且与SEQ ID NO:256至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%一致的序列。在一些实施例中,miR-155的3’微小RNA侧翼序列为SEQ ID NO:260或其功能性变体,例如与
SEQ ID NO:260相同的长度,或为SEQ ID NO:260的长度的95%、90%、85%、80%、75%,或
50%或长度为100个核苷酸或更少、95个核苷酸或更少、90个核苷酸或更少、85个核苷酸或更少、80个核苷酸或更少、75个核苷酸或更少、70个核苷酸或更少、65个核苷酸或更少、60个核苷酸或更少、55个核苷酸或更少、50个核苷酸或更少、45个核苷酸或更少、40个核苷酸或更少、35个核苷酸或更少、30个核苷酸或更少,或25个核苷酸或更少;且与SEQ ID NO:260至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%一致的序列。然而,作用以在插入其中的miRNA的细胞内提供适当处理以形成能够抑制其结合的靶标mRNA的表达的成熟
miRNA的任何已知的微小RNA框架涵盖于本发明中。
[0674] 在一些实施例中,由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的多核苷酸中的核酸序列编码的抑制性RNA分子中的至少一者、至少两者、至少三者,或至少四者具有呈5’至3’取向的以下排列:5’微小RNA侧翼序列、5’茎、环、与该5’茎部分或完全互补的3’茎,及3’微小RNA侧翼序列。在一些实施例中,所有抑制性RNA分子具有呈5’至3’取向的以下排列:5’微小RNA侧翼序列、5’茎、环、与该5’茎部分或完全互补的3’茎,及3’微小RNA侧翼序列。如本文所公开,抑制性RNA分子可由一个或多个接头序列分隔开,其在一些实施例中没有除在这些抑制性
RNA分子之间作为间隔子的外的功能。
[0675] 在一些实施例中,当包括两个或更多个抑制性RNA分子(在一些实例中,包括1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个抑制性RNA分子)时,这些抑制性RNA分子针对相同或不同的RNA靶标(诸如自相关基因转录的mRNA)。在说明性实施例中,第一核酸序列中包括2个与10个之间、2个与8个之间、2个与6个之间、2个与5个之间、3个与5个之间或3个与6个之间的抑制性RNA分子。在一说明性实施例中,第一核酸序列中包括四个抑制性RNA分子。
[0676] 在一些实施例中,RNA靶标为自由T细胞表达的基因转录的mRNA,这些mRNA诸如(但不限于):PD-1(防止失活);CTLA4(防止失活);TCRa(安全地防止自体免疫);TCRb(安全-防止自体免疫);CD3Z(安全-防止自体免疫);SOCS1(防止失活);SMAD2(防止失活);miR-155靶标(促进活化);IFNγ(减少CRS);cCBL(延长信号传导);TRAIL2(防止死亡);PP2A(延长信号传导);ABCG1(通过限制胆固醇的清除来增加胆固醇微含量)。在说明性实施例中,在本文提供的方法中插入至T细胞至基因组中的miRNA针对靶标,使得T细胞的增生经诱导且/或增强
且/或凋亡经抑制。
[0677] 在一些实施例中,RNA靶标包括编码T细胞受体(TCR)复合物的组份的mRNA。此类组分可包括用于产生和/或形成T细胞受体复合物的组分和/或用于T细胞受体复合物的恰当
功能的组分。因此,在一个实施例中,两种或更多种抑制性RNA分子中的至少一者使得TCR复合物(在说明性实施例中,T细胞的一种或多种内源性TCR复合物)的形成和/或功能降低。T
细胞受体复合物包括TCRa、TCRb、CD3d、CD3e、CD3g及CD3z。已知这些组分具有复杂的相互依赖性,使得任何一个子单元的表达的降低将导致复合物的表达及功能降低。因此,在一个实施例中,RNA靶标为表达与经转导T细胞内源性的TCRa、TCRb、CD3d、CD3e、CD3g及CD3z中的一者或多者的mRNA。在某些实施例中,RNA靶标为自T细胞的内源性TCRα或TCRβ基因转录的
mRNA,该T细胞的基因组包含编码一个或多个miRNA的第一核酸序列。在说明性实施例中,
RNA靶标为自TCRα基因转录的mRNA。在某些实施例中,可将针对自具有相似预期效用的靶基因转录的mRNA的抑制性RNA分子组合。在其他实施例中,可将针对自具有互补效用的靶基因转录的靶标mRNA的抑制性RNA分子组合。在一些实施例中,两种或更多种抑制性RNA分子针
对自靶基因CD3Z、PD1、SOCS1和/或IFNγ转录的mRNA。
[0678] 在本文提供的一些实施例中,两种或更多种抑制性RNA分子可在单个内含子中递送,诸如但不限于EF1-αa内含子A。可用于携带本发明的miRNA的内含子序列包括在T细胞内处理的任何内含子。如本文所示,此类排列的一个优势在于,此有助于以本文提供的方法使miRNA序列包括于用于将此类序列递送至T细胞的反转录病毒基因组的大小内的能力最大
化。当第一核酸序列的内含子包括用以以多顺反子方式表达内含子、CAR序列及本文所提供的其他功能性序列的启动子序列的全部或部分(诸如并非抑制性RNA分子的淋巴增生性组
件)时,此尤其为真。内含子的序列要求为此项技术中已知的。在一些实施例中,此类内含子处理可操作地连接至核糖开关,诸如本文所公开的任何核糖开关。因此,核糖开关可提供用于控制第一核酸序列上的一个或多个miRNA序列的表达的调节组件。因此,本文所提供的说明性实施例为针对内源性T细胞受体子单元的miRNA的组合,其中miRNA的表达由核糖开关
调节,该核糖开关可为本文所论述的核糖开关中的任一者。
[0679] 在一些实施例中,抑制性RNA分子可提供于可包括于相同或不同转录单元上的多个核酸序列上。举例而言,第一核酸序列可编码一种或多种抑制性RNA分子,且自第一启动子表达,且第二核酸序列可编码一种或多种抑制性RNA分子且自第二启动子表达。在说明性实施例中,两种或更多种抑制性RNA分子位于自单个启动子表达的第一核酸序列上。用于表达此类miRNA的启动子通常为在用以表达反转录病毒颗粒的包装细胞中无活性的启动子,
该反转录病毒颗粒将其基因组中的miRNA递送至靶标T细胞,但此类启动子在T细胞内为组
成性活性或呈可诱导的方式的活性。启动子可为Pol I、Pol II,或Pol III启动子。在一些说明性实施例中,启动子为Pol II启动子。
[0680] 特征及商业生产方法
[0681] 本发明提供多种方法及组合物,可使用作为研究试剂以用于科学实验及商业生产。此科学实验可包括用于使用以基因方式修饰(例如转导)本文提供的淋巴细胞的方法表
征淋巴细胞(诸如NK细胞,且在说明性实施例中,T细胞)的方法。这些方法例如可用于研究淋巴细胞的活化及通过其活化使得这些细胞可转导的详述分子机制。此外,本文提供将用
于例如作为研究工具以更好理解影响T细胞增生及存活的因素的经基因方式修饰的淋巴细
胞。这些经基因方式修饰的淋巴细胞(诸如NK细胞,且在说明性实施例中,T细胞)可此外用于商业生产,例如用于产生可经采集或测试或用于产生商业产物的某些因子,诸如生长因
子及免疫调节剂。
[0682] 淋巴细胞的科学实验和/或特征可包括用于分析或比较淋巴细胞的本文提供的方面、实施例或子实施例中的任一者。在一些实施例中,可用包括多核苷酸的本文提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导T细胞和/或NK细胞。在一些实施例中,转导T细胞和/或NK
细胞可包括多核苷酸,这些多核苷酸包括编码本发明的多肽的多核苷酸,例如CAR、淋巴增生性组件和/或活化组件。在一些实施例中,多核苷酸可包括如本文其他处论述的抑制性
RNA分子。在一些实施例中,淋巴增生性组件可为嵌合淋巴增生性组件。
[0683] 治疗方法
[0684] 本发明提供使用CAR的各种治疗方法。本发明的CAR在存在与T淋巴细胞或NK细胞中时,可介导对靶细胞的细胞毒性。本发明的CAR结合靶细胞上存在的抗原,从而通过经基因方式修饰以产生CAR的T淋巴细胞或NK细胞介导靶细胞的杀伤。CAR的ASTR结合存在于靶
细胞的表面上的抗原。
[0685] 本发明提供杀伤或抑制靶细胞的生长的方法,该方法包括使经基因方式修饰以产生个体CAR的细胞毒性免疫效应细胞(例如,细胞毒性T细胞或NK细胞)接触,使得T淋巴细胞或NK细胞识别存在于靶细胞的表面上的抗原,且介导对靶细胞的杀伤。
[0686] 本发明提供治疗患有疾病或病症的受试者中的疾病或病症的方法,该方法包括:a.将包括编码CAR的多核苷酸序列的表达载体引入至自个体获得的周边血细胞中以产生经
基因工程化的细胞毒性细胞;及b.向个体施用该经基因工程化的细胞毒性细胞。
[0687] 在包括向个体(尤其患有或疑似患有癌症的个体)施用经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞的本文提供的方法中,这些方法可进一步包括将有效剂量的免疫核查点抑制
剂递送至个体。此核查点抑制剂递送可在施用经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞之前、
之后或同时发生。免疫核查点抑制剂为已知的且各种化合物经批准且在临床研究中。在提
及一些免疫核查点抑制剂的情况下,核查点分子(其中的许多者为核查点抑制剂化合物的
靶标)包括以下:
[0688] CD27.此分子支持原生T细胞的抗原特异性扩增且对产生T细胞记忆而言为必不可少的。Celldex Therapeutics正在研究CDX-1127,其为激动抗CD27单纯系抗体。
[0689] CD28.此分子组成性地表达于几乎所有人类CD4+ T细胞上及所有CD8 T细胞的约一半上。CD28为TGN1412『超激动剂』的靶标。
[0690] CD40.此分子(出现于包括抗原呈现细胞的各种免疫系统细胞上)具有CD40L,另外称为CD154,且作为其配位体瞬时表达于经活化CD4+ T细胞的表面上。抗CD40激动剂单纯系抗体授权给Roche。
[0691] CD122.已知此分子(其为白细胞介素-2受体β子单元)增加CD8+效应T细胞的增生。Nektar Therapeutics已研发NKTR-214,其为经CD122偏压的免疫刺激性细胞因子。
[0692] CD137.当此分子(也称为4-1BB)由CD137配位体结合时,结果为T-细胞增生。Pieris Pharmaceuticals已研发对CD137及HER2具有双特异性的工程化脂质运载蛋白。
[0693] OX40.此分子(也称为CD134)具有作为其配位体的OX40L或CD252。如同CD27,OX40促进效应子及记忆T细胞的扩增,然而,其还抑止T调节细胞的分化及活性,且以其调节细胞因子产量的能力而闻名。AstraZeneca具有三种靶向OX40的研发药物:MEDI0562为人类化
OX40激动剂、MEDI6469、鼠类OX4激动剂;及MEDI6383(OX40激动剂)。
[0694] GITR为糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因的缩写,其促进T细胞扩增,包括Treg扩增。TG Therapeutics正在研究抗GITR抗体。
[0695] ICOS.此分子为可诱导T细胞共刺激因子的缩写,且也称为CD278,其表达于经活化T细胞上。Jounce Therapeutics正在研发ICOS激动剂。
[0696] A2AR.在癌症疗法中将腺苷A2A受体视为重要的核查点,这是因为引起A2a受体的活化的免疫微环境中的腺苷为负免疫反馈环且肿瘤微环境具有相对较高浓度的腺苷。
[0697] B7-H3(也称为CD276)最初理解为共刺激分子但现今视为共抑制的。MacroGenics正在研究MGA271,其为靶向B7-H3的经Fc优化的单纯系抗体。
[0698] B7-H4(也称为VTCN1)由肿瘤细胞及肿瘤相关巨噬细胞表达且在肿瘤逃逸中起作用。
[0699] BTLA.此分子为B及T淋巴细胞弱化子的缩写且也称为CD272,其具有作为其配位体的HVEM(疱疹病毒进入介体)。
[0700] CTLA-4为细胞因子T淋巴细胞相关蛋白4的缩写且也称为CD152,其为Bristol-Myers Squibb的化合物伊匹单抗(Yervoy)的靶标。
[0701] IDO为吲哚胺2,3-加双氧酶的缩写,其为具有免疫抑制性特性的色氨酸分解酶。另一重要的分子为TDO,色氨酸2,3-加双氧酶。IDO.Newlink Genetics及Incyte已鉴别IDO路
径抑制剂。
[0702] KIR为杀灭细胞免疫球蛋白样受体的缩写,其为自然杀灭细胞上的MHC类别I分子的受体。Bristol-Myers Squibb已研发丽瑞鲁单抗(Lirilumab),其为KIR的单纯系抗体。
[0703] LAG3,其为淋巴细胞活化基因-3的缩小,起作用以通过作用于Treg抑止免疫应答,且CD8+ T细胞具有直接影响。Bristol-Myers Squibb已研发称为BMS-986016的抗LAG3单纯系抗体。
[0704] PD-1为程序化死亡1(PD-1)受体的缩写,其具有两个配位体PD-L1及PD-L2。此核查点为Merck&Co.的黑素瘤药物默沙东(Keytrud)的靶标。
[0705] TIM-3为T细胞免疫球蛋白域及白结构域3的缩写,其表达于经活化人类CD4+ T细胞上且调节Th1 and Th17细胞因子。
[0706] VISTA(蛋白质)为T细胞活化的V域Ig抑制因子的缩写,VISTA起始表达于造血细胞上。
[0707] 适用于治疗的个体
[0708] 各种个体适用于通过本发明的方法及组合物治疗。适合的个体包括患有疾病或病症、经诊断患有疾病或病症、处于患有疾病或病症的风险、曾患有疾病或病症且处于疾病或病症复发的风险、已通过用于该疾病或病症的药物治疗且未能对此治疗作出反应、或已通
过用于该疾病或病症的药物治疗但在对此治疗的初步反应之后复发的任何个体,例如人或
非人类动物。
[0709] 适用于通过免疫调节方法治疗的个体包括具有自身免疫疾病的受试者;为器官或组织移植接受者及类似者的受试者;免疫缺陷的受试者;及感染病原体的受试者。
[0710] 例示性实施例
[0711] 此例示性实施例章节提供本文中提供的例示性方面及实施例且贯穿此说明书进一步论述。出于简洁及方便起见,所有所公开方面及实施例及所公开方面及实施例的所有
可能的组合不列于此章节中。应理解,所提供的实施例为针对许多方面的特定实施例,如此整个公开内容所论述。意欲鉴于本文的完整公开内容,以下所述或此完整公开内容中的任
何个别实施例可与以下所述或此完整公开内容中的任何方面组合,其中其为可添加至方面
的额外元素或因为其为针对已呈现于方面中的元素的更窄元素。此组合在此详细描述的其
他章节中论述了更多的规范。
[0712] 在一个方面中,本文提供包括多核苷酸的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,该多核苷酸包括:
[0713] A.可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元,其中该一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR);及
[0714] B.在其表面上的假型组件及活化组件(例如,NK细胞活化组件,或在说明性实施例中,T细胞活化组件),其中该活化组件不由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸
编码。
[0715] 在另一方面中,本文提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其包括多核苷酸,该多核苷酸包括可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元,其中该一个或多个转录单元编码包括嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽及包括淋
巴增生性组件的第二多肽。在此章节中及此公开内容中,本文提供诸如(但不限于)淋巴增
生性组件、活化组件、假型组件、控制组件、CAR及其他组件的这些颗粒的各种实施例。
[0716] 在另一方面中,本文提供包含多核苷酸的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,该多核苷酸包括可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录
单元,其中该一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽及包含嵌合淋
巴增生性组件(例如组成性活性嵌合淋巴增生性组件)的第二多肽。在说明性实施例中,嵌
合淋巴增生性组件不包含连接至其同源受体或连接至其同源受体的片段的细胞因子。在此
章节中及此公开内容中,本文提供诸如(但不限于)淋巴增生性组件、活化组件、假型组件、控制组件、CAR及其他组件的这些颗粒的各种实施例。
[0717] 在另一方面中,本文提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其包含:
[0718] A.多核苷酸,其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元,其中该一个或多个转录单元编码嵌合抗原受体(CAR);及
[0719] B.在其表面上的假型组件及T细胞活化组件,其中该T细胞活化组件不由该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码,且其中该T细胞活化组件为抗CD3 scFvFc抗
体。在此章节中及此公开内容中,本文提供诸如(但不限于)淋巴增生性组件、活化组件、假型组件、控制组件、CAR及其他组件的这些颗粒的各种实施例。
[0720] 在另一方面中,本文提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其包含:
[0721] A.一个或多个假型组件,其能够与T细胞和/或NK细胞结合且有助于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒与其的膜融合;
[0722] B.多核苷酸,其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元,其中该一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(包含抗原特异
性靶向区、跨膜域及胞内活化域)的第一工程化信号传导多肽及包含至少一个淋巴增生性
组件的第二工程化信号传导多肽;其中第一工程化信号传导多肽和/或第二工程化信号传
导多肽的表达由控制组件来调节;及
[0723] C.在其表面上的活化组件,其中该活化组件能够与T细胞和/或NK细胞结合且不由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码。在此章节中及此公开内容中,本文提
供诸如(但不限于)淋巴增生性组件、活化组件、假型组件、控制组件、CAR及其他组件的这些颗粒的各种实施例。
[0724] 在一些方面中,本文提供通过用本文提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的任一者离体转导静息T细胞和/或静息NK细胞制成的经基因方式修饰的淋巴细胞(诸如T细
胞或NK细胞),其中该接触有助于通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/
或NK细胞,由此产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞。在一些实施例中,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上的假型组件及在其表面上的膜结合T细胞活化组件。在
此章节中及此公开内容中,本文提供诸如(但不限于)接触时间、淋巴增生性组件、活化组
件、假型组件、控制组件及其他组件的此细胞的各种实施例。
[0725] 在另一方面中,本文提供任何复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在制造用于以基因方式修饰T细胞和/或NK细胞的试剂盒中的用途,其中试剂盒的用途包括本文提供的方法方
面及实施例中的任一者的步骤。举例而言,在另一方面中,本文提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在制造用于以基因方式修饰T细胞或NK细胞的试剂盒中的用途,其中试剂盒
的用途包括:使T细胞或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒离体接触,其中该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包括在表面上的假型组件及通常在表面上的T细胞活化组件,其
中该接触有助于通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导T细胞或NK细胞,由此产生经基
因方式修饰的T细胞或NK细胞。在一些实施例中,T细胞活化组件可经膜结合。在说明性实施例中,T细胞活化组件经由T细胞受体相关受体复合物活化T细胞。在一些实施例中,该接触可进行范围的低值端点为1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时或8小时与范围的高值端点为4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、10小时、12小时、15小时、18小时、21小时及24小时之间,例如1小时与12小时之间或1小时与5小时之间。在此用途方面及本文的其他用途方面中,用于制造试剂盒的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可包括本文提供的复制缺
陷型重组反转录病毒颗粒方面及实施例中的任一者。本文提供诸如(但不限于)其他接触时
间、淋巴增生性组件、活化组件、假型组件、经转染/经基因方式修饰的细胞百分比、控制组件及其他组件的这些方法的各种其他实施例。
[0726] 在另一方面中,本文提供转导和/或以基因方式修饰的淋巴细胞,通常T细胞和/或NK细胞,且通常静息T细胞和/或静息NK细胞,其包括使淋巴细胞与复制缺陷型重组反转录
病毒颗粒接触,其中该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒通常包含在其表面上的假型组件,
其中该接触(其也可被视为在接触条件下培育)有助于通过复制缺陷型重组反转录病毒颗
粒转导静息T细胞和/或NK细胞,由此产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞。假型组件
通常能够结合静息T细胞和/或NK细胞且通常有助于其自身的膜融合或与复制缺陷型重组
反转录病毒颗粒的其他蛋白质结合。在方法的一些实施例中,复制缺陷型重组反转录病毒
颗粒包含活化组件,诸如经由T细胞受体相关复合物活化T细胞的T细胞活化组件。此活化组件可为抗CD3抗体,例如抗CD3 scFv或抗CD3 scFvFc。本文提供各种例示性及说明性接触时间。本文提供诸如(但不限于)接触时间、淋巴增生性组件、活化组件、假型组件、经转染/经基因方式修饰的细胞百分比、控制组件及其他组件的这些方法的各种其他实施例。
[0727] 在另一方面中,本文提供用于以基因方式修饰和/或转导淋巴细胞的方法,该方法包含使淋巴细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒离体接触,其中该复制缺陷型重组反转
录病毒颗粒包含在其表面上的假型组件及在其表面上的膜结合T细胞活化组件,其中该接
触有助于通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导淋巴细胞,由此产生经基因方式修饰的
淋巴细胞。在一些实施例中,膜结合T细胞活化组件为抗CD3抗体,例如抗CD3 scFv或抗CD3 scFvFc。本文提供诸如(但不限于)接触时间、淋巴增生性组件、活化组件、假型组件、经转染/经基因方式修饰的细胞百分比、控制组件及其他组件的这些方法的各种其他实施例。
[0728] 在另一方面中,本文提供转导个体的静息淋巴细胞的方法,该方法包含使静息T细胞和/或静息NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒离体接触,其中该复制缺陷型重组
反转录病毒颗粒包含在其表面上的假型组件,该假型组件能够结合静息T细胞和/或静息NK
细胞且有助于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒与其的膜融合,其中该接触有助于通过复制
缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞,由此产生经基因方式修饰的T细
胞和/或NK细胞。在此方面的说明性实施例中,至少10%、20%或25%的静息T细胞和/或NK细胞或10%与70%之间、10%与50%之间或20%与50%之间的T细胞和/或NK细胞经转导作
为方法的结果。本文提供诸如(但不限于)接触时间、淋巴增生性组件、活化组件、假型组件、经转染/经基因方式修饰的细胞百分比、控制组件及其他组件的这些方法的各种其他实施
例。
[0729] 在另一方面中,本文提供用于转导来自经分离学院的静息T细胞和/或静息NK细胞的方法,其包含:
[0730] A.自个体收集血液;
[0731] B.分离包含静息T细胞和/或静息NK细胞的周边血液单核细胞(PBMC);
[0732] C.使个体的静息T细胞和/或静息NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒离体接触,其中该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上的假型组件,该假型组件能
够结合静息T细胞和/或静息NK细胞且有助于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒与其的膜结
合,其中该接触有助于通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导至少5%的静息T细胞和/
或NK细胞,由此产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞,由此转导静息T细胞和/或NK细
胞。本文提供诸如(但不限于)接触时间、淋巴增生性组件、活化组件、假型组件、经转染/经基因方式修饰的细胞百分比、控制组件及其他组件的这些方法的各种其他实施例。
[0733] 通常,包装细胞系用于产生本文其他处所论述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。在一些实施例中,包装细胞系可为悬浮细胞系。在说明性实施例中,包装细胞系可在无血清培养基中生长。在一些实施例中,淋巴细胞可来自个体。在说明性实施例中,淋巴细胞可来自个体的血液。本文提供诸如(但不限于)接触时间、淋巴增生性组件、活化组件、假型组件、经转染/经基因方式修饰的细胞百分比、控制组件及其他组件的这些方法的各种其他实施例。
[0734] 在另一方面中,本文提供用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导淋巴细胞的方法,其包含:
[0735] A.用包含复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的组分的一组载体转染包装细胞,其中该包装细胞在含悬浮液的无血清培养基中生长;
[0736] B.自无血清培养基采集该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒;及
[0737] C.使淋巴细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触。本文提供诸如(但不限于)接触时间、淋巴增生性组件、活化组件、假型组件、经转染/经基因方式修饰的细胞百分比、控制组件及其他组件的这些方法的各种实施例。
[0738] 在另一方面中,本文提供一种用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导淋巴细胞的方法,其包含:
[0739] A.将包装细胞培养培养在无血清培养基中的悬浮液中,其中该包装细胞包含编码该复制缺陷型反转录病毒颗粒的可包装RNA基因组、REV蛋白质、gag多肽、pol多肽及假型组件的核酸序列;
[0740] B.自无血清培养基采集该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒;及
[0741] C.使该淋巴细胞与该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触,其中该接触进行少于12小时,由此转导该淋巴细胞。本文提供诸如(但不限于)其他接触时间、淋巴增生性组件、活化组件、假型组件、经转染/经基因方式修饰的细胞百分比、控制组件及其他组件的这些方法的各种其他实施例。
[0742] 除非不与方面相容或已陈述于方面中,在说明性实施例中,包装细胞为永生化细胞,其包含编码可包装RNA基因组的稳定地整合至其中的DNA核酸。在一些实施例中,gag多肽及pol多肽自一个或多个可诱导启动子表达,其中该方法进一步包含:在培养期间,添加反式活化因子以诱导gag多肽及pol多肽自一个或多个可诱导启动子的表达。本文提供诸如
(但不限于)接触时间、淋巴增生性组件、活化组件、控制组件及其他组件的这些方法的各种实施例。
[0743] 除非不与方面相容或已陈述于方面中,在用于以基因方式修饰和/或转导淋巴细胞(T淋巴细胞),用于以基因方式修饰及扩增淋巴细胞(例如T淋巴细胞)或进行本文中的细
胞疗法或类似方法的的方法方面中的任一者的说明性实施例中,该接触可实行15分钟、30
分钟或45分钟或范围的地段在于1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时或8小时与范围的高值端点在于2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时及72小时之间。举例而言,在说明性实施例中,该接触实行2小时与24小时之间、2小时与20小时之间、2小时与6小时之间、1小时与20小时之间、1小时与12小时之间、1小时与
4小时之间、4小时与12小时之间或4小时与8小时之间。在一些实施例中,除非陈述或另外陈述于本文提供的广泛方面中,否则在方法、产生产物的制程或其的用途中的任一者中,使
PBMC、NK细胞(且在说明性实施例中,T细胞)与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触可进行
1小时与24小时之间,例如1小时与12小时之间、1小时与6小时之间。在一些实施例中,该接触可进行少于24小时,例如少于12小时、少于8小时或少于4小时。在说明性实施例中,该接触进行1小时与14小时之间、1小时与12小时之间、1小时与6小时之间、1小时与4小时之间或
2小时与14小时之间。可在不预先活化的情况下进行这些方法。
[0744] 除非不与方面相容或已陈述于方面中,用于转导和/或以基因方式修饰淋巴细胞(例如NK细胞或在说明性实施例中,T细胞)的以上方法、用途或方法方面的产物中的任一者的另外的实施例可包括本文中其他处公开的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒、淋巴增生性
组件、CAR、假型组件、核糖开关、活化组件、膜结合细胞因子、miRNA和/或其他组件的实施例中的任一者。在某些说明性实施例中,反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒。
[0745] 除非不与方面兼容或已陈述于方面中,在本文提供的方法、试剂盒、用途或组合物(例如,多核苷酸、包装细胞或复制缺陷型重组反转录病毒颗粒)中,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含或进一步包含在其表面上的活化组件,其能够活化T细胞和/或NK细胞。通常,诸如T细胞活化组件的活化组件不由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码。
[0746] 除非不与方面相容或已陈述于方面中,在叙述T细胞和/或NK细胞或静息T细胞和/或静息NK细胞的本文提供的方法、试剂盒、用途或组合物(例如,多核苷酸、包装细胞或复制缺陷型重组反转录病毒颗粒)中,在某些说明性实施例中,该细胞为T细胞。
[0747] 除非不与方面相容或已陈述于方面中,通常,本文提供的方法、试剂盒、用途或组合物(例如,多核苷酸、包装细胞或复制缺陷型重组反转录病毒颗粒)中的任一者中的重组反转录病毒颗粒为复制缺陷型的,亦即不可复制。在说明性实施例中,反转录病毒为慢病
毒,诸如复制或复制缺陷型HIV慢病毒。在说明性实施例中,反转录病毒为慢病毒,诸如复制缺陷型或复制缺陷型HIV慢病毒颗粒。因此,在文提供的方法、试剂盒、用途或组合物(例如,多核苷酸、包装细胞或复制缺陷型重组反转录病毒颗粒)中的任一者中的说明性实施例中,若未叙述或另外叙述,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒和/或经基因方式修
饰的细胞为经基因方式修饰的T细胞。
[0748] 除非不与方面兼容或已陈述于方面中,在本文提供的方面中的任一者的说明性实施例中,淋巴细胞可为T细胞和/或NK细胞。在另外的实施例中,T细胞和/或NK细胞可为静息T细胞和/或静息NK细胞。
[0749] 除非不与方面相容或已陈述于方面中,在用于转导、以基因方式修饰及扩增淋巴细胞或用于进行本文的适应性细胞疗法或类似疗法的方法方面中的任一者的说明性实施
例中,10%与75%之间、或10%与70%之间、或10%与60%之间、或10%与50%之间、或10%与25%之间、或20%与75%之间、或20%与50%之间,或至少10%、20%或25%的静息T细胞经转导或0%与75%之间的NK细胞经转导。在其他方面中,5%与80%之间、或10%与80%之间、或10%与70%之间、或10%与60%之间、或10%与50%之间、或10%与25%之间、或10%与20%之间、或20%与50%之间的静息NK细胞经转导。
[0750] 除非不与方面相容或已陈述于方面中,在用于以基因方式修饰及扩增淋巴细胞或用于进行本文的适应性细胞疗法的或类似疗法或本文提供的任何组合物的方法方面中的
任一者的说明性实施例中,该第二工程化信号传导多肽的表达由控制组件来调节。
[0751] 除非不与方面相容或已陈述于方面中,在包括经基因方式修饰的T细胞或NK细胞或复制缺陷型重组反转录病毒颗粒本文的方法、用途、制程产物或组合物中的任一者中,此经基因方式修饰的T细胞或NK细胞或复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可包括多核苷酸,其
包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元,其
中该一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽和/或包含T细胞淋巴增
生性组件的二多肽。在一些实施例中,CAR和/或淋巴增生性组件的表达受控制组件或针对
每一者的不同控制组件控制。在一些实施例中,CAR和/或淋巴增生性组件可表达于相同多
肽上,且在说明性实施例中,CAR和/或淋巴增生性组件表达为独立的多肽。在一些实施例
中,CAR为MRB CAR。在一些实施例中,嵌合淋巴增生性组件为组成性活性的,例如组成性活性嵌合细胞因子受体。在此实施例中,组成性活性嵌合细胞因子受体可受控制组件控制。
[0752] 除非与一个方面不相容或在一个方面中已陈述,否则在本文包括多核苷酸的方面中的任一者中,该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子
的一个或多个转录单元,其中该一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)的第一
多肽和/或包含T细胞淋巴增生性组件的第二多肽,该多核苷酸可进一步包含Kozak相关序
列、WPRE组件及多重终止序列(诸如双重终止密码子或三重终止密码子)中的一者或多者,
其中双重终止密码子或三重终止密码子中的一个或多个终止密码子限定自该一个或多个
转录单元中的至少一者中读取的终止。在某些实施例中,多核苷酸包含选自以下的Kozak类型序列:CCACCAT/UG(G)、CCGCCAT/UG(G)、GCCGCCGCCAT/UG(G),或GCCGCCACCAT/U(G)。在某些实施例中,相对于第一核酸序列的起始密码子的-3及+4核苷酸皆包含G。在可与包含
Kozak类型序列的前述实施例和/或包括三重终止密码子的以下实施例组合的另一实施例
中,多核苷酸包含WPRE组件。在一些实施例中,WPRE组件位于一个或多个转录单元的终止密码子的3’及多核苷酸的3’LTR的5’处。在可与前述实施例(亦即,其中多核苷酸包含Kozak类型序列的实施例和/或其中多核苷酸包含WPRE的实施例)中的任一者或两者组合的另一实
施例中,一个或多个转录单元经双重终止密码子或三重终止密码子中的一个或多个终止密
码子终止。
[0753] 除非与一个方面不相容或在一个方面中已陈述,否则在本文中提供的包括淋巴增生性组件的方法、用途及组合物中的任一者的说明性实施例中,该淋巴增生性组件可为嵌
合淋巴增生性组件。在本文中的包括嵌合淋巴增生性组件的实施例中的任一者中,该嵌合
淋巴增生性组件可为嵌合细胞因子受体。在本文中的包括嵌合淋巴增生性组件的实施例中
的任一者中,该嵌合淋巴增生性组件可为连接至IL-7受体α的IL-7,或不连接至IL-7受体α的IL-7。在一些实施例中,嵌合细胞因子受体包含连接至IL-7受体α的IL-7,或其保留促进T细胞和/或NK细胞的增生的能力的片段,且其中该嵌合细胞因子受体为组成性活性。在一些实施例中,嵌合细胞因子受体包含共价连接至能够结合IL-7的IL-7受体的功能性胞外片
段、IL-7受体跨膜域及IL-7受体信号传导域的IL-7。
[0754] 除非与一个方面不相容或在一个方面中已陈述,否则在本文中的包括嵌合淋巴增生性组件的方面或实施例中的任一者中,该嵌合淋巴增生性组件可不为嵌合细胞因子受
体。在本文中提供的包括淋巴增生性组件的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中,
嵌合淋巴增生性组件可为嵌合细胞因子受体。在本文中提供的包括嵌合细胞因子受体的方
法及组合物中的任一者的说明性实施例中,该嵌合细胞因子受体包含IL-7受体的胞内信号
传导域、IL-12受体的胞内信号传导域、IL-15/IL-2受体的胞内信号传导域(诸如IL-15/IL-
2β受体)、IL-21受体的胞内信号传导域、IL-23受体的胞内信号传导域、IL-27受体的胞内信号传导域、转化生长因子β(TGFβ)诱饵受体的胞内信号传导域或CD28。在一些实施例中,嵌合细胞因子受体包含与IL-7受体融合的IL-7。
[0755] 除非与一个方面不相容或在一个方面中已陈述,否则在本文中提供的包括淋巴增生性组件的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中,该淋巴增生性组件可包含T细胞
存活基元。T细胞存活基元可包含IL-7受体、IL-15受体或CD28的全部或功能性片段。在其他实施例中,淋巴增生性组件可包括细胞因子或细胞因子受体多肽,或其包含信号传导域的
片段。举例而言,淋巴增生性组件可包含白细胞介素多肽且该淋巴增生性组件可进一步包
含经由接头共价连接的其同源白细胞介素受体多肽的部分。通常,同源白细胞介素受体的
此部分包括能够结合白细胞介素细胞因子的胞外域及跨膜域的功能性部分。在一些实施例
中,胞内域为同源白细胞介素受体的胞内部分。在一些实施例中,胞内域为能够促进淋巴细胞增生且视情况在不存在将淋巴细胞暴露至外源性细胞因子且在不存在针对CAR的ASTR的
靶标的情况下在培养物中离体或活体外存活6天、7天、14天、21天或35天或更长的不同白细胞介素受体的胞内部分,这些外源性细胞因子为诸如IL-15、IL-7及在说明性实施例中IL-
2,该CAR在培养期间由淋巴细胞表达。
[0756] 除非与一个方面不相容或在一个方面中已陈述,否则在一些实施例中,淋巴增生性组件为经由接头共价连接至其全长同源白细胞介素受体多肽的白细胞介素多肽。替代
地,淋巴增生性组件可为IL-7受体的胞内信号传导域、IL-12受体的胞内信号传导域、IL-23受体的胞内信号传导域、IL-27受体的胞内信号传导域、IL-15受体的胞内信号传导域、IL-
21受体的胞内信号传导域,或转化生长因子β(TGFβ)诱饵受体的胞内信号传导域。
[0757] 除非与一个方面不相容或在一个方面中已陈述,否则在一些说明性实施例中,淋巴增生性组件为组成性活性。此外,淋巴增生性组件可包括突变IL-7受体或其片段,其可进一步包括组成性活性突变IL-7受体或其组成性活性片段。在一些实施例中,淋巴增生性组
件或嵌合细胞因子受体包含IL7 InsPPCL突变体。除非与一个方面不兼容或在一个方面中
已陈述,否则在包括淋巴增生性组件的方面中的任一者中,该淋巴增生性组件可为本文中
的淋巴增生性组件部分中列举的任一CLE。举例而言,在说明性实施例中,CLE包含来自特别称为尤其值得注意的基因基因和/或相对于本文中的实例的最优构建体(Top Constructs)
的域。
[0758] 在某些说明性实施例中,淋巴增生性组件包含细胞因子受体或包括活化Jak/STAT5路径的信号传导域的其片段。举例而言,此淋巴增生性组件可包括IL21R、IL27R、
IL31RA、LIFR及OSMR的胞内域。如实施例17及实施例18的实验及表7至表17中所显示,在候选嵌合多肽中发现包括这些基因的胞内域的嵌合淋巴增生性组件,这些候选嵌合多肽在不
存在诸如IL-2的外源性细胞因子的情况下培养的PBMC中诱导最高程度的增生。
[0759] 在一些实施例中,淋巴增生性组件可包含为白细胞介素或白细胞介素受体且为在实施例17及18(表7至17)中的库1A、1.1A、2B、2.1B、3A、3.1A、3B、3.1B、4B和/或4.1B中识别的最优构建体的部分的胞内域。在一些实施例中,淋巴增生性组件可包含为细胞因子受体
且为在实施例17及18(表7至17)中的库1A、1.1A、2B、2.1B、3A、3.1A、3B、3.1B、4B和/或4.1B中识别的最优构建体的部分的胞内域。在一些实施例中,淋巴增生性组件可包含包括至少
一个ITAM基元且为在实施例17及18(表7至17)中的库1A、1.1A、2B、2.1B、3A、3.1A、3B、3.1B、
4B和/或4.1B中识别的最优构建体的部分的胞内域。
[0760] 在说明性实施例中,淋巴增生性组件可包含来自IL7R、IL12RB1、IL15RA或IL27RA的胞内域,其存在于如实施例17及18(表19至23)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤
其值得注意的富集(亦即,引起最高程度的增生)的构建体中。
[0761] 在说明性实施例中,淋巴增生性组件可包含来自以下细胞因子受体的胞内域:CD27、CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCER1G、FCGR2A、FCGR2C、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR2、IL1R1、IL1RL1、IL2RA、IL2RG、IL3RA、IL5RA、IL6R、IL7R、IL9R、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17RB、IL18R1、IL18RAP、IL20RB、IL22RA1、IL27RA、IL31RA、LEPR、MPL、OSMR、PRLR、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF14或TNFRSF18,其存在于如实施例17及18(表19至23)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤其值得注意的富集
(亦即,引起最高程度的增生)的构建体中。
[0762] 在说明性实施例中,淋巴增生性组件可包含来自CD3D、CD3E、CD3G、CD79A、CD79B、FCER1G、FCGR2A或FCGR2C的胞内域,其包括至少一个ITAM基元且存在于如实施例17及18(表19至23)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤其值得注意的富集(亦即,引起最高程度
的增生)的构建体中。
[0763] 在一些实施例中,此段落中的淋巴增生性组件(其在实施例17及18中显示在具有仅单一胞内域的构建体中具有活性)可为具有两个或更多个胞内域,或在说明性实施例中
具有单一胞内域(亦即,该淋巴增生性组件不包含两个或更多个胞内域)的淋巴增生性组件
的胞内域。在说明性实施例中,淋巴增生性组件中的胞内域包含来自以下的域:CD40、
CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCGR2A、IFNAR2、IFNGR2、IL1R1、IL3RA、IL7R、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL13RA2、IL18RAP、IL31RA、MPL、MYD88、TNFRSF14或TNFRSF18,其存在于如在作为单一胞内信号传导域的实施例18(表22及23)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤其
值得注意的富集(亦即,引起最高程度的增生)的构建体中。在说明性实施例中,淋巴增生性组件中的胞内域包含来自IL7R或IL12RB1的域,其存在于如实施例18(表22及23)中详述的
在初始筛选及重复筛选中显示尤其值得注意的富集(亦即,引起最高程度的增生)的构建体
中。在一些实施例中,具有单一胞内域的淋巴增生性组件中的胞内域可为细胞因子受体。在说明性实施例中,具有单一胞内域的淋巴增生性组件中的细胞因子受体包含来自以下的
域:CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCGR2A、IFNAR2、IFNGR2、IL1R1、IL3RA、IL7R、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL13RA2、IL18RAP、IL31RA、MPL、TNFRSF14或TNFRSF18,其存在于如实施例
18(表22及23)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤其值得注意的富集(亦即,引起最
高程度的增生)的构建体中。在一些实施例中,淋巴增生性组件中的胞内域可包括至少一个ITAM基元。在说明性实施例中,包括至少一个ITAM基元的淋巴增生性组件中的胞内域包含
来自FCGR2A的域,其存在于如实施例18(表22)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤其
值得注意的富集(亦即,引起最高程度的增生)的构建体中。
[0764] 在说明性实施例中,淋巴增生性组件可包含来自CD27、CD28、OX40(也称为TNFRSF4)、GITR(也称为TNFRSF18)或HVEM(也称为TNFRSF14)的共刺激域,其存在于如实施
例17及18(表19至23)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤其值得注意的富集(亦即,
引起最高程度的增生)的构建体中。
[0765] 在一些实施例中,淋巴增生性组件可为以下构建体中的一者:M024-S190-S047、M025-S050-S197、M036-S170-S047、M012-S045-S048、M049-S194-S064、M025-S190-S050、M025-S190-S05、E013-T041-S186-S051、E013-T028-S186-S051、E014-T015-S186-S051、
E011-T016-S186-S050、E011-T073-S186-S050或E013-T011-S186-S211,其全部如实施例21(图35及36)中所示在转导之后刺激静息淋巴细胞的增生。在某些实施例中,淋巴增生性组
件包含来自CSF3R、IL3RA、ICOS、CRLF、CSF2RA、LIFR或CD40的胞外域;来自MyD88、CD40或MPL的第一胞内域,和/或来自CD27或MyD88的第二胞内域。
[0766] 在一些实施例中,淋巴增生性组件可为构建体E013-T041-S186-S051,其如实施例22(图38A及38B)中示出且分析在用显示UCHT1scFvFc-GPI的复制缺陷型重组反转录病毒颗
粒转导之后刺激静息淋巴细胞的增生。在其他实施例中,淋巴增生性组件为IL7-IL7RA-
IL2RB,如实施例22中所示出且分析。
[0767] 如实施例17中详述,对于库1A及1.1A,具有来自细胞因子受体CD27、IL1RL1、IL6R、IL31RA、TNFRSF4或TNFRSF18的域的构建体在库1A及1.1A(表19)中皆显示尤其值得注意的富集(亦即,引起最高程度的增生)。
[0768] 如实施例17中详述,对于库2B及2.1B,具有来自细胞因子受体CD40、FCER1G、FCGR2C、IFNGR2、GHR、IL10RB、IL11RA、IL13RA2、IL17RB、IL22RA1、TNFRSF14或TNFRSF9的域的构建体在库2B及2.1B(表20)中皆显示尤其值得注意的富集(亦即,引起最高程度的增
生)。
[0769] 如实施例18中详述,对于库3A及3.1A,具有来自细胞因子受体CD27、CD40、CSF2RA、FCGR2A、MPL、OSMR、TNFRSF4或TNFRSF18的域的构建体在库3A及3.1A(表21)中皆显示尤其值得注意的富集(亦即,引起最高程度的增生)。
[0770] 如实施例18中详述,对于库3B及3.1B,具有来自细胞因子受体CD27、CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCER1G、FCGR2A、FCGR2C、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR2、IL1RL1、IL2RG、IL3RA、IL5RA、IL6R、IL7R、IL9R、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL18RAP、IL20RB、IL27RA、IL31RA、LEPR、MPL、OSMR、PRLR、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF14或TNFRSF18的域的构建体在库3B及3.1B(表22)中皆显示尤其值得注意的富集(亦即,引起最高程度的增生)。
[0771] 如实施例18中详述,对于库4B及4.1B,具有来自细胞因子受体CD27、CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCGR2A、FCGR2C、IFNAR2、IFNGR2、IL1R1、IL2RA、IL3RA、IL2RG、IL6R、IL7R、IL10RB、IL11RA、IL31RA、IL13RA1、IL13RA2、IL18R1、MPL、OSMR、TNFRSF4、TNFRSF9或TNFRSF18的域的构建体在库4B及4.1B(表23)中皆显示尤其值得注意的富集(亦即,引起最高程度的增生)。
[0772] 除非与一个方面不相容或在一个方面中已陈述,否则在本文所公开的包括淋巴增生性组件的方面及实施例中的任一者中,诸如方法、用途、组合物及过程方面的产物,在说明性实施例中,经基因方式修饰的PBMC、淋巴细胞或经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞
能够促进淋巴细胞增生/扩增且视情况在不存在将这些细胞暴露至细胞因子(诸如IL-15、
IL-7及在说明性实施例中IL-2)及针对在培养期间由这些细胞表达的CAR的ASTR的靶目标
情况下在培养物中离体或活体外存活至少6天、7天、14天、21天或35天或更长。在本文中公开的包括CAR及淋巴增生性组件的实施例的任一者中,经基因方式修饰的T细胞和/或NK细
胞可能够植入小鼠体内而不暴露至由该CAR识别的靶标。
[0773] 除非与一个方面不相容或在一个方面中已陈述,否则在本文提供的包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中,这些复制缺陷型重
组反转录病毒颗粒可包含在其表面上的活化组件。在说明性实施例中,活化组件经由T细胞受体相关的复合物活化T细胞。在一些情况下,活化组件可仅活化T细胞。在其他情况下,活化组件需要经由TCR受体复合物的活化以进一步活化T细胞。因此,在一些实施例中,活化组件包含:
[0774] A.能够与CD3结合的膜结合多肽;和/或
[0775] B.能够与CD28结合的膜结合多肽。
[0776] 此外,能够与CD3结合的膜结合多肽为能够与融合至异源GPI锚定连接序列的CD3结合的多肽,且能够与CD28结合的膜结合多肽可为能够与融合至异源GPI锚定连接序列的
CD28结合的多肽。在一些实施例中,能够与CD28结合的膜结合多肽为CD80、CD86或能够诱导对Akt(诸如CD80的胞外域)的经CD28介导的活化的其功能性片段。
[0777] 除非与一个方面不相容或在一个方面中已陈述,否则在本文提供的为复制缺陷型重组反转录病毒颗粒或包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法及组合物中的任一者
的说明性实施例中,活化组件可为能够结合CD3的膜结合多肽,诸如抗CD3 scFv或抗CD3 
scFvFc。在本文提供的包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒及抗CD3的方法及组合物中的
任一者的说明性实施例,抗CD3可为与异源GPI锚定连接序列融合的抗CD3 scFvFc。在本文
提供的包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法及组合物中的任一者的说明性实施例
中,能够结合CD3的膜结合多肽可为与CD14 GPI锚定连接序列结合的抗CD3 scFv,且能够结合CD28的膜结合多肽可为与CD16B GPI锚定连接序列结合的CD80或其胞外域。在本文提供
的包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中,复
制缺陷型重组反转录病毒颗粒可在其表面上包含结合CD14 GPI锚定连接序列的抗CD3 
scFv,或结合CD16B GPI锚定连接序列的CD80或其胞外域,及IL-7的融合多肽或其活化片
段,及,及包含GPI锚定连接序列的DAF。在本文提供的包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中,IL-7或其活化片段,及DAF融合体、抗CD3 scFV及CD80及其胞外域各包含DAF信号序列。
[0778] 除非另外陈述,或在广泛方面中已陈述,否则在本文提供的包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中,这些复制缺陷型重组反转
录病毒颗粒可在其表面上包含膜结合细胞因子。膜结合细胞因子可为IL-7、IL-15或其活化片段。在其他实施例中,膜结合细胞因子为IL-7的的融合多肽或其活化片段及DAF。举例而言,融合多肽可包含DAF信号序列(SEQ ID NO:286的核苷酸1至34),无其信号序列(SEQ ID NO:286的核苷酸35至186)的IL-7及包括其GPI锚定连接序列(SEQ ID NO:286的核苷酸187
至532)的DAF片段。
[0779] 除非与一个方面不相容或在一个方面中已陈述,否则在本文提供的方法及组合物方面中的任一者的说明性实施例中,假型组件可包含一种或多种异源包膜蛋白质。在其他
实例中,假型组件可包括由T细胞识别的一种或多种病毒多肽。一个或多个假型组件可包含麻疹病毒F多肽、麻疹病毒H多肽和/或其片段。该一个或多个假型组件可为麻疹病毒F多肽
和/或麻疹病毒H多肽的细胞质域缺失变体。
[0780] 除非与一个方面不相容或在一个方面中已陈述,否则在本文提供的包括控制组件的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中,该控制组件为可调节淋巴增生性组件的控
制组件,其中淋巴增生性组件在促进T细胞和/或NK细胞的增生中在不存在化合物的情况下
无活性或具有较低活性,且其中该化合物为结合淋巴增生性组件且诱导淋巴增生性组件的
活性的分子伴侣。
[0781] 除非与一个方面不相容或在一个方面中已陈述,否则在本文提供的包括控制组件的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中,控制组件可为包含核糖开关的多核苷酸。
核糖开关可能够结合核苷类似物且结合控制组件的化合物为核苷类似物。核苷类似物可为
抗病毒剂。抗病毒剂可为阿昔洛韦或喷昔洛韦。
[0782] 除非与一个方面不相容或在一个方面中已陈述,否则在本文提供的包括工程化信号传导多肽(其包括ASTR)的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中,这些工程化信号
重叠多肽中的一者或两者的ASTR可结合肿瘤相关的抗原。在一些说明性实施例中,第二工
程化多肽的抗原特异性靶向区为微环境受限的抗原特异性靶向区。
[0783] 除非与一个方面不相容或在一个方面中已陈述,否则在本文提供的包括一个或多个复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中,若在最
广泛方面中未明确地叙述,则复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可编码经生物验证的单克隆
抗体的识别域。在一些实施例中,识别域在与嵌合抗原受体相同的转录物上表达,且其中通过核糖体跳跃和/或裂解信号将识别域与嵌合抗原受体分离。核糖体跳跃和/或裂解信号可
为2A-1。识别域可包括由识别EGFR的抗体识别的多肽或其抗原决定基。识别域可为由EGFR
抗体识别且在经转导的T细胞和/或NK细胞的表面上表达为本文提供的另一控制机制的
EGFR突变体。在相关实施例中,识别域可包括由识别EGFR的抗体识别的多肽或其抗原决定
基。
[0784] 除非与方面、方法、用途、过程产物中的任一者不相容或在一个方面中已陈述,否则该方法可进一步包括自个体收集血液。该方法可进一步包括在离体接触个体的静息T细胞和/或静息NK细胞之后,将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞再引入该个体。在某些实施例中,接触的静息T细胞和/或静息NK细胞来自个体的血液,且其中经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞的扩增在个体体内发生。在某些实施例中,在收集血液与再引入经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞之间的步骤在不超过24小时、18小时、12小时、8小时、6小时或4小时内进行。其他时间提供于本文中。在某些实施例中,个体在进行接触的7天内、在接触期间,和/或在将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞再引入至个体后的7天内并不暴露于淋
巴消耗剂。[684]在一个方面中,本文提供一种转导和/或以基因方式修饰个体的淋巴细胞
(例如,T细胞和/或NK细胞),在说明性实施例中静息淋巴细胞(静息T细胞和/或NK细胞)的
方法,该方法包含使个体的静息T细胞和/或静息NK细胞离体与复制缺陷型重组反转录病毒
颗粒接触,其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上的假型组件及在其表面上
的能够结合静息T细胞和/或静息NK细胞且有助于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒与其融
合的膜结合抗CD3 scFvFc抗体,其中该接触有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转
导静息T细胞和/或NK细胞,由此产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞。
[0785] 在一个方面中,本文提供一种转导和/或以基因方式修饰来自分离血液的静息T细胞和/或静息NK细胞的方法,该方法包含:自个体收集血液;分离包含静息T细胞和/或静息NK细胞的周边血单核细胞(PBMC);以及使个体的静息T细胞和/或静息NK细胞离体与复制缺
陷型重组反转录病毒颗粒接触有效时间,其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表
面上的假型组件及在其表面上的膜结合抗CD3scFvFc抗体,从而产生经基因方式修饰的T细
胞和/或NK细胞,由此转导静息T细胞和/或NK细胞。
[0786] 在本文中的转导和/或以基因方式修饰包括膜结合抗CD3 scFvFc抗体的T淋巴细胞(例如,T细胞和/或NK细胞)的方面中,假型组件在某些实施例中为疱疹性口腔病毒包膜
蛋白质(VSV-G)。在一些实施例中,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒进一步包含能够与CD28结合的膜结合多肽,其可包括例如CD80、CD86的胞外域,或其保留与CD28结合的能力的功能性片段。在一些实施例中,抗CD3 scFvFc抗体与异源性GPI锚定连接序列融合。在一些实施例中,抗CD3 scFvFc抗体不由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码。
[0787] 在本文中的转导和/或以基因方式修饰包括膜结合抗CD3 scFvFc抗体的T淋巴细胞(例如,T细胞和/或NK细胞)的方面中,重组反转录病毒颗粒可进一步包括多核苷酸,该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录
单元,其中该一个或多个转录单元编码嵌合抗原受体。在一些实施例中,能够与CD3结合的膜结合多肽不由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码。在一些实施例中,抗
CD3 scFvFc抗体不由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码。
[0788] 在另一方面中,本文提供一种转导和/或以基因方式修饰个体的静息淋巴细胞的方法,该方法包含使个体的静息T细胞和/或静息NK细胞离体与复制缺陷型重组反转录病毒
颗粒接触,其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上的假型组件及在其表面上
的能够与CD3结合的膜结合多肽,而非在其表面上的能够与CD28结合且活化CD28的膜结合
多肽,其中该接触有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细
胞,由此产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞。
[0789] 在另一方面中,本文提供一种转导和/或以基因方式修饰来自分离血液的静息T细胞和/或静息NK细胞的方法,该方法包含:自个体收集血液;分离包含静息T细胞和/或静息NK细胞的周边血单核细胞(PBMC);以及使个体的静息T细胞和/或静息NK细胞离体与复制缺
陷型重组反转录病毒颗粒接触有效时间,其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表
面上的假型组件及在其表面上的能够与CD3结合的膜结合多肽,而非在其表面上的能够与
CD28结合且活化CD28的膜结合多肽,由此产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞,由此
转导静息T细胞和/或NK细胞。
[0790] 在本文中的转导和/或以基因方式修饰静息T淋巴细胞的方面中,该静息T淋巴细胞包括在其表面上的假型组件及在其表面上的能够与CD3结合的膜结合多肽,而非在其表
面上的能够与CD28结合且活化CD28的膜结合多肽,假型组件可为例如疱疹性口腔病毒包膜
蛋白质(VSV-G)。在说明性实施例中,能够与CD3结合的膜结合多肽为抗CD3 scFvFc抗体,其在一些实施例中与异源性GPI锚定连接序列融合。在此方面的一些实施例中,接触进行至少
2小时、或2小时与24小时之间,或2小时与6小时之间。在一些实施例中,可检测标记由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的基因组编码,且在转导之后在T细胞和/或NK细胞中检测到。
在一些实施例中,能够与CD3结合的膜结合多肽不由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的
多核苷酸编码。在一些实施例中,可检测标记由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的基因组
编码,且在转导之后在T细胞和/或NK细胞中检测到。
[0791] 在另一方面中,本文提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其包含:一个或多个假型组件;多核苷酸,其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元,其中该一个或多个转录单元编码嵌合抗原受体;及在其表面上的
假型组件以及在其表面上的活化组件,其中该活化组件能够与T细胞和/或NK细胞结合且不
由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码,且其中该活化组件为抗CD3 scFvFc
抗体。
[0792] 在另一方面中,本文提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其包含:一个或多个假型组件,其能够与T细胞和/或NK细胞结合且有助于与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒至其上的膜融合;
[0793] 多核苷酸,其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元,其中该一个或多个转录单元编码嵌合抗原受体;及在其表面上的假型
组件以及在其表面上的活化组件,其中该活化组件能够与T细胞和/或NK细胞结合且不由复
制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码,且其中该活化组件为能够在其表面上与
CD3结合的膜结合多肽,但不为能够在其表面上与CD28结合且活化CD28的膜结合多肽。
[0794] 在本文中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的一些实施例中,该重组反转录病毒颗粒进一步包含多核苷酸,该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具
有活性的启动子的一个或多个转录单元,其中该一个或多个转录单元编码嵌合抗原受体。
在这些方面中的一些实施例中,能够与CD3结合的膜结合多肽不由复制缺陷型重组反转录
病毒颗粒中的多核苷酸编码。在这些方面中的一些实施例中,抗CD3 scFvFc抗体不由复制
缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码。
[0795] 在本文中的方面及实施例中的任一者中,诸如包括多肽或编码其的核酸的那些包括例如存在于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上的活化组件,该活化组件可进一步
包括例如具有能够与CD28或在说明性实施例中与CD3结合的多肽的融合多肽、可在不存在
二聚剂的情况下有活性的二聚基元。在一些实施例中,活化组件可为抗CD3单链抗体且二聚基元可选自由以下组成的群:CD69、CD71、CD72、CD96、Cd105、Cd161、Cd162、Cd249、CD271及Cd324,以及其保留二聚能力的突变体和/或活性片段。
[0796] 在本文中的方面及实施例中的任一者中,诸如包括多肽或编码其的核酸的那些包括例如存在于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上的活化组件,该活化组件可进一步
包括例如具有能够与CD28或在说明性实施例中与CD3结合的多肽的融合多肽、可在不存在
二聚剂的情况下有活性的二聚基元。在一些实施例中,活化组件可为抗CD3单链抗体且二聚基元可选自由以下组成的群:FKBP及雷帕霉素或其类似物、GyrB及香豆霉素或其类似物、
DHFR及甲胺蝶呤或其类似物,或DmrB及AP20187或其类似物,以及保留二聚能力的所述二聚蛋白质的突变体和/或活性片段。
[0797] 在本文中的方面及实施例中的任一者中,诸如包括多肽或编码其的核酸的那些包括例如存在于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上的活化组件,该活化组件可进一步
包括抗CD3-scFvFc-GPI部分(UCHT1)及视情况的VSV-G。
[0798] 在以上方面的一个实施例中,该多核苷酸进一步包含Kozak类型序列、WPRE组件及双重终止密码子或三重终止密码子中的一者或多者,其中双重终止密码子或三重终止密码
子中的一个或多个终止密码子限定自一个或多个转录单元中的至少一者中读取的终止。在
某些实施例中,多核苷酸包含选自以下的Kozak类型序列:CCACCAT/UG(G)、CCGCCAT/UG(G)、GCCGCCGCCAT/UG(G),或GCCGCCACCAT/U(G)。在某些实施例中,相对于第一核酸序列的起始密码子的-3及+4核苷酸皆包含G。在可与包含Kozak类型序列的前述实施例和/或包括三重
终止密码子的以下实施例组合的另一实施例中,多核苷酸包含WPRE组件。在一些实施例中,WPRE组件位于一个或多个转录单元的终止密码子的3’及多核苷酸的3’LTR的5’处。在可与前述实施例(亦即,多核苷酸包含Kozak类型序列的实施例和/或其中多核苷酸包含WPRE的
实施例)中的任一者或两者组合的另一实施例中,一个或多个转录单元经双重终止密码子
或三重终止密码子中的一个或多个终止密码子终止。
[0799] 在本文提供的包括ASTR的方面中的任一者的一些实施例中,ASTR可为抗tag ASTR。此方法可进一步包括例如与靶分子(诸如靶细胞上的靶蛋白)结合的经tag结合的抗
体。
[0800] 在本文提供的包括B细胞、T细胞或NK细胞的实施例及方面中的任一者中,细胞可为同种异体细胞,或其可不为同种异体细胞。
[0801] 在本文所公开的方面及实施例中的任一者中,将DNA转导成PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞及视情况将DNA并入宿主细胞基因组中可使用不利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法来进行。举例而言,可利用其他病毒载体,诸如来源于腺病毒、腺病毒相关病毒或1型单纯疱疹病毒的那些,作为非限制实施例。在其他实施例中,这些方面及实施例可包括用非病毒载体转染和/或转导靶细胞。在本文所公开的利用非病毒载体转染靶细胞的这
些实施例中的任一者中,可使用包括以下的方法将包括裸DNA的非病毒载体引入至靶细胞
(诸如PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞)中:电穿孔、核转染、脂质体制剂、脂质、树枝状聚合物、诸如聚(乙烯亚胺)(PEI)和聚(l-离氨酸)(PLL)的阳离子聚合物、纳米颗粒、细胞穿透
肽、显微注射和/或非整合慢病毒载体。在本文提供的方法及组合物的一些实施例中,可使用基于转座子的载体系统通过共转染、共核转染或共电穿孔靶DNA将DNA整合至基因组中,
该靶DNA作为在感兴趣基因及转座酶载体系统的5’及3’末端含有转座子ITR片段的质粒。这些方法中使用的转座酶或其他酶(例如CRISPR或TALEN)可与靶质粒共转染为DNA、mRNA或蛋
白质。
[0802] 在另一方面中,本文一种提供复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,每一者包含:
[0803] A.在其表面上的假型组件,该假型组件能够与T细胞和/或NK细胞结合且有助于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒与其的膜融合的,其中该假型组件包含麻疹病毒F多肽和/或
麻疹病毒H多肽的细胞质域缺失变体;
[0804] B.多核苷酸,其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元,其中该一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(其包含抗原特
异性靶向区、跨膜域及胞内活化域)的第一工程化信号传导多肽及包含组成性活性IL-7受
体突变体的第二工程化信号传导多肽;其中IL-7受体突变体的表达由结合核苷类似抗病毒
药物的核糖开关调节;及
[0805] C.能够与CD3结合的多肽及能够与CD28结合的多肽,其中这些多肽在复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上表达;能够与T细胞和/或NK细胞结合;且不由复制缺陷型重
组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码。在此方面的说明性实施例中,核苷类似抗病毒药物
与核糖开关的结合增加IL-7受体突变体的表达。
[0806] 在一个方面中,本文提供一种以基因方式修饰且扩增个体的淋巴细胞的方法,该方法包含:
[0807] A.使个体的静息T细胞和/或NK细胞离体在不需要进行预先离体刺激的情况下与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触,该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包括:
[0808] i.在其表面上的假型组件,该假型组件能够与T细胞和/或NK细胞结合且有助于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒与其的膜融合;及
[0809] ii.多核苷酸,其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元,其中该一个或多个转录单元编码由控制组件调节的第一工程化信
号传导多肽,其中该第一工程化信号传导多肽包含至少一个淋巴增生性组件,
[0810] 其中该接触有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞中的至少一些,由此产生能经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞;
[0811] B.将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞引入至个体中;及
[0812] C.使经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞活体内暴露于结合控制组件的化合物,以影响第一工程化信号传导多肽的表达且活体内促进和/或强化淋巴细胞的扩增、移植和/
或持久性,由此以基因方式修饰及扩增个体的淋巴细胞。在说明性实施例中,在无需活体外刺激的情况下进行转导。
[0813] 在以上方面及用于以基因方式修饰及扩增淋巴细胞或用于进行本文的细胞治疗的方法方面中的任一者中,若在最广泛的方面中未叙述,则在某些实施例中,多核苷酸进一步包含编码包含第一嵌合抗原受体的第二工程化信号传导多肽的转录单元,该第一嵌合抗
原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。
[0814] 在另一方面中,本文提供用于对个体进行过继性细胞疗法的方法,该方法包含:
[0815] A.自个体收集血液;
[0816] B.使来自个体的血液的静息T细胞和/或NK细胞离体与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触,其中该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含
[0817] i.在其表面上的假型组件,该假型组件能够与T细胞和/或NK细胞结合且有助于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒至其上的膜融合;及
[0818] ii.多核苷酸,其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元,其中该一个或多个转录单元编码包含至少一个淋巴增生性组件
(其表达由控制组件调节)的第一工程化信号传导多肽,及包含包含抗原特异性靶向区
(ASTR)、跨膜域及胞内活化域的嵌合抗原受体的第二工程化信号传导多肽,
[0819] 其中该接触产生变为经基因方式修饰的静息T细胞和/或NK细胞中的至少一些;及
[0820] C.将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞再引入至个体中,其中经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞的扩增、移植和/或持久性出现于个体体内,且其中在收集血液与再引入经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞之间的方法在不超过24小时内进行,从而对个体进
行过继性细胞疗法。
[0821] 本文的另一方面提供用于对个体进行过继性细胞疗法的方法,该方法包含:
[0822] A.自个体收集血液;
[0823] B.分离包含静息T细胞和/或静息NK细胞的周边血单核细胞(PBMC);
[0824] C.使个体的静息T细胞和/或静息NK细胞离体与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触,其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上的能够结合静息T细胞和/或NK
细胞且有助于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒至其上的膜融合的假型组件,其中该接触有
助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞,从而产生经基因方
式修饰的T细胞和/或NK细胞;及
[0825] D.在自个体收集血液的24小时内,将经基因方式修饰的细胞再引入至个体中,从而在个体中进行过继性细胞疗法。
[0826] 在用于以基因方式修饰且扩增淋巴细胞或用于进行本文的过继性细胞疗法或类似方法的方法方面中的任一者的说明性实施例中,若在最广泛方面中未明确地叙述,则该
方法可进一步包含将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞在体内暴露于结合控制组件的
化合物,以影响第一工程化信号传导多肽及视情况存在的第二工程化信号传导多肽的表
达,且促进体内淋巴细胞的扩增、移植和/或持久性。
[0827] 在用于以基因方式修饰且扩增淋巴细胞或用于进行本文的过继性细胞疗法或类似方法的方法方面中的任一者的说明性实施例中,若在最广泛方面中未明确地叙述,则经
基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞在经引入或再引入至个体之前离体经历8次、7次、6次、5次、4次、3次或更少的细胞分裂。
[0828] 在用于以基因方式修饰且扩增淋巴细胞或用于进行本文的过继性细胞疗法或类似方法的方法方面中的任一者的说明性实施例中,若在最广泛方面中未明确地叙述,则经
基因发生修饰的T细胞和/或NK细胞在体内的扩增、移植和/或持久性取决于结合控制组件
的化合物的存在或不存在,且在说明性实施例中取决于结合控制组件的化合物的存在。
[0829] 在用于以基因方式修饰且扩增淋巴细胞或用于进行本文的过继性细胞疗法或类似方法的方法方面中的任一者的说明性实施例中,若在最广泛方面中未明确地叙述,则个
体在进行接触的7天、14天或21天内或在接触期间,和/或在将经修饰的T细胞和/或NK细胞
引入至个体中之后7天、14天或21天内未暴露于淋巴消耗剂。在其他实施例中,个体在接触期间未暴露于淋巴消耗剂。
[0830] 在用于以基因方式修饰且扩增淋巴细胞或用于进行本文的过继性细胞疗法或类似方法的方法方面中的任一者的说明性实施例中,若在最广泛方面中未明确地叙述,则静
息T细胞和/或静息NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触15分钟与12小时之间。
[0831] 在用于以基因方式修饰及扩增淋巴细胞或用于进行本文的过继性细胞疗法或类似方法的方法方面中的任一者的说明性实施例中,若在最广泛方面中未明确地叙述,则该
方法进一步包括在接触之后自T细胞和/或NK细胞分离复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的
步骤。在包括引入或再引入的方法中,分离是在引入之前进行。在用于以基因方式修饰且扩增淋巴细胞或用于进行本文的过继性细胞疗法或类似方法的方法方面中的任一者的说明
性实施例中,若在最广泛方面中未明确地叙述,则该暴露步骤包括在接触之前或期间,和/或在已将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞引入至个体中之后向个体施用一定剂量的
化合物。
[0832] 在用于以基因方式修饰且扩增淋巴细胞或用于进行本文的过继性细胞疗法或类似方法的方法方面中的任一者的说明性实施例中,若在最广泛方面中未明确地叙述,则该
方法包含在使T细胞和/或NK细胞离体与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之前自个体
收集包含T细胞和/或NK细胞的血液,且其中该引入为再引入。举例而言,自个体抽取20ml与
250ml之间的血液。
[0833] 在用于以基因方式修饰且扩增淋巴细胞或用于进行本文的过继性细胞疗法或类似方法的方法方面中的任一者的说明性实施例中,若在最广泛方面中未明确地叙述,则在
自个体收集血液的时间与将经修饰的T细胞和/或NK细胞再引入至个体中的时间之间不超
过8小时、12小时、24小时或48小时。
[0834] 在用于以基因方式修饰且扩增淋巴细胞或用于进行本文的过继性细胞疗法或类似方法的方法方面中的任一者的说明性实施例中,若在最广泛方面中未明确地叙述,则在
自个体收集血液的时间与将经修饰的T细胞和/或NK细胞再引入至个体中的时间之间的范
围为在低值端点为4小时或8小时与高值端点为12小时、24小时、36小时或48小时之间。
[0835] 在本文提供的包括向个体(尤其在个体患有或疑似患有癌症时)施用经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞的方面及实施例中,方法可进一步包括向个体递送有效量的免疫
检查点抑制剂。
[0836] 在用于以基因方式修饰且扩增淋巴细胞或用于进行本文的过继性细胞疗法或类似方法的方法方面中的任一者的说明性实施例中,若在最广泛方面中未明确地叙述,则在
收集血液之后且在再引入血液之前的所有步骤都在一个封闭的系统中进行,在该系统中一
人在整个处理过程中监控该封闭系统。在另一实施例中,在收集血液之后及在再引入血液
之前,在与个体保持在同一房间中的封闭系统中进行。
[0837] 在本文中提供的包括一个或多个转录单元或一个或多个工程化信号传导多肽的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中,若在最广泛方面中未明确地叙述,则这些转
录单元中的一者或这些工程化信号传导多肽中的一者可编码或包含或进一步包含抗原特
异性靶向区(ASTR)及将该ASTR连接至淋巴增生性组件的跨膜域。此工程化信号传导多肽的
ASTR能够与第一肿瘤抗原结合,且在存在时,第二工程化信号传导多肽的ASTR能够与第二
肿瘤抗原结合。在说明性实施例中,第一工程化信号传导多肽和/或第二工程化信号传导多肽进一步包含共刺激域。此外,第一工程化信号传导多肽和/或第二工程化信号传导多肽进一步包含柄。此外,第一工程化信号传导多肽进一步包含胞内活化域。第一工程化信号传导多肽和/或第二工程化信号传导多肽上的胞内活化域可来源于CD3ζ。在本文中提供的包括
淋巴增生性组件的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中,该淋巴增生性组件可包含
MPL或可为MPL或其变体和/或片段,包括包括MPL的胞内域的至少75%、80%、85%、90%、
95%、96%、97%、98%、99%或100%,具有或不具有MPL的跨膜域和/或胞外域;和/或与MPL的胞内域具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性,具有或不具有MPL的跨膜域和/或胞外域的变体和/或片段,其中该变体和/或片段保留
促进PBMC(在一些实施例中T细胞)的细胞增生的能力。
[0838] 在本文中提供的包括淋巴增生性组件的方法或组合物的任一者中,该淋巴增生性组件可包括刺激STAT5路径或抑制SOCS路径的抑制性RNA分子,诸如miRNA或shRNA。举例而
言,抑制性RNA分子可结合编码选自由以下组成的群的蛋白质的核酸:ABCG1、SOCS、TGFbR2、SMAD2、cCBL及PD1。在本文提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒或转导细胞中的任一者
或包括其的方法的说明性实施例中,此类复制缺陷型重组反转录病毒颗粒或转导细胞可编
码两种或更多种抑制性RNA分子,诸如内含子中的miRNA或shRNA,在一些实施例中为1种、2种、3种或4种抑制性RNA分子,其结合编码以下目标内源性T细胞表达的基因中的一者或多
者的核酸:PD-1、CTLA4、TCRα、TCRβ、CD3ζ、SOCS、SMAD2、miR-155、IFNγ、cCBL、TRAIL2、PP2A或ABCG1。举例而言,在一个实施例中,靶向以下中的任一者的miRNA的组合可包括在复制缺陷型重组反转录病毒颗粒或转导细胞的基因组中:TCRα、CD3ζ、IFNγ,及PD-1;且在另一实施例中为SOCS 1、IFNγ、TCRα及CD3ζ。
[0839] 在本文提供的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒、哺乳动物细胞和/或包装细胞可包含Vpu多肽。Vpu多肽可为例如融合多肽,且在一些实例中,尤其在包装细胞中,为膜结合Vpu多肽。在本文提供的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒、哺乳动物细胞和/或包装细胞可包含Vpu多肽及Vpx多肽两者。
[0840] 在本文提供的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒、哺乳动物细胞和/或包装细胞可包含Vpx多肽。Vpx多肽可为例如融合多肽,且在一些实例中,尤其在包装细胞中,为膜结合Vpx多肽。
[0841] 在本文所提供的方法或组合物中的任一者中,一个或多个假型组件可包括疱疹性口腔病毒包膜蛋白质(VSV-G)、猫类内源性病毒(RD114)包膜蛋白、致癌反转录病毒双嗜性
包膜蛋白或致癌反转录病毒亲嗜性包膜蛋白或其功能性片段。
[0842] 在一个方面中,本文提供经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞,其中该T细胞和/或NK细胞已经基因方式修饰以表达包含淋巴增生性组件的第一工程化信号传导多肽及包
含CAR的第二工程化信号传导多肽,该CAR包括抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活
化域。
[0843] 在另一方面中,本文提供经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞,其包含:在该T细胞或NK细胞的表面上的假型组件及在该T细胞或NK细胞的表面上的活化组件,其中该T细胞
或NK细胞已经基因方式修饰以表达包含淋巴增生性组件的第一工程化信号传导多肽及包
含嵌合抗原受体的第二工程化信号传导多肽,该嵌合抗原受体包括抗原特异性靶向区
(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。
[0844] 在另一方面中,本文提供经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞,其包含:
[0845] A.第一工程化信号传导多肽,其包含至少一个淋巴增生性组件;及
[0846] B.第二工程化信号传导多肽,其包含嵌合抗原受体,该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。
[0847] 在一些实施例中,经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞能够在不存在IL-2的情况下离体存活于培养物中。在一些实施例中,经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞包含嵌合
细胞因子受体。在一些实施例中,经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞不包含嵌合细胞因
子受体。
[0848] 在本文提供的包括哺乳动物包装细胞的方法(包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包装系统方面,或用于制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法)中的任一者中,例
如,可包装RNA基因组由可操作地连接至启动子的多核苷酸编码,其中该启动子具有组成性活性或可由第一反式激活因子或第二反式激活因子诱导。可包装RNA基因组可由可操作地
连接至启动子的多核苷酸编码,其中该启动子可由第二反式激活因子诱导。本文中用于驱
动第一和/或第二工程化信号传导多肽的表达的启动子通常在靶细胞(例如淋巴细胞、PBL、T细胞和/或NK细胞)中具有活性,但在说明性实施例中,在包装细胞系中不具有活性。第二反式激活因子可调节能够结合并活化靶细胞的活化组件的表达。在本文提供的包括哺乳动
物包装细胞的方法(包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包装系统方面,或用于制备复制
缺陷型重组反转录病毒颗粒(例如,一些实施例中的可包装RNA基因组)的方法)中的任一者
中,可包装RNA基因组的表达可由第二反式激活因子调节。
[0849] 此外,可包装RNA基因组自5’至3’包含:
[0850] 1.)5’长末端重复或其活化片段;
[0851] 2.)核酸序列,其编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件;
[0852] 3.)编码第一靶标多肽的核酸序列和/或编码一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子的核酸序列;
[0853] 4.)在靶细胞中具有活性的启动子;及
[0854] 5.)3’长末端重复或其活化片段。
[0855] 在一些实施例中,编码第一靶标多肽的核酸序列与编码用于包装及组装的反转录病毒组分的RNA及5’LTR呈相反定向。
[0856] 在本文提供的包括哺乳动物包装细胞的方法(包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包装系统方面,或用于制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法)中的任一者中,例如第一靶标多肽包含第一工程信号传导多肽且其中该第一工程化信号传导多肽包含至少一
个淋巴增生性组件。可包装RNA基因组可进一步包含编码第二靶标多肽的核酸序列。第二靶标多肽可包含包括嵌合抗原受体的第二工程化信号传导多肽,该嵌合抗原受体包含:
[0857] 1.)第一抗原特异性靶向区;
[0858] 2.)第一跨膜域;及
[0859] 3.)第一胞内活化域。
[0860] 在本文提供的包括哺乳动物包装细胞的方法(包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包装系统方面,或用于制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(例如哺乳动物细胞)的方
法)中的任一者中,例如包装细胞可包括例如在第二转录单元或视情况存在的第三转录单
元上或在可操作地连接至第一可诱导启动子的其他转录单元上编码Vpu多肽的核酸序列。
在本文提供的包括哺乳动物包装细胞的方法(包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包装系
统方面,或用于制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(例如哺乳动物细胞)的方法)中的任
一者中,例如,包装细胞可包括例如在第二转录单元或视情况存在的第三转录单元上或在
可操作地连接至第一可诱导启动子的其他转录单元上编码Vpx多肽及Vpu多肽两者的核酸
序列。可为包装细胞的哺乳动物细胞可为293细胞。
[0861] 在本文提供的包括哺乳动物包装细胞的方法(包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包装系统方面,或用于制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(例如哺乳动物细胞)的方
法)中的任一者中,例如包装细胞可包括例如在第二转录单元或视情况存在的第三转录单
元上或在可操作地连接至第一可诱导启动子的其他转录单元上编码Vpx的核酸序列。可为
包装细胞的哺乳动物细胞可为293细胞。
[0862] 在本文提供的包括哺乳动物包装细胞的方法(包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包装系统方面,或用于制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法)中的任一者中,第一配位体可为雷帕霉素,且第二配位体可为四环素或阿霉素,或第一配体可为四环素或阿霉
素且第二配体可为雷帕霉素。
[0863] 在一些方面中,本文提供已通过本文提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的任一者转导的细胞。该细胞可为例如淋巴细胞,诸如T细胞或NK细胞。在说明性实施例中,该细胞为人类细胞。
[0864] 在一个方面中,本文提供用于扩增个体中经修饰的T细胞和/或NK细胞的方法,该方法包含:
[0865] A.使自该个体获得的经分离静息T细胞和/或静息NK细胞与本文所公开的实施例中的任一者的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触;
[0866] B.将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞引入至个体中;及
[0867] C.向该个体提供有效量的阿昔洛韦、阿昔洛韦前药、喷昔洛韦或喷昔洛韦前药,其中该经修饰的T细胞和/或NK细胞在施用阿昔洛韦、阿昔洛韦前药、喷昔洛韦或喷昔洛韦前药后在该个体中增生,从而扩增个体中的经修饰的T细胞和/或NK细胞。
[0868] 在另一方面中,本文提供用于停止个体中经修饰的T细胞和/或NK细胞的扩增、移植和/或持久性的方法,该方法包含:
[0869] A.使自该个体获得的经分离静息T细胞和/或NK细胞与本文所公开的实施例中的任一者的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触;
[0870] B.将经修饰的T细胞和/或NK细胞引入至个体中;
[0871] C.向该个体施用有效量的阿昔洛韦、阿昔洛韦前药、喷昔洛韦或喷昔洛韦前药以扩增个体中经修饰的T细胞和/或NK细胞,其中该经修饰的T细胞和/或NK细胞在施用阿昔洛
韦、阿昔洛韦前药、喷昔洛韦、喷昔洛韦前药后在该个体中增生,从而扩增个体中的经修饰PBL;及
[0872] D.停止施用阿昔洛韦、阿昔洛韦前药、喷昔洛韦或喷昔洛韦前药,其中该经修饰的T细胞和/或NK细胞在停止施用阿昔洛韦、阿昔洛韦前药、喷昔洛韦或喷昔洛韦前药后在该个体中停止增生,从而控制个体中的经修饰的T细胞和/或NK细胞的扩增、移植和/或持久
性。
[0873] 在另一方面中,本文中提供一种治疗个体中的癌症的方法,该方法包含:
[0874] A.使自该个体获得的经分离静息T细胞和/或NK细胞与根据本文所公开的实施例中的任一者的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触;
[0875] B.将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞引入至个体中;及
[0876] C.向该个体施用有效量的阿昔洛韦、阿昔洛韦前药、喷昔洛韦或喷昔洛韦前药以扩增个体中的经修饰T细胞和/或NK细胞,其中该经修饰T细胞和/或NK细胞在施用阿昔洛
韦、阿昔洛韦前药、喷昔洛韦、喷昔洛韦前药后在该个体中增生,且其中该经修饰T细胞和/或NK细胞中的嵌合抗原受体结合个体中的癌细胞,从而治疗个体中的癌症。
[0877] 在另一方面中,本文中提供一种经转导T细胞和/或NK细胞,其包含重组多核苷酸,该重组多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元,其中该一个或多个转录单元编码由控制组件调节的第一工程化信号传导多
肽,其中该第一工程化信号传导多肽包含组成性活性IL-7受体突变体,且其中该控制组件
能够活体内与化合物结合,和/或经设计和/或经配置与化合物结合。
[0878] 在另一方面中,本文中提供一种反转录病毒包装系统,其包含:
[0879] 哺乳动物细胞,其包含:
[0880] A.第一反式激活因子,其由组成性启动子表达且能够结合第一配位体及第一可诱导启动子以供在第一配位体的存在对比缺失下影响可操作地连接至其的核酸序列的表达;
[0881] B.第二反式激活因子,其能够结合第二配位体及第二可诱导启动子,且在第二配位体的存在对比缺失下影响可操作地连接至其的核酸序列的表达;及
[0882] C.针对反转录病毒颗粒的可包装RNA基因组,
[0883] 其中该第一反式激活因子调节该第二反式激活因子及反转录病毒REV蛋白质的表达,其中该第二反式激活因子调节gag多肽、pol多肽及能够与靶细胞结合且有助于与其膜
融合的一个或多个假型组件的表达,且其中反转录病毒蛋白质衍生自反转录病毒。此方面
的实施例可包括针对其他方面中的所述实施例在本文中提供的实施例中的任一者。
[0884] 在另一方面中,本文提供一种用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法,其包含:
[0885] A.培养包装细胞的群体以积聚第一反式激活因子,其中包装细胞包含由第一组成性启动子表达的第一反式激活因子,其中第一反式激活因子能够结合第一配位体及第一可
诱导启动子以供在第一配位体的存在下对比于缺失下影响可操作地连接至其的核酸序列
的表达,且其中由第一反式激活因子调节第二反式激活因子及反转录病毒REV蛋白质的表
达;
[0886] B.在第一配位体的存在下培育包含经积聚第一反式激活因子的包装细胞的群体以积聚第二反式激活因子及反转录病毒REV蛋白质,其中第二反式激活因子能够结合第二
配位体及第二可诱导启动子以供在第二配位体的存在下对比于缺失下影响可操作地连接
至其的核酸序列的表达;及
[0887] C.在第二配位体的存在下培育包含经积聚第二反式激活因子及反转录病毒REV蛋白质的包装细胞的群体,从而诱导gag多肽、pol多肽及一个或多个假型组件的表达,从而制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,
[0888] 其中可包装RNA基因组是由可操作地连接至第三启动子的多核苷酸编码,其中该第三启动子是组成性活性的或可由第一反式激活因子或第二反式激活因子诱导,且其中一
个或多个假型组件能够与靶标细胞结合和/或有助于膜与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒
融合。
[0889] 在本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法的一些实施例中,哺乳动物细胞进一步包含能够与靶细胞(通常为淋巴细胞,诸如NK细胞或在说明性实施例中为T细胞)结合且活化靶细胞的活化组件,且第一反式激活因子
调节活化组件的表达。活化组件在复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上且其中该活化
组件可包括:能够与CD3结合的膜结合多肽;和/或能够与CD28结合的膜结合多肽。能够与
CD3结合的膜结合多肽为能够与融合至异源GPI锚定连接序列的CD3结合的多肽,且能够与
CD28结合的膜结合多肽为能够与融合至异源GPI锚定连接序列的CD28结合的多肽。能够与
CD28结合的膜结合多肽在一些实施例中包含CD80、CD86或能够诱导经CD28介导的Akt的活
化的其功能性片段(诸如CD80的胞外域)。在其他实施例中,能够结合CD3的膜结合多肽为与CD14 GPI锚定连接序列结合的抗CD3 scFv或抗CD3 scFvFc,且其中能够与CD28结合的膜结
合多肽为CD80,或与CD16B GPI锚定连接序列结合的其胞外片段。
[0890] 在本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法的一些实施例中,哺乳动物细胞进一步包含膜结合细胞因子,且第一反式激
活因子调节膜结合细胞因子的表达。膜结合细胞因子可为例如IL-7、IL-15或其活化片段。
实施例中的膜结合细胞因子可为IL-7或其活化片段及DAF的融合多肽。举例而言,融合多肽可包含DAF信号序列及不具有其信号序列的IL-7,接着为DAF的残基36至525。
[0891] 在本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法的一些实施例中,哺乳动物细胞包含与其膜相关联的:活化组件,其包含与
CD14 GPI锚定连接序列结合的抗CD3scFV或抗CD3 scFvFc,或与CD16B GPI锚定连接序列结
合的CD80或其胞外片段;及膜结合细胞因子,其包含IL-7或其活化片段及包含GPI锚定连接序列的DAF的融合多肽,且其中第一反式激活因子调节活化组件及膜结合细胞因子中的每
一者的表达。在一些实施例中,IL-7或其活化片段及DAF融合、抗CD3scFV或抗CD3 scFvFc及CD80或其胞外片段各自包含DAF信号序列。
[0892] 在本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法的一些实施例中,哺乳动物细胞进一步包含Vpu多肽。在本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法的一些实施例中,哺
乳动物细胞进一步包含Vpu多肽及Vpx多肽。在本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制
造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法的一些实施例中,哺乳动物细胞进一步包含
Vpx多肽。在这些或其他实施例中,一个或多个假型组件包含由T细胞识别的一个或多个病
毒多肽。一个或多个假型组件可包含麻疹病毒F多肽、麻疹病毒H多肽和/或其片段。在某些说明性实施例中,一个或多个假型组件为麻疹病毒F多肽和/或麻疹病毒H多肽的细胞质域
缺失变体。
[0893] 在本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法的一些实施例中,可包装RNA基因组由可操作地连接至第三启动子的多核苷
酸编码,其中该第三启动子是组成性活性的或可由第一反式激活因子或第二反式激活因子
诱导。在说明性实施例中,可包装RNA基因组由可操作地连接至第三启动子的多核苷酸编
码,其中该第三启动子可由第二反式激活因子诱导。
[0894] 在本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法的一些实施例中,可包装RNA基因组进一步自5’至3’包含:
[0895] a)5’长末端重复或其活化片段;
[0896] b)核酸序列,其编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件;
[0897] c)核酸序列,其编码第一靶标多肽及视情况选用的第二靶标多肽;
[0898] d)第四启动子,其可操作地连接至第一靶标多肽及视情况选用的第二靶标多肽,其中该第四启动子在靶细胞中具有活性但在包装细胞系中为无活性的;及
[0899] e)3’长末端重复或其活化片段。
[0900] 在包括紧接着上文构建体的本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法的一些实施例中,第三启动子促进与由第四启动子
促进的转录及表达相反的方向上的转录或表达。
[0901] 在本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法的一些实施例中,可包装RNA基因组编码在本发明中公开的任何实施例的复
制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其中第一靶标多肽及第二靶标多肽分别为第一工程化信号
传导多肽及第二工程化信号传导多肽。在一些实施中,例如,可包装RNA基因组进一步包含可操作地连接至核酸的控制组件,该核酸编码第一工程化信号传导多肽或第二工程化信号
传导多肽。控制组件在说明性实施例中为核糖开关。核糖开关在说明性实施例中能够结合
化合物且结合控制组件的化合物为核苷类似物,且该核苷类似物可为抗病毒药物,例如阿
昔洛韦或喷昔洛韦。
[0902] 在本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法的一些实施例中,可包装RNA基因组进一步包含内含子,该内含子包含编码抑制性RNA分子(诸如miRNA或shRNA)的多核苷酸。内含子可邻近于第四启动子或在第四启动
子的下游。
[0903] 在本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法的一些实施例中,靶标细胞可为T细胞和/或NK细胞。
[0904] 在本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法的一些实施例中,一个或多个假型组件包含疱疹口腔炎病毒包膜蛋白(VSV-
G)、猫类内源性病毒(RD114)包膜蛋白、致癌反转录病毒双嗜性包膜蛋白或致癌反转录病毒亲嗜性包膜蛋白或其功能性片段。
[0905] 在本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法的一些实施例中,可包装RNA基因组大小为11,000KB或更小,或10,000KB或更小。在本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面
的方法的一些实施例中,第一靶标多肽包含第一工程化信号传导多肽且其中该第一工程化
信号传导多肽包含至少一个淋巴增生性组件,且第二靶标多肽包含包括CAR的第二工程化
信号传导多肽。
[0906] 在一个方面中,本文中提供一种用于调节多核苷酸靶标多核苷酸的表达的经分离多核苷酸,其包含:
[0907] 多核苷酸,其编码可操作地连接至启动子及核糖开关的多核苷酸靶标多核苷酸,其中该核糖开关包含:
[0908] a.)适体域,其能够结合核苷类似物抗病毒药物且相对于核苷类似物抗病毒药物减少与鸟嘌呤或2’-脱氧鸟苷的结合;
[0909] b.)功能切换域,其能够调节多核苷酸靶标多核苷酸的表达,其中由适体域结合的核苷类似物诱导或抑制功能切换域的表达调节活性,从而调节多核苷酸靶标多核苷酸的表
达。
[0910] 在包括控制组件的本文所提供的这些方法及组合物中的任一者的说明性实施例中可为包含核糖开关的多核苷酸。核糖开关可能够结合核苷类似物且结合控制组件的化合
物为核苷类似物。核苷类似物可为抗病毒剂。抗病毒剂可为阿昔洛韦或喷昔洛韦。核糖开关可较佳地经由喷昔洛韦结合阿昔洛韦或较佳地经由阿昔洛韦结合喷昔洛韦。核糖开关可在
高于37℃、37.5℃、38℃、38.5℃或39℃(例如,高于39℃)的温度下减少与核苷类似物抗病毒药物的结合。核糖开关可在长度为35、40、45及50个核苷酸的范围的低值端点与长度为
60、65、70、75、80、85、90、95及100个核苷酸的范围的高值端点之间,例如在长度为45与80个核苷酸之间。在包括核糖开关的本文所提供的这些方法及组合物中的任一者的说明性实施
例中,由核糖开关调节的多核苷酸靶标多核苷酸可包括编码miRNA、shRNA和/或多肽的区
域。多核苷酸靶标多核苷酸可编码淋巴增生性组件。多核苷酸靶标多核苷酸可可操作地连
接至启动子。多核苷酸靶标多核苷酸可包括编码多肽的区域,且该多肽可包括嵌合抗原受
体,该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区、跨膜域及胞内活化域。在包括核糖开关的本文所提供的这些方法及组合物中的任一者的说明性实施例中,功能切换域可调节内部核糖体
进入位点、病毒基因构建体中的pre-mRNA剪接供体可及性、翻译、转录终止、转录降解、
miRNA表达或shRNA表达,从而调节多核苷酸靶标多核苷酸的表达。核糖开关可包括核糖核
酸酶。在本文所提供的包括核糖开关的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中,经分
离多核苷酸可为分子克隆载体或表达载体。在本文所提供的包括核糖开关的方法及组合物
中的任一者的说明性实施例中,可将经分离多核苷酸整合至反转录病毒基因组中或至哺乳
动物染色体或其片段中。在本文中的包含核糖开关的方面及实施例中的任一者的说明性实
施例中,核糖开关调节前mRNA剪接。举例而言,核糖开关可包含通常在本文中的多核苷酸
和/或转录单元上的两个外显子之间的分支点序列。因此,核苷类似抗病毒化合物或药物与核糖开关的结合调节外显子剪接。此类实施例可包括多核苷酸,该多核苷酸包含第一外显
子、第二外显子及在第一外显子与第二外显子之间的核糖开关,其中该核糖开关包含分支
点序列,且其中核苷类似抗病毒化合物或药物(例如阿昔洛韦)与核糖开关的结合调节第一
及第二外显子的外显子剪接。在本文中的包含核糖开关的方面及实施例中的任一者的说明
性实施例中,核糖公开可通过调节前mRNA反式剪接来控制基因表达。在此类实施例中,核糖开关位于反式剪接内含子内。举例而言,一个方面可包括多核苷酸,该多核苷酸包含第一外显子、第二外显子及在第一外显子与第二外显子之间的核糖开关,其中该核糖开关包含分
支点序列,且其中阿昔洛韦与核糖开关的结合调节第一及第二外显子的外显子剪接。
[0911] 本文中提供的另一方面为一种用于以基因方式修饰及扩增个体的淋巴细胞的方法,其包含:
[0912] A.自个体收集血液;
[0913] B.使来自个体的血液的T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒活体外接触,该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含:
[0914] i.在其表面上的假型组件,该假型组件能够与T细胞和/或NK细胞结合且有助于与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒膜融合,其中该假型组件包含麻疹病毒F多肽和/或麻疹病
毒H多肽的细胞质域缺失变体;
[0915] ii.能够与CD3结合的多肽及能够与CD28结合的多肽,其中这些多肽在复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上表达且能够与T细胞和/或NK细胞结合,且另外其中这些多肽
并不由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码;及
[0916] iii.多核苷酸,其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元,
[0917] 其中一个或多个转录单元编码包含组成性活性IL-7受体突变体的第一工程化信号传导多肽及包含嵌合抗原受体的第二工程化信号传导多肽,该嵌合抗原受体包含抗原特
异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。
[0918] 其中IL-7受体突变体的表达由结合核苷类似物抗病毒药物的核糖开关调节,其中核苷类似物抗病毒药物与核糖开关的结合增加IL-7受体突变体的表达,且
[0919] 其中该接触使得静息T细胞和/或NK细胞中的至少一些变为经基因方式修饰;
[0920] C.将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞再引入至个体中;及
[0921] D.将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞活体内暴露于核苷类似物抗病毒药物以促进T细胞和/或NK细胞的扩增,其中收集血液与再引入经基因方式修饰的T细胞和/或NK
细胞之间的方法在不多于24小时内进行和/或不需要进行预先活体外刺激,从而以基因方
式修饰且扩增个体的淋巴细胞。
[0922] 在此方法方面的说明性实施例中,反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒。在另一说明性实施例中,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒以基因方式修饰T细胞。在另一说明性实施例
中,能够与CD3结合的多肽及能够与CD28结合的多肽各自与异源性GPI锚定连接序列融合。
在一些情况下,能够与CD3结合的多肽可为抗CD3 scFvFc或抗CD3 scFv,且能够与CD28结合的多肽可为CD80。抗CD3 scFvFc或抗CD3 scFv及CD80可各自进一步与DAF信号序列融合。在另一说明性实施例中,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其表面上进一步包含融合多肽,
该融合多肽包含共价连接至DAF的细胞因子。在一些情况下,细胞因子可为IL-7或IL-15,且融合多肽可包含DAF信号序列、不具有其信号序列的IL-7及包含GPI锚定连接序列的DAF的
片段。
[0923] 在紧接着上文的此方法方面的另一说明性实施例中,核糖开关进一步以通过核糖开关与核苷类似物抗病毒药物的结合调节的方式来控制嵌合抗原受体的表达,该核苷类似
物抗病毒药物在一些情况下为阿昔洛韦和/或喷昔洛韦。在另一实施例中,组成性活性IL-7可经miRNA或shRNA或编码miRNA或shRNA的核酸替换,且可存在IL-7。在一些情况下,miRNA或shRNA可由内含子内的核酸编码。
[0924] 本文中提供的另一方面为复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其包含:
[0925] A.在其表面上的假型组件,该假型组件能够与T细胞和/或NK细胞结合且有助于与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒膜融合,其中该假型组件包含麻疹病毒F多肽和/或麻疹病
毒H多肽的细胞质域缺失变体;
[0926] B.多核苷酸,其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元,其中该一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(包含抗原特异
性靶向区、跨膜域及胞内活化域)的第一工程化信号传导多肽及包含组成性IL-7受体突变
体的第二工程化信号传导多肽;其中IL-7受体突变体的表达由结合核苷类似物抗病毒药物
的核糖开关调节,其中核苷类似物抗病毒药物与核糖开关的结合增加IL-7受体突变体的表
达;及
[0927] C.能够与CD3结合的多肽及能够与CD28结合的多肽,其中这些多肽在复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上表达;能够与T细胞和/或NK细胞结合;且不由复制缺陷型重
组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码。
[0928] 在任一复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的说明性实施例中,该反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒。在该方法的其他说明性实施例中,能够与CD3结合的多肽及能够与CD28结合的多肽各自与异源性GPI锚定连接序列融合。在一些情况下,能够与CD3结合的多肽可为
抗CD3 scFvFc或抗CD3 scFv,且能够与CD28结合的多肽可为CD80。抗CD3 scFvFc或抗CD3 
scFv及CD80可各自进一步与DAF信号序列融合。在另一说明性实施例中,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其表面上进一步包含融合多肽,该融合多肽包含共价连接至DAF的细胞因
子。在一些情况下,细胞因子可为IL-7或IL-15,且融合多肽可包含DAF信号序列、不具有其信号序列的IL-7及包含GPI锚定连接序列的DAF的片段。
[0929] 在本文中的任一复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的另一说明性实施例中,核糖开关进一步以通过核糖开关与核苷类似抗病毒药物的结合调节的方式来控制嵌合抗原
受体的表达,该核苷类似抗病毒药物在一些情况下为阿昔洛韦和/或喷昔洛韦。在另一实施例中,组成性活性IL-7可经miRNA或shRNA或编码miRNA或shRNA的核酸替换,且可存在IL-7。
miRNA或shRNA可由内含子内的核酸编码。
[0930] 本文中提供的另一方面为一种用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法,其包含:
[0931] A.培养包装细胞的群体以积聚第一反式激活因子,其中包装细胞包含由组成性启动子表达的第一反式激活因子,其中第一反式激活因子能够结合第一配位体及第一可诱导
启动子以供在第一配位体的存在下对比于缺失下影响可操作地连接至其的核酸序列的表
达,且其中由第一反式激活因子调节第二反式激活因子及反转录病毒REV蛋白质的表达;
[0932] B.在第一配位体的存在下培育包含经积聚第一反式激活因子的包装细胞的群体以积聚第二反式激活因子及反转录病毒REV蛋白质及通常在其表面上的活化组件,该活化
组件包含能够与CD3结合的多肽及包含能够与CD28结合的多肽,其中第二反式激活因子能
够结合第二配位体及第二可诱导启动子以供在第二配位体的存在下对比于缺失下影响可
操作地连接至其的核酸序列的表达;及
[0933] C.在第二配位体的存在下培育包含经积聚第二反式激活因子及反转录病毒REV蛋白质的包装细胞的群体,从而诱导gag多肽、pol多肽、能够与T细胞和/或NK细胞结合且有助于与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒膜融合的假型组件的表达,其中该假型组件包含麻疹
病毒F多肽和/或麻疹病毒H多肽的细胞质域缺失变体,
[0934] 其中可包装RNA基因组由可操作地连接至第三启动子的多核苷酸编码,且其中该启动子可由第二反式激活因子诱导,
[0935] 其中可包装RNA基因组自5’至3’包含:
[0936] i.5’长末端重复或其活化片段;
[0937] ii.核酸序列,其编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件;
[0938] iii.核酸序列,其编码由裂解信号隔开的包含嵌合抗原受体的第一工程化信号传导多肽及包含组成性活性IL-7受体突变体的第二工程化信号传导多肽;
[0939] iv.第四启动子,其在T细胞和/或NK细胞中具有活性;及
[0940] v.3’长末端重复或其活化片段,且
[0941] 其中可包装RNA基因组进一步包含结合核苷类似物抗病毒药物的核糖开关,其中核糖开关与核苷类似物抗病毒药物的结合增加IL-7受体突变体的表达,
[0942] 从而制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。
[0943] 在该方法的一说明性实施例中,核糖开关进一步以通过结合核糖开关与核苷类似物抗病毒药物的结合调节的方式来控制嵌合抗原受体的表达。在另一说明性实施例中,核
苷类似物抗病毒药物为阿昔洛韦和/或喷昔洛韦。在另一说明性实施例中,可包装RNA基因
组进一步包含识别域,其中该识别域包含由识别EGFR或其抗原决定基的抗体识别的多肽。
在另一说明性实施例中,第一配位体为雷帕霉素,且第二配位体为四环素或阿霉素;或第一配位体为四环素或阿霉素,且第二配位体为雷帕霉素。在另一说明性实施例中,包装细胞进一步包含在第二或视情况选用的第三转录单元上或可操作地连接至第一可诱导启动子的
其他转录单元上编码Vpu的核酸序列。在另一说明性实施例中,包装细胞进一步包含在第二或视情况选用的第三转录单元上或可操作地连接至第一可诱导启动子的其他转录单元上
编码Vpu多肽及Vpx多肽的核酸序列。在另一说明性实施例中,包装细胞进一步包含在第二
或视情况选用的第三转录单元上或可操作地连接至第一可诱导启动子的其他转录单元上
编码Vpx的核酸序列。在另一说明性实施例中,能够与CD3结合的多肽及能够与CD28结合的
多肽各自与异源性GPI锚定连接序列融合。在一些情况下,能够与CD3结合的多肽可为抗CD3 scFvFc或抗CD3 scFv,且能够与CD28结合的多肽可为CD80。抗CD3 scFvFc或抗CD3 scFv及
CD80可各自进一步与DAF信号序列融合。在另一说明性实施例中,还包括包含共价连接至
DAF的细胞因子的融合多肽的表达。在一些情况下,细胞因子可为IL-7或IL-15,且融合多肽可包含DAF信号序列、不具有其信号序列的IL-7及包含GPI锚定连接序列的DAF的片段。在另一说明性实施例中,核糖开关进一步以通过核糖开关与核苷类似物抗病毒药物的结合调节
的方式来控制嵌合抗原受体的表达,该核苷类似物抗病毒药物在一些情况下为阿昔洛韦
和/或喷昔洛韦。在另一实施例中,组成性活性IL-7可经miRNA或shRNA或编码miRNA或shRNA的核酸替换,且可存在IL-7。miRNA或shRNA可由内含子内的核酸编码。在一说明性实施例
中,反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒。
[0944] 本文中的另一方面中提供一种以基因方式修饰的淋巴细胞,其包含:
[0945] A.第一工程化信号传导多肽,其包含组成性活性IL-7受体突变体;及
[0946] B.第二工程化信号传导多肽,其包含嵌合抗原受体,该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。
[0947] 在以上经基因方式修饰的淋巴细胞的说明性实施例中,经基因方式修饰的淋巴细胞为T细胞和/或NK细胞。在某些实施例中,淋巴细胞为T细胞。在另一说明性实施例中,该第一工程化信号传导多肽和/或该第二工程化信号传导多肽的表达由结合核苷类似物抗病毒
药物的核糖开关调节,其中核苷类似物抗病毒药物与核糖开关的结合增加IL-7受体突变体
的表达。在另一实施例中,经基因方式修饰的淋巴细胞表达至少一种(例如,两种)抑制性
RNA分子,诸如miRNA或shRNA。抑制性RNA分子可进一步由内含子内的核酸编码。
[0948] 本文中的另一方面提供一种以基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞,其包含:
[0949] a.第一工程化信号传导多肽,其包含至少一个淋巴增生性组件;及
[0950] b.第二工程化信号传导多肽,其包含嵌合抗原受体,该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。
[0951] 在经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞方面的说明性实施例中,淋巴增生性组件是组成性活性的,且在一些情况下为组成性活性突变的IL-7受体或其片段。在另一说明性
实施例中,第一工程化信号传导多肽和/或第二工程化信号传导多肽的表达由控制组件调
节。在一些情况下,控制组件为包含核糖开关的多核苷酸。在一些情况下,核糖开关能够结合核苷类似物且当核苷类似物存在时,表达第一工程化信号传导多肽和/或第二工程化信
号传导多肽。在其他说明性实施例中,经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞在其表面上具
有活化组件、假型组件和/或膜结合细胞因子。在一些情况下,活化组件包含能够与CD3结合的膜结合多肽;和/或能够与CD28结合的膜结合多肽。在某些实施例中,活化组件包含与异源性GPI锚定连接序列融合的抗CD3 scFV或抗CD3 scFvFc和/或与异源性GPI锚定连接序列
融合的CD80。在一说明性实施例中,假型组件包含麻疹病毒F多肽、麻疹病毒H多肽,和/或麻疹病毒F多肽和/或麻疹病毒H多肽的细胞质域缺失变体。在其他实施例中,膜结合细胞因子为包含IL-7或融合至DAF或包含GPI锚定连接序列的其片段的融合多肽。
[0952] 在一个方面中,本文中提供一种用于以基因方式修饰及扩增个体的淋巴细胞的方法,其包含:
[0953] A.使个体的静息T细胞和/或NK细胞活体外在通常不需要进行预先活体外刺激的情况下与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触,这些复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包
含:
[0954] i.在其表面上的假型组件,该假型组件能够与T细胞和/或NK细胞结合且有助于与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒膜融合;及
[0955] ii.多核苷酸,其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元,其中该一个或多个转录单元:编码由控制组件调节的第一工程化
信号传导多肽,其中该第一工程化信号传导多肽包含至少一个淋巴增生性组件;且视情况
编码由控制组件视情况调节的第二工程化信号传导多肽,其中第二工程化信号传导多肽包
含胞内活化域及视情况选用的CAR的其他组分,
[0956] 其中该接触有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞中的至少一些,从而产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞;
[0957] B.将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞引入至个体中;及
[0958] 将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞活体内暴露于充当控制组件的化合物以影响第一工程化信号传导多肽的表达且活体内促进淋巴细胞的扩增、移植和/或持久性,从而以基因方式修饰及扩增个体的淋巴细胞。
[0959] 在说明性实施例中,在无需活体外刺激的情况下进行转导。在说明性实施例中,化合物为分子伴侣,诸如小分子伴侣。在说明性实施例中,分子伴侣与淋巴增生性组件的结合增加淋巴增生性组件的增生活性。可在收集血液之前、在接触期间和/或在将T细胞和/或NK细胞引入至个体中之后将分子伴侣施用至个体。关于其中该化合物作为控制组件的这一方面,应当理解,此化合物通常能够与淋巴增生性组件和/或CAR的组分结合,且在进行该方法期间与此淋巴增生性组件或CAR组分结合。与包括用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转染T
细胞和/或NK细胞的本文所提供的方法相关的其他实施例及教示应用于此方面,还包括分
子伴侣实施例。
[0960] 在另一方面中,本文中提供一种用于选择受微环境限制的抗原特异性靶向区的方法,该方法包含通过以下淘选多肽显示库:
[0961] a.使多肽显示库的多肽在正常生理条件下经受结合分析及在异常条件下的结合分析;及
[0962] b.选择在与生理条件相比的异常条件下展现结合活性的增加的多肽,从而选择受微环境限制的抗原特异性靶向区。
[0963] 在另一方面中,本文中提供一种用于分离受微环境限制的抗原特异性靶向区的方法,其包含:
[0964] 通过以下淘选多肽库:
[0965] a)在异常条件下使多肽库与结合至固体载体的靶标抗原接触,其中表达与结合靶标抗原的多肽的纯系仍经由靶标抗原结合至固体载体;
[0966] b)在生理条件下将固体载体与结合多肽一起培育;及
[0967] c)收集在生理条件下自固体载体溶离的纯系,从而分离微环境受限的抗原特异性靶向区。
[0968] 在另一方面中,本文中提供一种用于结合靶标抗原的嵌合抗原受体,该嵌合抗原受体包含:
[0969] a)至少一个受微环境限制的抗原特异性靶向区,其通过淘选多肽库选择,且与正常生理条件下相比在异常条件下结合分析的活性增加;
[0970] b)跨膜域;及
[0971] c)胞内活化域。
[0972] 在另一方面中,本文中提供一种用于结合靶标抗原的嵌合抗原受体,该嵌合抗原受体包含:
[0973] a)受微环境限制的抗原特异性靶向区,其与正常生理环境下相比,在异常条件下展现与靶标抗原的结合的增加,其中抗原特异性靶向区与靶标结合;
[0974] b)跨膜域;及
[0975] c)胞内活化域。
[0976] 在包括受微环境限制的抗原特异性靶向区(ASTR)的本文所提供的这些方法及组合物中的任一者的说明性实施例中,与正常条件下相比,ASTR在异常条件下的分析中对靶
标抗原可增加至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或
100%的结合亲和力。异常条件可为低氧、酸性pH、较高浓度的乳酸、较高浓度的透明质酸、较高浓度的白蛋白、较高浓度的腺苷、较高浓度的R-2-羟基戊二酸、较高浓度的PAD酶、较高压力、较高氧化反应及较低养分可用性。如相比于在7.4的pH下,受微环境限制的ASTR在6.7的pH下可展现抗原结合的增加。受微环境限制的ASTR可展现在与对应生理条件相关的肿瘤
环境和/或活体内肿瘤环境分析条件中的抗原结合的增加。靶标可为4-1BB、ST4、腺癌抗原、α-胎蛋白、AXL、BAFF、B-淋巴瘤细胞、C242抗原、CA-125、碳酸酐酶-9(CA-IX)、C-MET、CCR4、CD 152、CD 19、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23(IgE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD4、CD40、CD44 v6、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CEA、CNT0888、CTLA-4、DRS、EGFR、EpCAM、CD3、FAP、纤连蛋白外域-B、叶酸受体1、GD2、GD3神经节苷脂、糖蛋白75、GPNMB、HER2/neu、HGF、人类分散因子受体激酶、IGF-1受体、IGF-I、IgG1、Ll-CAM、IL-13、IL-6、类胰岛素生长因子I受体、整合素nSP1、整合素nvP3、MORAb-009、MS4A1、MUC1、黏蛋白CanAg、N葡萄糖代神经氨酸、NPC-1C、PDGF-R a、PDL192、磷脂酰丝氨酸、前列腺癌细胞、RANKL、RON、ROR1、ROR2 SCH 
900105、SDC1、SLAMF7、TAG-72、生蛋白C、TGFβ2、TGF-P、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR2及波形蛋白。ASTR可为抗体、抗原、配位体、配位体的受体结合域、受体、受体的配位体结合域或亲和体。ASTR可为全长抗体、单链抗体、Fab片段、Fab’片段、(Fab’)2片段、Fv片段以及二价单链抗体或双功能抗体。ASTR可包括来自抗体的重链及轻链。抗体可为单链可变片段。在一些实施例中,重链及轻链可由接头隔开,其中该接头长度在6与100个氨基酸之间。在一些实施例中,重链可定位于嵌合抗原受体上的轻链
的N端,且在一些实施例中轻链可定位于嵌合抗原受体上的重链的N端。
[0977] 在包括多肽显示库的本文所提供的这些方法中的任一者的说明性实施例中,多肽显示库可为噬菌体显示库或酵母显示库。多肽显示库可为抗体显示库。抗体显示库可为人
类或人类化抗体显示库。抗体显示库可为原生库。这些方法可包括用所收集噬菌体感染细
菌细胞以产生精制噬菌体显示库,且重复接触、培育及收集1至1000个循环,使用由前述循环产生的精制噬菌体显示库。
[0978] 在包括分离或选择受微环境限制的ASTR的本文所提供的这些方法中的任一者的说明性实施例中,该方法可包括测定编码受微环境限制的抗原特异性靶向区的多核苷酸的
核酸序列,从而测定受微环境限制的ASTR的多肽序列。这些方法可包括通过产生编码多肽
的多核苷酸来制造受微环境限制的生物嵌合抗原受体,该多肽包含受微环境限制的ASTR、
跨膜域及胞内活化域。该库可为单链抗体库。
[0979] 用于分离受微环境限制的ASTR的方法可包括重复淘选1至1000次之间。可进行用于分离受微环境限制的ASTR的方法,而无需在淘选的轮次之间突变编码受微环境限制的抗
原特异性靶向区的多核苷酸。用于分离受微环境限制的ASTR的方法可在淘选的轮次之间通
过培养、高保真扩增和/或稀释编码抗原特异性靶向区的多核苷酸或包括其的宿主生物体
来进行。这些方法可包括在重复之前,诱变处理经选择和/或经分离受微环境限制的抗原特异性靶向区。这些方法可包括在经由长久读取DNA测序的淘选的一个或多个轮次之后测定
经选择和/或经分离受微环境限制的抗原特异性靶向区和/或编码其的多核苷酸的序列。这
些方法可包括在经分离受微环境限制的ASTR的扩增之前及之后测测序列。可进行用于分离
经分离受微环境限制的ASTR的方法,而无需在不需要重复淘选。可进行用于分离经分离受
微环境限制的ASTR的方法,而无需在分离受微环境限制的ASTR之后,突变编码经分离受微
环境限制的ASTR的多核苷酸。
[0980] 在包括具有受微环境限制的ASTR的嵌合抗原受体的本文所提供的这些组合物中的任一者的说明性实施例中,受微环境限制的ASTR可通过淘选抗体库来鉴别。在一些实施
例中,受微环境限制的ASTR通过淘选噬菌体显示库或酵母显示库来鉴别。在一些实施例中,嵌合抗原受体包含双特异性ASTR。
[0981] 在另一方面中本文中提供一种经转导T细胞和/或NK细胞,其包含重组多核苷酸,该重组多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或
多个转录单元,其中该一个或多个转录单元编码由控制组件调节的第一工程化信号传导多
肽,其中该第一工程化信号传导多肽包含组成性活性IL-7受体突变体,且其中控制组件能
够活体外或活体内与化合物结合,或经配置以活体内结合化合物。
[0982] 在另一方面中本文中提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,其包含重组多核苷酸,该重组多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一
个或多个转录单元,其中该一个或多个转录单元编码由控制组件(其可为活体内控制组件)
调节的第一工程化信号传导多肽,其中该第一工程化信号传导多肽包含组成性IL-7受体突
变体,且其中控制组件能够活体内与化合物结合,或经配置以活体内结合化合物。
[0983] 在另一方面中本文中提供一种转导T细胞和/或NK细胞的方法,该方法包含:使T细胞和/或NK细胞与包含重组多核苷酸的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触,该重组多核
苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单
元,其中该一个或多个转录单元编码由控制组件调节的第一工程化信号传导多肽,其中该
第一工程化信号传导多肽包含组成性IL-7受体突变体,且其中活体内控制组件能够在转导
条件下活体内或活体外与化合物结合,从而转导T细胞和/或NK细胞。
[0984] 在前述段落提供的经转导T细胞和/或NK细胞方面、复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面、及方法方面的说明性实施例中,重组多核苷酸进一步包含编码包含第一嵌合抗原
受体的第二工程化信号传导多肽的转录单元,该第一嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区
(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。在其他说明性实施例中,淋巴增生性组件包含经突变IL-7受体或其片段。在其他说明性实施例中,控制组件为包含核糖开关的多核苷酸。在一些情况
下,核糖开关能够结合核苷类似物且结合控制组件的化合物为核苷类似物。在一些情况下,核苷类似物为抗病毒剂,诸如阿昔洛韦或喷昔洛韦。在某些实施例中,抗病毒剂为阿昔洛
韦。在其他说明性实施例中,组成性活性IL-7受体突变体与EGFR或其抗原决定基融合。在其他说明性实施例中,组成性活性IL-7受体突变体包含eTag。在其他说明性实施例中,组成性活性IL-7受体突变体包含PPCL插入。在其他说明性实施例中,组成性活性IL-7受体突变体
包含等效于野生型人类IL-8受体中的位置243的位置处的PPCL插入。在其他说明性实施例
中,经转导T细胞和/或NK细胞为经转导T细胞。
[0985] 在另一方面中,本文中提供一种用于调节表达受微环境限制的生物嵌合抗原受体(MRB-CAR)的T细胞和/或NK细胞与表达个体中的MRB-CAR的同源抗原的细胞结合的方法,该
方法包括:
[0986] a.将包括编码MRB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞引入至个体中,其中在引入后,包括编码MRB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞表达MRB-CAR且与表达个体中的同源抗原的
细胞结合;及
[0987] b.向个体施用呈充足量的药用试剂以增加血液pH和/或组织的pH和/或微环境的pH,其中该施用在引入之前、期间或之后进行,且其中血液、组织和/或微环境的增加的pH调节表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞与表达具有增加的pH的血液、组织或微环境中的同源
抗原的细胞的结合。
[0988] 在另一方面中,本文中提供一种用于靶向减轻个体中的肿瘤毒性的方法,其包括:
[0989] a.将编码受微环境限制的生物嵌合抗原受体(MRB-CAR)的核酸引入至个体的T细胞和/或NK细胞中以产生包括编码MRB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞;
[0990] b.将包括编码MRB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞引入至个体中,其中在引入之后,包括编码MRB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞表达MRB-CAR且与表达个体中的同源抗原
的细胞结合;及
[0991] c.向个体施用呈充足量的药用试剂以增加血液pH和/或组织的pH和/或微环境的pH以调节MRB-CAR与具有增加的pH的血液、组织和/或微环境中的其同源抗原的结合,从而
靶向减轻个体中的肿瘤毒性。
[0992] 在一些实施例中,核酸可为载体。在说明性实施例中,载体为反转录病毒颗粒。
[0993] 在另一方面中,本文中提供一种用于控制T细胞和/或NK细胞与靶标哺乳动物细胞的结合的方法,其包括:
[0994] a.使靶标哺乳动物细胞与微环境中的T细胞和/或NK细胞接触,其中靶标哺乳动物细胞表达同源抗原,且如相比于在pH 7.4下,T细胞和/或NK细胞表达在pH 6.7下有差异地
与同源抗原结合的受微环境限制的生物嵌合抗原受体(MRB-CAR);及
[0995] b.通过将药用试剂以充足量引入微环境来增加微环境的pH,从而控制T细胞和/或NK细胞与靶标哺乳动物细胞的结合。
[0996] 在另一方面中,本文中提供一种用于控制表达受微环境限制的生物嵌合抗原受体(MRB-CAR)的T细胞和/或NK细胞与个体中的靶标哺乳动物细胞在活体内的结合的方法,该
方法包括经由增加个体内的微环境的pH的有效给药方案向个体施用pH调节药用试剂,其中
个体包括表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞,其中如相比于在pH 7.4下,MRB-CAR在pH 6.7
下有差异地与其同源抗原结合,其中微环境包括靶标哺乳动物细胞,其中靶标哺乳动物细
胞在其表面上表达同源抗原,且其中T细胞和/或NK细胞在增加微环境的pH之前相比于之后
有差异地与靶标哺乳动物细胞结合,从而控制T细胞和/或NK细胞与个体中的靶标哺乳动物
细胞在活体内的结合。
[0997] 在本文提供的包括药用试剂及MRB-CAR的方面中的任一者中,MRB-CAR可在一个pH下而非不同pH下减少与其同源抗原的结合。在针对MRB-CAR的差异性结合的说明性pH值未
曾提供于广泛方面中的说明性实施例中及替代地对于代替用于这些方面的那些值的其他
实施例,MRB-CAR可在较高pH下而非较低pH下减少结合。举例而言,MRB-CAR可在高于7.0、
7.1、7.2、7.3、7.4或7.5的pH下而非低于6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0的pH下减少与其同源抗原的结合。在其他实施例中,MRB-CAR可在较高pH下而非较低pH下减少结合。举例而言,MRB-CAR可在低于6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0的pH下而非高于7.0、7.1、7.2、7.3、
7.4或7.5的pH下减少与其同源抗原的结合。在一些说明性实施例中,相比于在pH 7.4至7.6下,MRB-CAR在6.5至6.7的pH下展现增加的结合。在其他说明性实施例中,相比于在7.4的pH下,MRB-CAR在6.7的pH下展现增加的结合。在其他实施例中,相比于在血液的pH下,MRB-CAR在肿瘤的pH下展现增加的结合。在一些实施例中,MRB-CAR可包括抗原特异性靶向区、柄及胞内活化域。在一些实施例中,MRB-CAR也可包括共刺激域。在一些实施例中,MRB-CAR可与肿瘤相关的抗原结合。
[0998] 在本文提供的包括药用试剂及MRB-CAR的方面中的任一者中,微环境的pH可自低于7.0的pH增加至高于7.0的pH。举例而言,pH可自低于6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0的pH增加至高于7.0、7.1、7.2、7.3或7.4的pH。在一些实施例中,MRB-CAR可在引入药用试剂之前在增加的pH下而非微环境的pH下与同源抗原结合。在某些实施例中,pH可自低于7.0增加
7.1至8.0的pH、或至7.1至7.8的pH、或至7.2至7.8的pH、或至7.2至7.6的pH、或至7.3至7.6的pH、或至7.4至7.8的pH、或至7.4至7.6的pH。视施用的药用试剂的类型及剂量而定,此pH的增加可发生少于1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时或24小时,或多于1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时或24小时。在某些实施例中,施用药用试剂,使得pH在靶标组织(诸如肿瘤)中,及例如在靶标组织(例如,肿瘤)微环境的至少一个表面中,在靶标组织(例如,肿瘤)微环境的至少一部分中以及在说明性实施例中在整个靶标组织(例如,肿瘤)
微环境中保持高于7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5;或在7.0、7.1、7.2、7.3的范围的低值端点与7.4、7.5、7.6、7.7或7.8的范围的高值端点之间。
[0999] 在本文提供的包括药用试剂及MRB-CAR的方面中的任一者中,微环境可为活体内微环境,诸如肿瘤、组织、非肿瘤组织、正常组织或已经历pH短暂变化的组织。举例而言,通常经历pH短暂变化的组织包括厌氧条件下的肌肉组织或经历锻炼的肌肉组织或已发炎组
织或正经历发炎的组织。在包括靶标哺乳动物细胞的一些实施例中,靶标哺乳动物细胞可
为肿瘤细胞或非肿瘤细胞或正常细胞。
[1000] 在本文提供的包括药用试剂及MRB-CAR的方面中的任一者中,药用试剂可为碳酸氢钠、参(羟甲基)胺基甲烷、碳酸氢钠及碳酸钠的等摩尔高渗溶液或质子泵抑制剂,这些质子泵抑制剂,诸如艾美拉唑(esomeprazole)、艾美拉唑及萘普生(naproxen)、兰索拉唑
(lansoprazole)、奥美拉唑(omeprazole)及雷贝拉唑(rabeprazole)。
[1001] 编码本发明的MRB-CAR的核酸可经由各种手段引入至T细胞和/或NK细胞中。在本文提供的包括药用试剂及MRB-CAR的方面中的任一者中,一个或多个引入步骤可通过以下
来进行:
[1002] a.使个体的静息T细胞和/或NK细胞活体外在不需要进行预先活体外刺激的情况下与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触,该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包括:
[1003] i.在其表面上的一个或多个假型组件,该假型组件能够与T细胞和/或NK细胞结合且有助于与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒膜融合;及
[1004] ii.多核苷酸,其包括可操作地连接至在编码MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的转录单元,
[1005] 其中该接触有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞中的至少一些,从而产生能够表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞,通常是因为其现今包括多核苷酸,该多核苷酸包括在编码MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的
转录单元;及
[1006] b.将能够表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞引入至个体中。
[1007] 在一些实施例中,T细胞和/或NK细胞可在引入之前活体外经历2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更少细胞分裂。在一些实施例中,静息T细胞和/或静息NK细胞可与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11或12小时的范围的低值端点与6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时的范围的高值端点之间,其中对于给定范围,较低值低于较高值。在一些实施例中,静息T细胞和/或静息NK细胞可来自自个体收集的血液。在说明性实施例中,在自个体收集血液的时间与将能够表达MRB-CAR的T细胞和/或静息NK细胞引入至个体中的时间之间可
不多于12小时、15小时、16小时、18小时、21小时、24小时、30小时、36小时、42小时或48小时。
在一些实施例中,收集血液之后及引入能够表达MRB-CAR的T细胞和/或静息NK细胞之前的
所有步骤在封闭系统中进行。
[1008] 在本文提供的包括方法(包括MRB-CAR及药用试剂)中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的任何实施例中,包括可操作地连接至在编码MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞中具有
活性的启动子的转录单元的多核苷酸由T细胞和/或NK细胞吸收,使得此类细胞能够表达
MRB-CAR。在说明性实施例中T细胞和/或NK细胞将多核苷酸整合至其基因组中。
[1009] 在本文提供的包括方法(包括MRB-CAR及药用试剂)中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的任何实施例中,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可进一步包括在其表面上的活化
组件,诸如能够活化静息T细胞和/或静息NK细胞的活化组件。在一些实施例中,活化组件可包括在本发明中提供的任何活化组件。在说明性实施例中,活化组件可包括能够与CD3结合的膜结合多肽和/或能够与CD28结合的膜结合多肽。在包括方法(包括MRB-CAR及药用试剂)
中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上的活化组件的紧接着上文提供的实施例中
的任一者中,膜结合多肽中的一个或多个可与异源性GPI锚定连接序列融合。在一些实施例中,能够与CD3结合的膜结合多肽和/或能够与CD28结合的膜结合多肽可为分别结合CD3或
CD28的scFv或scFvFc。在说明性实施例中,能够与CD3结合的膜结合多肽可为结合CD3的
scFv或scFvFc。在一些实施例中,能够与CD28结合的膜结合多肽可为CD80、CD86的胞外域或能够诱导CD28介导的Akt的活化的其功能性片段。
[1010] 在本文提供的包括方法(包括MRB-CAR及药用试剂)中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的任何实施例中,编码MRB-CAR的多核苷酸可可操作地连接至核糖开关。在一些实施例中,核糖开关可以能够结合核苷类似物。在一些实施例中,核苷类似物可为抗病毒药物,诸如阿昔洛韦或喷昔洛韦。
[1011] 在本文提供的包括方法(包括MRB-CAR及药用试剂)中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的任何实施例中,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可在其表面上包括生物批准的单
克隆抗体的识别域。举例而言,识别域可包括由识别EGFR或其抗原决定基的抗体所识别的
多肽。
[1012] 在本文提供的包括方法(包括MRB-CAR及药用试剂)中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的任何实施例中,一个或多个假型组件可包括麻疹病毒F多肽、麻疹病毒H多肽和/或保留与静息T细胞和/或静息NK细胞结合的能力的其片段。在一些实施例中,一个或多个假
型组件可包括VSV-G多肽。在一些实施例中,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可在其表面上包括IL-7或其活化片段及包括GPI锚定连接序列的DAF的融合多肽。
[1013] 在本文提供的包括方法(包括MRB-CAR及药用试剂)中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的任何实施例中,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的基因组可编码一种或多种抑制
性RNA分子,例如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、或六种或更多种抑制性RNA分子。在一些实施例中,抑制性RNA分子可针对不同RNA靶标。在一些实施例中,抑制性RNA分子可位于内含子内。在一些实施例中,抑制性RNA分子能够形成形成18至25个核苷酸RNA双螺旋的5’茎及3’茎。在一些实施例中,抑制性RNA分子中的至少一者自5’至
3’取向可包括:5’微小RNA侧翼序列、5’茎、环、3’茎及3’微小RNA侧翼序列,其中5’茎或3’茎能够与RNA靶标结合。在另一实施例中,5’茎长度可为18至25个核苷酸,其中该3’茎长度为
18至25个核苷酸,其中该环长度为3至40个核苷酸。在一些实施例中,5’微小RNA侧翼序列及
3’微小RNA侧翼序列中的一者或多者衍生自天然存在的miRNA,诸如mIR-155。
[1014] 在另一方面中,本文中提供一种pH调节药用试剂以供在用于控制T细胞和/或NK细胞与个体中的靶标哺乳动物细胞在活体内的结合的方法中使用,该方法包括经由增加个体
内的微环境的pH的有效给药方案向个体施用pH调节药用试剂,其中个体包括T细胞和/或NK
细胞,其中如相比于在pH 7.4下,T细胞和/或NK细胞表达在pH 6.7下有差异地与其同源抗
原结合的受微环境限制的生物嵌合抗原受体(MRB-CAR),其中T细胞和/或NK细胞表达MRB-
CAR,其中微环境包括靶标哺乳动物细胞,其中靶标哺乳动物细胞其表面上的表达同源抗
原,且其中T细胞和/或NK细胞在通过施用pH调节药用试剂增加微环境的pH之前相比于之后
有差异地与靶标哺乳动物细胞结合,从而控制T细胞和/或NK细胞与个体中的靶标哺乳动物
细胞在活体内的结合
[1015] 在另一方面中,本文中提供一种药用试剂以供在用于调节表达受微环境限制的生物嵌合抗原受体(MRB-CAR)的T细胞和/或NK细胞与表达个体中的MRB-CAR的同源抗原的细
胞的结合的方法中使用,以供治疗肿瘤生长,其中该方法包括:
[1016] a.将能够表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞引入至个体中,其中MRB-CAR与表达个体中的同源抗原的细胞结合,其中在引入之后,包括编码MRB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞表达MRB-CAR且与表达个体中的同源抗原的细胞结合;及
[1017] b.向个体施用呈有效量的药用试剂以增加血液pH和/或组织pH和/或微环境pH以调节表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞与表达具有增加的pH的血液、组织或微环境中的同
源抗原的细胞的结合。
[1018] 在另一方面中,本文中提供一种药用试剂以供在用于靶向减轻个体中的肿瘤毒性的方法中使用,其中该方法包括:
[1019] a.将编码受微环境限制的生物嵌合抗原受体(MRB-CAR)的核酸引入至个体的T细胞和/或NK细胞中,以产生能够表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞;
[1020] b.将能够表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞引入至个体中,其中在引入之后,包括编码MRB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞表达MRB-CAR且与表达个体中的同源抗原的细胞
结合;及
[1021] c.向个体施用呈充足量的药用试剂以增加血液pH和/或组织pH和/或微环境pH以调节MRB-CAR与具有增加的pH的血液、组织和/或微环境中的其同源抗原的结合,从而靶向
减轻个体中的肿瘤毒性。
[1022] 在另一方面中,本文中提供一种药用试剂以供在用于控制表达受微环境限制的生物嵌合抗原受体(MRB-CAR)的T细胞和/或NK细胞与靶标哺乳动物细胞的结合的方法中使
用,以供治疗肿瘤生长,其中该方法包括:
[1023] a.使靶标哺乳动物细胞与表达微环境中的MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞接触,其中靶标哺乳动物细胞表达同源抗原,且如相比于在pH 7.4下,T细胞和/或NK细胞表达在pH 
6.7下有差异地与同源抗原结合的MRB-CAR;及
[1024] b.通过将呈充足量的药用试剂引入至微环境来增加微环境的pH,从而控制表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞与靶标哺乳动物细胞的结合。
[1025] 在另一方面中,本文中提供一种药用试剂以供在用于控制表达受微环境限制的生物嵌合抗原受体(MRB-CAR)的T细胞和/或NK细胞与个体中的靶标哺乳动物细胞在活体内的
结合的方法中使用,以供治疗肿瘤生长,其中该药用试剂为pH调节药用试剂,且其中该方法包括经由增加个体内的微环境的pH的有效给药方案向个体施用pH调节药用试剂,其中个体
包括表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞,其中如相比于在pH 7.4下,MRB-CAR在pH 6.7下有
差异地与其同源抗原结合,其中微环境包括靶标哺乳动物细胞,其中靶标哺乳动物细胞在
其表面上表达同源抗原,且其中T细胞和/或NK细胞在增加微环境的pH之前相比于之后有差
异地与靶标哺乳动物细胞结合。
[1026] 在另一方面中,本文中提供一种pH调节药用试剂以供在用于控制表达受微环境限制的生物嵌合抗原受体(MRB-CAR)的T细胞和/或NK细胞与个体中的靶标哺乳动物细胞在活
体内的结合的方法中使用,以供治疗肿瘤生长,其中该方法包括经由增加个体内的微环境
的pH的有效给药方案向个体施用pH调节药用试剂,其中个体包括表达MRB-CAR的T细胞和/
或NK细胞,其中如相比于在pH 7.4下,MRB-CAR在pH 6.7下有差异地与其同源抗原结合,其中微环境包括靶标哺乳动物细胞,其中靶标哺乳动物细胞在其表面上表达同源抗原,且其
中T细胞和/或NK细胞在通过施用pH调节药用试剂增加微环境的pH之前相比于之后有差异
地与靶标哺乳动物细胞结合。
[1027] 在另一方面中,本文中提供一种pH调节药用试剂以供用于制造用于控制表达受微环境限制的生物嵌合抗原受体(MRB-CAR)的T细胞和/或NK细胞与个体中的靶标哺乳动物细
胞在活体内的结合的药剂,其中经由增加个体内的微环境的pH的有效给药方案向个体施用
pH调节药用试剂,其中个体包括表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞,其中如相比于在pH 7.4下,MRB-CAR在pH 6.7下有差异地与其同源抗原结合,其中微环境包括靶标哺乳动物细胞,其中靶标哺乳动物细胞在其表面上表达同源抗原,且其中T细胞和/或NK细胞在通过施用pH
调节药用试剂增加微环境的pH之前相比于之后有差异地与靶标哺乳动物细胞结合。
[1028] 在本文提供的包括用于方法中的pH调节药用试剂或药用试剂及MRB-CAR或包括pH调节药用试剂及MRB-CAR的用途的方面中的任一者中,MRB-CAR可在一个pH下而非不同pH下
减少与其同源抗原的结合。在针对MRB-CAR的差异性结合的说明性pH值未曾提供于广泛方
面中的说明性实施例中及替代地对于代替用于这些方面的那些值的其他实施例,MRB-CAR
可在较高pH下而非较低pH下减少结合。举例而言,MRB-CAR可在高于7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5的pH下而非低于6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0的pH下减少与其同源抗原的结合。
在其他实施例中,MRB-CAR可在较高pH下而非较低pH下减少结合。举例而言,MRB-CAR可在低于6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0的pH下而非高于7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5的pH下减少与其同源抗原的结合。在一些说明性实施例中,相比于在pH 7.4至7.6下,MRB-CAR在6.5至6.7的pH下展现增加的结合。在其他说明性实施例中,相比于在7.4的pH下,MRB-CAR在6.7的pH下展现增加的结合。在其他实施例中,相比于在血液的pH下,MRB-CAR在肿瘤的pH下展现增加的结合。在一些实施例中,MRB-CAR可包括抗原特异性靶向区、柄及胞内活化域。在一些实施例中,MRB-CAR还可包括共刺激域。在一些实施例中,MRB-CAR可与肿瘤相关的抗原结合。
[1029] 在本文提供的包括用于方法中的pH调节药用试剂或药用试剂及MRB-CAR或包括pH调节药用试剂及MRB-CAR的用途的方面中的任一者中,微环境的pH可自低于7.0的pH增加至
高于7.0的pH。举例而言,pH可自低于6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0的pH增加至高于7.0、
7.1、7.2、7.3或7.4的pH。在一些实施例中,MRB-CAR可在引入药用试剂之前在增加的pH下而非微环境的pH下与同源抗原结合。在某些实施例中,pH可自低于7.0增加7.1至8.0的pH、或至7.1至7.8的pH、或至7.2至7.8的pH、或至7.2至7.6的pH、或至7.3至7.6的pH、或至7.4至
7.8的pH、或至7.4至7.6的pH。视施用的药用试剂的类型及剂量而定,此pH的增加可发生少于1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时或24小时,或多于1小时、2小时、4小时、6小时、
8小时、12小时或24小时。在某些实施例中,施用药用试剂,使得pH在靶标组织(诸如肿瘤)中,及例如在靶标组织(例如,肿瘤)微环境的至少一个表面中,在靶标组织(例如,肿瘤)微环境的至少一部分中以及在说明性实施例中在整个靶标组织(例如,肿瘤)微环境中保持高
于7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5;或在7.0、7.1、7.2、7.3的范围的低值端点与7.4、7.5、7.6、
7.7或7.8的范围的高值端点之间。
[1030] 在本文提供的包括用于方法中的pH调节药用试剂或药用试剂及MRB-CAR或包括pH调节药用试剂及MRB-CAR的用途的方面中的任一者中,微环境可为活体内微环境,诸如肿
瘤、组织、非肿瘤组织、正常组织或已经历pH短暂变化的组织。举例而言,通常经历pH短暂变化的组织包括厌氧条件下的肌肉组织或经历锻炼的肌肉组织或已发炎组织或正经历发炎
的组织。在包括靶标哺乳动物细胞的一些实施例中,靶标哺乳动物细胞可为肿瘤细胞或非
肿瘤细胞或正常细胞。
[1031] 在本文提供的包括用于方法中的pH调节药用试剂或药用试剂及MRB-CAR或包括pH调节药用试剂及MRB-CAR的用途的方面中的任一者中,药用试剂可为碳酸氢钠、参(羟甲基)胺基甲烷、碳酸氢钠及碳酸钠的等摩尔高渗溶液或质子泵抑制剂,这些质子泵抑制剂诸如
艾美拉唑、艾美拉唑及萘普生、兰索拉唑、奥美拉唑及雷贝拉唑。
[1032] 在本文提供的包括用于方法中的pH调节药用试剂或药用试剂及MRB-CAR或包括pH调节药用试剂及MRB-CAR的用途的方面中的任一者中,药用试剂可在用于治疗癌症、肿瘤、肿瘤生长或细胞增生性病症的方法中使用。
[1033] 在另一方面中,本文中提供一种含有容器(含有复制缺陷型重组反转录病毒颗粒)及用于治疗肿瘤生长的其使用说明书的试剂盒,其中这些说明书指导用于控制T细胞和/或
NK细胞与靶标哺乳动物细胞的结合的方法,在该方法中包括:
[1034] a.用在其基因组中包括在与pH 7.4相比的pH 6.7下有差异地与同源抗原结合的受微环境限制的嵌合抗原受体(MRB-CAR)的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒来转导T细胞
和/或NK细胞,以产生能够表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞;
[1035] b.将能够表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞引入至个体中,其中在引入之后,包括编码MRB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞表达MRB-CAR且与表达个体中的同源抗原的细胞
结合;
[1036] c.使靶标哺乳动物细胞与微环境中的表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞接触,其中靶标哺乳动物细胞表达MRB-CAR的同源抗原,且T细胞和/或NK细胞表达MRB-CAR;及
[1037] d.通过引入呈充足量的pH调节药用试剂至微环境来增加微环境的pH,从而影响靶标哺乳动物细胞与T细胞和/或NK细胞的结合。
[1038] 在一些实施例中,试剂盒可进一步包括pH调节药用试剂。
[1039] 在试剂盒的一些实施例中,MRB-CAR可在一个pH下而非不同pH下减少与其同源抗原的结合。在针对MRB-CAR的差异性结合的说明性pH值未曾提供于广泛方面中的说明性实
施例中及替代地对于代替用于这些方面的那些值的其他实施例,MRB-CAR可在较高pH下而
非较低pH下减少结合。举例而言,MRB-CAR可在高于7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5的pH下而非低于6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0的pH下减少与其同源抗原的结合。在其他实施例中,MRB-CAR可在较高pH下而非较低pH下减少结合。举例而言,MRB-CAR可在低于6.4、6.5、6.6、
6.7、6.8、6.9或7.0的pH下而非高于7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5的pH下减少与其同源抗原的结合。在一些说明性实施例中,相比于在pH 7.4至7.6下,MRB-CAR在6.5至6.7的pH下展现增加的结合。在其他说明性实施例中,相比于在7.4的pH下,MRB-CAR在6.7的pH下展现增加的结合。在其他实施例中,相比于在血液的pH下,MRB-CAR在肿瘤的pH下展现增加的结合。在一些实施例中,MRB-CAR可包括抗原特异性靶向区、柄及胞内活化域。在一些实施例中,MRB-CAR还可包括共刺激域。在一些实施例中,MRB-CAR可与肿瘤相关的抗原结合。
[1040] 在试剂盒的一些实施例中,微环境的pH可自低于7.0的pH增加至高于7.0的pH。举例而言,pH可自低于6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0的pH增加至高于7.0、7.1、7.2、7.3或
7.4的pH。在一些实施例中,MRB-CAR可在引入药用试剂之前在增加的pH下而非微环境的pH
下与同源抗原结合。在某些实施例中,pH可自低于7.0增加7.1至8.0的pH、或至7.1至7.8的pH、或至7.2至7.8的pH、或至7.2至7.6的pH、或至7.3至7.6的pH、或至7.4至7.8的pH、或至
7.4至7.6的pH。视施用的药用试剂的类型及剂量而定,此pH的增加可发生少于1小时、2小
时、4小时、6小时、8小时、12小时或24小时,或多于1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时或24小时。在某些实施例中,施用药用试剂,使得pH在靶标组织(诸如肿瘤)中,及例如在靶标组织(例如,肿瘤)微环境的至少一个表面中,在靶标组织(例如,肿瘤)微环境的至少一部分中以及在说明性实施例中在整个靶标组织(例如,肿瘤)微环境中保持高于7.0、7.1、
7.2、7.3、7.4或7.5;或在7.0、7.1、7.2、7.3的范围的低值端点与7.4、7.5、7.6、7.7或7.8的范围的高值端点之间。在一些实施例中,微环境可为活体内微环境,诸如肿瘤、组织、非肿瘤组织、正常组织或已经历pH短暂变化的组织。举例而言,通常经历pH短暂变化的组织包括厌氧条件中的肌肉组织或经历锻炼的肌肉组织或已发炎组织或正经历发炎的组织。在包括靶
标哺乳动物细胞的一些实施例中,靶标哺乳动物细胞可为肿瘤细胞或非肿瘤细胞或正常细
胞。
[1041] 在试剂盒的一些实施例中,药用试剂可为碳酸氢钠、参(羟甲基)胺基甲烷、碳酸氢钠及碳酸钠的等摩尔高渗溶液或质子泵抑制剂,这些质子泵抑制剂诸如艾美拉唑、艾美拉唑及萘普生、兰索拉唑、奥美拉唑及雷贝拉唑。
[1042] 在一个方面中,本文中提供一种在其基因组中包含多核苷酸的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子
的一种或多种核酸序列,其中:
[1043] a.一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如,两个或更多个)抑制性RNA分子,及
[1044] b.该一种或多种核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR),该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。
[1045] 在本文中的另一方面中提供一种包含复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的可包装RNA基因组的哺乳动物包装细胞系,其中该可包装RNA基因组包含:
[1046] a.5’长末端重复或其活化片段;
[1047] b.核酸序列,其编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件;
[1048] c.多核苷酸,其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列,其中一种或多种核酸的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标
的一个或多个(例如,两个或更多个)抑制性RNA分子,且一种或多种核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR),该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域;及
[1049] d.3’长末端重复或其活化片段。
[1050] 在哺乳动物包装细胞系方面的一些实施例中,(c)的多核苷酸可在与编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件(b)、5’长末端重复(a)和/或3’长末端重复(d)的核酸序列呈相反定向。
[1051] 在哺乳动物包装细胞系方面的一些实施例中,可包装RNA基因组的表达通过在哺乳动物包装细胞系中具有活性的可诱导启动子驱动。
[1052] 在哺乳动物包装细胞系方面的一些实施例中,反转录病毒顺式作用RNA包装组件可包含中央聚嘌呤段(cPPT)/中央终止序列、HIV Psi或其组合。
[1053] 本文中的另一方面提供一种反转录病毒载体,其包含针对复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的可包装RNA基因组,其中该可包装RNA基因组包含:
[1054] a.5’长末端重复或其活化片段;
[1055] b.核酸序列,其编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件;
[1056] c.多核苷酸,其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列,其中一种或多种核酸的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标
的一个或多个(例如,两个或更多个)抑制性RNA分子,且一种或多种核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR),该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域;及
[1057] d.3’长末端重复或其活化片段。
[1058] 在反转录病毒载体方面的一些实施例中,(c)的多核苷酸可在与编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件的核酸序列(b)、5’长末端重复(a)和/或3’长末端重复(d)相反的取向中。
[1059] 在反转录病毒载体方面的一些实施例中,可包装RNA基因组的表达是由在哺乳动物包装细胞系中具有活性的可诱导启动子驱动。
[1060] 在反转录病毒载体方面的一些实施例中,反转录病毒顺式作用RNA包装组件可包含中央聚嘌呤段(cPPT)/中央终止序列、HIV Psi或其组合。反转录病毒载体可视情况包括
抗生素抗性基因和/或可检测标记。
[1061] 在另一方面中,本文提供一种用于以基因方式修饰或转导个体的淋巴细胞(例如,T细胞和/或NK细胞)或其群的方法,该方法包含使个体的淋巴细胞(例如,T细胞和/或NK细
胞)或其群活体外与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触,该复制缺陷型重组反转录病毒
颗粒在其基因组中包含多核苷酸,该多核苷酸包含可操作地连接至在淋巴细胞(例如,T细
胞和/或NK细胞)中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列,其中该一种或多种核酸序列
的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如,两个或更多个)抑制性
RNA分子,且该一种或多种核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR),该嵌合抗原
受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域,其中该接触有助于利用复制缺
陷型重组反转录病毒颗粒基因修饰和/或转导淋巴细胞(例如,T细胞和/或NK细胞)或淋巴
细胞(例如,T细胞和/或NK细胞)中的至少一些,从而产生经基因方式修饰和/或转导的淋巴细胞(例如,T细胞和/或NK细胞)。
[1062] 在紧接着上文提供的方法的一些实施例中,将经基因方式修饰和/或转导的淋巴细胞(例如,T细胞和/或NK细胞)或其群引入至个体中。在一些实施例中,经基因方式修饰
和/或转导的淋巴细胞(例如,T细胞和/或NK细胞)或其群体在被引入或再次引入至个体中
之前活体外经历4次或更少细胞分裂。在一些实施例中,淋巴细胞为与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触1小时与12小时之间的静息T细胞和/或静息NK细胞。在一些实施例中,自个体收集血液的时间与将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞再引入至个体中的时间之间
不超过8小时。在一些实施例中,在收集血液之后及再引入血液之前的所有步骤均在封闭系统中进行,在整个处理期间人监测该封闭系统。
[1063] 在另一方面中,本文中提供一种经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞,其包含:
[1064] a.针对一个或多个RNA靶标一个或多个(例如,两个或更多个)抑制性RNA分子;及
[1065] b.嵌合抗原受体(CAR),其包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域,其中该一个或多个(例如,两个或更多个)抑制性RNA分子及CAR由T细胞和/或NK细胞的基因
修饰的核酸序列编码。
[1066] 在经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞方面的一些实施例中,经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞还包含不为抑制性RNA分子的至少一个淋巴增生性组件,其中该淋巴增
生性组件由T细胞和/或NK细胞的基因修饰的核酸编码。在一些实施例中,抑制性RNA分子、CAR和/或至少一个淋巴增生性组件以多顺反子物质表达。在说明性实施例中,抑制性RNA分子由单个多顺反子转录物表达。
[1067] 在另一方面中本文提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒以供在用于以基因方式修饰个体的淋巴细胞的方法中使用,以供治疗肿瘤生长,其中复制缺陷型重组反转录
病毒颗粒在其基因组中包含多核苷酸,该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细
胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列,其中一种或多种核酸序列的第一核酸序列
编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如,两个或更多个)抑制性RNA分子,且一种
或多种核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR),该嵌合抗原受体包含抗原特异
性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域,其中该方法包含活体外接触个体的T细胞和/或NK
细胞,且该接触有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞中
的至少一些,从而产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞。
[1068] 在紧接着上文提供的用于以基因方式修饰个体方面的淋巴细胞的方法中,在一些实施例中,将药用试剂用于该方法中,其进一步包括将经基因方式工程化的T细胞和/或NK
细胞引入至个体中。
[1069] 在另一方面中本文提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒以供在用于以基因方式修饰个体的T细胞和/或NK细胞的方法中使用,以供治疗肿瘤生长,其中该方法包含:
[1070] a.使个体的T细胞和/或NK细胞活体外与在其基因组中包含多核苷酸的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触,该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有
活性的启动子的一种或多种核酸序列,其中一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码针对
一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如,两个或更多个)抑制性RNA分子,且一种或多种核
酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR),该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区
(ASTR)、跨膜域及胞内活化域,其中该接触有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转
导静息T细胞和/或NK细胞中的至少一些,从而产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞;

[1071] b.将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞引入至个体中,从而以基因方式修饰个体的T细胞和/或NK细胞。
[1072] 在紧接着上文提供的方面中,在一些实施例中,T细胞和/或NK细胞的群体在接触步骤中接触,且在引入步骤中引入至个体中。
[1073] 在另一方面中本文提供复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在制造用于以基因方式修饰个体的T细胞和/或NK细胞的试剂盒中的用途,其中该试剂盒的用途包含:
[1074] 1.使个体的T细胞和/或NK细胞活体外与在其基因组中包含多核苷酸的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触,该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有
活性的启动子的一种或多种核酸序列,其中一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码针对
一个或多个靶标的一个或多个(例如,两个或更多个)抑制性RNA分子,且一种或多种核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR),该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区
(ASTR)、跨膜域及胞内活化域,其中该接触有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转
导静息T细胞和/或NK细胞中的至少一些,从而产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞;

[1075] 2.将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞引入至个体中,从而以基因方式修饰个体的T细胞和/或NK细胞。
[1076] 在另一方面中本文提供复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在制造用于以基因方式修饰个体的T细胞和/或NK细胞的药剂中的用途,其中该药剂的用途包含:
[1077] A)使个体的T细胞和/或NK细胞活体外与在其基因组中包含多核苷酸的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触,该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有
活性的启动子的一种或多种核酸序列,其中一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码针对
一个或多个靶标的一个或多个(例如,两个或更多个)抑制性RNA分子,且一种或多种核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR),该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区
(ASTR)、跨膜域及胞内活化域,其中该接触有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转
导静息T细胞和/或NK细胞中的至少一些,从而产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞;

[1078] B)将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞引入至个体中,从而以基因方式修饰个体的T细胞和/或NK细胞。
[1079] 在另一方面中本文提供一种含有复制缺陷型重组反转录病毒颗粒及用以以治疗个体中的肿瘤生长的其使用说明书的商用容器,其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其
基因组中包含多核苷酸,该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性
的启动子的一种或多种核酸序列,其中一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码针对一个
或多个RNA靶标的一个或多个(例如,两个或更多个)抑制性RNA分子,且一种或多种核酸序
列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR),该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区
(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。
[1080] 在一些实施例中,在商用容器的方面中,该说明书指导使用者活体外接触个体的T细胞和/或NK细胞,以有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导个体的至少一个静
息T细胞和/或NK细胞,从而产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞。
[1081] 在本文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方面中的任一者中,其中一种或多种核酸序列的第
一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如,两个或更多个)抑制性RNA分
子,且一种或多种核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR),该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域,该多核苷酸可进一步包括第三核酸序列,该第三核酸序列编码不为抑制性RNA分子的至少一个淋巴增生性组件。在一些实施例中,淋巴增生性组件可为细胞因子或细胞因子受体多肽,或其包含信号传导域的片段。在一些实
施例中,淋巴增生性组件为组成性活性。在某些实施例中,淋巴增生性组件可为IL-7受体或其片段。在说明性实施例中,淋巴增生性组件可为组成性活性IL-7受体或其组成性活性片
段。
[1082] 在本文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方面中的任一者中,其中一种或多种核酸序列的第
一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如,两个或更多个)抑制性RNA分
子,抑制性RNA分子在一些实施例中可包括与彼此部分或完全互补的5’链及3’链,其中该5’链及该3’链能够形成18至25个核苷酸RNA双螺旋。在一些实施例中,5’链长度可为18、19、
20、21、22、23、24或25个核苷酸,且3’链长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施例中,5’链及3’链长度可相同或不同。在一些实施例中,RNA双螺旋可包括一个或多个错配。在替代实施例中,RNA双螺旋不具有错配。
[1083] 在本文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方面中的任一者中,其中一种或多种核酸序列的第
一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如,两个或更多个)抑制性RNA分
子,抑制性RNA分子可为miRNA或shRNA。在一些实施例中,抑制性分子可为miRNA的前体,诸如Pri-miRNA或前miRNA,或shRNA的前体。在一些实施例中,抑制性分子可为人工衍生的
miRNA或shRNA。在其他实施例中,抑制性RNA分子可为经处理成siRNA的dsRNA(经转录或人
工引入)或siRNA本身。在一些实施例中,抑制性RNA分子可为miRNA或shRNA,其具有在自然界中未发现的序列,或具有在自然界中未发现的至少一个功能性区段,或具有在自然界中
未发现的功能性区段的组合。在说明性实施例中,抑制性RNA分子中的至少一者或全部为
miR-155。
[1084] 在本文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方面中的任一者中,其中一种或多种核酸序列的第
一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如,两个或更多个)抑制性RNA分
子,在一些实施例中,抑制性RNA分子可自5’至3’取向包含:5’臂、5’茎、环、与该5’茎部分或完全互补的3’茎,及3’臂。在一些实施例中,两个或更多个抑制性RNA分子中的至少一者具有此排列。在其他实施例中,两个或更多个抑制性RNA分子的全部均具有此排列。在一些实施例中,5’茎长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施例中,3’茎长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施例中,环长度可为3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、
36、37、38、39或40个核苷酸。在一些实施例中,5’臂、3’臂或两者均衍生自天然存在的miRNA。在一些实施例中,5’臂、3’臂或两者均衍生自天然存在的miRNA,该天然存在的miRNA选自以下组成的群:miR-155、miR-30、miR-17-92、miR-122及miR-21。在说明性实施例中,5’臂、3’臂或两者衍生自miR-155。在一些实施例中,5’臂、3’臂或两者衍生自小家鼠(Mus musculus)miR-155或智人(Homo sapiens)miR-155。在一些实施例中,5’臂具有阐述于SEQ ID NO:256中的序列或为其功能性变体,诸如长度与SEQ ID NO:256相同,或SEQ ID NO:256长度的95%、90%、85%、80%、75%或50%或为100个核苷酸或更少、95个核苷酸或更少、90个核苷酸或更少、85个核苷酸或更少、80个核苷酸或更少、75个核苷酸或更少、70个核苷酸或更少、65个核苷酸或更少、60个核苷酸或更少、55个核苷酸或更少、50个核苷酸或更少、45个核苷酸或更少、40个核苷酸或更少、35个核苷酸或更少、30个核苷酸或更少或25个核苷酸或更少的序列;且至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%与SEQ ID NO:256一致。在一些实施例中,3’臂具有阐述于SEQ ID NO:260中的序列或为其功能性变
体,诸如长度与SEQ ID NO:260相同,或SEQ ID NO:260长度的95%、90%、85%、80%、75%或50%或为100个核苷酸或更少、95个核苷酸或更少、90个核苷酸或更少、85个核苷酸或更少、80个核苷酸或更少、75个核苷酸或更少、70个核苷酸或更少、65个核苷酸或更少、60个核苷酸或更少、55个核苷酸或更少、50个核苷酸或更少、45个核苷酸或更少、40个核苷酸或更少、35个核苷酸或更少、30个核苷酸或更少或25个核苷酸或更少的序列;且至少50%、55%、
60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%与SEQ ID NO:260一致。在一些实施例中,3’臂包含小家鼠BIC的核苷酸221至283。
[1085] 在本文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方面中的任一者中,其中一种或多种核酸序列的第
一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的两个或更多个抑制性RNA分子,在一些实施例
中,两个或更多个抑制性RNA分子可连续地定位于第一核酸序列中。在一些实施例中,抑制性RNA分子可利用非功能性接头序列直接地或间接地与彼此邻接。在一些实施例中,接头序列长度可在5个与120个核苷酸之间,或长度在10个与40个核苷酸之间。
[1086] 在本文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方面中的任一者中,其中一种或多种核酸序列的第
一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的两个或更多个抑制性RNA分子,在一些实施例
中,第一核酸序列编码两个至四个抑制性RNA分子。在说明性实施例中,第一核酸序列中包括2个与10个之间、2个与8个之间、2个与6个之间、2个与5个之间、2个与4个之间、3个与5个之间或3个与6个之间的抑制性RNA分子。在一说明性实施例中,第一核酸序列中包括四个抑制性RNA分子。
[1087] 在本文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方面中的任一者中,其中一种或多种核酸序列的第
一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如,两个或更多个)抑制性RNA分
子,该一个或多个(例如,两个或更多个)抑制性RNA分子可在内含子中。在一些实施例中,内含子在启动子中。在说明性实施例中,内含子为EF-1α内含子A。在一些实施例中,内含子邻近启动子且在启动子的下游,在说明性实施例中,该内含子在用于产生复制缺陷型重组反
转录病毒颗粒的包装细胞中为无活性的。
[1088] 在本文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方面中的任一者中,其中一种或多种核酸序列的第
一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的两个或更多个抑制性RNA分子,在一些实施例
中,该两个或更多个抑制性RNA分子可针对不同靶标。在一替代实施例中,两个或更多个抑制性RNA分子针对同一靶标。在一些实施例中,RNA靶标为自由T细胞表达的基因转录的
mRNA,这些mRNA诸如(但不限于):PD-1(防止失活);CTLA4(防止失活);TCRa(安全地防止自体免疫);TCRb(安全-防止自体免疫);CD3Z(安全-防止自体免疫);SOCS1(防止失活);SMAD2(防止失活);miR-155靶标(促进活化);IFNγ(减少CRS);cCBL(延长信号传导);TRAIL2(防止死亡);PP2A(延长信号传导);ABCG1(通过限制胆固醇的清除来增加胆固醇微含量)。在一些实施例中,RNA靶标为自编码T细胞受体(TCR)复合物的组分的基因转录的mRNA。在一些实施例中,两个或更多个抑制性RNA分子中的至少一者可减少T细胞受体(在说明性实施例中,T细胞的一个或多个内源性T细胞受体)的表达。在某些实施例中,RNA靶标可为自T细胞的内源性TCRα或TCRβ基因转录的mRNA,该T细胞的基因组包含编码一个或多个miRNA的第一核酸序列。在说明性实施例中,RNA靶标为自TCRα基因转录的mRNA。
[1089] 在本文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方面中的任一者中,其中一种或多种核酸序列的第
一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如,两个或更多个)抑制性RNA分
子,且一种或多种核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR),该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域,在一些实施例中,CAR为受微环境限制的生物(MRB)-CAR。在其他实施例中,CAR的ASTR与肿瘤相关的抗原结合。在其他实施例中,CAR的ASTR为微环境受限的生物(MRB)-ASTR。
[1090] 在本文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方面中的任一者中,其中一种或多种核酸序列的第
一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如,两个或更多个)抑制性RNA分
子,且一种或多种核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR),该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域,且在一些情况下,编码至少一个淋巴增生性组件的一种或多种核酸序列的第三核酸序列不为抑制性RNA分子,在一些实施例中,第一核酸序列、第二核酸序列及第三核酸序列中的任一者或全部可操作地连接至核糖开关。在
一些实施例中,核糖开关能够结合核苷类似物。在一些实施例中,核苷类似物为抗病毒药
物。
[1091] 在本文提供的包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方面中的任一者中,在一些实施例中,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上的假型组件,该假型组件能够
与T细胞和/或NK细胞结合且有助于与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒膜融合。在一些实施
例中,假型组件可为麻疹病毒F多肽、麻疹病毒H多肽、VSV-G多肽,或保留与静息T细胞和/或静息NK细胞结合的能力的任何其片段。在说明性实施例中,假型组件为VSV-G。
[1092] 在本文提供的包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方面中的任一者中,在一些实施例中,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上的活化组件,该活化组件包含
能够与CD3结合的膜结合多肽,和/或能够与CD28结合的膜结合多肽。在一些实施例中,能够与CD3结合的膜结合多肽与异源性GPI锚定连接序列融合,和/或能够与CD28结合的膜结合
多肽与异源性GPI锚定连接序列融合。在一些实施例中,能够与CD3结合的膜结合多肽为抗
CD3 scFV或抗CD3 scFvFc。在说明性实施例中,能够与CD3结合的膜结合多肽为抗CD3 
scFvFc。在说明性实施例中,能够与CD28结合的膜结合多肽为CD80,或与CD16B GPI锚定连接序列结合的其胞外细胞域。
[1093] 在本文提供的包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方面中的任一者中,在一些实施例中,复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其表面上包含核酸,该核酸编码由经生物验
证的单克隆抗体识别的域。
[1094] 在下文提供的包括促进PBMC(例如B细胞、T细胞和/或NK细胞)的细胞增生的嵌合多肽的方面中,嵌合多肽可在本文中称为嵌合淋巴增生性组件(CLE)。在下文中提供的包括编码CLE及CAR的核酸序列的实施例在本文中称为CLE CAR多核苷酸实施例。
[1095] 在本文中提供的包括淋巴增生性组件的方面及实施例中的任一者的实施例及子实施例(包括在本节上述段落中的那些)中,淋巴增生性组件可为本文中提供的嵌合淋巴增
生性组件中的任一者,包括在本节的下文中。在本文中的包括CAR的方面及实施例中的任一者的其他实施例及子实施例中,淋巴增生性组件在说明性实施例中为由本文所提供的CLE 
CAR多核苷酸(及相关多肽)实施例中的核酸编码的嵌合淋巴增生性组件中的任一者,例如
在本节的下文中所阐述。
[1096] 在一个方面中,本文提供包含一种或多种核酸序列的经分离的多核苷酸,其中:
[1097] 该一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码在胺基至羧基取向中包含以下的嵌合多肽,
[1098] a)来自细胞因子受体或激素受体的胞外域及跨膜域,其中胞外域及跨膜域中的至少一者包含
[1099] a在细胞因子受体的组成性活性突变体上发现的突变,且其中胞外序列不结合细胞因子受体的配位体,或
[1100] b来自LMP1的胞外域及跨膜域;及
[1101] b)第一胞内域,其选自具有在表7-10中识别的所选多肽的第一胞内域的基因的胞内域,其中该嵌合多肽促进B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生。
[1102] 在紧接着上文段落中的方面的一个实施例中,第一核酸序列进一步编码第二胞内域,其中该第二胞内域可在第一胞内域的上游(亦即5’)处,或在说明性实施例中第二胞内域在第一胞内域的下游处。在此实施例的子实施例中,第一胞内域及第二胞内域组合包含
所选择多肽的第一胞内域及第二胞内域组合。因此,为了清楚起见,在非限制例示性实施例中,所选择的多肽为M008-S212-S075。在此实施例中,嵌合多肽的第一胞内域包含或即为
TNFRSF8转录变体1(NM_001243_4)(S212)且第二多肽包含或即为FCGR2C(NM_201563_5)
(S075)。
[1103] 在此方面的一个实施例中,嵌合多肽包含所选择多肽的跨膜域、第一胞内域及第二胞内域。在此方面的一个实施例中,嵌合多肽包含所选择多肽的胞外域及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域。因此,为了清楚起见,在非限制例示性实施例中,所选择的多肽为M008-S212-S075。在此实施例中,嵌合多肽的胞外域及跨膜域包含或即为Myc LMP1(NC_007605_
1)(M008),嵌合多肽的第一胞内域包含或即为TNFRSF8转录变体1(NM_001243_4)(S212),且嵌合多肽的第二胞内域包含或即为FCGR2C(NM_201563_5)(S075)。在一相关子实施例中,嵌合多肽包含所选择多肽的胞外及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域,除了胞外域及跨膜域
视情况包含识别域或消除域,或不包含识别域或消除域。在一相关子实施例中,嵌合多肽包含所选择多肽的胞外域及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域,除了胞外域及跨膜域以外包
含所选择多肽的识别或消除域,或另一清除标签。在上述段落中提供的方面的另一实施例
中,第一胞内域及第二胞内域组合包含所选择多肽的第一胞内域及在表7-10中的任何候选
多肽的第二胞内域中识别的任何基因的任何胞内域。
[1104] 在此方面的另一实施例中,多核苷酸进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列,该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。在此方面的一子实施例中,第一胞内域及第二胞内域组合为所选择多肽的第一胞内域及第二胞内域
组合,且所选择多肽经识别在表7-10中。在此实施例的另一子实施例中,嵌合多肽包含所选择多肽的胞外域及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域,且所选择多肽识别在表7-10中。在一相关子实施例中,嵌合多肽包含所选择多肽的胞外域及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域,除了胞外域及跨膜域视情况包含识别或消除域,且其中该识别或消除域为所选择多肽的胞
外域的识别或消除域,或其他识别或消除域,且其中所选择多肽经识别在表7-10中。
[1105] 在另一方面中,本文提供包含一种或多种核酸序列的经分离多核苷酸,其中:
[1106] 该一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码在胺基至羧基取向中包含以下的嵌合多肽,
[1107] a)来自细胞因子受体或激素的胞外域及跨膜域,其中胞外域及跨膜域中的至少一者包含
[1108] c在细胞因子受体的组成性活性突变体上发现的突变,且其中胞外序列不结合细胞因子受体的配位体,或
[1109] d来自LMP1的胞外域及跨膜域;及
[1110] b)第一胞内域,其选自CD3D、CD3E、CD8A、CD27、CD40、CD79B、IFNAR1、IL2RA、IL3RA、IL13RA2、TNFRSF8、TNFRSF9、IL31RA或MyD88的胞内域,其中该嵌合多肽促进PBMC,在说明性实施例中B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生。
[1111] 在紧接着上文段落中的方面的一个实施例中,第一核酸序列进一步编码第二胞内域,其中该第二胞内域可在第一胞内域的上游(亦即5’)处,或在说明性实施例中第二胞内域在第一胞内域的下游处。在此实施例的一子实施例中,第二胞内域来自在实施例17的任
一表中识别为在第35天对比第7天产生高于0、1或2的富集的所选择多肽中的第二胞内域的
基因,其中该第一胞内域来自所选择多肽的第一胞内域的基因。在此子实施例或实施例的
另一子实施例中,第一胞内域及第二胞内域组合为来自在实施例17的任一表中识别为在第
35天对比第7天产生高于0、1或2的富集的所选择多肽的第一胞内域及第二胞内域。在此段
落中的实施例或子实施例的另一实施例中,第一胞内域来自表7-10中所选择多肽的所选择
第一胞内域的第一基因且第二胞内域来自所选择多肽的所选择第二胞内域的第二基因。在
此段落中的实施例或子实施例的另一实施例中,第一胞内域来自表7-10中的所选择多肽且
第二胞内域来自标7-10中的所选择多肽。
[1112] 在其中第一核酸序列进一步编码第二胞内域的紧接着上文实施例的另一子实施例中,第二胞内域选自在实施例17中的任一表中识别为针对相应的第一胞内域在第35天对
比第7天产生高于0、1或2的富集的第二胞内域。在这些实施例的子实施例中,第一胞内域选自CD27、CD40或CD79B的胞内域。在此实施例的其他子实施例中,第一胞内域选自在实施例
17的任一表中识别为在第35天对比第7天产生高于0、1或2的富集的CD3D、CD3E、CD8A、CD27、CD40、CD79B、IFNAR1、IL2RA、IL3RA、IL13RA2、TNFRSF8、TNFRSF9、IL31RA或MyD88的胞内域。
在此段落中的实施例或子实施例的另一实施例中,第一胞内域来自表7-10中所选择的嵌合
多肽的第一基因且第二胞内域来自表7-10中所选择的嵌合多肽的第二基因。在此段落中的
实施例或子实施例的另一实施例中,第一胞内域来自表7-10中所选择嵌合多肽的第一基因
且第二胞内域来自CD3D、CD3G、CD8A、CD8B、CD27、CD40、CD79B、CRLF2、FCGR2C、ICOS、IL2RA、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、TNFRSF9及TNFRSF18的胞内域。在此段落中的实施例或子实施例的另一实施例中,第一胞内域来自在表7-10中识别的所选择多肽且第二胞内域来自在表7-
10中识别的所选择多肽。在一相关子实施例中,嵌合多肽包含所选择多肽的胞外域及跨膜
域、第一胞内域及第二胞内域,除了胞外域及跨膜域视情况包含清除标签,或不包含清除标签,且其中所选择多肽识别在表7-10中。在一相关子实施例中,嵌合多肽包含所选择多肽的胞外域及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域,除了胞外域及跨膜域包含所选择多肽的识别
或消除域,或其他识别或消除域,且其中所选择多肽识别在表7-10中。
[1113] 在此方面的另一实施例中,第一胞内域选择CD3D、CD3E、CD8A、CD27、CD40、CD79B、IFNAR1、IL2RA、IL3RA、IL13RA2、TNFRSF8或TNFRSF9的胞内域,多核苷酸进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列,该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。在此方面的一子实施例中,第一胞内域来自所选择多肽的第一胞内域的基因且第二胞内域来自所选择多肽的第二胞内域的基因,且所选择多肽经识别在表7-10中。
在此方面的一子实施例中,第一胞内域及第二胞内域组合为所选择多肽的第一胞内域及第
二胞内域组合,且所选择多肽经识别在表7-10中。在此实施例的一子实施例中,嵌合多肽包含所选择多肽的胞外域及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域,且所选择多肽经识别在表7-
10中。在一相关子实施例中,嵌合多肽包含所选择多肽的胞外及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域,除了胞外域及跨膜域视情况包含识别或消除域,且其中该识别或消除域为所选择
多肽的胞外域的识别或消除域,或其他识别或消除域,且其中所选择多肽经识别在表7-10
中。
[1114] 在另一方面中,本文提供包含一种或多种核酸序列的经分离多核苷酸,其中:
[1115] 该一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码在胺基至羧基取向中包含以下的嵌合多肽,
[1116] (a)来自细胞因子受体或激素的胞外域及跨膜域,其中胞外域及跨膜域中的至少一者包含
[1117] i.在细胞因子受体的组成性活性突变体上发现的突变,且其中胞外序列不结合细胞因子受体的配位体,或
[1118] ii.来自LMP1的胞外域及跨膜域;及
[1119] (b)第一胞内域,其选自CD3D、CD3G、CD8A、CD8B、CD27、CD40、CD79B、CRLF2、FCGR2C、ICOS、IL2RA、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、TNFRSF9及TNFRSF18的胞内域,其中该嵌合多肽促进PBMC,且在说明性实施例中B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生。
[1120] 在实施例17中,在紧接着上述方面中所述的胞内域识别为值得注意的第二胞内域。然而应当理解,在一些实施例中,识别为值得注意的第二胞内域的胞内域为这些实施例的嵌合多肽的第一胞内域。
[1121] 在另一方面中,本文提供包含一种或多种核酸序列的经分离多核苷酸,其中:
[1122] 该一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码在胺基至羧基取向中包含以下的嵌合多肽,
[1123] a)来自细胞因子受体或激素的胞外域及跨膜域,其中胞外域及跨膜域中的至少一者包含
[1124] a.在细胞因子受体的组成性活性突变体上发现的突变,且其中胞外序列不结合细胞因子受体的配位体,或
[1125] b.来自LMP1的胞外域及跨膜域;及
[1126] b)第一胞内域,其选自CD3D、CD3E、CD8A、CD27、CD40、CD79B、IFNAR1、IL2RA、IL3RA、IL13RA2、TNFRSF8、TNFRSF9、IL31RA或MyD88的胞内域,
[1127] 其中该嵌合多肽促进PBMC,且在说明性实施例中B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生,且其中胞外域及跨膜域选自IL7RA Ins PPCL、LMP1、CRLF2 F232C、CSF2RB V449E、CSF3R T640N、EPOR L251C I252C、GHR E260C I270C、IL27RA F523C及MPL S505N的胞外域及跨膜域。
[1128] 在上述关于编码嵌合多肽的多核苷酸的方面中的任一者的某些实施例中,其中该嵌合多肽促进PBMC,且在说明性实施例中B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生,胞外域及跨膜域选自CSF3R T640N及MPL S505N。在说明性实施例中,胞外域及跨膜域来自CSF3R 
T640N且在某些实施例中,分离的多核苷酸不包含CAR。在某些子实施例中,胞外域及跨膜域为表6中所提供的CSF3R T640N,但识别域及消除域为可选的。在某些实施例中,第一胞内域及第二胞内域来自本文中的包括所述胞内域及胞外域及所述第一胞内域的实施例17及表
中所提供的多肽中的任一者。在其他子实施例中,胞外域及胞内域来自MPL S505N,且在某些实施例中,表6中提供的MPL S505N的除识别域及消除域以外的胞外域及跨膜域为可选
的。
[1129] 在另一方面中,本文提供包含一种或多种核酸序列的经分离多核苷酸,其中:
[1130] 该一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码在胺基至羧基取向中包含以下的嵌合多肽,
[1131] a)来自I型跨膜蛋白的跨膜域;及
[1132] b)第一胞内域,其选自具有在表11-16中识别的所选择多肽的第一胞内域的基因的胞内域,其中该嵌合多肽促进B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生
[1133] 且在说明性实施例中B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生。
[1134] 其中该嵌合多肽促进PBMC,且在说明性实施例中B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生。如附加实施例18中所示,此类嵌合多肽能够在培养期间在PBMC不暴露于IL-2的情况
下,例如在不添加IL-2至表达编码嵌合多肽的核酸的PBMC培养培养基(例如B细胞、T细胞
和/或NK细胞)中的情况下促进PBMC的细胞增生。
[1135] 在紧接着上文段落中的方面的一个实施例及在下文本节中的此方面的任何实施例中,第一胞内域为具有表11-16中的第一胞内域的基因的胞内域,且在其他说明性实施例中,第一50、25或10构建体中的一者列于表11-16中,且在其他说明性实施例中,第一50、25或10构建体中的一者列于表11-16中的六个表中的两者、三者、四者或五者中,或全部表中。
在一个实施例中,第一胞内域为在表17中识别的胞内域。表17识别在第7天与第21天或第35天之间促进PBMC的增生的构建体,其中第二胞内域不存在于该构建体中。在此实施例的一
些实施例中,嵌合多肽包含跨膜域及胞内域的组合,具有或不具有包含表17的二聚基元的
胞外域。
[1136] 在紧接着上文段落中的方面的一个实施例及在下文本节中的此方面的任何实施例中,第一核酸序列进一步编码胞外域,且在说明性实施例中,该胞外域包含二聚基元。在其中CLE的胞外域包含二聚基元的任何方面或实施例中,二聚基元可选自由以下组成的群:
含亮氨酸拉链基元的多肽、CD69、CD71、CD72、CD96、Cd105、Cd161、Cd162、Cd249、CD271及Cd324,以及其保留二聚能力的突变体和/或活性片段。在其中CLE的胞外域包含二聚基元的方面或实施例中的任一者中,二聚基元可需要二聚剂,且二聚基元及相关二聚剂可选自由
以下组成的群:FKBP及雷帕霉素或其类似物、GyrB及香豆霉素或其类似物、DHFR及甲胺喋呤或其类似物或DmrB及AP20187或其类似物,以及保留二聚能力的所述二聚蛋白的突变体和/
或活性片段。
[1137] 在其中CLE的胞外域包含二聚基元的任何方面或实施例的说明性实施例中,胞外域可包含亮氨酸拉链基元。在一些实施例中,亮氨酸拉链基元来自jun多肽,例如c-jun。在某些实施例中,c-jun多肽为ECD-11的c-jun多肽区。[867]在此方面的一个实施例中,第一核酸序列进一步编码第二胞内域,其中该第二胞内域可在第一胞内域的上游(亦即5’)处,或在说明性实施例中第二胞内域在第一胞内域的下游处。在此实施例的子实施例中,第一
胞内域及第二胞内域组合包含所选择多肽的第一胞内域及在表11-16中的任何候选多肽的
第二胞内域中识别的任何基因的任何胞内域,且在表11-16中的说明性实施例中,及在其他实施例中,第一50、25或10构建体的一者列于表11-16中,且在其他说明性实施例中,第一
50、25或10构建体的一者列于表11-16中的表的两者、三者、四者或五者,或全部表中。在此实施例的子实施例中,第一胞内域及第二胞内域组合包含所选择多肽的第一胞内域及第二
胞内域。
[1138] 在此方面的一个实施例中,嵌合多肽包含所选择多肽的跨膜域、第一胞内域及第二胞内域。在此方面的一个实施例中,嵌合多肽包含所选择多肽的胞外及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域,其中该胞外域视情况包含识别域或消除域。
[1139] 在一相关子实施例中,嵌合多肽包含所选择多肽的胞外及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域,除了胞外域及跨膜域视情况包含识别域或消除域,或不包含识别域或消除域。
在一相关子实施例中,嵌合多肽包含所选择多肽的胞外及跨膜域、第一胞内域及第二胞内
域,除了胞外域及跨膜域视情况包含所选择多肽的识别域或消除域,或另一识别域或消除
域。
[1140] 在此方面的另一实施例中,多核苷酸进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列,该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。在此方面的子实施例中,第一胞内域及第二胞内域组合为所选择多肽的第一胞内域及第二胞内域组
合,且所选择多肽识别在表11-16中,且在其他实施例中,第一50、25或10构建体中的一者列于表11-16中,且在其他实施例中,第一50、25或10构建体中的一者列于表11-16中的表中的两者、三者、四者或五者,或全部表中。在此实施例的另一实施例中,嵌合多肽包含所选择多肽的胞外域及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域,且所选择多肽识别在表11-16中,或在说明性实施例中,第一50、25或10构建体中的一者列于表11-16中,在其他实施例中,第一50、
25或10构建体中的一者列于表11-16中的表的两者、三者、四者或五者,或全部表中。在一相关子实施例中,嵌合多肽包含所选择多肽的胞外域及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域,除了胞外域及跨膜域视情况包含识别域或消除域,且其中该识别域或消除域为所选择多肽的
胞外域的识别域或消除域,或另一识别域或消除域,且其中所选择多肽识别在表11-16中。
[1141] 在另一方面中,本文提供包含一种或多种核酸序列的经分离多核苷酸,其中:
[1142] 该一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码在胺基至羧基取向中包含以下的嵌合多肽,
[1143] a)来自I型跨膜蛋白的跨膜域;及
[1144] b)第一胞内域,其选自LEPR、MYD88、IFNAR2、MPL、IL18R1、IL13RA2、IL10RB、IL23R或CSF2RA的胞内域,
[1145] 其中该嵌合多肽促进PBMC,且在说明实施例中,B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生。
[1146] 在紧接着上文段落中的方面的一个实施例及在下文本节中的此方面的任何实施例中,第一核酸序列进一步编码胞外域,且在说明性实施例中,该胞外域包含二聚基元。在此方面的说明性实施例中,胞外域包含亮氨酸拉链。在一些实施例中,亮氨酸拉链来自jun多肽,例如c-jun。在某些实施例中,c-jun多肽为ECD-11的c-jun多肽区。
[1147] 在其中第一胞内域选自LEPR、MYD88、IFNAR2、MPL、IL18R1、IL13RA2、IL10RB、IL23R或CSF2RA的胞内域的此方面的另一实施例中,第一核酸序列进一步编码第二胞内域,其中第二胞内域可在第一胞内域的上游(即5’)处,或在说明性实施例中,第二胞内域在第一胞内域的下游处。在此实施例的一子实施例中,第二胞内域来自在实施例18的任一表中识别
为在第21天对比第7天产生高于0、1或2的富集的所选择多肽中的第二胞内域的基因,其中
该第一胞内域来自所选择多肽的第一胞内域的基因。在此子实施例或实施例的另一子实施
例中,第一胞内域及第二胞内域组合为来自在实施例18的任一表中识别为在第21天对比第
7天产生高于0、1或2的富集的所选择多肽的第一胞内域及第二胞内域。在此段落中的实施
例或子实施例的另一实施例中,第一胞内域来自表11-16中所选择多肽的所选择第一胞内
域的第一基因且第二胞内域来自所选择多肽的所选择第二胞内域的第二基因。在此段落中
的实施例或子实施例的另一实施例中,第一胞内域来自表11-16中所选择多肽且第二胞内
域来自所选择多肽。在此方面的另一实施例或本文中的任何实施例中,多核苷酸进一步包
含编码嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列,该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区
(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。
[1148] 在此方面的一个实施例或紧接着前述段落中的包含第二胞内域的实施例及子实施例的一个子实施例或其他子实施例中,第一胞内域为LEPR、MYD88、IFNAR2及MPL的胞内
域。在另一实施例中,第一胞内域为LEPR、IFNAR2及MPL的胞内域。在另一实施例中,第一胞内域不是MyD88。在另一实施例中,第一胞内域不是MyD88且第二胞内域不是CD40。在此段落中的此实施例的子实施例中,多核苷酸进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序
列,该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。
[1149] 在本发明的此方面的一个实施例中,MPL为第一胞内域且第二胞内域来自在表11-16中识别的所选择多肽中的第二胞内域的基因。在此实施例的其他子实施例中,第一胞内
域及第二胞内域组合包含来自在表11-16中识别的所选择嵌合多肽的第一胞内域及第二胞
内域。在这些实施例的一些子实施例中,第一胞内域及第二胞内域的取向是相反的以使得
第二域的羧基端残基与第一域或与第二域与第一域之间的间隔区结合。
[1150] 在本发明的此方面的一个实施例中,LEPR为第一胞内域且第二胞内域来自在表11-16中识别的所选择多肽中的第二胞内域的基因。在此实施例的其他子实施例中,第一胞内域及第二胞内域组合包含来自在表11-16中识别的所选择嵌合多肽的第一胞内域及第二
胞内域。在这些实施例的一些子实施例中,第一胞内域及第二胞内域的取向是相反的以使
得第二域的羧基端残基与第一域或与第二域与第一域之间的间隔区结合。
[1151] 在本发明的此方面的一个实施例中,IFNAR2为第一胞内域且第二胞内域来自在表11-16中识别的所选择多肽中的第二胞内域的基因。在此实施例的其他子实施例中,第一胞内域及第二胞内域组合包含来自在表11-16中识别的所选择嵌合多肽的第一胞内域及第二
胞内域。在这些实施例的一些子实施例中,第一胞内域及第二胞内域的取向是相反的以使
得第二域的羧基端残基与第一域或第二域与第一域之间的间隔区结合。
[1152] 在本发明的此方面的一个实施例中,MPL为第一胞内域且第二胞内域来自在表11-16中识别的所选择多肽中的第二胞内域的基因。在此实施例的其他子实施例中,第一胞内
域及第二胞内域组合包含来自在表11-16中识别的所选择嵌合多肽的第一胞内域及第二胞
内域。在这些实施例的一些子实施例中,第一胞内域及第二胞内域的取向是相反的以使得
第二域的羧基端残基与第一域或第二域与第一域之间的间隔区结合。
[1153] 在上文其中第一胞内域选自LEPR、MYD88、IFNAR2、IL17RD、IL17RE、IL1RAP、IL23R及MPL的胞内域的经分离多核苷酸方面的一些实施例中,跨膜域选自CD40、CD8B、CRLF2、CSF2RA、GCGR2C、ICOS、IFNAR1、IFNGR1、IL10RB、IL18R1、IL18RAP、IL3RA及PRLR的跨膜域。在一些说明性实施例中,跨膜域为CD40或ICOS的跨膜域。在一些子实施例中,第一胞内域来自LEPR、MYD88、IFNAR2及MPL。举例而言,在一些实施例中,跨膜域为来自CD40的跨膜域且第一胞内域为来自MPL的胞内域。
[1154] 在上文其中第一胞内域选自LEPR、MYD88、IFNAR2、IL17RD、IL17RE、IL1RAP、IL23R及MPL的胞内域的经分离多核苷酸方面的一些实施例中,第二胞内域来自CD40、CD79B或CD27。在一些子实施例中,第一胞内域来自LEPR、MYD88、IFNAR2及MPL。举例而言,在一些实施例中,第一胞内域为MPL且第二胞内域为CD40。在此段落中的所有实施例中,第一胞内域及第二胞内域在多肽上的顺序可相反。
[1155] 在另一方面中,本文提供包含一种或多种核酸序列的经分离多核苷酸,其中:
[1156] 该一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码在胺基至羧基取向中包含以下的嵌合多肽,
[1157] a)来自I型跨膜蛋白的跨膜域;及
[1158] b)第一胞内域,其选自具有在表11-16中识别的所选择多肽的第一胞内域的基因的胞内域,其中该嵌合多肽促进B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生
[1159] 其中该嵌合多肽促进PBMC,且在说明实施例中,B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生。在一些实施例中,NK细胞为NKT细胞。
[1160] 在紧接着上文段落中的方面的一个实施例及在下文本节中的此方面的任何实施例中,第一核酸序列进一步编码胞外域,且在说明性实施例中,该胞外域包含二聚基元。在其中CLE的胞外域包含二聚基元的任何方面或实施例中,二聚基元可选自由以下组成的群:
含亮氨酸拉链基元的多肽、CD69、CD71、CD72、CD96、Cd105、Cd161、Cd162、Cd249、CD271及Cd324,以及其保留二聚能力的突变体和/或活性片段。在本文中的CLE的胞外域包含二聚基元的任何方面或实施例中,二聚基元可需要二聚剂,且二聚基元及相关二聚剂可选自由以
下组成的群:FKBP及雷帕霉素或其类似物、GyrB及香豆霉素或其类似物、DHFR及甲胺蝶呤或其类似物,或DmrB及AP20187或其类似物,以及保留二聚能力的所述二聚蛋白质的突变体
和/或活性片段。
[1161] 在本文中的CLE的胞外域包含二聚基元的任何方面或实施例的说明性实施例中,胞外域可包含亮氨酸拉链基元。在一些实施例中,亮氨酸拉链基元来自jun多肽,例如c-
jun。在某些实施例中,c-jun多肽为ECD-11的c-jun多肽区。
[1162] 在此方面的一个实施例中,第一核酸序列进一步编码第二胞内域,其中该第二胞内域可在第一胞内域的上游(亦即5’)处,或在说明性实施例中第二胞内域在第一胞内域的下游处。在此实施例的子实施例中,第一胞内域及第二胞内域组合包含所选择多肽的第一
胞内域及在表11-16中的任何候选多肽的第二胞内域中识别的任何基因的任何胞内域。在
此实施例的子实施例中,第一胞内域及第二胞内域组合包含所选择多肽的第一胞内域及第
二胞内域。
[1163] 在此方面的一个实施例中,嵌合多肽包含所选择多肽的跨膜域、第一胞内域及第二胞内域。在此方面的一个实施例中,嵌合多肽包含所选择多肽的胞外及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域,其中该胞外域视情况包含识别域或消除域。
[1164] 在一相关子实施例中,嵌合多肽包含所选择多肽的胞外及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域,除了胞外域及跨膜域视情况包含识别域或消除域,或不包含识别域或消除域。
在一相关子实施例中,嵌合多肽包含所选择多肽的胞外及跨膜域、第一胞内域及第二胞内
域,除了胞外域及跨膜域视情况包含所选择多肽的识别域或消除域,或另一识别域或消除
域。
[1165] 在此方面的另一实施例中,多核苷酸进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列,该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。在此方面的子实施例中,第一胞内域及第二胞内域组合为所选择多肽的第一胞内域及第二胞内域组
合,且所选择多肽识别在表11-16中。在此实施例的另一实施例中,嵌合多肽包含所选择多肽的胞外域及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域,且所选择多肽识别在表11-16中。在一相关子实施例中,嵌合多肽包含所选择多肽的胞外域及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域,除了胞外域及跨膜域视情况包含识别域或消除域,且其中该识别域或消除域为所选择多肽的
胞外域的识别域或消除域,或另一识别域或消除域,且其中所选择多肽识别在表11-16中。
[1166] 在另一方面中,本文提供包含一种或多种核酸序列的经分离多核苷酸,其中:
[1167] 该一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码在胺基至羧基取向中包含以下的嵌合多肽,
[1168] c)来自I型跨膜蛋白的跨膜域;及
[1169] d)第一胞内域,其选自LEPR、MYD88、IFNAR2、IL17RD、IL17RE、IL1RAP、IL23R及MPL的胞内域,
[1170] 其中该嵌合多肽促进PBMC,且在说明实施例中,B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生。
[1171] 在紧接着上文段落中的方面的一个实施例及在下文本节中的此方面的任何实施例中,第一核酸序列进一步编码胞外域,且在说明性实施例中,该胞外域包含二聚基元。在此方面的说明性实施例中,胞外域包含亮氨酸拉链。在一些实施例中,亮氨酸拉链来自jun多肽,例如c-jun。在某些实施例中,c-jun多肽为ECD-11的c-jun多肽区。
[1172] 在其中第一胞内域选自LEPR、MYD88、IFNAR2、IL17RD、IL17RE、IL1RAP、IL23R及MPL的胞内域的此方面的另一实施例中,第一核酸序列进一步编码第二胞内域,其中第二胞内域可在第一胞内域的上游(即5’)处,或在说明性实施例中,第二胞内域在第一胞内域的下游处。在此实施例的一子实施例中,第二胞内域来自在实施例18的任一表中识别为在第21
天对比第7天产生高于0、1或2的富集的所选择多肽中的第二胞内域的基因,其中该第一胞
内域来自所选择多肽的第一胞内域的基因。在此子实施例或实施例的另一子实施例中,第
一胞内域及第二胞内域组合为来自在实施例18的任一表中识别为在第21天对比第7天产生
高于0、1或2的富集的所选择多肽的第一胞内域及第二胞内域。在此段落中的实施例或子实施例的另一实施例中,第一胞内域来自表11-16中所选择多肽的所选择第一胞内域的第一
基因且第二胞内域来自所选择多肽的所选择第二胞内域的第二基因。在此段落中的实施例
或子实施例的另一实施例中,第一胞内域来自表11-16中所选择多肽且第二胞内域来自所
选择多肽。在此方面的另一实施例或本文中的任何实施例中,多核苷酸进一步包含编码嵌
合抗原受体(CAR)的第二核酸序列,该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。
[1173] 在本文中包括嵌合多肽的方法或经分离多核苷酸实施例中的任一者的某些实施例中,其中该嵌合多肽促进PBMC,且在说明性实施例中,B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生,第一和/或第二胞内域(在说明性实施例中第一胞内域)为来自LEPR、MYD88、IFNAR2、
MPL、IL18R1、IL13RA2、IL10RB、IL23R或CSF2RA的胞内域。在一些实施例中,第一胞内域来自MPL。在例示性子实施例中,嵌合多肽包含包含本文中所提供的二聚基元的胞外域。
[1174] 在本文中包括嵌合多肽的方法或经分离多核苷酸实施例中的任一者的某些实施例中,其中该嵌合多肽促进PBMC,且在说明性实施例中,B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生,跨膜域来自CD40、ICOS、FCGR2C、PRLR、IL3RA或IL6ST。在一些实施例中,跨膜域来自CD40或ICOS。在例示性子实施例中,嵌合多肽包含包含本文中所提供的二聚基元的胞外域。
[1175] 在本文中包括嵌合多肽的方法或经分离多核苷酸实施例中的任一者的某些实施例中,其中该嵌合多肽促进PBMC,且在说明性实施例中,B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生,第一和/或第二胞内域(在说明性实施例中第一胞内域)为来自CD40、CD79B、TNFRSF4、TNFRSF9、TNFRSF14、FCGRA2、CD3G或CD27的胞内域。在一些说明性实施例中,第二胞内域来自CD40、CD79B或CD27。在例示性子实施例中,嵌合多肽包含包含本文中所提供的二聚基元的胞外域。
[1176] 在本文中包括嵌合多肽的方法或经分离多核苷酸实施例中的任一者的某些实施例中,其中该嵌合多肽促进PBMC,且在说明性实施例中,B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生,第一和/或第二胞内域为表11-16中的嵌合多肽中的任一者的胞内域(P3或P4组件)。在
一些实施例中,嵌合多肽包含表11-16中的嵌合多肽中的任一者的任一P2、P3及P4组合。
[1177] 在其中跨膜域为I型跨膜蛋白的方面及实施例中的任一者的实施例中,跨膜域可为I型细胞因子受体、激素受体、T细胞受体或TNF家族受体。在其中嵌合多肽包含跨膜域且其中跨膜域包含二聚基元的方面及实施例中的任一者的实施例中,跨膜域可为I型细胞因
子受体、激素受体、T细胞受体或TNF家族受体。在此段落中的这些实施例中的任一者的说明性实施例中,第一胞内域选自LEPR、MYD88、IFNAR2、IL17RD、IL17RE、IL1RAP、IL23R及MPL的胞内域。
[1178] 在作为关于包含编码嵌合多肽的核酸序列的多核苷酸的方面及实施例中的任一者的实施例中,该嵌合多肽包含胞外域,该胞外域可包含胞外域的羧基端的20个氨基酸内
(且在说明性实施例中,在胞外域的羧基端处)的1、2、3或4个氨基酸间隔子以使得间隔子将胞外域及跨膜域间隔开。在一些实施例中,1、2、3或4个氨基酸间隔子包含丙氨酸残基,且在一些情况下,仅丙氨酸残基。在包含该间隔子的实施例的说明性子实施例中,胞外域包含二聚基元,例如亮氨酸拉链基元。
[1179] 应理解,本文所提供的包含促进PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生的嵌合多肽的方面及实施例的第一胞内域及第二胞内域可包括所述基因的突变体和/或片段,
其限制条件为该嵌合多肽保留其促进PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生的能力。
这些突变体和/或片段通常保留信号传导活性以使得嵌合多肽保留其促进存活及增生活
性。应理解,第一胞内域及第二胞内域可为相反的以便用于本文中所提供的包含促进PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生的嵌合多肽的任一方面及实施例中。因此,在这些实施例应当理解,第一胞内域为第二胞内域且反之亦然。
[1180] 在本文提供的包含多核苷酸的方面及实施例中的任一者中,该多核苷酸包括编码促进PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生的嵌合多肽的核酸序列,该核酸序列可进一步编码识别域或消除域。在一些实施例中,识别域或消除域为生物学批准的单克隆抗体
的识别域。在一些实施例中,识别域或消除域包含由识别EGFR的抗体识别的多肽,或其抗原决定基。在一些实施例中,识别域或消除域包含由识别MYC的抗体识别的多肽,或其抗原决定基。
[1181] 在本文提供的包含多核苷酸的方面及实施例中的任一者中,该多核苷酸包括编码促进PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生的嵌合多肽的核酸序列,该核酸序列和/或第二核酸序列可操作地连接至在B细胞、T细胞和/或NK细胞中具有活性的第一启动子。在一些说明性实施例中,第一启动子在T细胞和/或NK细胞中为活性的。
[1182] 在本文提供的具有编码促进PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生的嵌合多肽的核酸序列的经分离多核苷酸方面及实施例中的任一者的实施例中,针对包含第二胞内
域的多核苷酸实施例,接头可存在于跨膜域与第一胞内域之间和/或在第一胞内域与第二
胞内域之间。在一些实施例中,针对包含胞外域的实施例,在1与4个丙氨酸之间的接头存在于胞外域与跨膜域之间。
[1183] 在本文提供的包含编码促进PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生的嵌合多肽的第一核酸序列及编码嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列的经分离多核苷酸或载体方
面及实施例中的任一者的实施例中,该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜
域及胞内活化域,该第一核酸序列及第二核酸序列可通过核糖体跳跃序列间隔开。在一些
实施例中,核糖体跳跃序列为F2A、E2A、P2A或T2A。
[1184] 在本文提供的编码促进PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生的嵌合多肽的经分离多核苷酸方面及实施例中的任一者的实施例中,该多核苷酸进一步包含Kozak类型
序列、WPRE组件及双重终止密码子或三重终止密码子中的一者或多者,其中双重终止密码
子或三重终止密码子中的一个或多个终止密码子限定自一个或多个转录单元中的至少一
者中读取的终止。在某些实施例中,多核苷酸进一步包含选自以下的Kozak类型序列:
CCACCAUG(G)、CCGCCAT/UG(G)、GCCGCCGCCAT/UG(G)或GCCGCCGCCAT/UG。在某些实施例中,相对于第一核酸序列的起始密码子的-3及+4核苷酸皆包含G。在可与包含Kozak类型序列的前
述实施例和/或包括三重终止密码子的以下实施例组合的另一实施例中,多核苷酸包含
WPRE组件。在一些实施例中,WPRE组件位于一个或多个转录单元的终止密码子的3’及多核苷酸的3’LTR的5’处。在可与前述实施例(亦即,多核苷酸包含Kozak类型序列的实施例和/或其中多核苷酸包含WPRE的实施例)中的任一者或两者组合的另一实施例中,一个或多个
转录单元经双重终止密码子或三重终止密码子中的一个或多个终止密码子终止。
[1185] 在一个方面中,本文提供包含以下的核酸载体
[1186] 本文提供的编码促进PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生的嵌合多肽的经分离多核苷酸方面及实施例中的任一者的实施例,
[1187] a.复制源;
[1188] b.抗生素抗性基因;和/或
[1189] c.一种或多种病毒和/或反转录病毒序列,其选自反转录病毒长端重复序列(LTR)或其活性片段、反转录病毒顺式作用RNA包装组件,和/或反转录病毒中心多嘌呤段/中心终止序列(CTS)组件。
[1190] 在此方面的某些实施例中,载体为质粒。在其他实施例中,载体为复制缺陷型病毒载体,例如复制缺陷型反转录病毒载体或颗粒。在这些实施例中,复制缺陷型反转录载体或颗粒颗包含5’反转录病毒LTR或其活性片段、反转录病毒顺式作用RNA包装组件,及3’反转录病毒LTR或其活性片段,其中5’反转录病毒LTR及3’反转录病毒LTR侧接经分离的多核苷酸。在一些实施例中,该经分离的多核苷酸与编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件、5’长端重复序列和/或3’长端重复序列的核酸序列呈相反定向。
[1191] 在一些方面中,本文提供包含反转录病毒基因组且进一步包含包膜及衣壳的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒,该反转录病毒基因组包含本文中的包含经分离多核苷酸的方
面及实施例中的任一者,该经分离多核苷酸包含编码促进PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生的嵌合多肽的第一核酸序列。反转录病毒颗粒可额外包含本公开案中所阐述的
反转录病毒组件中的任一者。在一个实施例中,反转录病毒基因组进一步包含编码嵌合抗
原受体(CAR)的第二核酸序列,该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。在一些实施例中,第一核酸序列及第二核酸序列可通过核糖体跳跃序列间隔开。
在一些实施例中,核糖体跳跃序列为F2A、E2A、P2A或T2A。在这些实施例中,第一核酸序列及第二核酸序列通常在相同的转录单元上。
[1192] 在另一实施例中,本文提供一种哺乳动物细胞,其中该哺乳动物细胞(例如人类细胞)为包含经分离多核苷酸的B细胞、T细胞或NK细胞,根据本文中的包含经分离多核苷酸的方面及实施例中的任一者,该经分离多核苷酸视情况可整合至该细胞的基因组中,该经分
离多核苷酸包含编码促进PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生的嵌合多肽的第一核酸序列。在一个实施例中,哺乳动物细胞中的经分离多核苷酸进一步包含编码嵌合抗原受
体(CAR)的第二核酸序列,该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。在一些实施例中,第一核酸序列及第二核酸序列可通过核糖体跳跃序列间隔开。在一些实施例中,核糖体跳跃序列为F2A、E2A、P2A或T2A。在这些实施例中,第一核酸序列及第二核酸序列通常在相同的转录单元上。在一些实施例中,细胞为T细胞或NK细胞,且在某些说明性实施例中,细胞为人类T细胞。
[1193] 在另一方面中,本文提供根据本文中的包含经分离多核苷酸的方面及实施例中的任一者的包含经分离多核苷酸的包装组件,该经分离多核苷酸可整合至细胞的基因组中,
包含编码促进PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生的嵌合多肽的第一核酸序列。在一些实施例中,该细胞中的经分离多核苷酸进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第二核
酸序列,该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。在一些实施例中,第一核酸序列及第二核酸序列可通过核糖体跳跃序列间隔开。在一些实施例中,核糖体跳跃序列为F2A、E2A、P2A或T2A。在这些实施例中,第一核酸序列及第二核酸序列通常在相同的转录单元上。在一些实施例中,细胞为本文提供用于产生反转录病毒颗粒的细胞。
[1194] 在一个方面中,本文提供一种促进PBMC(例如,B细胞、T细胞和/或NK细胞)的细胞增生的方法,该方法包含用编码淋巴增生性组件(且在说明性实施例中,根据本文所提供的实施例中的任一者的嵌合多肽)的载体转导和/或以基因方式修饰细胞,其中该嵌合多肽促
进PBMC增生。该方法可包括培养细胞至少7天、14天、21天、28天、35天、42天或60天。通常地,此培养例如在一些实施例中在用可诱导IL-2的培养基转导之后在存在IL-2的情况下进行。
[1195] 在一个方面中,本文提供一种转染、转导和/或以基因方式修饰B细胞、T细胞和/或NK细胞(在一些非限制性实施例中,可为同种异体细胞、自体细胞或非同种异体细胞)的方法,该方法包含使该细胞与根据本文中的包含经分离多核苷酸的方面及实施例中的任一者
的经分离多核苷酸接触,该经分离多核苷酸包含编码促进PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生的嵌合多肽的第一核酸序列(CLE方面及实施例)。在此方法方面中的一些实施
例中,该细胞为T细胞且经分离多核苷酸进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序
列,该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。换言的,用于转染、转导和/或以基因方式修饰B细胞、T细胞和/或NK细胞的方法可包括使该细胞与根据本
文中的CLE或CLE CAR实施例中的任一者的经分离多核苷酸接触。在一些实施例中,第一核
酸序列及第二核酸序列可通过核糖体跳跃序列间隔开。在一些实施例中,核糖体跳跃序列
为F2A、E2A、P2A或T2A。在这些实施例中,第一核酸序列及第二核酸序列通常在相同的转录单元上。在一些实施例中,细胞为T细胞或NK细胞,且在某些说明性实施例中,细胞为人类T细胞。该接触在用于转染、转导和/或以基因方式修饰细胞的有效条件下进行。在一些实施例中,在接触时的经分离多核苷酸在根据本文中所提供的载体方面及实施例中的任一者的
载体内。在一些实施例中,经分离多核苷酸在接触时在非复制型反转录病毒颗粒中。
[1196] 在本文方面中的任一者的一些实施例中,NK细胞为NKT细胞。
[1197] 以下非限制性实施例仅借助于说明例示性实施例而提供,且绝不限制本发明的范畴及精神。此外,应理解,本文所公开或主张的任何发明涵盖本文所描述的任何一个或多个特征的所有变体、组合及排列。任何一个或多个特征可明确地自权利要求排除,即使未在本文中明确地阐述特定排除。还应理解,除非一般熟练此项技术人员将理解,否则根据本文公开的特定方法或本领域中已知的其他方法,用于方法中的试剂的公开内容意欲与(及为其
提供支持)涉及试剂的用途的方法同义。另外,除非一般熟练此项技术人员将理解,否则说明书和/或权利要求公开一种方法,本文所公开的试剂中的任何一者或多者可用于该方法。
[1198] 实施例
[1199] 实施例1.特异性响应于核苷类似物抗病毒药物的核糖开关的产生。
[1200] 此实施例提供一种基于结合鸟苷及脱氧鸟苷的天然结构性核糖开关来筛选库的方法。这些核糖开关为用作架构以发展偏差库(biased library)以供选择与配位体核苷类
似物特异性结合的适体。以前,等温滴定热量测定法已用于显示这些天然核糖开关与其天
然配位体结合。额外测试显示,脱氧鸟苷开关也微弱地与核苷类似物(阿昔洛韦及喷昔洛
韦)相互作用,从而导致将此序列重新设计为新的库。核糖开关的单链区用于特异性回应于所选择的阿昔洛韦或喷昔洛韦的突变及变体序列。
[1201] 材料
[1202] 自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)订购选择组分:鸟嘌呤、鸟苷、脱氧鸟苷、阿昔洛韦及喷昔洛韦。阿昔洛韦为初始靶标,而喷昔洛韦为在稍后轮次中使用的特别关注的分析物,且鸟嘌呤、鸟苷及脱氧鸟苷用作反向靶标。待用作分配培养基的氧化石墨烯(GrO)购自Angstron Materials(俄亥俄州代顿))。HEPES(pH 7.3)及MgCl2购自Amersco LLC.(俄亥俄
州Solon)。KCl购自Teknova(加州Hollister)。在5×(1×为50mM HEPES,100mM KCl,20mM 
MgCl2,pH 7.3)下制备选择缓冲液。在无核酸酶的水中重建构靶标、反向靶标及寡核苷酸以供初步分析及适体筛选。制备所有靶标的等份且储存在-20℃下以最大化保质期。
[1203] 适体库的产生
[1204] 利用IBA GmbH(德国哥廷根)合成呈图14中的序列的反向互补物的初始适体库模板。在图14中,盒中的核苷酸为已知序列中的单链,其中在合成期间引入“突变”以使与原始靶标的类似物的更佳结合。对于用实线勾勒出的盒内的核苷酸,允许取代突变;对于用虚线勾勒出的盒内的核苷酸,允许取代突变以及插入或缺失。利用IDT(爱荷华州Coralville)合成呈单链DNA的引物。将T7引物(SEQ ID NO:240)与库模板序列组合以供利用Titanium Taq DNA聚合酶(Clontech;加州山景城)进行引物扩增。使用Ampliscribe T7高产率转录试剂盒(Epicentre;威斯康星州麦迪逊)转录经引物扩增的材料,且接着在用于选择之前在具有8M脲素的10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上进行纯化。在选择期间,使用SuperScript 
IV反转录酶(Invitrogen;加州卡尔斯巴德)使用反向引物(SEQ ID NO:241)来反转录库且
使用Titanium Taq DNA聚合酶(Clontech;加州山景城)对该库进行扩增。具有SEQ ID NO:
248的适体具有-3至-1的J2-3环变化及~2.25×1010的多样性。具有SEQ ID NO:250的适体
具有0(天然)至+5的J2-3环变化及~9.38×1014的多样性。两种寡核苷酸(SEQ ID NO:249及
SEQ ID NO:250)以1:4160的比率混合以在经组合库池中产生等摩尔多样性,具有~9.38×
1013的总多样性。
[1205] 库筛选
[1206] 使用氧化石墨烯-指数富集的配位体的系统进化(GO-SELEX)方法(图15)(Park等人,2012),利用使氧化石墨烯针对单链核酸的高亲和力的π-π相互作用(Zeng等人,2015)来进行库筛选。目标是选择不与1×选择缓冲液或不与反向靶标(鸟嘌呤、鸟苷及脱氧鸟苷)相
互作用但与阳性靶标阿昔洛韦结合的序列。
[1207] 对于每个轮次,首先在1×选择缓冲液中对给定量的库进行复性(在90℃下变性5分钟,在4℃下5分钟,接着在室温下)。接着将反向靶标添加至经复性的库中且在37℃下培育30分钟。此的例外为轮次1及轮次2,其中仅短暂地(<1分钟)包括反向靶标以帮助将库装
载至GrO上。在使库与反向靶标及缓冲液组分相互作用之后,历经在37℃下培育10分钟的时程将未结合库装载至GrO上(质量等于轮次开始时库的质量的100倍)。接着以7,000×g离心
溶液以沉降GrO。移除含有与反向靶标和/或缓冲液结合的序列的上清液。沉降物接着用200μL 1×选择缓冲液洗涤,以7,000×g离心且在每次洗涤后移除上清液。接着添加阳性含靶
标溶液且允许在37℃下至多60分钟的表1中指示的条件下自GrO溶离库,基本上允许靶标针
对库结合与氧化石墨烯竞争。与靶标更强有力地结合的序列将自氧化石墨烯解吸附且在培
育末期保持与靶标结合。最终离心步骤自保持与氧化石墨烯结合的无响应库分离位于上清
液中的经释放材料。
[1208] 在阳性选择之后,经回收RNA使用具有8M脲素的10%变性PAGE来进行纯化,接着使用分光亮度计读数(表1)来定量,用SuperScript IV反转录且使用PCR用Titanium Taq DNA
聚合酶进行扩增。将扩增产物转录为RNA以供选择的下一轮次。
[1209] 历经选择的时程实施三级严格性(表1)。选择之前两个轮次并不包括针对反向靶标的筛选以最大化装载至GrO上的库。另外,阳性培育中使用大量过量的阿昔洛韦以最大化库回收率,如此为低严格性设计。在实现库回收之后引入反向靶标培育物,作为中等严格性条件。同样在这些三个轮次期间降低阿昔洛韦与库的比率以增加针对靶标结合的库竞争。
一旦实现大于10%的回收率,则实施高严格性选择的最终轮次。使保持高及阳性靶标/库比率的反向靶标/库比率为1:1,同时减少阳性培育时间,以选择更快结合序列。一旦库回收率在高严格性条件的两个轮次之后显示为保持超过10%,则进行平行评估。
[1210]
[1211] 表1.选择及评估条件用于选择及培育的各轮次的条件,具有作为针对各轮次的经回收样本与输入库之间的比率的回收率。历经选择的时程监测库富集。*反向靶标用于装
载,而非扩增培育。用经汇集的反向靶标进行预装载培育。用阳性靶标阿昔洛韦进行预装
载培育。进行这是用于最小化交叉反应物种的回收率。以下缩写用于此表中:“X-靶标”为反向靶标;“(+)靶标”为阿昔洛韦或喷昔洛韦;“(+)培育时间(分钟)”为“库:(+)靶标”溶液于GrO上培育的时间。G0为代0等;R1为轮次1等。对于平行评估(平行1及平行2),用以下进行培育:(-)为仅1×选择缓冲液,(×)为含反向靶标的1×选择缓冲液,(+)为含阿昔洛韦的1×
选择缓冲液,及(P)为含喷昔洛韦的1×选择缓冲液。
[1212] 对于两个平行评估,将待评估的库分为四个相等量以用于如上制备及复性(图16)。对于各条件,将50皮摩尔的库与1×选择缓冲液组合,复性(90℃下5分钟,4℃下5分
钟),且接着在37℃下与200μL的10μM含经合并反向靶标的1×选择缓冲液一起培育30分钟。
接着将这些样本装载至氧化石墨烯的量相当于样本中的库的质量的100倍的氧化石墨烯
上,并在37℃下培育10分钟,且接着如前述用200μL的1×选择缓冲液洗涤两次。接着在37℃下将经装载氧化石墨烯样本与含200μL的合适评估条件(仅1×选择缓冲液,10μM经汇集反
向靶标,1μM喷昔洛韦,1μM阿昔洛韦(第一平行评估),或0.5μM阿昔洛韦(第二平行评估);在表1中,这些条件分别显示为:(-)、(X)、(P)、(+)及(+))的1×选择缓冲液一起平行培育30分钟。最终离心步骤自无回应的经氧化石墨烯结合的库分离经解吸附回应库。响应库使用分
光亮度计读数来定量(表1),使用具有8M的10%变性PAGE脲素来鉴别,且准备用于第二平行评估。此后续评估对于阳性样本的预装载培育继续使用反向靶标,但对于各其他样本的预
培育利用阳性靶标阿昔洛韦。进行这是用于最小化给定样本中的交叉反应序列的表示(亦
即,响应于阳性样本中的反向靶标,回应于阴性反向靶标或喷昔洛韦样本中的阿昔洛韦)。
自第二平行评估回收的材料使用分光亮度计读数来定量(表1),使用具有8M脲素的10%变
性PAGE来鉴别,且利用反转录及PCR来准备以供测序以产生双链DNA。
[1213] 测序
[1214] 初始库经受大于10个轮次的基于GrO的选择及平行评估(表1)。GO-SELEX方法经设计以经由多个轮次的选择来富集与感兴趣的给定靶标结合的序列并移除与非靶标化合物
或缓冲液组分结合的序列。作为结果,期望待测序的群体含有潜在适体候选物的多个拷贝。
[1215] 实施Illumina MiSeq系统(加州圣地亚哥)以在平行评估之后使用单端读取技术测序适体库。深度测序与后续数据分析减少传统SELEX所需的大量筛选轮次,此可由于筛选方法引入误差及偏差(Schütze等人,2011)。测序以下五个样本:回应于阿昔洛韦的最后一代库,回应于反向靶标的最后一代库,响应于1×选择缓冲液(阴性条件)的最后一代库,响
应于阿昔洛韦的倒数第二代库,及响应于感兴趣的额外靶标(喷昔洛韦)的最后一代库。根
据这些数据集,以95%同源性(考虑到突变、缺失及插入的序列相似性)构建序列家族以用
于适体候选物鉴别。存在来自回应于阿昔洛韦的库的1,711,535个原始序列(124,600个唯
一序列)及来自回应于喷昔洛韦的库的2,074,832个原始序列(110,149个唯一序列)。
[1216] 适体候选物选择
[1217] 序列家族构建主要聚焦于序列相似性。这表示计入阳性靶标群体中的序列的频率,但强调的是相似序列之间的变化程度,其中95%同源性为最小要求(在整个序列中
100%匹配对于加入家族并不是必需的,可错配、插入或缺失至多2个碱基)。因此,期望具有最多成员的家族高度作为适体候选物。在构建家族之后,考虑到家族在某一给定群体中的
相对存在—频繁出现在阴性及反向靶标群体中的家族被视为较弱的候选物,这是因为其显
示在与缓冲液或反向靶标组分结合时的一定程度的非特异性相互作用。另外,显示高富集
率(亦即,最终阳性群体与倒数第二阳性群体之间的较大比率)的家族提高其候选资格,这
是因为富集率已与候选物相对于剩余群体的结合亲和力相关(Levay等人,2015;Wang等人,
2014)。在这些条件下,若干候选物家族似乎为针对结合阿昔洛韦(表2)及喷昔洛韦的强有
力候选物。
[1218]
[1219]
[1220]
[1221]
[1222]
[1223] 表2.用于结合阿昔洛韦及喷昔洛韦的候选物。DNA序列对应于结合RNA核糖开关的阿昔洛韦的非茎区。在筛选时鉴别到七个家族:582、769、795、935、946、961及996,其中在各家族中具有在1个与39个之间的序列。将家族中各序列的一致性%与各家族(582-1、769-1、
795-1、935-1、946-1、961-1及996-1)内的最常见的序列进行比较。也将家族中各序列的一致性%与野生型序列进行比较。
[1224] 阳性靶标阿昔洛韦产生对应于582-1(SEQ ID NO:108)、769-1(SEQ ID NO:147)、795-1(SEQ ID NO:164)、935-1(SEQ ID NO:183)、946-1(SEQ ID NO:198)、961-1(SEQ ID NO:220)及996-1(SEQ ID NO:221)的七个强有力候选物(SEQ ID NO:87至SEQ ID NO:93;包
括茎区的RNA序列),各自命名为F1A(图17)。这些序列为各家族中最常见的序列(各家族的
所有成员的DNA序列为:582(SEQ ID NO:108至SEQ ID NO:146);769(SEQ ID NO:147至SEQ ID NO:163);795(SEQ ID NO:164至SEQ ID NO:182);935(SEQ ID NO:183至SEQ ID NO:
197);946(SEQ ID NO:198至SEQ ID NO:219);961(SEQ ID NO:220);及996(SEQ ID NO:
221))。共有序列显示各家族的各核苷酸位置处的所有可能的取代或间隙(SEQ ID NO:222
至SEQ ID NO:226)。由于目标为基于为与脱氧鸟苷结合所已知的RNA来鉴别来自库的适体,所以强有力候选物需要在反向靶标群体中具有最小的存在。候选物F1A-795、F1A-935及
F1A-946非常符合此标准,这是因为未在反向靶标群体中检测到这些候选物。就此而言,将F1A-996及F1A-961视为下一最佳候选物,即使其在反向靶标群体中显示较小程度。另外,候选物应最低程度地出现于阴性群体中,这是因为那些序列自GrO解吸附而无阿昔洛韦的影
响且可表示假阳性。F1A-935及F1A-946在此标准下非常好的理想地表达,这是因为未在阴
性群体中发现其等。候选物F1A-769在阴性群体中被最小程度地检测到,其中候选物F1A-
961、F1A-795及F1A-996表达的较不佳。富集率为需考虑的最终条件,其中F1A-935、F1A-946及F1A-769充分地表达。包括候选物F1A-582,这是因为其展现最大富集率,尽管其在其他标准下表达并不良好。剩余候选物相对于这些四个并不表达良好,但展现可接受特性。
[1225] 额外靶标喷昔洛韦产生七个强有力候选物(SEQ ID NO:94至SEQ ID NO:100),各自命名为F1P(图18)。如前,目标为基于为与脱氧鸟苷结合所已知的RNA来鉴别来自库的适
体,偏离经富集的库以供在轮次10之后与阿昔洛韦结合。强有力候选物需要在阿昔洛韦及
反向靶标群体两者中具有最小存在以最小化交叉反应性。候选物F1P-923符合第一个标准,候选物F1P-710符合第二个标准,且候选物F1P-584在一定程度上符合两个标准。候选物
F1P-584还显示喷昔洛韦优于阴性条件的适中偏好,以及相对于针对阿昔洛韦之前代的响
应的适中富集。剩余候选物显示喷昔洛韦优于阿昔洛韦的最小偏好或喷昔洛韦优于反向靶
标(分别为F1P-837及F1P-932;F1P-991及F1P-718)的最小偏好。这些四个候选物显示喷昔
洛韦优于最小化假阳性的机会的阴性条件的一些偏好,但在候选物不显示喷昔洛韦优于其
类似物的选择性时,此标准是不显著的。富集率为需考虑的最终条件,其中F1P-923、F1P-
932及F1P-584充分地表达。
[1226] 进行所选择适体的定性的PAGE评估。经个别合成及转录的适体在生理Mg++(0.5mM)下经受氧化石墨烯(GrO)选择,且用阿昔洛韦(+)或反向靶标(x)溶离。各样本的经
特异性溶离的适体碎片经受PAGE以供分析。
[1227] 将100皮摩尔的各适体候选物(每次实验/泳道)再悬浮于1×经修改的选择缓冲液(50mM HEPES,100mM KCl,0.5mM MgCl2,pH 7.3)中且复性(90℃下5分钟,接着4℃下5分
钟),接着在37℃下与200皮摩尔(每一)的经汇集反向靶标或靶标一起培育30分钟。最终库
浓度为0.5μM,靶标/反向靶标浓度为1μM(培育体积为200μl)。
[1228] 在靶标/反向靶标培育之后,添加250μg的GrO(Angstron Materials(俄亥俄州代顿))以吸附未结合的候选物(在37℃下培育10分钟)。
[1229] 以7,000×g离心样本5分钟。回收上清液,使用具有40mM EDTA的2×甲酰胺变性,且在具有8M脲素的10%变性PAGE上电泳(供货商:American Bioanalytical;目录号#
AB13021-01000.AB13022-01000)。电泳缓冲液为1×TBE(供货商:Amresco/VWR;目录号#
0658-20L,使用DI水稀释)。DNA梯为20/100 DNA梯(IDT)。凝胶用凝胶星型(Lonza,50535)染色且在蓝光透射仪上成像。
[1230] 候选物F1A-769、F1A-795、F1A-946及F1A-996似乎在此定性PAGE评估(自GrO用阿昔洛韦靶标的适体的良好溶离及用反向靶标的相对较低或最小溶离)中展现选择性阳性反
应。
[1231] 结论
[1232] 在反复筛选及平行评估的十二个轮次之后鉴别针对阿昔洛韦的强有力候选物;在筛选及平行评估的两个轮次之后鉴别针对喷昔洛韦的合理候选物。
[1233] 实施例2.条件性scFv’s的分离
[1234] 移除潜在剪接位点库,且肿瘤抗原特异性scFv’s是利用重叠寡聚合成来合成且将其克隆至含有阿昔洛韦响应性组件及灵长类CD3ζ启动子的CAR穿梭式构建体中。作为初始
原型,利用具有CD8-α信号肽、柄及跨膜域的EPCAM或ERBB2scFv的抗ECD。使用如美国专利第
8,709,755号及PCT公开案第WO/2016/033331A1号中所描述的方法或通过在许可及非许可
条件下自人类噬菌体库直接选择来产生受实体肿瘤微环境限制的CAR产物。简言之,在以下肿瘤许可条件下淘选来自Creative Biolabs(Shirley,纽约)的人类VH×VL库:100μg/ml透明质酸,100kDa碎片(Lifecore Biomedical,明尼苏达州查斯卡),20mg/ml重组HAS
(Cyagen,加州圣克拉拉),含200ng/ml重组人类VEGF的25mM碳酸氢钠缓冲液,2μM腺苷,10mM乳酸钠pH 6.7,接着用与生物素标记的人类IgG结合的链霉抗生素磁珠(ThermoFisher,加
州卡尔斯巴德)清除。与在37℃下结合珠粒的EPCAM及ERBB2的生物素标记的靶标受体ECD的
结合在允许条件下,接着为在允许条件下的连续洗涤来进行。用生理条件(1μg/ml透明质
酸,20mg/ml HAS,25mM碳酸氢盐,1mM乳酸钠pH 7.2),接着用酸性溶离液溶离封闭性变体且用1M Tris快速中和来释放噬菌体。扩增噬菌体且使用长读取测序(PacBio,加州门洛帕克)分裂基因组DNA以供VH×VL链的深度序列分析。可重复淘选以供富集。排除在经由对靶标富
集的噬菌体培养过程期间显示读数的较佳扩增的VH×VL序列以供进一步分析。与在肿瘤许
可条件下富集但在生理条件下释放的靶标选择性结合的噬菌体经选择以供进一步表征为
克隆至CAR构建体表达系统中,慢病毒的世代且转导至T细胞中以供测试表达CAR介导的肿
瘤抗原的靶标细胞在肿瘤选择性环境中相比于生理条件下的杀伤。
[1235] 实施例3.使用受微环境限制的scFv’s产生MRB-CAR。
[1236] 获得受微环境限制的ASTR,其通过利用如申请WO/2016/033331A1中所描述的进化使VH及VL序列进行针对低pH微环境的低选择性来制得。在相比于正常组织MRB-CAR的微环境下,在肿瘤微环境的降低的pH下具有增加的活性的用于结合两种同源肿瘤抗原(靶标1或靶
标2)中的任一者的嵌合抗原受体(CAR)通过将受微环境限制的单链抗体的重链及轻链与其
他CAR域一起并入慢病毒表达载体中以产生一系列候选MRB-CAR来制得。这些MRB-CAR包括
分子的各种组合。MRB-CAR自胺基至羧基末端在位置1至位置9中包括:CD8信号肽(sp)(P1)
(SEQ ID NO:74);受微环境限制的抗靶标1ASTR或抗靶标2ASTR(P2至P4);在T2A及T2B的情
况下来自CD8的柄及跨膜(TM)域(SEQ ID NO:75)(P5)及来自CD137的共刺激域(P6)(SEQ ID 
NO:1)或在T1A的情况下来自CD28的柄及跨膜(TM)域(SEQ ID NO:76)(P5)及来自ICΔ的共
刺激域(SEQ ID NO:3)(P6);来自CD3Z的活化域(SEQ ID NO:13)(P7);2A-1核糖体跳跃序列(SEQ ID NO:77)(P8);及例示性eTAG(SEQ ID NO:78)(P9)。
[1237] 用重组慢病毒颗粒转导淘选T细胞(AllCells,Alameda,CA)以表达该系列的候选MRB-CAR,且通过使用FACS测定表达eTag的细胞的百分比来计算经转导细胞的百分比。用编码候选MRB-CAR的重组慢病毒颗粒成功地转导淘选T细胞。
[1238] 利用xCELLigence系统(ACEA)在7.4的pH(正常组织)或6.7的pH(肿瘤微环境的降低的pH)下分析候选MRB-CAR针对表达靶标1或靶标2(分别为CHO-靶标1及CHO-靶标2)的靶
标细胞的细胞毒性活性。简言之,在实验前一天将表达靶标1或靶标2的靶标细胞以20,000
个细胞/孔接种至具有肿瘤条件或正常培养基的96-孔E-盘中。使效应细胞在含有100IU/mL
的IL-2的人类T细胞培养基中静息两天且以3:1、1:1及0.3:1的效应细胞/靶标细胞比率(E/
T)添加至含有靶标细胞的实验孔中。
[1239] 在添加效应细胞之后每5分钟进行阻抗读取持续大约40小时且阻抗报告为细胞指数(CI)。如下计算特异性细胞溶解的百分比:((CI靶标+经对照病毒转导的效应T细胞)-(CI靶标+用针对靶标1或靶标2的CAR转导的效应T细胞))/(CI靶标+经对照病毒转导的效应T细
胞)×100。
[1240] 结果
[1241] 许多候选MRB-CAR在6.7的pH下比在7.4的pH下对靶标细胞具有更高细胞毒性活性。在6.7的pH下比在7.4的pH下在裂解靶标细胞处更有效的例示性MRB-CAR包括MRB-CAR 
T1A、MRB-CAR T2A及MRB-CAR T2B。MRB-CAR T1A的ASTR自5’至3’包含由接头1(SEQ ID NO:
283)隔开的靶标1MRB VH(SEQ ID NO:281)及靶标1MRB VL(SEQ ID NO:282)。MRB-CAR T2A
的ASTR自5’至3’包含由接头2(SEQ ID NO:291)隔开的靶标2MRB VH(SEQ ID NO:289)及靶
标2MRB VL(SEQ ID NO:290)。除交换VH及VL的位置以外,MRB-CAR T2B的ASTR与MRB-CAR 
T2A的ASTR相同。
[1242] 实施例4.配位体可诱导的核糖开关的构建。
[1243] 将脱氧鸟苷核糖开关适体及鸟苷核糖开关适体(Pikovskaya,2014;Kim,2007)或其他嘌呤核糖开关适体合成为寡核苷酸。在一个实例中,针对进化选择来自Mesoplasma 
florum的脱氧鸟苷IA核糖开关(在图6及图7中加下划线且呈粗体)以产生阿昔洛韦回应性
核糖开关。在另一实例中,针对进化选择来自枯草芽孢杆菌的鸟苷xpt核糖开关(在图10及
图11中加下划线且呈粗体)以产生阿昔洛韦回应性核糖开关。对于这些两个实例中的每一
者,在P2、P3、J1-2及J2-3区段(图7及图11)中用替代核苷酸在经靶标序列位置处产生随机RNA库。各区段在各经靶标序列位置处允许3个替代核酸,或替代地在各经靶标序列位置处
在+1位点中允许4个核苷酸的碱基缺失及插入以供如图8A至图8B及图9(M.florum IA)与图
12A至图12B及图13(B.subtilis xpt)中所指示的饱和诱变。引物扩增及试剂制备是在RNA
转录之后。所得RNA库在鸟嘌呤、鸟苷及脱氧鸟苷的存在下对氧化石墨烯进行阴性选择,接着为用阿昔洛韦及喷昔洛韦进行阳性选择。在阴性及阳性选择过程中,使用人类细胞生理
镁水平(0.5mM至1.2mM)且温度保持在37℃下。对经回收适体进行反转录且扩增PCR,接着进行转录且随后筛选至少8个连续轮次的选择。在平行方法中,在40℃下用额外阴性筛选来筛选适体。通过NextGen测序及分析来检查所得阳性池。合成个别适体且利用在35℃至40℃下呈人类细胞生理镁水平的等温热量测定法来检查亲和力。之后进行阳性阿昔洛韦及喷昔洛
韦特异性适体的选择,将适体与核糖核酸酶锤头型及枪式核糖核酸酶整合在一起。将阳性
阿昔洛韦选择性适体与枪式核糖核酸酶组合以鉴别经阿昔洛韦调节的核糖核酸酶。
(Harris KA RNA.2015 Nov;21(11):1852-8.doi:10.1261/rna)。变体在存在阿昔洛韦下及不存在喷昔洛韦下经受基于凝胶移位的PAGE纯化。另外,将环鸟苷选择性核糖开关立即置
放于环中的3′以剪接CAR/IL-7构建体的受体上游。在不存在阿昔洛韦下,剪接位点位置在核糖开关复合物中结合,但在存在阿昔洛韦下变得可接近,从而产生功能性CAR转录物。
[1244] 实施例5.活体内传播域的构建。
[1245] 利用重叠寡核苷酸合成(DNA2.0,Newark,California)来合成来自T细胞淋巴母细胞白血病(243InsPPCL(SEQ ID NO:82);246InsKCH(SEQ ID NO:101);241InsFSCGP(SEQ ID NO:102);244InsCHL(SEQ ID NO:103);及244InsPPVCSVT(SEQ ID NO:104);全部均来自
Shochat等人2011,J.Exp.Med.Vol.208No.5 901-908)的一系列组成性活性IL7受体(IL7R)
跨膜突变体。将经合成组成性活性IL7R跨膜突变体立即插入至在2A核糖体跳跃序列后面的
组成性表达慢病毒载体主链中,接着为抗CD19 CD3ζ表达盒,该表达盒包括CD8A柄(SEQ ID NO:79)及前导肽(SEQ ID NO:74)。HEK293包装细胞用IL7R跨膜突变体慢病毒载体及慢病毒
包装构建体来转染,进行生长,并使用本领域中已知的方法采集病毒上清液。经CD3/CD28刺激的T细胞用病毒上清液来转导且在IL2缺陷型AIM V、CTS OpTmizer T细胞扩增SFM或X-
VIVO 15培养基中生长4周,每周一次补充来自相同供体的冷冻PBMC。所得经扩增的表达
IL7R变体的经转导T细胞利用FACS分选来克隆且通过测序RT-PCR产物来鉴别IL7R构建体的
序列。选择243InsPPCL变体(PPCL)(SEQ ID NO:82)以供进一步进化以产生条件性活性CAR。
[1246] 实施例6.用于CAR-T活化及传播的辅助组分的筛选。
[1247] 一系列蛋白编码的域(ABCG1、SOCS1、SMAD2、TGFBR2、cCBL及PD1)及miRNA序列经构建以供并入至CD3-启动子驱动的CAR盒(cassette)的反向链上的合成内含子中。含有CD3-启动子驱动的CAR盒(cassette)及蛋白编码的域或miRNA序列的各构建体包括用于深度测
序的唯一条形码且使用Gibson组装来组装,接着转型,及在大肠杆菌(E.coli.)中进行库扩增。制备病毒原液且用于在AIM V、CTS OpTmizer T细胞扩增SFM或不具有IL2的X-VIVO 15
培养基中转导经CD3/CD28刺激的T细胞且使其在连续取样DNA的情况下在培养物中生长4周
以供用于密码鉴别的扩增及深度测序。库还经受PACBio全长测序以测定库多样性且解码条
形码组分。针对CAR CD3ζ域的协同活性测试miRNA序列及蛋白编码的域。
[1248] 实施例7.将反转录病毒包装及转导系统工程化为靶向静息T细胞以供选择T细胞整合及由PBMC表达。
[1249] 尽管可能利用瞬态转染产生高效价慢病毒载体,但此方法带有产生复制缺陷型重组反转录病毒(RCR)的风险且对于临床应用不可扩增。在此,通过将编码可诱导启动子的多个构建体及其调节剂同步引入至HEK293悬浮适应性细胞(HEK293S)中以稳定地产生病毒组
分、CAR基因及其调节组分来产生稳定的反转录病毒包装细胞系。两个不同的可诱导系统可用于暂时控制基因的表达。一个系统是基于两种转录因子的雷帕霉素-或雷帕霉素类似物
诱导的二聚合。一个转录因子由与ZFHD1 DNA结合域融合的FKPB蛋白质的三个拷贝组成且
其他转录因子由与p65活化域融合的FRB蛋白质组成。雷帕霉素或雷帕霉素类似物将转录因
子二聚合以形成ZFHD1/p65 AD且可在12xZFHD1结合位点处活化基因转录。
[1250] 如图3A至图3E中所显示的一系列载体是通过侧接转座子序列产生以用于整合至HEK293S基因组中。一旦整合至细胞的基因组中,这些序列充当调节组分及lox位点和/或
FRT位点(在此被称为着陆点)以供随后使用Cre和/或flp重组酶进行整合。初始5个构建体
含有编码嘌呤霉素抗性、GFP、RFP及经由N端PLss(牛促乳素信号肽)靶向细胞膜且经由衍生自血小板的生长因子受体(PDGFR)C端跨膜锚定域锚定至细胞膜的胞外MYC标记的多核苷酸
序列。初始5个构建体也可包括组成性最小CMV启动子及最小IL-2启动子、经雷帕霉素调节
的基于ZFHD1的启动子、四环素响应性组件(TRE)启动子或双向TRE(BiTRE)启动子。图3A中
的构建体含有编码与NFκB p65活化子域(p65 AD)融合的FRB域及与组成性表达的三个FKBP
重复融合的ZFHD1 DNA结合域的多核苷酸序列。图3A中的构建体也包括在雷帕霉素可诱导
的ZFHD1/p65 AD启动子下的HIV1 REV及HSV VP65域SrcFlagVpx。图3B中的构建体包括编码
在ZFHD1/p65 AD启动子的控制下的rtTA序列的多核苷酸。图3C中的构建体包括编码侧接有
loxP位点的嘌呤霉素抗性基因及侧接有lox2272位点的胞外MYC标记的多核苷酸。这些可选
标记的两者均在BiTRE启动子的控制下,该BiTRE启动子侧接有FRT位点。图3D中的构建体包括编码在TRE启动子的控制下侧接有loxP位点的GFP的多核苷酸。图3D中的构建体还包括在
TRE启动子与GFP的5’loxP位点之间的单个FRT位点。图3E中的构建体包括编码在ZFHD1/p65 AD启动子的控制下侧接有loxP位点的RFP的多核苷酸。图3E中的构建体还包括在ZFHD1/p65 AD启动子与RFP的5’loxP位点之间的单个FRT位点。图3C至图3E中的构建体充当其他多核苷酸序列的着陆点以插入至包装细胞系的基因组中。待插入的多核苷酸序列可侧接有lox位
点且使用Cre重组酶及loxP位点插入至基因组中。此导致编码嘌呤霉素抗性、胞外MYC标记、GFP及RFP的基因组区的插入及同步移除。替代地,多核苷酸序列可侧接有FRT位点,且使用flp重组酶及FRT位点来插入至基因组中,接着使用Cre重组酶移除编码嘌呤霉素抗性、胞外MYC标记、GFP及RFP的多核苷酸序列。
[1251] 为用整合至基因组中的着陆点产生包装细胞系,用等摩尔浓度的5种质粒(图3A至图3E)加5μg的经活体外转录的piggybac转座酶mRNA或5μg的具有用于在PEI的存在下以2:1或3:1的PEI比DNA(w/w)的比率表达piggybac转座酶的启动子的质粒或2μg至5μg piggybac转座酶蛋白使用阳离子肽混合物来共转染HEK293S细胞。在100nm雷帕霉素及1μg/mL多西环素的存在下用嘌呤霉素选择经转染细胞2至5天,接着荧光活化的细胞分选以收集表达GFP
及RFP的细胞。经分选细胞在不存在嘌呤霉素、雷帕霉素及多西环素下生长5天,且移除表达GFP及RFP的细胞,也用myc珠粒移除myc阳性细胞。接着筛选来自经阴性分选的细胞的个别
纯系以供利用雷帕霉素及多西环素以及所克隆的单个细胞诱导GFP及RFP。采集来自纯系的
DNA且经测序以用于整合分析。对在存在雷帕霉素及多西环素下具有GFP及RFP的强有力诱
导表达,在不存在雷帕霉素及多西环素下具有受限背景表达呈阳性的纯系进行扩增并进行
堆积。
[1252] 接着用含有三顺反子多核苷酸的构建体转染具有来自整合至基因组中的图3A至图3E的构建体的HEK293S细胞,该三顺反子多核苷酸编码DAF信号序列/抗CD3 scFvFc
(UCHT1)/CD14 GPI锚定连接位点(SEQ ID NO:287)、能够结合CD28/CD16B GPI锚定连接位
点(SEQ ID NO:286)的DAF信号序列/CD80胞外域及DAF信号序列/IL-7/DAF(SEQ ID NO:
286)及侧接用于整合至HEK293S基因组中的多核苷酸区的转座子序列(图4)。在转染之后,
细胞在不存在雷帕霉素及多西环素下扩增2天且选择为组成性红色的纯系。接着用用于表
达Cre重组酶的构建体瞬时转染阳性纯系以移除剩余基因组DNA及RFP编码区。同时转染含
有具有BiTRE启动子的多核苷酸、及在一个方向上编码gag多肽及pol多肽的多核苷酸区以
及在另一方向上编码麻疹病毒F蛋白质及H蛋白质的多核苷酸区的另一构建体(图4B)。Cre
重组酶将构建体整合至基因组中以产生显示于图4B中的经整合序列。针对在多西环素及雷
帕霉素的存在下的蛋白表达评估所得纯系且通过用于基因组整合的深度测序进行分析。保
留剩余TRE回应性GFP位点以用于慢病毒基因组插入。
[1253] 实施例8.慢病毒载体及反转录病毒包装的产生。
[1254] 用用于表达Flp重组酶的构建体(图4C)及含有多核苷酸序列的构建体转染实施例7中产生的反转录病毒包装稳定细胞系,该多核苷酸序列编码CAR及在CD3Z启动子(其在
HEK293S细胞中无活性)的控制下的淋巴增生性组件IL7Rα-insPPCL,其中CAR及IL7Rα-
insPPCL由编码T2A核糖体跳跃序列的多核苷酸序列隔开,且IL7Rα-insPPCL具有阿昔洛韦
核糖开关控制的核糖核酸酶。含CAR的构建体进一步包括cPPT/CTS及RRE序列以及编码HIV-
1Psi的多核苷酸序列。待被整合至基因组中的含CAR的构建体上的整个多核苷酸序列侧接
有FRT位点。含CAR的构建体的成功整合造成因此通过用用于表达Cre重组酶的构建体瞬时
转染而移除的GFP的组成性表达。HEK293S株在无血清培养基中生长。在经搅拌槽反应器中
生长至峰值细胞密度之后,将细胞稀释至70%峰值细胞密度且用100nM雷帕霉素处理2天以
诱导早期基因REV、Vpx及aCD3 scFv CD16B GPI、aCD28 scFv CD16B GPI及IL-7 SD GPI 
DAF的表达,接着在培养基中添加1μg/mL多西环素以诱导如Gag Pol、MV(Ed)-FΔ30、MV
(Ed)-HΔ18及包括治疗性靶标的慢病毒基因组的结构化组件的表达。病毒产量的水平由包
装序列的qPCR及p24 ELISA来检查。通过细胞的深度过滤及使用TFF盒的浓缩/渗滤,接着快速冷冻以供装入小瓶来采集病毒。
[1255] 实施例9.周边血单核细胞(PBMC)分离、转导及表达
[1256] 以下实施例说明在活体内扩增之前用于活体外处理PBMC的封闭系统的用途。作为一实施例,用酸性柠檬酸盐葡萄糖溶液(ACD)作为抗凝剂自个体抽取30ml至200ml的人类血
液至血液收集袋中。替代地,将血液抽取至采血管、注射器或等效物中且转移至空血液收集袋或IV袋中。根据制造商的说明书,在Sepax2细胞处理系统(BioSafe)上使用纯细胞试剂盒(目录号#CS-900.2,Omniamed)处理全部血液。将周边血单核细胞(PBMC)收集至培养袋中,或替代地注射器中。无菌地等份采集以用于细胞计数以测定存活细胞的数目。在具有呈至
多200ml最终体积的10IU/ml至300IU/ml IL-2(目录号#202-IL-010,R&D Systems)的X-
VIVO 15(目录号#08-879H,Lonza)或CTS OpTmizer细胞扩增SFM(目录号#A1048501,Thermo Fisher Scientific)培养基中将呈0.1×106至1.0×106个存活细胞/毫升的最终浓度的
PBMC转移至G-Rex100MCS透气细胞培养系统器件(Wilson Wolf)。除IL-2以外,可将CTS免疫细胞SR(目录号#A2596101,Thermo Fisher Scientific)添加至培养基。根据制造商的说明书,封闭G-Rex透气细胞培养系统器件可预涂布有Retronectin(目录号#CH-296,Takara)或类似衍生自纤连蛋白的等效物。
[1257] 将自周边血液分离的PBMC装载至PALL PBMC过滤器上,经由过滤器用10ml AIM V(Thermo Fisher Scientific)或X-VIVO 15培养基洗涤一次,接着在37℃下以5毫升/小时
用10ml至60ml慢病毒原液(如实施例8中所制备)灌注。接着再次用含有重组人类DNase
(Pulmozyme,Genentech)的AIM V、CTS OpTmizer T细胞扩增SFM或X-VIVO 15培养基洗涤
PBMC,接着用无DNase的林格氏乳酸盐(Lactated Ringers)(目录号#L7500,Braun)洗涤。接着经由过滤器将PBMC反灌注至注射器中。接着经由静脉内输注将细胞(细胞的靶标水平为5
×105至1×106个细胞/公斤)再输注至个体中。
[1258] 根据反转录病毒基因组内含有的核糖开关,将各别核苷类似物抗病毒药物或核苷类似物抗病毒前药(阿昔洛韦、伐昔洛韦、喷昔洛韦及泛昔洛韦)给予个体。可经口每天三次将任何治疗有效剂量(诸如500mg核苷类似物抗病毒药物或前药)给予个体。用核苷类似物
抗病毒药物或前药治疗较佳地在再输注之前(诸如2小时前)开始,且也可在再输注的时或
再输注一些时间后开始。治疗可继续至少1、2、3、4、5、7、10、14、21、28、30、60、90、120天或5、
6、9、12、24、36或48个月或更长。治疗可包括每天一次、两次、三次或四次施用核苷类似物抗病毒药物或前药。在再输注及治疗开始后,经由使用qPCR以定量病毒基因组的量在再输注
后第2天、第5天、第7天、第11天、第13天、第18天、第28天及第56天血液计数来测定经感染细胞的数目。经历发热或细胞因子释放综合症的个体可使核苷类似物抗病毒药物或前药的剂
量或频率减少或停止。若经感染T细胞未能在第18天扩增10,000至100,000倍,则可增加核
苷类似物抗病毒药物或前药的剂量或频率。可经由FDG PET成像及连续CT扫描来量测个体
的临床反应。可在经延长缓解期后或在过量T细胞传播超出总周边T细胞计量的30%的情形
下减少或停止核苷类似物抗病毒药物或前药的口服剂量
[1259] 实施例10.增加血管或组织pH的治疗性干预。
[1260] 为减少抗原结合域与其同源抗原的结合,将NaHCO3作为IV丸剂或通过IV输注来施用。标准剂量为1mg/kg的体重作为初始剂量,接着每10分钟0.5mg/kg。50毫升丸剂的NaHCO3将增加血清pH大约0.1的pH单位。若pH为7.0,则其需要四个50mEq安瓿的NaHCO3以将pH校正为7.40。
[1261] 实施例11.测试PBMC中的IL-7受体淋巴增生性/存活组件的活性。
[1262] 为测试IL-7Rα变体的其介导T细胞的细胞因子非依赖性存活的能力,用酸性柠檬酸盐(ACD)作为抗凝剂将三十毫升人类血液抽取至采血管中。遵循制造商的说明书使用用
Ficoll-PacqueTM(General Electric)的密度梯度离心来处理全部血液,以获得周边血单核细胞(PBMC)。将PBMC的等份与X-VivoTM 15培养基(Lonza)一起无菌地转移至12孔组织培养
盘的孔,至含50万存活细胞/毫升的1mL最终体积中的最终浓度。还将重组人类白细胞介素-
2(IL-2)(Novoprotein)添加至浓度为100IU/ml的一些样本。在50ng/ml的浓度下添加活化
抗CD3 Ab(OKT3,Novoprotein),以活化PBMC以供病毒转导。在37℃及5%二氧化碳下在标准湿润组织培养培育箱中培育盘隔夜。在培育隔夜之后,在5重感染(MOI)下将含有所要测试
构建体(图19A)的慢病毒颗粒制剂添加至个别孔。在37℃及5%二氧化碳下在标准湿润组织
培养培育箱中培育盘隔夜。在培育隔夜之后,收集12孔盘的孔中的每一者的内含物且离心
TM
以获得丸粒。用D-PBS+2%人类血清白蛋白(HSA)洗涤样本一次,将其再悬浮于X-Vivo15 培养基中,且转移至 6-孔透气细胞培养器件(Wilson Wolf)的孔。添加额外X-VivoTM 
15培养基以使各孔的最终体积达至30ml。将构建体中的每一者的匹配对照样本转移至
6-孔透气细胞培养器件(Wilson Wolf)的孔且添加额外培养基以用针对一些对照样
本的100IU/ml IL-2使最终体积达至30ml。在37℃及5%二氧化碳下在标准湿润组织培养培
育箱中培育 器件7天。在培养期间每2至3天将新鲜IL-2添加至含有IL-2的对照样本。
不具有IL-2的经匹配测试样本不进行补充。移除样本以供在扩增期间(Countess,Thermo 
Fisher)在第7天追踪细胞数目及存活率。
[1263] 图19A提供所测试的IL7Rα构建体的示意图。将这些构建体插入至重组慢病毒基因组中。复制缺陷型重组反转录病毒颗粒用于转导PBMC。图19A显示野生型IL7Rα(SEQ ID NO:
229)的示意图,其由信号序列(SS)、胞外域(ECD)、跨膜(TM)域及胞内域(ICD)组成。“1”指示纤连蛋白III型域的位点;“2”指示WSXWS基元的位点;“3”指示Box 1位点;“4”指示蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点的位点;及“5”指示Box 2位点。
[1264] 变体“A”为在位置243处具有InsPPCL(Shochat等人2011,J.Exp.Med.Vol.208No.5 901-908)但不具有S185C突变的IL-7Rα,其在具有GFP多肽、GSG接头及与其N端融合的P2A核糖体跳跃序列的转录物上表达。变体“B”为具有GFP多肽、GSG接头及与其N端融合的P2A核糖体跳跃序列以及信号序列与胞外域之间的Myc标记的IL-7RαInsPPCL。变体“C”类似于变体“B”,除其胞内域在位置292处截短以外。变体“D”类似于变体“A”,除其胞内域在位置292处截短以外。变体“E”为在其N端处截短使得信号序列及大部分胞外域(残基1至残基228)不存在的IL-7RαInsPPCL变体;变体“E”自胺基端依次还具有GFP多肽、GSG接头、P2A核糖体跳跃序列及与N端融合的eTag。氨基酸残基的编号基于IL7Rα(NCBI GI第002176.2号)。使用
Trypan Blue排除法针对在存在或不存在IL-2下的存活率测试含有变体中的每一者的T细
胞。
[1265] 如图19B中所显示,PBMC需要IL-2以供活体外存活。如图19B中所说明,未转染PBMC在转导后第7天在存在IL-2下具有约80%存活率且在不存在IL-2下具有0%存活率。具有IL-7RαInsPPCL(图19A中的IL-7Rα变体A及B)的全长版本的PBMC在转导后第7天在不存在
IL-2下具有大于20%的存活率,从而指示组成性活性IL-7RαInsPPCL受体的表达在这些细
胞中具有存活活性。此外,相比于野生型IL-7受体,表达具有经截短胞内域(ICD)的IL-7RαInsPPCL(图19A中的IL-7Rα变体C及D)变体的T细胞在转导后第7天具有增加的存活率。最
后,如图19B中显示的N端IL-7受体突变体(图19A中的IL-7Rα变体E)在这些细胞中具有存活活性。因此,此实施例说明,当在PBMC中表达时IL-7受体具有存活活性。
[1266] 实施例12.通过用VSV-G假型化且在其表面上表达抗CD3 scFvFc的反转录病毒颗粒转导新鲜经分离及未经刺激的人类T细胞的效率。
[1267] 重组慢病毒颗粒通过用编码gag/pol及rev的单独的慢病毒包装质粒及编码VSV-G的假型化质粒瞬时转染293T细胞(Lenti-XTM 293T,Clontech)来生产。用包装质粒共转染编码GFP、抗CD19嵌合抗原受体及在此称为F1-0-03(图20)的eTAG的第三代慢病毒表达载体
(在3’LTR中含有缺失导致自身失活)。细胞通过在FreestyleTM 293 Expression Medium
(ThermoFisher Scientific公司)中连续生长来适应悬浮培养。以1×106个细胞/毫升
(30mL)在125mL Erlenmeyer烧瓶中接种悬浮液中的细胞,并立即使用溶解于弱酸中的聚乙
烯亚胺(PEI)(Polysciences)转染。
[1268] 对于30mL细胞将质粒DNA稀释于1.5ml GibcoTM Opti-MEMTM培养基中。为获得用VSV-G假型化的慢病毒颗粒,所使用的总DNA(每mL培养体积中1μg)为具有以下穆尔比的4种质粒的混合物:2×基因组质粒(F1-0-03)、1×含Rev的质粒、1×含VSV-G的质粒及1×含
gag/pol的质粒。为获得用VSV-G假型化且在其表面上表达抗CD3-scFvFc-GPI的慢病毒颗
粒,所使用的总DNA(每mL培养体积中1μg)为具有以下穆尔比的5种质粒的混合物:2×基因
组质粒(F1-0-03)、1×含Rev的质粒、1×含VSV-G的质粒、1×含抗CD3-scFvFc-GPI的质粒及
1×含gag/pol的质粒。为获得用VSV-G假型化且在其表面上表达抗CD3-scFvFc-GPI及CD80-
GPI的慢病毒颗粒,所使用的总DNA(每mL培养体积中1μg)为具有以下穆尔比的6种质粒的混合物:2×基因组质粒(F1-0-03)、1×含Rev的质粒、1×含VSV-G的质粒、1×含抗CD3-scFvFc
的质粒、1×含CD80的质粒及1×含gag/pol的质粒。单独地,在1.5ml GibcoTM Opti-MEMTM中稀释PEI至每mL培养体积中2μg(与DNA的比为2:1比率)。在5分钟室温培育之后,将两种溶液彻底地混合在一起,且在室温下培育20分钟。将最终体积(3ml)添加至细胞。接着伴随
125rpm的旋转及具有8%CO2、在37℃下培育细胞72小时。含有抗CD3-scFvFc-GPI的质粒包
括衍生自OKT3或UCHT1的scFv及GPI锚定连接序列。UCHT1scFvFc-GPI载体编码包括人类Igκ信号肽(NCBI GI第CAA45494.1号的氨基酸1至氨基酸22)的肽(SEQ ID NO:278),该人类Igκ信号肽与UCHT1 scFv(NCBI GI第CAH69219.1号的氨基酸21至氨基酸264)融合,与具有位置
115处的A取代为T的人类IgG1 Fc(NCBI GI第AEV43323.1号的氨基酸1至氨基酸231)融合,
该人类IgG1 Fc与人类DAF GPI锚定连接序列(NCBI GI第NP_000565号的氨基酸345至氨基
酸381)融合。OKT3scFvFc-GPI载体编码包括人类Igκ信号肽(NCBI GI第CAA45494.1号的氨
基酸1至氨基酸22)的肽(SEQ ID NO:279),该人类Igκ信号肽与OKT3 scFv(SEQ ID NO:285)融合,该OKT3 scFv与人类IgG1 Fc(NCBI GI第AEV43323.1号的氨基酸1至氨基酸231)融合,该人类IgG1 Fc与人类DAF GPI锚定连接序列(NCBI GI第NP_000565号的氨基酸345至氨基
酸381)融合。CD80-GPI载体编码包括人类CD80信号肽及与人类CD16b GPI锚定连接序列
(NCBI GI第NP_000561号的氨基酸196至氨基酸233)融合的胞外域(NCBI GI第NP_005182号
的氨基酸1至氨基酸242)的肽(SEQ ID NO:280)。
[1269] 在72小时后,采集上清液且通过以1,200g离心10分钟来澄清。将经澄清上清液倒入新试管中。在4℃下,通过以3,300g隔夜离心来沉淀慢病毒颗粒。舍弃上清液,且将慢病毒颗粒丸粒再悬浮于1:100的初始体积的X-VivoTM 15培养基(Lonza)中。利用连续稀释及在转导72小时后的293T及Jurkat细胞中利用流式细胞术分析GFP表达来滴定慢病毒颗粒。
[1270] 将周边血单核细胞(PBMC)首先自供体12F及供体12M的ACD(酸性柠檬酸盐)试管中的新鲜血液或自供体13F的血块黄层分离,利用加州圣地亚哥血库(San Diego Blood 
Bank,CA)收集并分配。根据制造商的说明书,进行基于SepMateTM 50(StemcellTM)的
Ficoll-Paque  (GE Healthcare Life Sciences)上的PBMC的梯度密度分离。根据各
SepMateTM试管将稀释于PBS-2%HIFCS(热灭活胎牛血清)中的30mL的血液或血块黄层分层。
在室温下以1,200g离心20分钟之后,收集PBMC层,经汇集且用45mL的PBS-2%HIFCS洗涤三
次,并在室温下以400g离心10分钟。接着在室温下在10mL的RBC裂解缓冲液(Alfa Aesar)中培育丸粒10分钟,且用45mL的PBS-2%HIFCS洗涤额外两次,并在室温下以400g离心10分钟。
在以下转导及培养培养基中进行最终洗涤:供体13F的X-VivoTM 15或供体12F及供体12M的
RPMI-1640+10%HIFCS。不采取额外步骤以移除单核细胞。在分离之后,新鲜及未经刺激
PBMC经再悬浮在各别培养基中达到1×106/mL的最终浓度,且用先前公开的慢病毒颗粒转
导这些PBMC(两个重复或三个重复)。使传导在37℃、5%CO2下在供体13F的X-VivoTM 15培养基中或在供体12F及供体12M的RPMI-1640+10%HIFCS中进行14小时传导通常在1毫升/孔的
12孔盘形式中在MOI 1下进行。对于动力学实验,0.5×106PBMC/mL是在7mL最终溶液、在MOI 
1下,伴随125rpm的旋转及具有8%CO2,在37℃下在125mL振荡烧瓶中培育2小时至20小时来转导。在与慢病毒一起培育所选择时间后,用供体13F的X-VivoTM 15培养基或供体12F及供体12M的PBS+2%HIFCS洗涤三次,且最终在37℃,5%CO2下在供体13F的X-VivoTM 15培养基或供体12F及供体12M的RPMI-1640+10%HIFCS中在1×106/mL的细胞密度下培育。在转导后
第3天开始,并且从此开始每隔2-3天,将培养基体积加倍且用IL-2补充至最终浓度100U/
mL。在转导后的不同天(第3天至第17天)收集样本,以利用GFP表达水平评估所产生的各类
型的慢病毒的转导效率。
[1271] 在转导后的不同天,对于具有或不具有呈1μg/ml的OKT3抗体(Biolegend)下用VSV-G假型化的慢病毒颗粒,VSV-G假型化且在其表面上表达抗CD3 scFvFc-GPI的慢病毒颗
粒,或用VSV-G假型化且在其表面上表达抗CD3 scFvFc-GPI及CD80-GPI的慢病毒颗粒,收集
100μL的细胞且利用流式细胞术对于CD3+细胞群体中的GFP的表达进行分析。
[1272] 图21A及图21B分别显示在用所指示慢病毒颗粒转导自供体12M的新鲜经分离及未经刺激PBMC 14小时后第3天、第6天、第9天、第13天及第17天的总CD3+群体中的CD3+GFP+细胞的百分比(%)的直方图及CD3+GFP+群体的每孔绝对细胞数量的直方图。各棒表示重复的
平均值+/-SD。图21A及图21B显示,用VSV-G假型化慢病毒颗粒且在慢病毒颗粒的表面上表
达抗CD3-scFvFc有效地转导新鲜经分离及未经刺激的PBMC。衍生自OKT3或UCHT1的抗CD3 
scFv’s在呈scFvFc-GPI的形式时是有效的。
[1273] 图22A及图22B分别显示在用所指示慢病毒颗粒转导自供体13F的新鲜经分离及未经刺激PBMC 14小时后第3天及第6天的总CD3+群体中的CD3+GFP+细胞的百分比(%)的直方
图及CD3+GFP+群体的每孔绝对细胞数量的直方图。请注意,“A”为使用经VSV-G假型化的慢病毒颗粒的结果(三个重复实验);“B”为在向转导培养基添加OKT3 Ab(1μg/mL)的情况下使用经VSV-G假型化的慢病毒颗粒的结果(两个重复实验);“C”为使用在其表面上表达经GPI锚定的UCHT1scFvFc的经VSV-G假型化的慢病毒颗粒的结果(三个重复实验);及“D”为使用在其表面上表达经GPI锚定的UCHT1scFvFc及经GPI锚定的CD80的经VSV-G假型化的慢病毒
颗粒的结果(两个个重复实验)。各棒表示两个重复或三个重复的平均值+/-SD,如图22A所
指示。图22A及图22B显示,当进行转导14小时时,用VSV-G假型化慢病毒且在其表面上表达抗CD3-scFvFc-GPI及CD80-GPI也有效地转导新鲜经分离及未经刺激的PBM。
[1274] 图23A及图23B分别显示在用所指示慢病毒颗粒转导自供体12M的新鲜经分离及未经刺激PBMC持续暴露的所指示时间(2小时至20小时)(亦即,细胞与慢病毒颗粒在转导反应
混合物中的接触)后第3天、第6天及第9天的总CD3+群体中的CD3+GFP+细胞的百分比(%)的
直方图及CD3+GFP+群体的每孔绝对细胞数量的直方图。转导是在如所指示的盘或振荡器烧
瓶中进行。各棒表示用VSV-G(“[VSV-G]”)假型化的慢病毒颗粒的两个重复的平均值+/-SD;
其他实验不具有重复。图23A及图23B显示,可用用VSV-G假型化及在其表面上表达抗CD3 
scFvFc及CD80的慢病毒颗粒在少至2小时内有效地转导新鲜经分离及未经刺激的PMBC。
[1275] 值得注意的是,随后的试验使用仅使用Rev、VSV-G、gag/pol及F1-0-03(而非编码抗CD3或CD80的载体)在存在可溶性抗CD3抗体(100ng/ml)下转导新鲜分离的静息PBMC 2.5
小时所产生的慢病毒颗粒来进行。转导使用3种不同的可溶性抗CD3抗体纯系来实现。针对
CD3抗体纯系HIT3A、OKT3及UCHT1,在第6天通过CD3+GFP+细胞量测的转导效率分别为
4.31%、3.27%及0.52%。在不存在可溶性抗体下的背景转导效率为0.06%。
[1276] 实施例13.插入至EF-1α启动子内含子中的miRNA的功能性。
[1277] 设计四个单独 基因片段,各自含有包括miR-155 5’侧接序列或“5’臂”(SEQ ID NO:256)及miR-155 3’侧接序列或“3’臂”(SEQ ID NO:260)的miR-155框架。对于各 靶向CD3zeta mRNA转录物的唯一miRNA片段用于替换miR-155茎-环前体。各
含有经设计以有助于将全部四个 作为单链组装至EF-1α启动子内含子中的
40bp重叠序列。使用用于进行 组装ultra的商用试剂盒(NEBuilder,New England 
Biolabs,Inc.)来组装
[1278] 含有miRNA(在序列SEQ ID NO:255中)的合成EF-1α启动子及内含子A为驱动慢病毒载体主链中所含有的GFP及eTag的表达的转殖基因表达盒(cassette)的部分(具有由西
妥昔单抗识别的GFP及例示性eTag的慢病毒载体主链在此称为F1-0-02;图24A及24B)。在表
3中指示的SEQ ID NO:255中的各 及其各别组分的核苷酸位置为图24B中的各“特
征”的位置。将四个miRNA适当组装至慢病毒载体主链中是通过对经修饰的EF-1α启动子及内含子区进行全面测序来确认的。
[1279]
[1280] 表3.SEQ ID NO:255中的特征的核苷酸位置
[1281] 在其基因中含有编码针对CD3zeta的四个miRNA的核酸的复制缺陷型慢病毒颗粒通过将以下四个质粒瞬时共转染至悬浮HEK293细胞中来产生:含有编码经修饰以包括靶向
CD3zeta mRNA转录物的四个miRNA的F1-0-02的核酸的质粒,编码VSV-G的质粒,编码REV的
质粒及编码GAG-POL的质粒。在48小时后采集慢病毒颗粒上清液且经PEG沉淀24小时。离心
上清液,且将成丸粒慢病毒颗粒再悬浮于不具有IL-2的完全PBMC生长培养基中。利用
Jurkat细胞的48小时转导来计算慢病毒颗粒效价。
[1282] 对于转导,在第0天融解PBMC且与100U/mL的hrIL-2一起培育24小时。在第1天,经由经CD3/CD28结合的珠粒活化PBMC。在第2天,在10MOI下用含有具有编码miRNA的核酸序列的基因组的慢病毒颗粒转导经活化PBMC。扩增细胞直至第11天,其中每两天添加新鲜hrIL-
2。在第7天、第9天及第11天,采集1百万个细胞以供FACS分析。
[1283] 针对CD3 Epsilon表面表达,使用经PE结合的OKT-3抗体(Biolegend)染色细胞。表达水平是利用GFP阳性群体(经转导细胞)中的PE的平均荧光强度来测定。在衍生自F1-0-02
的反转录慢病毒颗粒与衍生自F1-0-02的反转录慢病毒颗粒之间比较经转导细胞的表达水
平,其中将编码连续定位的CD3z miRNA核酸序列插入至EF-1α启动子及内含子A中。
[1284] 结果显示于图25中。此数据显示,靶向由EF-1α启动子内含子A内的核酸序列编码的CD3zeta的连续miRNA在基因敲除CD3复合物的表达时有效。
[1285] 实施例14.插入至EF-1α启动子内含子中的连续抑制性RNA的位置独立性
[1286] 克隆
[1287] 四个表达miRNA的慢病毒载体构建体经设计以测试在包含连续的4个miRNA前体的结构中的个别miRNA前体的处理。表4显示个别构建体的名称及各构建体中的miR-TCRα的位置。
[1288] 构建体 位置1 位置2 位置3 位置4TCRa-P1 miR-TCRa miR-155 miR-PD-1 miR-CTLA-4
TCRa-P2 miR-155 miR-TCRa miR-PD-1 miR-CTLA-4
TCRa-P3 miR-155 miR-PD-1 miR-TCRa miR-CTLA-4
TCRa-P4 miR-155 miR-CTLA-4 miR-PD-1 miR-TCRa
[1289] 表4.含有多顺反子miRNA的构建体
[1290] 各miRNA含有用于实施例13中的miR-155框架,亦即,miR-155 5′臂(SEQ ID NO:256)、miR-155 3′臂(SEQ ID NO:260)、环(SEQ ID NO:258)及如表5中所显示的茎序列的特异性次序。类型II组装方法用于达成将四个miRNA片段组装至慢病毒载体构建体(F1-0-02;
提供于实施例13中且显示于图24A中)的EF-1α内含子内的其合适位置中。
[1291]
[1292]
[1293] 其中:
[1294] SEQ ID NO:267=TCRαmiRNA茎1;ATATGTACTTGGCTGGACAGC
[1295] SEQ ID NO:268=TCRαmiRNA茎2;GCTGTCCACAAGTACATAT
[1296] SEQ ID NO:269=接头1;CACATTGGTGCCGGATGAAGCTCTTATGTTGCCGGTCAT
[1297] SEQ ID NO:270=mir-155茎1;CTGTTAATGCTAATCGTGATA
[1298] SEQ ID NO:271=mir-155茎2;TATCACGATTATTAACAG
[1299] SEQ ID NO:272=接头2;GTTGCCGGAGTCTTGGCAGCGAGAGATCACTATCAACTAA
[1300] SEQ ID NO:273=PD-1miRNA茎1;TACCAGTTTAGCACGAAGCTC
[1301] SEQ ID NO:274=PD-1miRNA茎2;GAGCTTCGCTAAACTGGTA
[1302] SEQ ID NO:275=接头3;GTGTTAATTGTCCATGTAGCGAGGCATCCTTATGGCGTGG
[1303] SEQ ID NO:276=CTLA-4miRNA茎1;TGCCGCTGAAATCCAAGGCAA
[1304] SEQ ID NO:277=CTLA-4miRNA茎2;TTGCCTTGTTTCAGCGGCA
[1305] 表5:miRNA构建体中的序列
[1306] 慢病毒颗粒产生
[1307] 四个构建体及对照F1-0-02(其不包括编码miRNA的核酸序列)用于在293T细胞的30mL悬浮培养物中产生慢病毒颗粒。采集慢病毒颗粒且利用PEG沉淀浓缩。功能性慢病毒颗粒效价通过在多次稀释(1:1000、1:10000、1:100000)下转导Jurkat细胞,在37℃下培育慢病毒颗粒及细胞2天,用FACS缓冲液洗涤细胞2×及利用流式细胞术分析GFP来获得。关于慢
病毒颗粒产生的其他细节在本文实施例13中提供。
[1308] 转导
[1309] 对于转导,融解PBMC且在含有100U/mL hrIL-2的完全培养基中回收隔夜。经由暴露于经CD3/CD28结合的珠粒24小时来活化1×105PBMC。在MOI 10下用四个miRNA构建体中
的每一者或用对照反转录病毒颗粒F1-0-02在两个重复孔中转导细胞。每3天用100U/mL 
hrIL-2供应细胞且扩增这些细胞直至第10天。
[1310] FACS
[1311] 采集细胞以供FACS分析,该FACS分析确认用复制缺陷型慢病毒载体转导的细胞。结果显示,在实验中将大约等量的含有miRNA的病毒递送至各孔。
[1312] 细胞-对-ct miRNA RT-qPCR及分析
[1313] RT-qPCR分析经设计以检测表达及将miRNA前体加工为经成熟加工的miR。通过首先将所有miR-TCRa ct值归一化为RNU48内部对照以产生ΔCt值来进行分析。接着,自未经
转导的对照的ΔCt减去各经转导样本的ΔCt值以产生ΔΔCt。此值表示各经转导样本相对
于未经转导的对照中的经加工miR-TCRa miRNA的量。
[1314] 如图26中所显示,RT-qPCR分析成功地检测到用含有miR-TCRα的复制缺陷型慢病毒颗粒转导的样本中的经加工miR-TCRα。此外,结果清晰地指示,在所测试的四个位置中的任一者处的miRNA TCRα加工中无显著影响。
[1315] 实施例15.受微环境限制的生物的表达CAR的T细胞的细胞毒性活性可通过改变pH来控制。
[1316] 以下实施例说明,表达MRB-CAR的经转导T细胞(也称为效应细胞)的细胞毒性活性可如何通过改变微环境的pH来调节。在此实施例中,编码能够结合同源抗原靶标1(抗靶标
1)的MRB-CAR的核酸为用于产生复制缺陷型重组慢病毒颗粒。用慢病毒颗粒转导淘选T细
胞,且在改变培养基的pH之前及之后使用实时细胞分析(RTCA)来比较效应细胞的细胞毒性
活性。
[1317] 复制缺陷型重组慢病毒颗粒的产生
[1318] 测试编码T1B的核酸(实施例3中的来自候选MRB-CAR的系列的抗靶标1MRB-CAR)。复制缺陷型重组慢病毒颗粒是通过用慢病毒表达载体及核酸瞬时转染Lenti-X 293T细胞
(Clontech,加州山景城)来产生,这些核酸包括编码MRB-CAR或对照物C1(含有GMCFsp及
eTAG(SEQ ID NO:284))的区段,但不包括抗靶标1MRB-CAR。细胞通过在Freestyle 
293Expression Medium(ThermoFisher Scientific,马萨诸塞州沃尔瑟姆)中连续生长来
适应悬浮培养。使用溶解于弱酸中的PEI(Polysciences,Warminster,PA)转染悬浮液中的
6
细胞。细胞(30mL)在125mL Erlenmeyer烧瓶中生长至1×10个细胞/毫升。
[1319] 对于30mL细胞将总DNA稀释于1.5ml Optimem培养基中。总DNA(每mL培养体积中1μg)为具有以下摩尔比的4种质粒的混合物:包括慢病毒包装组件、LTR及编码T1B的核酸的2
×基因组质粒,1×编码Rev的质粒,1×编码VSVg的质粒及1×编码Gagpol的质粒。单独地,
在1.5ml Optimem中稀释PEI至每mL培养体积中2μg(与DNA的2:1比率)。在5分钟室温培育之后,将两种溶液充分混合在一起,且在室温下培育20分钟。将最终体积(3ml)添加至细胞。接着伴随120rpm的旋转及具有5%至8%CO2、在37℃下培育细胞72小时。
[1320] 在72小时后,通过以1,000g离心10分钟来采集上清液。将上清液倒入新鲜试管且添加PEG溶液(PEG-IT,System Biosciences)中的1/4上清液体积。通过在4℃下培育隔夜来沉淀复制缺陷型重组慢病毒颗粒,接着在4℃下以1,500g离心20分钟。移除上清液,且将细胞再悬浮于1:100体积的X-VIVO 15培养基中。利用Jurkat细胞中的eTAG表达滴定病毒。
[1321] T细胞转导/扩增
[1322] 自AllCells获得淘选T细胞。如上论述制造抗靶标1 MRB-CAR复制缺陷型重组慢病毒颗粒。在慢病毒转导前两天,融解细胞且在X-VIVO  15培养基(Lonza,Basel,
Switzerland)中与5%人类血清(Valley Biomedical Inc.,Winchester,VA)及10mM N-乙
酰基L-半胱氨酸(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)一起培养。添加重组人类IL-2(R&D 
Systems,明尼苏达州明尼阿波利斯)达到100IU/mL的最终浓度。在慢病毒转导前二十四小
时,将初级人类T细胞以0.5×106个细胞/孔接种至12-孔盘中且在1:3细胞:珠粒比率下使
用Dynabeads人类T-活化子CD3/CD28(ThermoFisher Scientific)来活化。在转导当天,在
5MOI下将慢病毒颗粒溶液添加至孔。使经传导淘选T细胞在X-VIVO 15培养基中维持~106
个/mL持续3天,接着用100IU/mL IL-2转移至具有30毫升/孔的X-VIVO 15培养基的6-孔G-
Rex盘中。在进行实验之前培养细胞至少10天,且每隔一天添加IL-2。
[1323] pH变化细胞毒性分析
[1324] 通过添加NaHCO3或NaOH改变pH之前及之后的经转导T细胞的细胞毒性活性是使用xCELLigence系统来量测。简言之,在实验前一天,用含有40mM HEPES及40mM PIPES(pH 
6.7)的X-VIVO 15培养基将靶标细胞(用在细胞表面上表达靶标1的构建体稳定地转染的
CHO细胞(CHO-靶标1细胞))以10,000个细胞/孔接种至96-孔E-盘(ACEA;加州圣地亚哥)中。
融解先前用含有编码如上论述产生的T1B或C1(分别为T1BVP及C1VP)的核酸的慢病毒颗粒
转导的经冷冻保存的效应细胞且在含有100IU/mL的IL-2(R&D Systems,明尼苏达州明尼阿
波利斯)的X-VIVO 15培养基中培养两天。在实验当天,洗涤用T1BVP或C1VP转导的细胞且将其再悬浮于含有40mM HEPES及40mM PIPES(pH 6.7)的X-VIVO 15培养基中,且接着以1:1的
效应细胞/靶标细胞比率(E/T)添加至实验孔中。
[1325] 每5分钟获取在xCELLigence系统(ACEA)上量测的阻抗读数且报告为细胞指数(CI)以定量细胞汇合度作为细胞增生/细胞裂解的量测。添加效应细胞后大约3小时,将8μl的7.5%NaHCO3或14μl的0.5M NaOH添加至具有含有40mM HEPES及40mM PIPES(pH 6.7)的
X-VIVO 15培养基的孔中以将pH自6.7增加至7.4。在添加效应细胞后继续阻抗读数大约20
小时。如下计算特异性细胞溶解的百分比:((CI靶标+经C1VP转导的效应T细胞)-(CI靶标+
经T1BVP转导的效应T细胞))/(CI靶标+经C1VP转导的效应T细胞)×100。
[1326] 对RTCA杀伤分析的HCl切换
[1327] 通过添加HCl改变pH之前及之后的经转导T细胞的细胞毒性活性是使用xCELLigence系统来量测。简言之,在实验前一天,用含有40mM HEPES及40mM PIPES(pH 
7.4)的X-VIVO 15培养基将CHO-靶标1细胞以10,000个细胞/孔接种至96-孔E-盘。融解先前
用C1VP或T1BVP转导的经冷冻保存的效应细胞且在含有100IU/mL的IL-2的X-VIVO 15培养
基中培养两天。在实验当天,洗涤用T1BVP或C1VP转导的细胞且将其再悬浮于含有40mM 
HEPES及40mM PIPES(pH 7.4)的X-VIVO 15培养基中,且接着以1:1的效应细胞/靶标细胞比
率(E/T)添加至实验孔中。
[1328] 每5分钟获取阻抗读数且报告为细胞指数(CI)。添加效应细胞后大约3小时,将8μl的1M HCl添加至具有含有40mM HEPES及40mM PIPES(pH 7.4)的X-VIVO 15培养基的孔中以将pH自7.4切换至6.7。在添加效应细胞后继续阻抗读数大约20小时。如下计算特异性细胞
溶解的百分比:((CI靶标+C经1VP转导的效应T细胞)-(CI靶标+经T1BVP转导的效应T细
胞))/(CI靶标C1VP)×100。
[1329] 结果
[1330] 在pH 6.7及pH 7.4下比较能够在降低的pH下结合具有增加的活性的同源抗原靶标1的MRB-CAR的细胞毒性活性。用编码抗靶标1MRB-CAR的慢病毒颗粒转导的T细胞是用于
杀伤表达靶标1的CHO细胞,且接着增加pH以测定细胞毒性活性是否可由pH变化抑制。如图
27A及图27B中所显示,添加NaHCO3或NaOH至活性CAR-T细胞的微环境以增加培养基的pH抑
制了表达MRB-CAR的T细胞的细胞毒性活性。这些结果显示,表达活性MRB-CAR的T细胞可杀
伤表达靶标的细胞,且接着此杀伤活性可通过增加微环境的pH来抑制。
[1331] 也测定了待利用pH变化活化的表达MRB-CAR的T细胞的细胞毒性活性的能力。如图27C中所显示,表达抗靶标1MRB-CAR的T细胞的对于CHO-靶标1细胞的细胞毒性活性在7.4的
pH较低且该活性是通过添加HCl以降低微环境的pH来增加。此外,这些结果显示,表达MRB-CAR的T细胞的细胞毒性活性可由微环境内的pH的变化(通过在增加pH后降低细胞毒性活性
及在减少pH后增加细胞毒性活性两者)来调节在此非限制实施例中,pH自pH 6.7增加且自
pH 7.4减少。
[1332] 实施例16.碳酸氢盐施用可增加小鼠中的微环境的pH。
[1333] 以下实施例显示,活体内肿瘤微环境的pH可通过施用药用试剂来调节。在此实施例中,药用试剂为碳酸氢钠,且肿瘤微环境为小鼠中的CHO异种移植肿瘤。该实施例包括量测活体内及活体外两者的肿瘤微环境的pH的两种方法。
[1334] 大多数实体肿瘤的胞外微环境是酸性的,通常具有在6.5与6.9之间的pH。相反,正常组织pH系碱性的,通常具有在7.2与7.5之间的pH。然而,直接地量测肿瘤微环境的活体内pH可能为困难的。幸运的是,组织蛋白酶的相关蛋白酶活性在较低pH下较高且在较高pH下较低。因此,肿瘤内组织蛋白酶活性的量测可充当肿瘤微环境的pH的替代量测。为量测组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、组织蛋白酶S、组织蛋白酶K、组织蛋白酶V及组织蛋白酶D的活体内活性,使用近红外ProSense 750 FAST探针(PerkinElmer)。为进一步确认利用碳酸氢钠的
施用的肿瘤微环境中的pH的调节,用酚红处理所切除肿瘤并注意颜色。酚红为经历pH有关
的颜色转换的pH指示剂。酚红的钠盐广泛用于细胞培养培养基中以鉴别pH值。酚红的溶液
在6.4或更低的pH下呈黄色颜色,或在约pH 7.0下呈橙色颜色,在约pH 7.4下呈红色颜色及在高于pH 7.8下紫色颜色。
[1335] 根据研究所动物看护与使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准的方案来处理小鼠。皮下(sc)中国仓鼠卵巢(CHO)肿瘤异种移植建立于12
周龄至14周龄雌性B-NSG小鼠(NOD-PrkdcscidIl2rgtm1/Bcgen(北京百奥赛图基因生物技
术有限公司))的后腿中。简言之,在DPBS(ThermoFisher)中洗涤经培养CHO细胞(ATCC,弗吉
6
尼亚州马纳萨斯),经计数,并再悬浮于冷DPBS中且在上在1.5×10 个细胞/200微升的浓
度下与合适体积的Matrigel ECM(Corning;最终浓度5mg/mL)混合。
[1336] 动物用于在注射之前移除毛发(Nair)的情况下使用标准经批准的麻醉的注射。将含200μl的细胞悬浮液的ECM皮下注射至小鼠的后腿中。一旦肿瘤可触,使用侧径计2次/周
2
量测肿瘤。使用以下方程式计算肿瘤体积:(最长直径*最短直径)/2。当平均肿瘤体积达到
200mm3时,将小鼠随机地分配至各别处理组。
[1337] 在施用碳酸氢盐前两天,将B-NSG小鼠的饮用水自酸性改变为常规pH的经高压灭菌纯化的水。在随后一天,经由100μl尾部静脉注射(4nmol ProSense 750FAST探针/100μl PBS)将750 ProSense FAST探针施用至6个携带有CHO-异种移植肿瘤的小鼠。使单独一组的
携带有CHO-异种移植肿瘤的小鼠未经处理。在随后一天,施用碳酸氢钠且使用Caliper 
IVIS Lumina XR对用ProSense 750 FAST探针处理的小鼠进行成像。简言之,使用含3%O2 
2L/min异氟烷的O2载气以2L/min麻醉小鼠,且接着置放向成像期间经麻醉小鼠供应1.5%
异氟烷的鼻锥。图像采集由5秒的近红外探针(745/810nm激励/发射波长)的暴露组成。将荧光图像覆盖在小鼠的正常光图像上。在施用PBS(对照)或碳酸氢钠之前获取时间0(处理前)
图像。接着经由腹膜内注射(ip)向小鼠施用1毫升/小鼠PBS(对照,ThermoFisher)或1毫升/小鼠1M碳酸氢钠(Shanghai Experiment Reagent Co.,LTD)。接着在施用PBS或碳酸氢盐后
30min对小鼠进行成像。调整所收集荧光图像以具有相同的最小值、最大值及临限值。在此研究中将光子计数定义为相对荧光单位(RFU)。通过将各小鼠中的来自30min时间点的光子
计数归一化为处理前时间点(时间0;100%)来计算RFU。由于时间0处理前值处的各小鼠中
的荧光值之间的可变性,不同时间点处的所观测荧光强度值仅针对个别小鼠归一化而不针
对处理前值。
[1338] 在实验的单独臂中,未接受NIR组织蛋白酶探针的6只小鼠在腹膜内施用PBS或碳酸氢钠后1.5小时利用颈椎脱位来安乐死。自各小鼠切除CHO异种移植肿瘤。用解剖刀将异
种移植肿瘤分成两半且置放于皮式培养皿(petri dish)上。接着使用解剖刀重复地切割/
分割肿瘤组织半部。将水或0.05%酚红溶液(50mg酚红/100ml水)分别逐滴添加至各肿瘤半
部。注意颜色,且在移除肿瘤异种移植样本后,即获取经处理肿瘤异种移植及留在皮式培养皿上的酚红溶液的图像。
[1339] 结果
[1340] 图29显示来自在施用PBS(对照;n=3)或碳酸氢盐(n=3)之前及之后携带CHO-异种移植肿瘤的小鼠中的成像肿瘤内组织蛋白酶活性的RFU结果(具有SEM的平均值)。这些结
果表明,碳酸氢钠施用可增加活体内肿瘤微环境的pH,如由在腹膜内碳酸氢钠施用后观测
到的降低的组织蛋白酶活性所证明。
[1341] 使用自相对于经PBS处理的小鼠(n=3)的经碳酸氢钠处理的小鼠(n=3)切除的肿瘤组织观测到酚红指示剂自黄色/橙色变为红色的颜色改变。这些结果表明,在腹膜内施用后,碳酸氢钠施用增加活体内肿瘤微环境的pH,如由酚红指示剂自黄色/橙色变为红色的颜色改变所证明。
[1342] 实施例17.候选嵌合多肽淋巴增生性组件的识别
[1343] 在此实施例中,候选(推定)嵌合淋巴增生性组件的两个嵌合多肽库(库1及库2)经组装至来自胞外-跨膜阻断序列库、胞内阻断序列库及根据图30及图31中所提供的编码嵌
合多肽的构建体的条形码库的病毒载体中。库转导的PBMC的增生随时间进行:以一周间隔
自PBMC提取基因组DNA且扩增条形码区以用于DNA测序以估计在这些混合的含有测试候选
嵌合淋巴增生性组件中的每一者的PBMC培养物中的细胞数目。因此,筛选测试候选嵌合淋
巴增生性组件在不存在IL-2或任何其他外源性细胞因子下促进PBMC细胞增生的能力。
[1344] 在此研究中制备且分析两个库:库1(其用于识别为库1A、1.1A及1.1B的筛选中)的构建体在候选嵌合多肽的5’末端处侧接有CAR,而库2(其用于识别为库2B及2.1B的筛选中)的构建体不包括CAR(图30及图31)。图30提供含有多核苷酸序列的非限制性例示性转基因
表达盒的示意图,该多核苷酸序列编码由慢病毒载体主链中的EF-1α启动子及Kozak类型序列(GCCGCCACC(SEQ ID NO:519))驱动的库1的CAR及候选嵌合淋巴增生性组件。CAR经FLAG
标记且含有针对CD19的ASTR、CD8的茎及跨膜部分,及来自CD3z的胞内活化域。库1的各候选淋巴增生性组件包括3个模块:一个胞外/跨膜模块(P1-2)及2个胞内模块(P3及P4)。P1-2模块还编码识别和/或消除域(TAG)。三重终止序列(TAATAGTGA(SEQ ID NO:520))自DNA条形
码(P5)中分离P4。WPRE
[1345] (GTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCC
TTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG(SEQ ID NO:521))存在于最后一
个终止密码子(开始于最后一个终止密码子的最后一个核苷酸之后的4bp)与3’LTR(其开始
于WPRE的最后一个核苷酸之后的83个核苷酸)之间。
[1346] 库1的CAR及P1-2通过编码T2A核糖体跳跃序列的多核苷酸序列间隔开。
[1347] 图31提供含有多核苷酸序列的非限制性例示性转基因表达盒的示意图,该多核苷酸序列编码由慢病毒载体主链中的EF-1α启动子及Kozak类型序列(GCCGCCACC(SEQ ID NO:
519))驱动的库2的候选CLE。库2的各候选淋巴增生性组件包括3个模块:一个胞外/跨膜模
块(P1-2)及2个胞内模块(P3及P4)。P1-2模块还编码识别和/或消除域(TAG)。三重终止序列(TAATAGTGA(SEQ ID NO:520))自DNA条形码(P5)中分离P4。WPRE
[1348] (GTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCC
TTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG(SEQ ID NO:521))存在于最后一
个终止密码子(开始于最后一个终止密码子的最后一个核苷酸之后的4bp)与3’LTR(其开始
于WPRE的最后一个核苷酸之后的83个核苷酸)之间。
[1349] 两个库的经组装候选嵌合多肽部分遵循具有3个位置(1个胞外/跨膜模块(P1-2)及2个胞内模块(P3及P4),其中的一者可为提前终止信号)的完全相同的设计。包括由各域
中的每一者之间的核酸序列编码的GGS接头作为构建体组件产物。编码Myc或eTAG识别和/
或消除域(在表6中称为“eTAG”或“Myc Tag”)的完整或变体形式的核酸经插入各截短细胞因子受体(或选择LMP1构建体)的胞外域的5’作为P1-2模块的部分,以使得所编码的候选嵌合多肽在具有胞外域的框中包括识别和/或消除域。信号序列插入在库1中的编码CAR序列
的5’端处及在库2的编码识别和/或消除域序列的5’端处。也为增强型Kozak类型序列的
Kozak类型序列(GCCGCCACC(SEQ ID NO:519))插入在ATG起始密码子之前的10个核苷酸内,
该起始密码子在库1中的信号序列编码序列的5’端处及在库2中的编码识别和/或消除域序
列(或选择LMP1构建体)的5’端处。第4个模块含有由~10,000×~10,000个子条形码的随
机PCR组件产生的随机条形码(~1亿个组合)。库1构建体的CAR的写码序列编码信号序列、
FLAG标签、抗CD19 ASTR scFv、CD8a茎、CD8a跨膜域及CD3ζ胞内活化域。CAR(仅库1)及CLE(库1及库2)的表达由EF1α启动子驱动。在库1的构建体中,T2A位点位于CAR与嵌合多肽编码序列之间。在库1及2中,三重终止密码子存在于P4的3’末端处。
[1350] 病毒载体的合成
[1351] 库组件的个别部分经设计且合成为具有兼容性IIs型酶(AarI)突出端及在各部分的5’及3’末端上编码甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸序列的连接体的DNA嵌段。随后将这些部分各别选殖至通用质粒载体中。各部分的组件完成为一个管组件,其中将0.04pmol的部分、
0.04pmol条形码混合物及0.04pmol质粒载体主链添加至10ul反应物中,接着添加1单位
AarI酶、10单位T4 DNA连接酶及1X连接酶缓冲液(50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM ATP、
10mM DTT)以获得最佳连接酶活性。使用如下的热循环进行分解及连接循环:在37℃下2min及16℃下5min;在50℃下培育5min以最终分解;在80℃下培育10min以使AarI失活,以及最终保持在4℃下的55个循环。随后组装的载体通过习知的乙醇沉淀来纯化。将得到的纯化载体电穿孔(Electro Micropulser,Bio-rad)至Top10电感受态细胞(Thermo Fisher 
Scientific)中且直接回收在含有康微素抗生素的液体培养物中以用于选择及扩增。在37
℃下培育培养物10至12小时并且随后收集,且使用ZymoPURE-EndoZeroTM质粒Gigaprep试剂盒纯化质粒。
[1352] 慢病毒颗粒生产
[1353] 重组慢病毒颗粒是通过用编码gag/pol及rev的单独的慢病毒包装质粒及编码VSV-G的假型化质粒瞬时转染293T细胞(Lenti-XTM 293T,Clontech)来产生。编码具有或不具有共表达嵌合抗原受体的候选嵌合多肽的合成病毒载体用包装质粒共转染。细胞通过在
TM
Freestyle  293Expression Medium(ThermoFisher Scientific公司)中连续生长来适应
悬浮培养。以1×106个细胞/毫升(200mL)在1L Erlenmeyer烧瓶中接种悬浮液中的细胞,并
立即使用溶解于弱酸中的聚乙烯亚胺(PEI)(Polysciences)转染。
[1354] 对于200mL细胞将质粒DNA稀释于10ml GibcoTM Opti-MEMTM培养基中。为获得用VSV-G假型化的慢病毒颗粒,所使用的总DNA(每mL培养体积中1μg)为具有以下穆尔比的4种质粒的混合物:2×组合病毒载体、1×含Rev的质粒、1×含VSV-G的质粒及1×含gag/pol的
质粒。单独地,将PEI在10ml GibcoTM Opti-MEMTM中稀释至每mL培养体积中2μg(与DNA的比为2:1比率)。在5分钟室温培育之后,将两种溶液彻底地混合在一起,且在室温下培育20分钟。将最终体积(20ml)添加至细胞中。接着伴随125rpm的旋转及具有8%CO2、在37℃下培育细胞48小时。
[1355] 在48小时后,采集上清液且通过以1,000g离心10分钟来澄清。随后使病毒上清液经由低蛋白结合的Millex-HV 0.45μm PVDF过滤器(Millipore,目录编号SLHVR25LS)来过
滤。将澄清上清液倒入新试管中,使1体积的Lenti-X PEG(Takara,4×)与3体积的澄清上清液混合,并且在4℃下培育隔夜。随后通过以1,500g且在4℃下离心90分钟来沉淀慢病毒颗
粒。舍弃上清液,且将慢病毒颗粒丸粒再悬浮于1:100的初始体积的不具有IL-2的完全PBMC生长培养基中。使用来自Takara(#632200)的p24检定ELISA试剂盒来滴定慢病毒颗粒。
[1356] PBMC的转导及培养
[1357] 将来自健康供体的全部人类血液(101ml)收集至200ml含有CDP抗凝剂(Nanger;S-200)的血袋中。遵循制造商的说明书及试剂盒CS900.2(BioSafe;1008)使用Sepax 2S-100
器件(Biosafe;14000)使用用Ficoll-PacqueTM(General Electric)的密度梯度离心来处理血液,以获得周边血单核细胞(PBMC)。活PBMC的产量为7.3×107个细胞。将1.5×107个PBMC
各自添加至两个G-Rex 100M细胞培养器件(Wilson Wolf,81100S)中以在最终体积30ml的
TM TM TM
完全OpTmizer  CTS  T细胞扩增SFM(根据制造商的说明书的补充有26ml OpTmizer  
CTSTM T细胞扩增补充液(Thermo Fisher,A10484-02)、25ml CTSTM免疫细胞SR(Thermo 
Fisher,A2596101)及10ml CTSTM GlutaMAXTM-I补充液(Thermo Fisher,A1286001)的
OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增基础培养基1L(Thermo Fisher,A10221))中达到最终浓度0.5×106个活细胞/毫升。还将浓度为100IU/ml的重组人类白细胞介素-2(IL-2)
(Novoprotein)以及浓度为50ng/ml的活化抗CD3 Ab(OKT3,Novoprotein)一起添加以活化
PBMC用于病毒转导。将G-Rex器件在37℃及5%CO2下在标准湿润组织培养箱中培育隔夜。在隔夜培育之后,在5重感染(MOI)下将含有所要测试编码嵌合多肽的构建体(库1或库2)的慢
病毒颗粒制剂添加至个别G-Rex器件中。将G-Rex器件(库1及库2)在37℃及5%CO2下在标准
湿润组织培养箱中培育隔夜。在隔夜培育之后,添加额外的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM以使各G-Rex器件的最终体积达到500ml。在此或以下细胞培养步骤中不添加额外的
IL-2或其他外源性细胞因子。自PBMC分离后,将 器件在37℃及5%CO2下在标准湿润
组织培养箱中培育7天。在第7天,通过离心自用库1或库2转导的两个G-Rex器件中收集细胞并将这些细胞再悬浮于新鲜的不具有IL-2的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM中。将
1.25×107个库1细胞及2.54×107的库2细胞置放在含有500ml不具有IL-2的完全
OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM的新G-Rex 100M器件上。将一小瓶解冻的第0天冷冻供体
匹配的PBMC(1.46×107个PBMC)添加至含有用库1转导的细胞的G-Rex器件中以提供对CD19 
ASTR的CD19+B细胞活化。在这些筛选中,用库数目之后的A指定用PBMC供养的细胞,例如使用用库1转导且用PBMC供养的细胞进行的筛选在本文称为库1A。库2不接受第0天PBMC。在这些筛选中,用库数目之后的B指定不用PBMC供养的细胞,例如使用用库2转导且不用PBMC供
养的细胞进行的筛选在本文称为库2B。将G-Rex器件在37℃及5%CO2下在标准湿润组织培
养箱中培育隔夜。在第14天,通过离心自两个G-Rex器件(库1A及库2B)中收集细胞并将这些TM TM
细胞再悬浮于新鲜的不具有IL-2的完全OpTmizer  CTS  T细胞扩增SFM中。将这些细胞各
自置放在含有30ml不具有IL-2的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM的6孔G-rex盘
(Wilson-Wolf;80240M)的个别孔中。将一小瓶解冻的第0天冷冻供体匹配的PBMC添加至含
有库1A细胞的孔中以提供对CD19 ASTR的CD19+B细胞活化。将G-Rex器件在37℃及5%CO2下
在标准湿润组织培养箱中培育隔夜。在第21天,自6孔G-rex盘的各孔收集细胞,并且重复在第14天进行的处理。在转导后的不同天(第7天、第21天、第28天和/或第35天)收集样本(1×
105至~4-5×106个细胞),且根据试剂盒方案使用GenEluteTM哺乳动物基因组DNA微量制剂
纯化基因组DNA。在一些情况下,使用用Ficoll-PacqueTM(General Electric)的密度梯度离心来纯化样本以在基因组DNA提取之前移除死亡细胞。使用Illumina HiSeq对纯化的基因
组DNA进行测序,产生配对末端150bp读数。通常,从每个索引的fastq文文件中提取一千万个读数的子集,并使用barcode_reader进行分析处理,该barcode_reader为一个自定义的R脚本,用于基于恒定区域的存在提取条形码序列。还将纯化的基因组DNA在PacBio测序系统上测序以获得更长读取长度以将条形码与构建体相关联。重复这些筛选且将这些库指定为
1.1A、1.1B及2.1B,其中A及B指示如上文所论述的细胞是否用PBMC供养。
[1358] 资料分析
[1359] 一旦获得所有时间点的HiSeq数据后,就基于条形码ID合并条形码计数表。使用下式将计数标准化为“每百万计数”:1×106*原始计数/总和(样本中所有条形码的原始计
数),其称为流行率值。舍弃具有每时间点0.33cpm或更少的平均流行率的条形码。通过SMRT测序(Pacific Biosciences)在选择时间点获得的全长构建体-条形码关联性用于识别感
兴趣的组件。过滤掉不具有3个部分的非胜任型构建体或具有超过一个构筑细胞的模糊构
建体。各组件的富集值以(最终时间点的标准化计数+1)/(最初时间点的标准化计数+1)计
算。候选嵌合多肽基因经识别为富集度高于各库特异性阈值的构建体。
[1360] 结果
[1361] 嵌合多肽候选物经指示具有3个测试域,其包括一胞外及跨膜域(P1-2)、第一胞内域(P3)及第二胞内域(P4)(图30及图31)。此外,构建体包括DNA条形码以帮助使用下一代测序来分析且识别构建体。另外,如表6中所示的最多构建体包括在具有胞外域及跨膜域的框中编码识别和/或消除域的核酸序列。然而,编码LMP1的胞外或跨膜片段的那些构建体的识别和/或消除域在含有此类识别和/或消除域的那些构建体的细胞内。库1构建体编码嵌合
多肽候选物的上游的CAR。基于20个不同的胞外-跨膜域、106个可能的P3域及107个可能的
P4域设计总共226,840个可能的概念化组合,其中一个为终止密码子。在病毒载体组装、慢病毒颗粒产生、PBMC的转导及培养7天后,并非所有概念化构建体均检测到。对于库1A,在转导PBMC及培养7天之后,存在57,815个构建体。对于库2B,在转导PBMC及培养7天之后,存在
69,578个构建体。关于分析的候选物的详细信息以及详细结果提供在表7至11中。关于各候选部分的详细信息提供在表6中。表7-11的标题如下:BlockSequence为在各构建体中使用
的来自表6的P1-P2、P3及P4域的密码;Norm_D7为在第7天的标准化计数;Enrich_DXX为在第XX天对比第7天的富集度,其中XX为表中指示的当天,例如Enrich_D21为第21天对比第7天
的富集度且Enrich_D35为第35天对比第7天的富集度。构建体的资料紧接着该构建体的右
行显示。两个构建体的资料显示于各列中。举例而言,在表7中识别的第一候选物为M008-
S212-S075。对于此候选物,胞外及跨膜域(P1-2)为M008,第一胞内域(P3)为S212,且第二胞内域(P4)为S075。关于这些模块的身份标识的详细信息(例如M008)可在表6中找到。表6公
开M008为LMP1且该构建体包括Myc标签。候选域的氨基酸序列提供于表6中。为清楚说明,表
6中的GenBank标识符提供编码多肽域的核酸序列。在一些情况下,核酸序列经修饰以辅助
克隆,或用于密码子优化,但编码与GenBank序列相同的多肽。在一些情况下,如由表6中提供的氨基酸序列显而易见,使用由GenBank序列编码的多肽的部分。
[1362] 候选胞外及跨膜域选自已知的突变受体,诸如已经报导在至少一些细胞类型中表达时为组成性活性的细胞因子或激素受体。配位体结合域不包括在候选胞外及跨膜域中。
此类受体突变体中的突变发生在跨膜区或近膜区中。例示性候选胞外及跨膜域包括IL7RA 
Ins PPCL、LMP1、CRLF2 F232C、CSF2RB V449E、CSF3R T640N、EPOR L251C I252C、GHR E260C I270C、IL27RA F523C及MPL S505N。候选胞外及跨膜域包括野生型病毒蛋白LMP1,其为一种已知在靶向脂质筏时或在与CD40融合时活化与配位体无关的细胞信号传导的多重跨膜蛋
白(Kaykas等人.EMBO J.20:2641(2001))。
[1363] 选择占据候选嵌合多肽的第一及第二胞内域的潜在多肽的身份标识为一致的。这些候选胞内域为已知在至少一些细胞类型中促进增生、存活(抗细胞凋亡)和/或提供共刺
激信号的基因的胞内信号传导域,该共刺激信号增强分化状态、增生潜能或对细胞死亡的
抗性。已知候选嵌合多肽的胞内域中的一些可活化JAK1/JAK2信号传导及STAT5。来自表6中所列出的基因中的一些的胞内域包括在库中。来自这些基因的例示性胞内域提供在表7至
11的P3及P4位置。关于这些P3及P4域的详细信息提供在表6中。
[1364] 对于包括编码嵌合多肽及CAR的构建体的库1A,当在不存在IL-2下培养时识别到在第7天与表上指示的最后一天之间促进PBMC增生至最大程度(及也可能存活)的172个最
优候选嵌合多肽(参见表7,其中富集度以Log2(表中所指示的最后一天的标准化计数+1)–
log2(第7天的标准化计数+1)计算)。值得注意的是,实施例17及18的此筛选实验或全部筛
选实验为竞争性实验。因此,阴性结果并不意味构建体在不存在诸如IL-2的生长因子下不
促进T细胞的增生。其仅意味相对于所测试的其他构建体,其在增生方面表达优于其他构建体。
[1365] 对于库1A,对于在P1-2位置测试的每个胞外及跨膜突变体域,一些嵌合多肽构建体在第7天与表上所指示的最后一天之间促进细胞增生。当将自相同位置P1-2突变体推导
的所有构建体的全部结果组合时,所有测试的胞外及跨膜域在第7天与表上所指示的最后
一天之间产生大于1的细胞富集度(即促进细胞增生)。存在于促进细胞增生的构建体中的
胞外和/或跨膜域或其部分和/或突变体的实例提供于表7中。在称为库1.1A的重复筛选中
存在于促进细胞增生的构建体中的胞外和/或跨膜域或其部分和/或突变体的实例提供于
表9中。在称为库1.1B(其包括用库1转导不用PBMC供养的细胞)的重复筛选中存在于促进细
胞增生的构建体中的胞外和/或跨膜域或其部分和/或突变体的实例提供于表10中。
[1366] 对于库1A,已知具有信号传导活性的来自CD3D、CD3E、CD8A、CD27、CD40、CD79B、IFNAR1、IL2RA、IL3RA、IL13RA2、TNFRSF8及TNFRSF9的胞内域或其突变体(若此类突变体存在于这些表中提供的构建体中)在发现处于候选嵌合多肽的第一胞内域位置(P3)时在第7天与表上所指示的最后一天之间促进PBMC增生,此时以组合方式考虑具有来自彼基因的第
一细胞内域(P3)的所有构建体的数据。此结论基于混合培养的PBMC细胞群体中的构建体的
序列计数的富集,当将一个基因的所有构建体的结果组合时,使得对于库1A,在表中指示的最后一天存在的此结构域计数比第7天多至少3倍。存在于促进最高程度的细胞增生的构建
体中的第一胞内域或其部分和/或突变体的实例提供于表7中。在称为库1.1A的重复筛选中
存在于促进最高程度的细胞增生的构建体中的第一胞内域或其部分和/或突变体的实例提
供于表9中。在称为库1.1B(其包括用库1转导不用PBMC供养的细胞)的重复筛选中存在于促
进细胞增生的构建体中的第一胞内域或其部分和/或突变体的实例提供于表10中。
[1367] 对于库1A,已知具有信号传导活性的来自CD3D、CD3G、CD8A、CD8B、CD27、CD40、CD79B、CRLF2、FCGR2C、ICOS、IL2RA、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、TNFRSF9及TNFRSF18的胞内域或其突变体(若此类突变体存在于这些表中)在发现处于候选嵌合多肽的第二胞内域位置(P4)时在第7天与表上所指示的最后一天之间促进PBMC增生,此时以组合方式考虑具有
来自彼基因的第二细胞内域(P4)的所有构建体的数据。此结论基于混合培养的PBMC细胞群
体中的构建体的序列计数的富集,当将一个基因的所有构建体的结果组合时,使得对于库
1A,在第35天存在的此结构域计数比第7天多至少2.9倍。存在于促进最高程度的细胞增生
的构建体中的第二胞内域或其部分和/或突变体的实例提供于表7中。在称为库1.1A的重复
筛选中存在于促进细胞增生的构建体中的第二胞内域或其部分和/或突变体的实例提供于
表9中。在称为库1.1B(其包括用库1转导不用PBMC供养的细胞)的重复筛选中存在于促进细
胞增生的构建体中的第二胞内域或其部分和/或突变体的实例提供于表10中。
[1368] 特定言的,对于库1A,在具有MPL S505N(MPL原癌基因,具有丝氨酸505突变成天冬酰胺的血小板生成素受体)作为P1-P2模块的5,996个构建体中,165个为阳性的,其定义为对于库1A具有富集度大于二的构建体。在具有CD3D(CD3d分子)作为P3模块的436个构建体
中,24个为阳性的。在具有CD3E(CD3e分子)作为P3模块的528个构建体中,17个为阳性的。在具有CD8A(CD8a分子)作为P3模块的261个构建体中,14个为阳性的。在具有CD40(CD40分子)作为P3模块的1,022个构建体中,50个为阳性的。在具有IL3RA(白细胞介素3受体次单元α)作为P3模块的568个构建体中,26个为阳性的。在具有CD79B(CD79b分子)作为P3模块的556
个构建体中,27个为阳性的。在具有IFNAR1(干扰素α及β受体次单元1)作为P3模块的131个构建体中,7个为阳性的。在具有IL13RA2(白细胞介素13受体次单元α2)作为P3模块的519个构建体中,33个为阳性的。在具有IL2RA(白细胞介素2受体子单元α)作为P3模块的571个构建体中,28个为阳性的。在具有CD27(CD27分子)作为P3模块的618个构建体中,30个为阳性的。在具有TNFRSF8(TNF受体超家族成员8)作为P3模块的573个构建体中,15个为阳性的。在具有TNFRSF9(TNF受体超家族成员9)作为P3模块的573个构建体中,25个为阳性的。在具有
IL13RA2(白细胞介素13受体次单元α2)作为P4模块的360个构建体中,25个为阳性的。在具有IL2RA(白细胞介素2受体次单元α)作为P4模块的490个构建体中,28个为阳性的。在具有IL15RA(白细胞介素15受体次单元α)作为P4模块的489个构建体中,22个为阳性的。在具有CD8A(CD8a分子)作为P4模块的590个构建体中,25个为阳性的。在具有IL13RA1(白细胞介素
13受体次单元α1)作为P4模块的619个构建体中,25个为阳性的。在具有CD3G(CD3g分子)作为P4模块的637个构建体中,30个为阳性的。在具有CD3D(CD3d分子)作为P4模块的618个构
建体中,37个为阳性的。在具有CD27(CD27分子)作为P4模块的673个构建体中,29个为阳性的。在具有CD79B(CD79b分子)作为P4模块的654个构建体中,33个为阳性的。在具有TNFRSF9(TNF受体超家族成员9)作为P4模块的728个构建体中,30个为阳性的。在具有CD40(CD40分
子)作为P4模块的1,169个构建体中,53个为阳性的。在具有TNFRSF18(TNF受体超家族成员
18)作为P4模块的1,324个构建体中,54个为阳性的。在具有CD8B作为P4模块的1,739个构建体中,73个为阳性的。在具有CRLF2作为P4模块的286个构建体中,8个为阳性的。在具有
FCGR2C作为P4模块的725个构建体中,29个为阳性的。在具有ICOS作为P4模块的602个构建
体中,24个为阳性的。
[1369] 对于库1A及1.1A,构建体M001-S116-S044、M024-S192-S045、M001-S047-S102、M048-S195-S043、M012-S216-S211及M030-S170-S194在两次筛选中具有尤其值得注意的富
集度。出于重复筛选的目的,具有尤其值得注意的富集度的构建体为具有log2((在最后一
天的标准化计数数据+1)/(在第7天的标准化计数数据+1))值大于2的那些构建体。
[1370] 关于在对库1A及库1.1A两者的筛选中的具有尤其值得注意的富集度的构建体中的第一及第二胞内域的其他信息提供于表19中,包括第一及第二胞内域来源的基因,第一
和/或第二胞内域是否为细胞因子受体,且第一和/或第二胞内域是否具有至少一个ITAM基
元。具有来自IL6R、MYD88、CD27、MYD88、TNFRSF18或IL31RA的胞内域的构建体存在于第一胞内域(P3)时,且具有来自CD8B、IL1RL1、CD8A、TNFRSF4或MYD88的胞内域的构建体存在于第二胞内域(P4)时,在库1A及1.1A两者中显示尤其值得注意的富集度(表19)。具有来自细胞
因子受体IL6R、CD27、TNFRSF18或IL31RA的结构域的构建体存在于第一胞内域(P3)时,且具有来自细胞因子受体IL1RL1或TNFRSF4的结构域的构建体存在于第二胞内域(P4)时,在库
1A及1.1A两者中显示尤其值得注意的富集度(表19)。
[1371] 在包括编码嵌合多肽且不编码CAR的构建体的库2B中,当在不存在IL-2下培养时识别到在第7天与表上指示的最后一天之间促进PBMC增生的167个最优候选物(参见表8,其
中富集度以Log2(表上所指示的最后一天的标准化计数+1)–log2(第7天的标准化计数+1)
计算)。值得注意的是,一般富集度小于针对库1A构建体(包括CAR)发现的彼富集度。
[1372] 对于库2B,在P1-2位置中的CSF3R T640N在第7天与表上所指示的最后一天之间促进细胞增生比其他所测试的胞外及跨膜(P1-2)域更佳,当将来自胞外及跨膜域的所有构建
体的所有结果组合时,产生大于2.5的富集因子。存在于促进最高程度的细胞增生的构建体中的胞外及/跨膜域或其部分和/或突变体的实例提供于表8中。存在于在称为库2.1B的重
复筛选中促进最高程度的细胞增生的构建体中的胞外和/或跨膜域或其部分和/或突变体
的实例提供于表11中。
[1373] 对于库2B,已知具有信号传导活性的来自CD8A、CD40、IFNAR1、IL31RA及MyD88的胞内域或其突变体(若此类突变体存在于这些表中所提供的构建体中)在发现处于候选嵌合多肽的第一胞内域位置(P3)时在第7天与表上所指示的最后一天之间促进PBMC增生,此时
以组合方式考虑具有来自彼基因的第一细胞内域(P3)的所有构建体的数据。此结论基于混
合培养的PBMC细胞群体中的构建体的序列计数的富集,当将一个基因的所有构建体的结果
组合时,使得对于库2B,在第28天存在的此结构域计数比第7天多至少2倍。存在于促进最大程度的细胞增生的构建体中的第一胞内域或其部分和/或突变体的实例提供于表8中。存在
于在称为库2.1B的重复筛选中促进最高程度的细胞增生的构建体中的第一胞内域或其部
分和/或突变体的实例提供于表11中。
[1374] 对于库2B,已知具有信号传导活性的来自CD27的胞内域或其突变体(若此类突变体存在于这些表中所提供的构建体中)在发现处于嵌合多肽候选物的第二胞内域位置(P4)
时在第7天与表上所指示的最后一天之间促进PBMC增生,此时以组合方式考虑具有来自彼
基因的第二细胞内域(P4)的所有构建体的数据。此结论基于混合培养的PBMC细胞群体中的
构建体的序列计数的富集,当将一个基因的所有构建体的结果组合时,使得对于库2B,在第
28天存在的此结构域计数比第7天多至少11倍。存在于促进最大程度的细胞增生的构建体
中的第二胞内域或其部分和/或突变体的实例提供于表8中。存在于在称为库2.1B的重复筛
选中促进最大程度的细胞增生的构建体中的第二胞内域或其部分和/或突变体的实例提供
于表11中。
[1375] 特定言的,对于库2B,在具有CSF3R T640N(具有苏氨酸640突变成天冬酰胺的群落刺激因子3受体)作为库2B的P1/P2模块的6,909个构建体中,59个为阳性的,其定义为对于
库2B具有大于二的富集度的构建体。在具有IFNAR1(干扰素α及β受体次单元1)作为库2B的P3模块的184个构建体中,3个为阳性的。在具有CD40(CD40分子)作为库2B的P3模块的1,258个构建体中,17个为阳性的。在具有CD27(CD27分子)作为库2B的P4模块的851个构建体中,
11个为阳性的。在具有CD8A作为库2B的P3模块的418个构建体中,10个为阳性的。在具有
IL31RA作为库2B的P3模块的1,385个构建体中,12个为阳性的。在具有MyD88作为库2B的P3
模块的5,757个构建体中,56个为阳性的。
[1376] 对于库2B及2.1B,构建体M007-S049-S051、M007-S050-S039、M012-S050-S043、M012-S161-S213、M030-S142-S049、M001-S145-S130、M018-S085-S039、M018-S075-S053、M012-S135-S074及M007-S214-S077在两个筛选中具有尤其值得注意的富集度。出于重复筛
选的目的,具有尤其值得注意的富集度的构建体为具有log2((在最后一天的标准化计数数
据+1)/(在第7天的标准化计数数据+1))值大于2的那些构建体。
[1377] 关于在对库2B及库2.1B两者的筛选中的具有尤其值得注意的富集度的构建体中的第一及第二胞内域的其他信息提供于表20中,包括第一及第二胞内域来源的基因,第一
和/或第二胞内域是否为细胞因子受体,且第一和/或第二胞内域是否具有至少一个ITAM基
元。具有来自CD28、CD40、IL22RA1、IL13RA2、IL17RB、IFNGR2、FCGR2C、IL11RA或TNFRSF14的胞内域的构建体存在于第一胞内域(P3)时,且具有来自CD40、CD3G、CD8A、TNFRSF9、CD28、IL10RB、CD79B、FCER1G或GHR的胞内域的构建体存在于第二胞内域(P4)时,在库2B及2.1B两者中显示尤其值得注意的富集度(表20)。具有来自细胞因子受体CD40、IL22RA1、IL13RA2、IL17RB、IFNGR2、FCGR2C、IL11RA或TNFRSF14的结构域的构建体存在于第一胞内域(P3)时,且具有来自细胞因子受体TNFRSF9、IL10RB、FCER1G、GHR或CD40的结构域的构建体存在于第二胞内域(P4)时,在库2B及2.1B两者中显示尤其值得注意的富集度(表20)。具有含有
FCGR2C的ITAM基元的结构域的构建体存在于第一胞内域(P3)时,且具有含有CD3G、CD79B或FCER1G的ITAM基元的结构域的构建体存在于第二胞内域(P4)时,在库2B及2.1B两者中显示
尤其值得注意的富集度(表20)。
[1378] 实施例18.候选嵌合多肽淋巴增生性组件的识别。
[1379] 在此实施例中,候选(推定)嵌合淋巴增生性组件的两个嵌合多肽库(库3及库4)经组装至来自胞外-跨膜阻断序列库、胞内阻断序列库及根据图32及图33中所提供的编码嵌
合多肽的构建体的条形码库的病毒载体中。库转导的PBMC的增生随时间进行:以一周间隔
自PBMC提取基因组DNA且扩增条形码区以用于DNA测序以估计在这些混合的含有测试候选
嵌合多肽中的每一者的PBMC培养物中的细胞数目。因此,筛选测试候选嵌合多肽在不存在
外源性添加的IL-2或任何其他外源性细胞因子下促进PBMC细胞增生的能力。
[1380] 在此研究中制备且分析两个库:库3(其用于识别为库3A、3B、3.1A及3.1B的筛选中)在嵌合多肽的5’末端处侧接有CAR,而库4(其用于识别为库4B及4.1B的筛选中)不包括
CAR。图32提供含有多核苷酸序列的非限制性例示性转基因表达盒的示意图,该多核苷酸序列编码由慢病毒载体主链中的EF-1α启动子及Kozak类型序列(GCCGCCACC(SEQ ID NO:
519))驱动的库3的CAR及候选CLE。CAR经FLAG标记且含有针对CD19的ASTR、CD8的茎及跨膜
部分,及来自CD3z的胞内活化域。库3的各候选淋巴增生性组件包括4个模块:胞外模块
(P1)、跨膜模块(P2)及2个胞内模块(P3及P4)。P1模块还编码Myc识别和/或消除域。三重终止序列(TAATAGTGA(SEQ ID NO:520))自DNA条形码(P5)中分离P4。WPRE
[1381] (GTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCC
TTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG(SEQ ID NO:521))存在于最后一
个终止密码子(开始于最后一个终止密码子的最后一个核苷酸之后的4bp)与3’LTR(其开始
于WPRE的最后一个核苷酸之后的83个核苷酸)之间。
[1382] 库3的CAR及P1通过编码T2A核糖体跳跃序列的多核苷酸序列间隔开。
[1383] 图33提供含有多核苷酸序列的非限制性例示性转基因表达盒的示意图,该多核苷酸序列编码由慢病毒载体主链中的EF-1α启动子及Kozak类型序列(GCCGCCACC(SEQ ID NO:
519))驱动的库4的候选CLE。库4的各候选淋巴增生性组件包括4个模块:胞外模块(P1)、跨膜模块(P2)及2个胞内模块(P3及P4)。P1模块还编码Myc识别和/或消除域。三重终止序列
(TAATAGTGA(SEQ ID NO:520))自DNA条形码(P5)中分离P4。WPRE
[1384] (GTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCC
TTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG(SEQ ID NO:521))存在于最后一
个终止密码子(开始于最后一个终止密码子的最后一个核苷酸之后的4bp)与3’LTR(其开始
于WPRE的最后一个核苷酸之后的83个核苷酸)之间。
[1385] 两个库的经组装候选嵌合多肽部分遵循具有4个位置(1个胞外模块(P1)、1个跨膜模块(P2)及2个胞内模块(P3及P4),其中的一者可为提前终止信号)的完全相同的设计(图
32及33)。编码Myc标签或eTAG识别和/或消除域(在表6中称为“eTAG”或“Myc Tag”)的完整或变体形式的核酸经插入在库3中的编码CAR序列的5’端处及在库4中的P1中的c-Jun结构
域的5’端处。信号序列插入在库3中的编码CAR序列的5’端处及在库4的编码识别和/或消除域序列的5’端处。除P1及P2结构域如本实施例稍后更详细阐述的外,库的通用设计及构建(包括条形码)如本文实施例17中所公开。此外,清除域在如表6中所指示的一些构建体上,且在存在时为eTag变体或Myc标签。
[1386] 病毒载体的合成及慢病毒生产
[1387] 如实施例17中所公开合成载体并且产生各库的慢病毒颗粒。
[1388] PBMC的转导及培养
[1389] 对于库3A,将来自健康供体的全部人类血液(89.1ml)收集至200ml含有CDP抗凝剂(Nanger;S-200)的血袋中。遵循制造商的说明书及试剂盒CS900.2(BioSafe;1008)使用
Sepax 2S-100器件(Biosafe;14000)使用用Ficoll-PacqueTM(General Electric)的密度梯
7
度离心来处理血液,以获得周边血单核细胞(PBMC)。活PBMC的产量为8.4×10个细胞。将十
小瓶每瓶5×106个PBMC的细胞冷冻以稍后用于供养含有CD19-CAR的库3A样本的CD19+B细
胞。将3×107个PBMC添加至一个G-Rex 100M细胞培养器件(Wilson Wolf,81100S)中以在最
终体积60ml的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM(根据制造商的说明书的补充有26ml 
OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增补充液(Thermo Fisher,A10484-02)、25ml CTSTM免疫细胞SR(Thermo Fisher,A2596101)及10ml CTSTM GlutaMAXTM-I补充液(Thermo Fisher,
A1286001)的OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增基础培养基1L(Thermo Fisher,A10221))中达到最终浓度0.5×106个活细胞/毫升。还将浓度为100IU/ml的重组人类白细胞介素-2(IL-2)
(Novoprotein)以及浓度为50ng/ml的活化抗CD3 Ab(OKT3,Novoprotein)一起添加以活化
PBMC用于病毒转导。将G-Rex器件在37℃及5%CO2下在标准湿润组织培养箱中培育隔夜。在隔夜培育之后,在5重感染(MOI)下将含有所要测试编码嵌合多肽的构建体(库3)的慢病毒
颗粒制剂添加至G-Rex器件中。将G-Rex器件在37℃及5%CO2下在标准湿润组织培养箱中培
育隔夜。在隔夜培育之后,添加额外的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM以使最终体积达到500ml。在此或以下细胞培养步骤中不添加额外的IL-2或其他外源性细胞因子。自PBMC分离后,将 器件在37℃及5%CO2下在标准湿润组织培养箱中培育7天。在第7天,通过
离心自用库3转导的G-Rex器件中收集细胞并将这些细胞再悬浮于新鲜的不具有IL-2的完
全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM中。将5×107个库3细胞置放在含有500ml不具有IL-2的
完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM的新G-Rex 100M器件上且标记为库3A。将1.1×108个
TM TM
库3细胞置放在含有500ml不具有IL-2的完全OpTmizer  CTS  T细胞扩增SFM的新G-Rex 
100M器件上且标记为库3B。在这些筛选中,用库数目之后的A指定用PBMC喂供养的细胞,例如使用用库3转导且用PBMC供养的细胞进行的筛选在本文称为库3A。将一小瓶解冻的第0天
冷冻供体匹配的PBMC(2×107个PBMC)添加至含有用库3A转导的细胞的G-Rex器件中以提供
对CD19 ASTR的CD19+B细胞活化。库3B不接受第0天PBMC。在这些筛选中,用库数目之后的B指定不用PBMC喂供养的细胞。举例而言,使用用库3转导且不用PBMC供养的细胞进行的筛选在本文中称为库3B。将G-Rex器件在37℃及5%CO2下在标准湿润组织培养箱中培育。在第14天,通过离心自两个G-Rex器件(库3A、库3B)中收集细胞并将这些细胞再悬浮于新鲜的不具有IL-2的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM中。将这些细胞各自置放在含有30ml不具有IL-2的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM的6孔G-Rex盘(Wilson-Wolf;80240M)的个别
孔中。将一小瓶解冻的第0天冷冻供体匹配的PBMC(5×106个PBMC)添加至含有库3A G-Rex
中以提供对CD19 ASTR的CD19+B细胞活化。
[1390] 将G-Rex器件在37℃及5%CO2下在标准湿润组织培养箱中培育。在第21天、第28天、第35天及第42天重复此过程,除了在第21天将两小瓶冷冻第0天PBMC添加至库3A,在第
28天、第35天及第42天添加一瓶。库3B在过去21天不培养。重复这些筛选,除了P1部分上的Myc标签用eTag替换(如表6、14及15中所显示)并且指定为库3.1A及3.1B,其中该A及B指示
如上文所论述的细胞是否用PBMC供养。
[1391] 制备库3A的细胞以在第49天通过流式细胞术(400g,5分钟)分析。通过离心收集细胞并且根据制造商的说明在Ficoll(Ficoll-Paque Premium(GE,cat#17-5442-02))上分
层。将1.7x 106个细胞再悬浮于450μl FACs染色缓冲液(554656,BD)中。将再悬浮的细胞等分至9个eppendorf管中,每个管含有50μl或1.8×105个细胞。将2.5μl人类Fc嵌段(564220,BD)添加至各管中并且在室温下培育10分钟。将以下抗体配方添加至50μl样本中以染色
CD3、CD4、CD8、CD56、CD19、FLAG Tag(CAR+):2.5μl抗CD3-BV421抗体(纯系OKT3,317344,Biolegend)、2.5μl抗CD8-BV510抗体(纯系RPA-T8(301048,Biolegend))、2.5μl抗CD4-PE-Cy7抗体(纯系OKT4(317412,Biolegend))、2.5μl抗CD56-BV785(362550,Biolegend)及0.5μl PE抗FLAG Tag(抗DYKDDDDK,Clone L5,637310,Biolegend)用于5种颜色染色样本。添加
2.5μl BB515 CD19抗体(纯系HIB19,564456,BD)及0.5ul PE抗FLAG Tag抗体用于2种颜色
染色样本。还使用上述抗体及体积制备单染色CD3、CD4、CD8、CD56或FLAG Tag的样本。添加
2.5μl BV421 IgG(小鼠IgG2a,400259,Biolegend)、2.5μl PE/CY5 IgG(小鼠IgG2b,
400317,Biolegend)、2.5μl BV510 IgG(小鼠IgG1,400171,Biolegend)、2.5μl BV785 IgG(小鼠IgG1,400169,Biolegend)及10μl PE IgG(小鼠IgG1,555749,BD)用于IgG对照染色样本。不添加抗体以用于未染色对照。将样本在冰上培育30分钟。将这些样本离心(400g,5分钟)并且移除上清液。用0.5ml FACS染色缓冲液洗涤这些样本两次。将经染色的细胞集结粒再悬浮于125μl FACS染色缓冲液中且随后通过添加125ul BD固定缓冲液(554655BD)来固
定。在4℃下用固定缓冲液培育这些样本15分钟。用500μl FACS染色缓冲液洗涤这些样本两次并且用0.4ml FACS染色缓冲液再悬浮。在Novocyte流式细胞测仪(ACEA Biosciences)进
行样本的FAC分析并且基于正向散射及侧向散射使用淋巴细胞门分析。
[1392] 对于库4B,将来自健康供体的全部人类血液(70ml)收集至200ml含有CDP抗凝剂(Nanger;S-200)的血袋中。遵循制造商的说明书及试剂盒CS900.2(BioSafe;1008)使用
TM
Sepax 2S-100器件(Biosafe;14000)使用用Ficoll-Pacque (General Electric)的密度梯
度离心来处理血液,以获得周边血单核细胞(PBMC)。活PBMC的产量为4.9×107个细胞。将
4.9×107个PBMC添加至一个G-Rex 100M细胞培养器件(Wilson Wolf,81100S)中以在最终
体积98ml的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM中达到最终浓度0.5×106个活细胞/毫升。
还将浓度为100IU/ml的重组人类白细胞介素-2(IL-2)(Novoprotein)以及浓度为50ng/ml
的活化抗CD3 Ab(OKT3,Novoprotein)一起添加以活化PBMC用于病毒转导。将G-Rex器件在
37℃及5%CO2下在标准湿润组织培养箱中培育隔夜。在隔夜培育之后,在5重感染(MOI)下
将含有所要测试编码嵌合多肽的构建体(库4)的慢病毒颗粒制剂添加至G-Rex器件中。将G-
Rex器件在37℃及5%CO2下在标准湿润组织培养箱中培育隔夜。在隔夜培育之后,添加额外的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM以使最终体积达到500ml。在此或以下细胞培养步
骤中不添加额外的IL-2。自PBMC分离后,将 器件在37℃及5%CO2下在标准湿润组织
培养箱中培育7天。在第7天,通过离心自用库4转导的G-Rex器件中收集细胞并将这些细胞
再悬浮于新鲜的不具有IL-2的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM中。将1.63×108个库4
细胞置放在含有500ml不具有IL-2的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM的新G-Rex 100M
器件上且标记为库4。库4不接受第0天PBMC。因此,在这些筛选中,用库数目之后的B指定库,例如使用用库4转导且不用PBMC供养的细胞进行的筛选在本文称为库4B。将G-Rex器件在37
℃及5%CO2下在标准湿润组织培养箱中培育。在第14天,通过离心自G-Rex器件(库4)中收
TM TM
集细胞并将这些细胞再悬浮于新鲜的不具有IL-2的完全OpTmizer  CTS  T细胞扩增SFM
中。将这些细胞各自置放在含有30ml不具有IL-2的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM的
6孔G-rex盘(Wilson-Wolf;80240M)的个别孔中。将G-Rex器件在37℃及5%CO2下在标准湿
润组织培养箱中培育。库4样本在过去21天培养。重复这些筛选,除了P1部分上的Myc标签用eTag替换(如表6及16中所显示)并且指定为库4.1B,其中该B指示如上文所论述的细胞不用
PBMC供养。
[1393] 在转导后的不同天(第7天及第21天)收集样本(7×104至~4-8×106个细胞),且根据试剂盒方案使用GenEluteTM哺乳动物基因组DNA微量制剂纯化基因组DNA。在一些情况下,使用用Ficoll-PacqueTM(General Electric)的密度梯度离心来纯化样本以在基因组DNA提
取之前移除死亡细胞。使用Illumina HiSeq对纯化的基因组DNA进行测序,产生配对末端
150bp读数。通常,从每个索引的fastq文文件中提取一千万个读数的子集,并使用barcode_reader进行分析处理,该barcode_reader为一个自定义的R脚本,用于基于恒定区域的存在提取条形码序列。还将纯化的基因组DNA在PacBio测序系统上测序以将条形码与构建体相
关联。
[1394] 资料分析
[1395] 除时间点不同以外,如实施例17中所公开进行数据分析。
[1396] 结果
[1397] 在此实验中,嵌合多肽候选物经设计具有4个测试域,其包括胞外域(P1)、跨膜域(P2)、第一胞内域(P3)及第二胞内域(P4)(图32及图33)。如实施例17中所解释,构建体包括DNA条形码以帮助使用下一代测序来分析且识别构建体。另外,所有构建体包括在具有胞外域的框中编码识别和/或消除域的核酸序列。库3而非库4中的构建体编码嵌合多肽候选物
上游的CAR,其在结构上与库1(实施例17)中所使用的CAR一致。
[1398] 用于库3及库4的胞外域为包括已知为二聚基元的亮氨酸拉链基元(NM_002228_3)的c-Jun变体(参见例如Chinenov及Kerppola,Oncogene.2001年4月30日;20(19):2438-
52)。具有0与4个丙氨酸残基之间之间隔区包括在c-Jun胞外域与跨膜域之间的候选嵌合多
肽。不受理论限制,据信丙氨酸间隔区可通过改变连接的跨膜域和/或胞内域的方向来影响经由跨膜域与亮氨酸胞外区连接的胞内域的信号传导。
[1399] 候选跨膜域选自已知的野生型及突变体I型受体的单跨膜域,诸如已经报导在至少一些细胞类型中表达时为组成性活性的细胞因子、激素、共刺激或活化受体。选自库3及库4的此类受体突变体中的突变发生在跨膜区中。库3A、3B、3.1A、3.1B、4B及4.1B的例示性跨膜域可识别在表12至17中。表12至17的标题如下:BlockSequence为各构建体中使用的来自表6的P1、P2、P3及P4域的密码;Norm_D7为在第7天的标准化计数;Enrich_DXX为第XX天对比第7天的富集度,其中XX为表中所指示的天数,例如Enrich_D21为第21天对比第7天的富
集度且Enrich_D35为第35天对比第7天的富集度。构建体的资料紧接着该构建体的右行显
示。两个构建体的资料显示于各列中。举例而言,在表12中识别的第一构建体为E013-T047-S158-S080,其阐述为P1-P2-P3-P4。在彼构建体中,跨膜域(P2)为T047,其为IL7RA Ins 
PPCL(白细胞介素7受体)的跨膜域,如表6中所提供,以及此结构域的氨基酸序列包括在此
构建体中。实施例17中包括的相同的第一胞内域(P3)及第二胞内域(P4)包括在此实施例中
的库中,但P3部分中的一者为间隔区(参见下文)。
[1400] 基于Jun亮氨酸拉链胞外域及将其与82个不同的跨膜域、81个潜在的P3域间隔开的0-4个苏氨酸间隔区(其中的一者为23个氨基酸间隔区)、及21个潜在的P4域(其中一个为
终止密码子)设计总共5个可能的概念化组合。在病毒载体组装、慢病毒颗粒产生、PBMC的转导及培养7天后,并非所有概念化构建体均检测到。对于库3A及库3B,在转导PBMC及培养7天之后,存在68,951个构建体。对于库4B,在转导PBMC及培养7天之后,存在50,652个构建体。
可自表6及12至17中确定关于分析的候选物的详细信息。构建体的写码系统与实施例17所
解释的相同,如前述段落中所阐述。
[1401] 对于库3A、3B、3.1A、3.1B、4B及4.1B,在第7天与表上指示的最后一天之间识别到促进PBMC细胞增生的构建体。在CLE的特定模块中的某些多肽在库3A、3B及4中的最优命中者之间。这些CLE促进增生至最大程度。举例而言,在P2位置含有CD40或ICOS;在P3位置含有MPL、MyD88、LEPR或IFNAR2;和/或在P4位置含有CD40、CD79B或CD27的例示性构建体为3个库
3A、3B及4B中的至少2个中之前5个最常见的嵌合多肽(参见表12、13及16)。显然,MPL为对于所有3个库而言在P3大间隔处的最常见嵌合多肽。注意来自P3(MP、MyD88、LEPR及IFNAR2)的最优命中者不包括在这些构建体的P4位置中。
[1402] 在包括编码嵌合多肽及CAR的构建体以及补充有(库3A)或不具有(库3B)新鲜未转导PBMC的转导PBMC的库3A及库3B中,当在不存在IL-2下培养时分别识别到在第7天与表上
指示的最后一天之间促进PBMC增生的126个及127个最优候选物(参见表12及13)。表12及13
的最优候选物清单通过将基于初始中期资料分析的在第21天之前100个最流行候选物与基
于初始中期数据分析在第21天与第7天之间之前100个最富集的候选构建体组合来产生。初
始中期数据通过译码经编码库的部分来产生,以使得对于库3A已解码前100个构建体中的
66个及前1000个构建体中的538个;且对于库3B已解码前100个构建体中的77个,及前1000
个构建体中的464个。
[1403] 对于库3A,当以组合方式考虑具有来自彼基因的跨膜域的所有构建体的数据时(数据未示出),来自CD40、CD8B、CRLF2、CSF2RA、FCGR2C、ICOS、IFNAR1、IFNGR1、IL10RB、IL18R1、IL18RAP、IL3RA、LEPR及PRLR的跨膜域(P2)或其突变体已知在某些细胞类型中促进信号传导活性(若此类突变体存在于这些表中所提供的构建体中)、在第7天与第21天之间
促进PBMC的增生。此结论基于混合培养的PBMC细胞群体中的构建体的序列计数的富集,当
将一个基因的所有构建体的结果组合时,使得对于库3A,以第21天的标准化计数加一与第7天的标准化计数加一之间的比率的以2为底的对数计算的富集度为至少2。对于库3B,来自
CD40、ICOS、CSF2RA、IL18R1、IL3RA及TNFRSF14的跨膜域在以此方式分析时为表达最佳的。
对于第35天及第21天的库3A及3B,存在于促进细胞增生的构建体中的跨膜域或其部分和/
或突变体的实例分别提供于表12及13中。存在于称为库3.1A及3.1B的重复筛选中的促进细
胞增生的构建体中的跨膜域或其部分和/或突变体的实例提供于表14及15中。
[1404] 对于库3A,当在第7天与第21天之间在本文的候选嵌合多肽组件的第一胞内域位置(P3)处发现促进PBMC增生时,当以组合方式考虑具有来自彼基因的第一细胞内域的所有
构建体的数据时(数据未示出),来自IL17RD、IL17RE、IL1RAP、IL23R及MPL的第一胞内域
(P3)或其突变体已知在某些细胞类型中促进信号传导活性(若此类突变体存在于这些表中
所提供的构建体中)。此结论基于混合培养的PBMC细胞群体中的构建体的序列计数的富集,当将一个基因的所有构建体的结果组合时,使得对于库3A,以第21天的标准化计数加一与
第7天的标准化计数加一之间的比率的以2为底的对数计算的富集度为至少2。对于库3B,已知在某些细胞类型中促进信号传导活性的来自IL21R、MPL及IL2RB的第一胞内域或其突变
体(若此类突变体存在于这些表中)在以此方式分析时为表达最佳的。对于第35天及第21天
的库3A及3B,存在于促进最大程度的细胞增生的构建体中的第一胞内域或其部分和/或突
变体的实例分别提供于表12及13中。存在于称为库3.1A及3.1B的重复筛选中的促进细胞增
生的构建体中的第一胞内域或其部分和/或突变体的实例提供于表14及15中。
[1405] 对于库3A,当在第7天与第21天之间在本文的候选嵌合多肽组件的第二胞内域位置(P4)处发现促进PBMC增生时,当以组合方式考虑具有来自彼基因的第二细胞内域的所有
构建体的数据时(数据未示出),来自CD27、CD3G、CD40及CD79B的第二胞内域(P4)或其突变体已知在某些细胞类型中促进信号传导活性(若此类突变体存在于这些表中)。此结论基于
混合培养的PBMC细胞群体中的构建体的序列计数的富集,当将一个基因的所有构建体的结
果组合时,使得对于库3A,以第21天的标准化计数加一与第7天的标准化计数加一之间的比率的以2为底的对数计算的富集度为至少2。对于库3B,已知在某些细胞类型中促进信号传
导活性的来自CD40的第二胞内域或其突变体(若此类突变体存在于这些表中)在以此方式
分析时为表达最佳的。对于第35天及第21天的库3A及3B,存在于促进最大程度的细胞增生
的构建体中的第二胞内域或其部分和/或突变体的实例分别提供于表12及13中。存在于称
为库3.1A及3.1B的重复筛选中的促进最大程度的细胞增生的构建体中的第二胞内域或其
部分和/或突变体的实例提供于表14及15中。
[1406] 关于特定基因,在具有CD8B(CD8b分子)作为P2部分的798个构建体中,111个阳性的,其定义为对于第21天的库3A或3B具有富集度大于二(log2)的构建体。在具有CD40(CD40分子)作为P2部分的1,032个构建体中,159个阳性的。在具有CRLF2(细胞因子受体类似因子
2)作为P2部分的1,339个构建体中,175个阳性的。在具有CSF2RA(群落刺激因子2受体α次单元)作为P2部分的593个构建体中,108个阳性的。在具有FCGR2C(IgG受体IIc的Fc片段(基
因/假基因))作为P2部分的714个构建体中,88个阳性的。在具有ICOS(可诱导T细胞共刺激
剂)作为P2部分的788个构建体中,108个阳性的。在具有IFNAR1(干扰素α及β受体次单元1)作为P2模块的882个构建体中,106个为阳性的。在具有IFNGR1(干扰素γ受体1)作为P2模块的806个构建体中,104个为阳性的。在具有IL3RA(白细胞介素3受体次单元α)作为P2模块的
938个构建体中,132个为阳性的。在具有IL10RB(白细胞介素10受体次单元α)作为P2模块的
746个构建体中,99个为阳性的。在具有IL18R1(白细胞介素18受体1)作为P2模块的814个构建体中,131个为阳性的。在具有IL18RAP(白细胞介素18受体辅助蛋白)作为P2模块的552个构建体中,83个为阳性的。在具有LEPR(瘦素受体)作为P2模块的1,390个构建体中,184个为阳性的。在具有PRLR(催乳素受体)作为P2模块的795个构建体中,123个为阳性的。
[1407] 在具有IL1RAP(白细胞介素1受体辅助蛋白)作为P3部分的1,259个构建体中,158个阳性的,其定义为对于第21天的库3A或3B具有富集度大于二的构建体。在具有IL17RD(白细胞介素17受体D)作为P3部分的200个构建体中,31个阳性的。在具有IL17RE(白细胞介素
17受体E)作为P3模块的11个构建体中,3个为阳性的。在具有IL23R(白细胞介素23受体)作
为P3模块的538个构建体中,86个为阳性的。在具有MPL(MPL原癌基因,血小板生成素受体)作为P3模块的1,531个构建体中,509个为阳性的。
[1408] 在具有CD3G(CD3g分子)作为P4部分的3,124个构建体中,458个阳性的,其定义为对于第21天的库3A或3B具有富集度大于二的构建体。在具有CD27(CD27分子)作为P4部分的
3,293个构建体中,443个阳性的。在具有CD40(CD40分子)作为P4模块的5,163个构建体中,
724个为阳性的。在具有CD79B(CD79b分子)作为P4模块的4,486个构建体中,663个为阳性
的。值得注意的是,对于任何构建体而言,由于这是一种竞争性测定法,“阴性”表示构建体在促进增生方面不参与竞争,而非构建体不能够促进增生。
[1409] 对于库3A及3.1A,构建体E008/E013-T041-S186-S050、E006/E011-T077-S186-S211、E007/E012-T021-S186-S051、E009/E014-T041-S186-S053、E007/E012-T073-S186-
S053、E006/E011-T017-S186-S051、E006/E011-T031-S186-S211、E006/E011-T011-S186-
S050、E006/E011-T011-S186-S047、E007/E012-T001-S186-S050、E006/E011-T041-S186-
S051、E008/E013-T028-S186-S076、E009/E014-T029-S199-S053、E009/E014-T062-S186-
S216、E007/E012-T006-S058-S051、E009/E014-T076-S186-S211及E007/E012-T001-S186-
S047在两个筛选中均具有尤其值得注意的富集度,其中通过此处的斜杠间隔开的P1部分包
括如表6、12及14中所示的库3A及3.1A的不同标签。出于重复筛选的目的,具有尤其值得注意的富集度的构建体为具有log2((在最后一天的标准化计数数据+1)/(在第7天的标准化
计数数据+1))值大于2的那些构建体。
[1410] 关于在对库3A及库3.1A两者的筛选中的具有尤其值得注意的富集度的构建体中的第一及第二胞内域的其他信息提供于表21中,包括第一及第二胞内域来源的基因,第一
和/或第二胞内域是否为细胞因子受体,且第一和/或第二胞内域是否具有至少一个ITAM基
元。具有来自MPL、OSMR或CSF2RA的胞内域的构建体存在于第一胞内域(P3)时,且具有来自CD40、TNFRSF4、CD79B、CD27、FCGR2A或TNFRSF18的胞内域的构建体存在于第二胞内域(P4)时,在库3A及3.1A两者中显示尤其值得注意的富集度(表21)。具有来自细胞因子受体MPL、OSMR或CSF2RA的结构域的构建体存在于第一胞内域(P3)时,且具有来自细胞因子受体
CD40、TNFRSF4、CD27、FCGR2A或TNFRSF18的结构域的构建体存在于第二胞内域(P4)时,在库
3A及3.1A两者中显示尤其值得注意的富集度(表21)。具有含有MPL或OSMR的ITAM基元的结
构域的构建体存在于第二胞内域(P4)时,在库3A及3.1A两者中显示尤其值得注意的富集度
(表21)。
[1411] 对于库3B及3.1B,构建体E007/E012-T017-S186-S051、E007/E012-T073-S186-S053、E008/E013-T028-S186-S047、E006/E011-T011-S186-S047、E007/E012-T082-S176-
S214、E006/E011-T046-S186-S052、E008/E013-T029-S186-S052、E009/E014-T011-S186-
S053、E008/E013-T032-S186-S039、E007/E012-T034-S186-S051、E007/E012-T041-S192-
S213、E006/E011-T014-S069-S213、E006/E011-T022-S186-S053、E006/E011-T023-S115-
S075、E006/E011-T029-S106-S213、E006/E011-T032-S155-S080、E006/E011-T041-S186-
S216、E006/E011-T057-S135-S080、E006/E011-T072-S191-X002、E006/E011-T077-S186-
S216、E006/E011-T080-S141-S080、E007/E012-T001-X001-S214、E007/E012-T007-S059-
S211、E007/E012-T016-S186-S052、E007/E012-T031-S186-S053、E007/E012-T044-S102-
S052、E007/E012-T044-S142-X002、E007/E012-T055-S069-S053、E007/E012-T063-S176-
S216、E007/E012-T065-S157-S075、E008/E013-T008-S085-X002、E008/E013-T011-S085-
S048、E008/E013-T021-S109-X002、E008/E013-T021-S168-S211、E008/E013-T032-S064-
S214、E008/E013-T037-S170-S215、E008/E013-T038-S176-S048、E008/E013-T039-S137-
S216、E008/E013-T041-S141-S053、E008/E013-T045-S177-S048、E008/E013-T048-S109-
S074、E008/E013-T073-S199-S075、E009/E014-T001-S157-S074、E009/E014-T005-S196-
S049、E009/E014-T011-S130-X002、E009/E014-T013-S155-X002、E009/E014-T017-S186-
S076、E009/E014-T021-S142-S080、E009/E014-T023-S082-S076、E009/E014-T038-S196-
S037、E009/E014-T055-S186-S052、E009/E014-T060-S175-S053、E009/E014-T070-S085-
S212、E008/E013-T026-S054-S213、E009/E014-T007-S120-S053、E007/E012-T045-S186-
S211、E008/E013-T073-S186-X002、E008/E013-T074-S186-X002、E007/E012-T055-S186-
S053、E008/E013-T036-S186-S053、E007/E012-T017-S058-S053、E008/E013-T030-S189-
S080、E006/E011-T029-S081-S047、E009/E014-T044-S194-S050、E006/E011-T028-S121-
X002、E008/E013-T028-S186-S053、E009/E014-T078-S142-S213、E009/E014-T041-S186-
S051、E008/E013-T006-S186-S050、E006/E011-T028-S186-S075、E006/E011-T040-S120-
S038、E007/E012-T044-S115-S211、E009/E014-T039-S176-S075、E007/E012-T028-S186-
S050、E008/E013-T031-S202-S050、E007/E012-T072-S192-S053、E006/E011-T065-X001-
S051、E007/E012-T030-S062-X002、E007/E012-T073-S186-X002、E009/E014-T056-S186-
S053、E008/E013-T046-S137-X002、E006/E011-T016-S136-S076、E007/E012-T032-S142-
S037、E007/E012-T065-S120-S215、E009/E014-T077-S186-S047、E009/E014-T001-S126-
S051、E006/E011-T030-S121-S039、E008/E013-T006-S176-S213、E009/E014-T032-S130-
S215、E008/E013-T041-S186-S039、E009/E014-T021-S186-S047、E008/E013-T026-S137-
S214、E007/E012-T029-S116-S075、E008/E013-T026-S106-S049及E007/E012-T032-S168-
S075在两个筛选中均具有尤其值得注意的富集度,其中通过此处的斜杠间隔开的P1部分包
括如表6、13及15中所示的库3B及3.1B的不同标签。出于重复筛选的目的,具有尤其值得注意的富集度的构建体为具有log2((在最后一天的标准化计数数据+1)/(在第7天的标准化
计数数据+1))值大于2的那些构建体。
[1412] 关于在对库3B及库3.1B两者的筛选中的具有尤其值得注意的富集度的构建体中的第一及第二胞内域的其他信息提供于表22中,包括第一及第二胞内域来源的基因,第一
和/或第二胞内域是否为细胞因子受体,且第一和/或第二胞内域是否具有至少一个ITAM基
元。具有来自MPL、LEPR、MYD88、EPOR、IL5RA、IL2RG、IL18RAP、IL11RA、IL13RA1、CSF2RA、IL1RL1、IL13RA2、IL20RB、IFNGR2、IL3RA、IL27RA、CSF3R、IL31RA、IL12RB1、OSMR、IL10RB、IFNAR2、CRLF2、IL7R、IFNAR1、PRLR、IL9R、IL6R或IL15RA的胞内域的构建体存在于第一胞内域(P3)时,且具有来自CD40、CD79B、CD27、TNFRSF14、CD79A、CD3G、TNFRSF9、FCGR2C、ICOS、TNFRSF18、TNFRSF4、CD28、FCER1G、FCGR2A、CD3D、TNFRSF8或CD3E的胞内域的构建体存在于第二胞内域(P4)时,在库3B及3.1B两者中显示尤其值得注意的富集度(表22)。具有来自
MPL、LEPR、EPOR、IL5RA、IL2RG、IL18RAP、IL11RA、IL13RA1、CSF2RA、IL1RL1、IL13RA2、IL20RB、IFNGR2、IL3RA、IL27RA、CSF3R、IL31RA、IL12RB1、OSMR、IL10RB、IFNAR2、CRLF2、IL7R、IFNAR1、PRLR、IL9R、IL6R或IL15RA的胞内域的构建体存在于第一胞内域(P3)时,且具有来自CD40、CD27、TNFRSF14、TNFRSF9、FCGR2C、TNFRSF18、TNFRSF4、FCER1G、FCGR2A或TNFRSF8的胞内域的构建体存在于第二胞内域(P4)时,在库3B及3.1B两者中显示尤其值得
注意的富集度(表22)。具有含有CD79B、CD79A、CD3G、FCGR2C、FCER1G、FCGR2A、CD3D或CD3E的ITAM基元的结构域的构建体存在于第二胞内域(P4)时,在库3B及3.1B两者中显示尤其值得
注意的富集度(表22)。
[1413] FACs分析显示第49天库3A扩增细胞主要为CD3+、CD8+、CD56+及FLAG-Tag+。下文紧接的表格显示对指定标记及标记组合染色呈阳性的淋巴细胞百分比。此数据显示自此库筛选中识别的驱动程序主要为扩增CD3+T细胞组分。
[1414]
[1415] 对于在包括编码嵌合多肽而无CAR的构建体以及未补充有新鲜未转导PBMC的转导PBMC的库4B,当在不存在IL-2下培养时识别到在第7天与表上指示的最后一天之间促进最
大程度的PBMC增生的154个最优候选物(参见表16)。
[1416] 对于库4B,当在第7天与表上指示的最后一天之间在本文的候选嵌合多肽组件的跨膜域位置(P2)处发现促进PBMC的细胞增生时,当以组合方式考虑具有来自彼基因的跨膜
域的所有构建体的数据时,来自CD40、CD8B、CSF2RA、IL18R1及IL3RA的跨膜域(P2)或其突变体已知在某些细胞类型中促进组成性信号传导活性(若此类突变体存在于这些表中所提供
的构建体中)。此结论基于混合培养的PBMC细胞群体中的构建体的序列计数的富集,使得当针对一个基因将所有构建体的结果组合时,对于库4B,以表上指示的最后一天的标准化计
数加一与第7天的标准化计数加一之间的比率的以2为底的对数计算的富集度为至少2。存
在于库4B中促进细胞增生的构建体中的跨膜域或其部分和/或突变体的实例提供于表16
中。存在于在称为库4.1B的重复筛选中促进细胞增生的构建体中的跨膜域或其部分和/或
突变体的实例提供于表17中。
[1417] 对于库4B,当在第7天与表上指示的最后一天之间在本文的候选嵌合多肽组件的第一胞内域位置(P3)处发现促进PBMC的细胞增生时,当以组合方式考虑具有来自彼基因的
第一细胞内域的所有构建体的数据时,来自CRLF2、CSF2RA、IFNGR2、IL4R、MPL及OSMR的第一胞内域(P3)或其突变体已知在某些细胞类型中促进信号传导活性(若此类突变体存在于这
些表中所提供的构建体中)。此结论基于混合培养的PBMC细胞群体中的构建体的序列计数
的富集,当将一个基因的所有构建体的结果组合时,使得对于库4B,以表上指示的最后一天的标准化计数加一与第7天的标准化计数加一之间的比率的以2为底的对数计算的富集度
为大于0。存在于库4B中促进细胞增生的构建体中的第一胞内域域或其部分和/或突变体的
实例提供于表16中。存在于在称为库4.1B的重复筛选中促进细胞增生的构建体中的第一胞
内域域或其部分和/或突变体的实例提供于表17中。
[1418] 对于库4,当在第7天与表上指示的最后一天之间在本文的候选嵌合多肽组件的第二胞内域位置(P4)处发现促进PBMC的增生时,当以组合方式考虑具有来自彼基因的第二细
胞内域的所有构建体的数据时,来自CD27、CD40及CD79B的第二胞内域(P4)或其突变体已知在某些细胞类型中促进信号传导活性(若此类突变体存在于这些表中所提供的构建体中)。
此结论基于混合培养的PBMC细胞群体中的构建体的序列计数的富集,当将一个基因的所有
构建体的结果组合时,使得对于库4B,在最后一天存在的此结构域计数比第7天多。存在于库4B中促进细胞增生的构建体中的第二胞内域域或其部分和/或突变体的实例提供于表16
中。存在于在称为库4.1B的重复筛选中促进细胞增生的构建体中的第二胞内域域或其部分
和/或突变体的实例提供于表17中。
[1419] 对于库4B及4.1B,构建体E007/E012-T078-S154-S047、E008/E013-T062-S186-X002、E008/E013-T055-S186-S050、E009/E014-T057-S186-S050、E007/E012-T077-S054-
S053、E007/E012-T034-S135-S211、E009/E014-T071-X001-S216、E009/E014-T011-S141-
S037、E008/E013-T041-S186-S037、E006/E011-T038-S106-S039、E006/E011-T011-S121-
X002、E007/E012-T007-S085-S215、E006/E011-T041-S186-S050、E007/E012-T008-S064-
S051、E006/E011-T041-S186-S047、E008/E013-T045-S186-S051、E008/E013-T003-S104-
S216、E006/E011-T019-S186-S053、E008/E013-T071-S064-S080、E006/E011-T021-S054-
X002、E006/E011-T003-S135-X002、E009/E014-T020-S199-S213、E008/E013-T027-S121-
S211、E009/E014-T032-S195-X002、E009/E014-T050-S171-X002、E008/E013-T069-S083-
X002、E008/E013-T026-S116-S038、E009/E014-T072-S195-X002、E007/E012-T047-S058-
S211、E008/E013-T046-S142-S080、E006/E011-T065-S186-S076、E006/E011-T062-S069-
X002、E007/E012-T047-S098-X002、E009/E014-T069-S099-S048、E008/E013-T039-S141-
S050、E006/E011-T052-S130-S052、E008/E013-T041-S186-X002、E007/E012-T019-S120-
X002、E008/E013-T045-S186-S053、E006/E011-T003-S170-S039、E007/E012-T047-S058-
S051、E007/E012-T069-S109-X002、E009/E014-T019-S130-S075及E006/E011-T047-S054-
S053在两个筛选中均具有尤其值得注意的富集度,其中通过此处的斜杠间隔开的P1部分包
括如表6、16及17中所示的库34B及4.1B的不同标签。出于重复筛选的目的,具有尤其值得注意的富集度的构建体为具有log2((在最后一天的标准化计数数据+1)/(在第7天的标准化
计数数据+1))值大于2的那些构建体。
[1420] 在表23中提供关于在对库4B及库4.1B两者的筛选中的具有尤其值得注意的富集度的构建体中的第一及第二胞内域的其他信息,包括第一及第二胞内域来源的基因,第一
和/或第二胞内域是否为细胞因子受体,且第一和/或第二胞内域是否具有至少一个ITAM基
元。具有来自IL18R1、MPL、CRLF2、IL11RA、IL13RA1、IL2RG、IL7R、IFNGR2、CSF3R、IL2RA、OSMR、MYD88、IL31RA、IFNAR2、IL6R、CSF2RA、IL13RA2、EPOR、IL1R1、IL10RB或IL3RA的胞内域的构建体存在于第一胞内域(P3)时,且具有来自CD27、CD40、CD79B、TNFRSF4、TNFRSF18、CD3D、CD3G、CD27、ICOS、TNFRSF9、CD3E、FCGR2A、CD28、CD79A或FCGR2C的胞内域的构建体存在于第二胞内域(P4)时,在库4B及4.1B两者中显示尤其值得注意的富集度(表23)。具有来
自IL18R1、MPL、CRLF2、IL11RA、IL13RA1、IL2RG、IL7R、IFNGR2、CSF3R、IL2RA、OSMR、IL31RA、IFNAR2、IL6R、CSF2RA、IL13RA2、EPOR、IL1R1、IL10RB或IL3RA的胞内域的构建体存在于第一胞内域(P3)时,且具有来自CD27、CD40、TNFRSF4、TNFRSF18、TNFRSF9、FCGR2A或FCGR2C的胞内域的构建体存在于第二胞内域(P4)时,在库4B及4.1B两者中显示尤其值得注意的富集度
(表23)。具有含有CD79B、CD3D、CD3G、CD3E、FCGR2A、CD79A或FCGR2C的ITAM基元的结构域的构建体存在于第二胞内域(P4)时,在库4B及4.1B两者中显示尤其值得注意的富集度(表
23)。
[1421] 对于库4B,在具有CD8B(CD8b分子)作为P2部分的572个构建体中,21个为阳性的,其定义为对于库4B具有富集度大于二的构建体。在具有CD40(CD40分子)作为P2模块的897
个构建体中,50个为阳性的。在具有CSF2RA(群落刺激因子2受体α次单元)作为P2模块的551个构建体中,25个为阳性的。在具有IL3RA(白细胞介素3受体次单元α)作为P2模块的732个构建体中,47个为阳性的。在具有IL18R1(白细胞介素18受体1)作为P2模块的738个构建体
中,44个为阳性的。在具有MPL(MPL原癌基因,血小板生成素受体)作为P3模块的1,683个构建体中,305个为阳性的。
[1422] 在第21天对库3A的初始中期分析中,前100个命中者中的66个及前1000个命中者中的538个已经解码。进一步译码提供深度译码及对库3A之前100个命中者中的99个及前
1000个命中者中的992个的识别且在第35天收集资料并且在第21天更新分析。在第21天对
库3B的初始分析中,前100个命中者中的77个及前1000个命中者中的464个已经在初始中期
分析中解码。进一步译码提供深度译码及对库3B之前100个命中者中的100个及前1000个命
中者中的708个的识别。库3A及3B的最优构建体以及库3A的第35天数据及库3B的第21天资
料分别显示与表12及13中。
[1423] 在包括编码嵌合多肽及CAR的构建体以及补充有(库3A)或不具有(库3B)新鲜未转导PBMC的转导PBMC的库3A及库3B中,当在不存在IL-2(亦即,在初始转导之后的培养期间,不将IL-2不添加到培养培养基中)下培养时识别到在第7天与表上指示的最后一天之间促
进最大程度的PBMC增生的针对第35天的库3A的124个最优候选物,并且识别到针对第21天
的库3B的131个最优候选物(分别参见表12及13)。表12(第35天的库3A)及13(第21天的库
3B)的最优候选清单是通过在深度解码之后将在第21天(库3B)或第21或35天(库3A)之前
100个最流行候选物与第21天与第7天之间(库3B)或第21天与第7天之间或第35天与第7天
之间(库3A)之前100个最富集候选构建体组合来产生。
[1424] 从使用深度译码所得结果的最优命中者表中来看,CLE的特定模块中的某些多肽是在库3A及库3B中的至少一者及第21天及第35天(库3A)或第21天(库3B)的时间点中的至
少一者的最优命中者当中。举例而言,含有以下的例示性构建体是在前5个最常见嵌合多肽当中(参见表12及表13):在P2位置中,CD40(特定言的例如具有密码T011的跨膜域)、ICOS
(特定言的例如具有密码T028的跨膜域)、FCGR2C(特定言的例如具有密码T024的跨膜域)、
PRLR(特定言的例如具有密码T077的跨膜域)、IL3RA(特定言的例如具有密码T041的跨膜
域)、IL6ST(特定言的例如具有密码T045的跨膜域);在P2位置中,IL18R1(特定言的例如具有密码T062的跨膜域);在P3位置中,MPL(特定言的例如具有密码S186的胞内域)、IL18R1
(特定言的例如具有密码S154的胞内域)、IL13RA2(特定言的例如具有密码S142的胞内域)、IL10RB(特定言的例如具有密码S130的胞内域)、LEPR(特定言的例如具有密码S176的胞内
域)、IFNAR2(特定言的例如具有密码S083的胞内域)、IL23R(特定言的例如具有密码S165的胞内域)、MyD88(特定言的例如具有密码S194的胞内域,及CSF2RA(特定言的例如具有密码
S058的胞内域);和/或在P4位置中,CD40(特定言的例如具有密码S050或S051的胞内域)、
CD79B(特定言的例如具有密码S053的胞内域)、TNFRSF4(特定言的例如具有密码S211的胞
内域)、TNFRSF9(特定言的例如具有密码S213的胞内域)、TNFRSF14(特定言的例如具有密码S214的胞内域)、FCGRA2(特定言的例如具有密码S076的胞内域)、CD3G(特定言的例如具有
密码S039的胞内域)或CD27(特定言的例如具有密码S047的胞内域)。显然,MPL为对于两个
库3A及3B而言在P3大间隔处的最常见嵌合多肽。注意来自P3的最优命中者不包括在库3A或
3B中的这些构建体的P4位置中。
[1425] 以下额外观测结果值得注意:P2_CD40、P2_ICOS、P3_MPL、P4_CD40及P4_CD79B在表12及13中的每一者中显示为最优命中者中的最常见部分。P4_CD27在表12及13中显示为最
常见部分。CSF2RB在前123个最富集中出现4次且在P2处重复最多,但突变V449E并不出现在这些最优命中者中(表12)。因此,在本文的一些实施例中,嵌合多肽包含在表12及13中所示的任何构建体中识别的跨膜域,除CSF2RB的跨膜域突变V449E以外。八个MyD88变体在库3A
前123个中的P3位置处出现至少一次(表12)。在库中测试的CD40的两个变体在库3A之前123
个列表中的P4位置处出现至少一次(表12)。在P3处的MPL与在P4处的CD40的组合显示在库
3A之前123个构建体清单中的26个构建体中(表12)。
[1426] 为对基因进行基因分析,对于库3A,已知在某些细胞类型中促进信号传导活性的来自CD4、CD8B、CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCGR2C、GHR、ICOS、IFNAR1、IFNGR1、IFNGR2、IL1R1、IL1RAP、IL2RG、IL3RA、IL5RA、IL6ST、IL7RA、IL10RB、IL11RA、IL13RA2、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RE、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL22RA1、IL31RA、LEPR、PRLR及TNFRSF8的跨膜域(P2)或其突变体(若此类突变体存在于这些表中所提供的构建体中)在第
7天与表示所指示的最后一天之间促进PBMC的增生,此时以组合方式考虑具有来自彼基因
的跨膜域的所有构建体的数据时(表12)。此结论基于混合培养的PBMC细胞群体中的构建体
的序列计数的富集,使得当针对一个基因将所有构建体的结果组合时,对于库3A,以表上指示的最后一天的标准化计数加一与第7天的标准化计数加一之间的比率的以2为底的对数
计算的富集度为至少2。对于库3B(表13),已知在某些细胞类型中促进信号传导活性的来自CD40、ICOS及IL18R1的跨膜域或其突变体(若此类突变体存在于这些表中)在以此方式分析
时为表达最佳的。对于库3A及库3B,在表12及表13中提供了存在于促进最大程度的细胞增
生的构建体中的跨膜域或其部分和/或突变体的实例。在表14及15中提供了存在于称为库
3.1A及库3.1B的重复筛选中的促进细胞增生的构建体中的跨膜域或其部分和/或突变体的
实例。
[1427] 对于库3A,已知在某些细胞类型中促进信号传导活性的来自CSF2RA、IFNAR1、IL1RAP、IL4R、IL6ST、IL11RA、IL12RB2、IL17RA、IL17RD、IL17RE、IL18R1、IL21R、IL23R、MPL及MyD88的第一胞内域(P3)或其突变体(若此类突变体存在于这些表中所提供的构建体中)
在发现处于本文的候选嵌合多肽组件的第一胞内域位置(P3)时在第7天与表上指示的最后
一天之间促进PBMC的细胞增生,此时以组合方式考虑具有来自彼基因的第一细胞内域的所
有构建体的数据。此结论基于混合培养的PBMC细胞群体中的构建体的序列计数的富集,使
得当针对一个基因将所有构建体的结果组合时,对于库3A,以表上指示的最后一天的标准
化计数加一与第7天的标准化计数加一之间的比率的以2为底的对数计算的富集度为至少
2。对于库3B,已知在某些细胞类型中促进信号传导活性的来自CSF2RB、IL4R及MPL的第一胞内域或其突变体(若此类突变体存在于这些表中)在以此方式分析时为表达最佳的。在表12
及表13中提供了对于库3A及库3B,存在于促进最大程度的细胞增生的构建体中的第一胞内
域或其部分和/或突变体的实例。在表14及表15提供了存在于称为库3.1A及库3.1B的重复
筛选中的促进细胞增生的构建体中的第一胞内域或其部分和/或突变体的实例。
[1428] 对于库3A,已知在某些细胞类型中促进信号传导活性的来自CD3D、CD3G、CD27、CD40、CD79A、CD79B、FCER1G、FCGRA2、ICOS、TNFRSF4及TNFRSF8的第二胞内域(P4)或其突变体(若此类突变体存在于这些表中所提供的构建体中)在发现处于本文的候选嵌合多肽组
件的第二胞内域位置(P4)时在第7天与第21或第7天与表上指示的最后一天之间促进PBMC
的增生,此时以组合方式考虑具有来自彼基因的第二细胞内域的所有构建体的数据。此结
论基于混合培养的PBMC细胞群体中的构建体的序列计数的富集,使得当针对一个基因将所
有构建体的结果组合时,对于库3A,以表上指示的最后一天的标准化计数加一与第7天的标准化计数加一之间的比率的以2为底的对数计算的富集度为至少2。对于库3B,已知在某些
细胞类型中促进信号传导活性的来自CD40的第二胞内域或其突变体(若此类突变体存在于
这些表中)尽管未获得2倍log2富集度,但在以此方式分析时为表达最佳的。对于库3A及库
3B,在表12及表13中提供了存在于促进最大程度的细胞增生的构建体中的第二胞内域或其
部分和/或突变体的实例。在表14及表15中提供了存在于称为库3.1A及库3.1B的重复筛选
中的促进细胞增生的构建体中的第二胞内域或其部分和/或突变体的实例。
[1429] 实施例19.利用差示扫描量热法(DSC)在阿昔洛韦的不存在及存在下的F1A-795的热变性
[1430] 在此实施例中,核苷类似物抗病毒药物与核糖开关(SEQ ID NO:87)的适体域的结合通过在核苷类似物抗病毒药物阿昔洛韦的缺失相比于存在下比较适体域的热变性来证
实。
[1431] 适体制备
[1432] 利用IDT(Coralville,IA)将T7引物(SEQ ID NO:246)以及所鉴别候选序列的模板(反向互补物)合成为单链DNA。通过组合组分至1μM模板、2μM T7引物、200μM dNTP、1×Titanium Taq DNA聚合酶及1×Titanium Taq缓冲液(Clontech Laboratories;加州山景
城),接着在95℃下加热3分钟,在55℃下加热1分钟及在68℃下加热2分钟(无循环)来使候
选物经引物扩增。42皮摩尔的双链DNA是用于根据标准试剂盒指示(1×反应缓冲液,7.5mM
各NTP,10mM DTT,1×RiboGuard RNase抑制剂,1×Ampliscribe T7酶溶液)用Ampliscribe T7高产率转录试剂盒(Lucigen;威斯康星州米德尔顿)进行十二次20-μl反应。在42℃下培育反应物隔夜,接着通过添加1μl DNase I终止且在37℃下培育15分钟。在具有8M脲素的
10%变性PAGE上纯化转录产物。冻干至少10纳摩尔的各候选物,且在结合评估当天将其再
悬浮于1×结合缓冲液(50mM HEPES,100mM KCl,0.5mM MgCl2,pH 7.3)中。
[1433] 简言之,DSC是用于分析在不存在阿昔洛韦的情况下的F1A-795(7.2μM)及在存在阿昔洛韦(29.4μM)的情况下的F1A-795(2.77μM)。所有分析均在1×结合缓冲液中进行且所使用的所有水均经DEPC处理。将所有分析物首先再悬浮于经DEPC处理的水中,接着在1×结
合缓冲液中稀释至其最终所列浓度。在装载DSC(GE Healthcare MicroCal VP-DSC)之前,
在25℃下对样本进行脱气10分钟。以每分钟1℃的速率自10℃至115℃扫描不具有阿昔洛韦
的样本。以每分钟1℃的速率自10℃至105℃扫描具有阿昔洛韦的样本。
[1434] 结果
[1435] 如由DSC量测,在不存在阿昔洛韦的情况下的F1A-795的热变性具有中心在约60℃下的转换(图28)。此转换表明,适体域在不存在阿昔洛韦的情况下结构化。在不存在阿昔洛韦的情况下,F1A-795具有中心在约75℃下的转换(图28)。此稳定效果指示,核苷类似物抗病毒药物阿昔洛韦与适体域F1A-795结合。因此,此实验确认,F1A-795由阿昔洛韦结合。
[1436] 实施例20.通过含有VSV-G的假型组件及膜结合活化组件及并且视情况含有Vpu蛋白质的反转录病毒颗粒对新鲜经分离且未经刺激的人类T细胞的转导效率
[1437] 重组慢病毒颗粒是通过用编码gag/pol及rev的单独的慢病毒包装质粒及编码VSV-G的假型化质粒瞬时转染293T细胞(Lenti-XTM 293T,Clontech)来产生。编码GFP、抗
CD19嵌合抗原受体及在本文称为F1-0-03的eTAG(图20)的第三代慢病毒表达载体用包装质
TM
粒共转染。细胞通过在Freestyle  293Expression Medium(ThermoFisher Scientific公
司)中连续生长来适应悬浮培养。以1×106个细胞/毫升(30mL)在125L Erlenmeyer烧瓶中
接种悬浮液中的细胞,并立即使用溶解于弱酸中的聚乙烯亚胺(PEI)(Polysciences)转染。
[1438] 对于30mL细胞将质粒DNA稀释于1.5ml GibcoTM Opti-MEMTM培养基中。为获得用VSV-G假型化的慢病毒颗粒,所使用的总DNA(每mL培养体积中1μg)为具有以下穆尔比的4种质粒的混合物:2×基因组质粒(F1-0-03)、1×含Rev的质粒、1×含VSV-G的质粒及1×含
gag/pol的质粒。为获得用VSV-G假型化且在其表面呈现抗CD3-scFvFc-GPI的慢病毒颗粒,
所使用的总DNA(每mL培养体积中1μg)为具有以下穆尔比的5种质粒的混合物:2×基因组质
粒(F1-0-03)、1×含Rev的质粒、1×含VSV-G的质粒、1×含抗CD3-scFvFc-GPI的质粒及1×
含gag/pol的质粒。为获得用VSV-G假型化且呈现抗CD3-scFvFc-GPI并且含有辅助蛋白Vpu
的慢病毒颗粒,所使用的总DNA(每mL培养体积中1μg)为具有以下穆尔比的6种质粒的混合
物:2×基因组质粒(F1-0-03)、1×含Rev的质粒、1×含VSV-G的质粒、1×含抗CD3-scFvFc-
GPI的质粒、1×含Vpu-CH的质粒及1×含gag/pol的质粒。单独地,将PEI在1.5ml GibcoTM 
Opti-MEMTM中稀释至每mL培养体积中2μg(与DNA的比为2:1比率)。在5分钟室温培育之后,将两种溶液彻底地混合在一起,且在室温下培育20分钟。将最终体积(3ml)添加至细胞中。接着伴随125rpm下及具有8%CO2、在37℃下培育细胞72小时。含有抗CD3-scFvFc-GPI的质粒
包括来源于UCHT1的scFv及来源于DAF(CD55)的GPI锚定连接序列。UCHT1scFvFc-GPI载体编
码包括与人类Igκ信号肽(NCBI GI No.CAA45494.1的氨基酸1-22)的肽(SEQ ID NO:278),
该人类Igκ信号肽与UCHT1 scFv(NCBI GI No.CAH69219.1的氨基酸21-264)融合、与人类
IgG1 Fc(NCBI GI No.AEV43323.1的氨基酸1-231)、与人类DAF GPI锚定连接序列(NCBI GI No.NP_000565的氨基酸345-381)融合。含有Vpu-CH的质粒编码包括来自HIV-1M CH167-CC
分离体(氨基酸1-84,GeneBank:AGF30946.1)的Vpu序列的肽(MFDFIARVDYRVGVVALVVALIIA
IIVWSIVYIEYRKLLKQRKIDWLIKRIRERAEDSGNESDGEIEELSTMVDMEHLRLLDDL*)。
[1439] 在72小时之后,采集上清液并且通过以1,200g离心10分钟来澄清。将经澄清上清液倒入新试管中。在4℃下,通过以3,300g隔夜离心来沉淀慢病毒颗粒。舍弃上清液,且将慢TM
病毒颗粒集结粒再悬浮于1:100的初始体积的X-Vivo  15培养基(Lonza)中。通过连续稀释
及在转导72小时后的293T及Jurkat细胞中通过流式细胞术分析GFP表达来滴定慢病毒颗
粒。
[1440] 将周边血单核细胞(PBMC)自血块黄层分离,利用加州圣地亚哥血库收集并分配。根据制造商的说明书,进行基于SepMateTM 50(StemcellTM)的Ficoll-Paque  (GE 
TM
Healthcare Life Sciences)上的PBMC的梯度密度分离。根据各SepMate 试管将稀释于X-
VivoTM 15培养基中的30mL的血块黄层分层。在室温下以1,200g离心20分钟之后,收集PBMC层,经汇集且用45mL的X-VivoTM 15培养基洗涤三次,并在室温下以400g离心10min。接着在室温下在10mL的RBC裂解缓冲液(Alfa Aesar)中培育丸粒10分钟,且用45mL的X-VivoTM 15
培养基洗涤额外两次,并在室温下以400g离心10min。不采取额外步骤以移除单核细胞。在分离之后,将新鲜及未经刺激的PBMC再悬浮于X-VivoTM 15中达到1×106/mL的最终浓度,且用先前公开的慢病毒颗粒转导这些PBMC(两个重复)。使传导在37℃、5%CO2下在X-VivoTM 
15培养基中进行3天。传导通常在1毫升/孔的12孔盘形式中在针对[VSV-g]pp的MOI 10下及
在针对[VSV-G+UCHT1]pp及[VSV-G+UCHT1+Vpu-CH]pp的MOI 1进行(两个重复)。在转导3天
之后,收集样本并通过FACS分析CD3+群体中的绝对细胞计数及GFP表达量。
[1441] 图34A及图34B分别显示在用所指示慢病毒颗粒转导新鲜经分离及未经刺激PBMC之后3天的总CD3+群体中的CD3+GFP+细胞的百分比(%)的直方图(图34A)及或CD3+群体的
每孔绝对细胞数量的直方图(图34B)。各棒表示重复的平均值+/-SD。图34A显示,将抗CD3-scFvFc-GPI部分(UCHT1)添加至VSV-G假型化慢病毒颗粒中与单独的[VSV-G]pp相比产生对
新鲜经分离及未经刺激PBMC的更高转导效率。图34A还示出,Vpu-CH的添加可进一步提高双假型化载体[VSV-G+UCHT1]pp的转导效率。图34B显示,UCHT1与仅VSV-G相比以每微升绝对
细胞计数增强细胞刺激。Vpu及UCHT1的添加与仅VSV-G相比以绝对细胞计数类似地增强细
胞刺激。
[1442] 实施例21.个别淋巴增生性组件的特征化
[1443] 在此实施例中,在实施例17及实施例18中描述的库筛选中识别的选择嵌合淋巴增生性组件(CLE)经单独地评估。为进一步分析在库2B筛选中识别的CLE,活化的PBMC用编码
单独的CLE的慢病毒颗粒隔夜转导并且在不存在外源性细胞因子下培养。为进一步分析在
库3A筛选中识别的CLE,活化的PBMC用编码在5’末端侧接有抗CD19 CAR的CLE的慢病毒颗粒隔夜转导,并且在存在每7天将供体匹配的CD19+B细胞添加至培养物中,但不存在外源性细胞因子的情况下培养。将细胞培养至多35天以评估CLE促进PBMC增生的能力。此实施例进一步提供表征任何个别推定的淋巴增生性组件的方法并且进一步证实若干高度活跃CLE的身
份。
[1444] 重组反转录病毒颗粒是在293T细胞(Lenti-XTM 293T,Clontech)中产生,该293T细胞适应在FreestyleTM 293 Expression Medium(ThermoFisher Scientific公司)无血清化学成分界定的培养基中悬浮培养。如实施例20中所解释,使用具有基因组质粒及3种编码
gag/pol、rev的慢病毒包装质粒及编码的假型化质粒的PEI转染这些细胞。在实施例17及实施例18中描述的库筛选中识别的所选择CLE是自其部分(P1-2、P3及P4或P1、P2、P3及P4)各别再生的并且经插入至与其首先经识别的库相同的转基因表达盒中。所选择CLE中的每一
者的模块部分显示于图35及36中并且基因名称及氨基酸序列显示于表6中。图31及32分别
显示库2及库3的卡匣。用含有经由库筛选识别的构建体的慢病毒颗粒转导的细胞被称为
“DL”紧接着库编号。举例而言,用含有来自库2的构建体的慢病毒颗粒转导的细胞称为DL2。
因此,具有前缀“DL2”及“DL3”的CLE分别在图31及图32中所示的卡匣中构建的。类似地,“DC1-5”及“DC1-6”包含插入至如图30中所示的库1所使用的转基因表达盒中的CLE。DC1-5的嵌合淋巴增生性组件自胺基端至羧基端编码:人类IL-7(SEQ ID NO:511)、柔性接头(SEQ ID NO:53)及为不具有其信号肽的全长IL-7Rα的人类IL-7Rα(SEQ ID NO:229)的残基21-
458。DC1-6的CLE自胺基端至羧基端编码:IL-7(SEQ ID NO:511)、柔性接头(SEQ ID NO:
53)、IL-7Rα(CD127)(SEQ ID NO:513)的胞外及跨膜部分,及IL-2Rβ(CD122)(SEQ ID NO:
514)的胞内域。先前已描述嵌合蛋白IL-7–IL-7Rα及IL-7–IL-7Rα–IL-2Rβ(Hunter等人.Molecular Immunology 56(2013):1-11)。IL-7“DC2-5”及“DC2-6”包含插入至如图31中所示的库2所使用的转基因表达盒中的CLE。DC2-5及DC2-6中的CLE分别为与DC1-5及DC1-6相
同的CLE。包括未经转导的PBMC(NT)、用编码eTag而非CLE(F1-0-01)的载体转导的PBMC及用编码抗CD19 CAR及eTag而非CLE(F1-3-23)的载体转导的PBMC作为阴性对照。
[1445] 此实施例中使用的来自库2B的构建体为DL2-1(M024-S190-S047)、DL2-2(M025-S050-S197)、DL2-3(M036-S170-S047)、DL2-4(M012-S045-S048)、DL2-5(M049-S194-S064)、DL2-6(M025-S190-S050)及DL2-7(M025-S190-S051)。
[1446] 此实施例中使用的来自库3A的构建体为DL3A-1(E013-T047-S158-S080)、DL3A-2(E011-T024-S194-S039)、DL3A-3(E014-T040-S135-S076)、DL3A-4(E013-T041-S186-
S051)、DL3A-5(E013-T064-S058-S212)、DL3A-6(E013-T028-S186-S051)、DL3A-7(E014-
T015-S186-S051)、DL3A-8(E011-T016-S186-S050)、DL3A-9(E011-T073-S186-S050)及
DL3A-10(E013-T011-S186-S211)。
[1447] 在第0天,根据制造商的说明书,通过用Ficoll-Paque  (GE Healthcare Life Sciences)密度梯度离心接着裂解红细胞来自血块黄层(加州圣地亚哥血库)富集
PBMC。将1.5×106个PBMC在补充有100IU/ml(IL-2)及50ng/ml抗CD3抗体(317326,
Biolegend)的3ml完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM中接种在G-Rex 6孔盘(Wilson 
Wolf,80240M)的各孔中以活化PBMC用于病毒转导。在37℃及5%CO2下转导隔夜之后,在MOI为5下将上文所描述的编码构建体的慢病毒颗粒直接添加至经活化PBMC中并且在37℃及
5%CO2下培育隔夜。第二天,用完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM使各孔中的培养基体积达到30ml并且将盘放回培养箱中。在此或以下细胞培养步骤中不添加IL-2、IL-7或其他外
源性细胞因子。在第7天收集各孔的细胞以测定细胞数目、存活百分比及经转导细胞百分
比,其通过FACS分析定义为FLAG-Tag+或E-Tag+细胞的百分比。随后将这些细胞离心,再悬浮于新鲜的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM中,并且将各样本的0.5×106个细胞在
30ml完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM中再接种至G-Rex 6孔盘的孔中。先前将含有0.5×106个CD19+B细胞的冷藏第0天供体匹配的PBMC(如在第0天由FACS测定)添加至“DL3A-”
培养物中以提供对CD19 ASTR的CD19+B细胞活化。在第35天采集细胞之前,在第14天、第20天及第28天重复此过程。
[1448] 结果
[1449] 将用编码CLE的慢病毒颗粒转导的PBMC在不存在外源性细胞因子下培养35天。增生表示为倍数扩增,其通过细胞总数除以该时间点接种的细胞数来计算。用图35中所示的
各单独选择的CLE转导的PBMC比阴性对照增生更多,该阴性对照包括未经转导PBMC及用编
码eTag而非CLE的载体转导的PBMC(图35)。此外,以下CLE在第14天、第21天、第28天及第35天呈现大于23的倍数扩增,而对于这些时间点,阴性对照的倍数扩增几乎为0:DL2-7、DC2-
6、DL2-6、DL2-2、DL2-1及DC2-5。用编码抗CD19 CAR及不同CLE(图36中所示)的构建体转导并且在存在每7天添加新鲜的供体匹配的PBMC,但不存在外源性细胞因子的情况下培养的
PBMC比阴性对照增生更多,该阴性对照包括未经转导PBMC及用编码抗CD19 CAR及eTag而非
CLE的载体转导的PBMC。图36中所示的所有CLE在第35天呈现大于23的倍数扩增,而阴性对
照的倍数扩增在第35天几乎为0。用含有编码DL3A-1(E013-T047-S158-S080)、DL3A-2
(E011-T024-S194-S039)、DL3A-3(E014-T040-S135-S076)及DL3A-5(E013-T064-S058-
S212)的多核苷酸的慢病毒颗粒转导的PBMC的增生与阴性对照相当并且未显示于图36中。
[1450] 实施例22.对本文提供的各种说明性方法(包括经基因方式修饰的淋巴细胞的体内扩增)的概念性证明
[1451] 此实施例提供用于离体转导PBMC(包括T细胞)并且活体内扩增这些经转导PBMC(包括T细胞)的例示性方法。此类方法包括用表达某些说明性嵌合淋巴增生性组件的说明
性重组慢病毒颗粒进行的说明性4小时转导方法。此外,此类方法提供用于用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导PBMC(其在说明性实施例中通常为T细胞)4小时的额外例示性方法,
其中该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒通过在无血清化学成分界定的培养基中的悬浮液
中用编码复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的各种组分的载体转染包装细胞来产生。
[1452] 材料及方法
[1453] 重组反转录病毒颗粒在293T细胞(Lenti-XTM 293T,Clontech)中产生,293T细胞适应在FreestyleTM 293 Expression Medium(ThermoFisher Scientific公司)无血清化学成分界定的培养基中悬浮培养。如实施例20中所解释使用具有3种基因组质粒(详述于下文)
及3种编码gag/pol、rev的单独的包装质粒及编码VSV-G的假型化质粒中的1种的PEI瞬时转
染细胞。为产生也显示膜结合活化组件的慢病毒颗粒,如实施例20中所描述共转染编码能
够与CD3(UCHT1scFvFc-GPI)结合的膜结合多肽的第四包装质粒。基因组质粒为在3’LTR中
含有导致自身失活的缺失的第三代慢病毒表达载体,其中该质粒编码以下:
[1454] (1)抗ROR2 MRB-CAR:T2A:eTag(F1-1-27):该基因组质粒与图20中所示的彼基因组质粒一致,不同的处在于编码抗CD19 CAR的序列经具有识别人类ROR2、CD8茎及跨膜序列(SEQ ID NO:75)、CD137(SEQ ID NO:1)及CD3z(SEQ ID NO:13)的scFv的MRB-ASTR替代。编
码此构建体的重组慢病毒颗粒称为F1-1-27
[1455] (2)Flag-抗ROR2 MRB-CAR:T2A:CLE(F1-1-228及F1-1-228U):该基因组质粒与图20中所示的彼基因组质粒一致,不同的处在于编码抗CD19的序列经与上述(1)中所描述的
抗ROR2 MRB-CAR共价连接的Flag标签替代,并且GMCSFR ss:eTag经CLE替代。该CLE为包含
胞外二聚模块(P1)、跨膜模块(P2)及2个胞内模块(P3及P4)的I型跨膜蛋白质。在位置P1-
P2-P3-P4中的基因为MycTag 2A Jun–IL13RA–MPL–CD40。这些模块的密码为E013-T041-
S186-S051(参见表6)。该CLE首先在库3A、3B及4B中识别并且在库3A中的第7天与第35天之
间为第6个最富集的CLE。编码此构建体的重组反转录病毒颗粒称为F1-1-228并且编码此构
建体并且显示UCHT1scFvFc-GPI的重组反转录病毒颗粒称为F1-1-228U;或
[1456] (3)Flag-抗CD19 CAR:T2A:CLE(F1-3-219及F1-3-219U):该基因组质粒与图20中所示的抗人类CD19 CAR一致,不同的处在于Flag标签插入在CD8ss与CAR之间,并且编码
GMCSFRss:eTag的序列经CLE替代。该CLE为I型跨膜蛋白质,其包含经由柔性接头共价连接
至其同源白细胞介素受体的胞外及跨膜模块域并且共价连接至不同细胞因子受体的胞内
域的白细胞介素多肽。特定言的,自胺基端至羧基端,该质粒编码:IL-7(SEQ ID NO:511)、柔性接头(SEQ ID NO:53)、IL-7Rα(CD127)(SEQ ID NO:513)的胞外及跨膜部分,及IL-2Rβ(CD122)(SEQ ID NO:514)的胞内域。编码此构建体的重组反转录病毒颗粒称为F1-3-219并
且编码此构建体并且显示UCHT1scFvFc-GPI的重组反转录病毒颗粒称为F1-3-219U。
[1457] PBMC分离,在离体刺激之后对PBMC的隔夜转导,接着对经工程化淋巴细胞的15天离体扩增
[1458] 在第0天,根据制造商的说明使用CS-900.2试剂盒(BioSafe;1008)在Sepax 2 S-100器件(Biosafe;14000)上通过密度梯度离心使用Ficoll-PacqueTM(General Electric)
自知情同意的健康志愿者的ACD周边血中分离PBMC。将3.0×107个活PBMC接种在1L G-Rex
(Wilson-Wolf)上并且使用补充有100IU/ml IL-2(Novoprotein,GMP-CD66)、10ng/ml IL-7(Novoprotein,GMP-CD47)及50ng/ml抗CD3抗体(OKT3,Novoprotein)的完全OpTmizerTM 
TM
CTS  T细胞扩增SFM使体积达到60ml以活化这些PBMC(其包括T细胞及NK细胞)用于病毒转
导。在37℃及5%CO2下培育隔夜之后,在MOI为5(440ul)下将编码抗ROR2 MRB-CAR、F1-1-27的慢病毒颗粒直接添加至经活化PBMC中并且在37℃及5%CO2下培育隔夜。在隔夜培育之
后,通过使用补充有NAC(Sigma)的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM使G-Rex中的培养
基总体积达到100ml来供养细胞以使最终浓度增加10mM以及100IU/ml重组人类IL-2及
10ng/ml重组人类IL-7。在每48小时添加100IU/ml重组人类IL-2及10ng/ml重组人类IL-7溶
液下在37℃及5%CO2下将G-Rex器件在标准湿润组织培养箱中培育。在采集之前,细胞在第
15天时扩增。将这些经转导细胞在冷冻培养基(70%RPMI 1640、20%热失活FBS、10%DMSO)
7
中洗涤并且以5.0×10个细胞/毫升的1ml等分试样冷藏保存以稍后使用。在用于下文实施
例中的实验A组之前两天,将8小瓶(4.0×108)这些冷藏保存的经F1-1-27转导的PBMC解冻
并且在含有377ml补充有100IU/ml的IL-2(Novoprotein)、10ng/ml IL-7(Novoprotein)及
充足的NAC的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM(根据制造商的说明书补充有26ml 
OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增补充液(Thermo Fisher,A10484-02)、25ml CTSTM免疫细胞SR(Thermo Fisher,A2596101)及10ml CTSTMGlutaMAXTM-I补充液(Thermo Fisher,A1286001)的OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增基础培养基1L(Thermo Fisher,A10221))的G-Rex100M中静置2天以使最终浓度增加10mM。
[1459] 在无需事先离体刺激并且无需离体细胞扩增下的PBMC分离及静息淋巴细胞的有利快速转导
[1460] 将知情同意的2个健康志愿者的全部人类血液收集至含有1.5ml柠檬酸葡萄糖溶液A抗凝剂的多个100mm Vacutainer管(Becton Dickenson;364606)中(ACD周边血)。对于
各志愿者,将来自Vacutainer管的血液汇集(185.2ml用于B组,182.5ml用于C组)并且分配
至2个标准500ml血液收集袋中经由转导进行PBMC富集的以下步骤在封闭系统中进行。
[1461] 在Sepax 2S-100器件(Biosafe;14000)上使用CS-900.2试剂盒(BioSafe;1008)使用用Ficoll-PaqueTM(General Electric)的密度梯度离心对来自各志愿者的2个血袋中的
血液依次处理,根据制造商的说明书使用2次洗涤循环,以每次运行获得45ml经分离PBMC。
用于Sepax 2处理中的洗涤溶液为标准生理盐水(Chenixin Pharm)+2%人类血清白蛋白
(HSA)(Sichuan Yuanda Shuyang Pharmaceutical)。最终的细胞再悬浮溶液为45ml完全
OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM(补充有26ml OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增补充液(Thermo Fisher,A10484-02)、25ml CTSTM免疫细胞SR(Thermo Fisher,A2596101)及10ml CTSTM 
TM TM TM
GlutaMAX -I补充液(Thermo Fisher,A1286001)的OpTmizer  CTS  T细胞扩增基础培养
基1L(Thermo Fisher,A10221-03))。Sepax 2机器上的每一处理步骤大约为1小时及12分
钟。自2个处理轮次获得的经富集PBMC分别汇集用于B组及C组,并且对这些细胞计数。
[1462] 将5.5×107个新鲜富集的活PBMC接种至用于B组的4个标准血液收集袋中的每一个中,并且使用完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM使体积达到55ml以使得细胞密度为
1.0×106/ml。将1.12×108个新鲜富集的活PBMC接种至用于C组的2个标准血液收集袋中的
每一个中,并且使用完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM使体积达到110ml以使得细胞密
度为1.0×106/ml。不添加抗CD3、抗CD28、IL-2、IL-7或其他外源性细胞因子以在转导之前离体活化或以其他方式刺激淋巴细胞。如下在MOI为1下将慢病毒颗粒直接添加至血液收集
袋中的未刺激PBMC中:将0.779ml的F1-1-228添加至一袋B组PBMC中并且将3.11ml的F1-1-
228U添加至另一袋B组PBMC中;将0.362ml的F1-3-219添加至一袋C组PBMC中并且将3.52ml
的F1-3-219U添加至另一袋C组PBMC中。温和地按摩转导反应混合物以混合内容物,随后在
37℃及5%CO2下在标准湿润组织培养箱中在血液收集袋中培育四(4)小时。随后将来自各
袋的PBMC翻译至50ml Conical管中(从而在此概念验证试验中自封闭系统移除细胞)并在
再悬浮于5ml DPBS+2%HAS中之前在DPBS+2%HAS中洗涤3次并计数。下表显示该过程中的
每一步骤的持续时间及经历的总时间。在这些PBMC用于此实施例中的试验中之前不对其进
行其他处理。
[1463]
[1464] 表24.在血液解冻及汇集之后各步骤的经历时间。
[1465] 通过上述方法转导PBMC的体外转导效率及细胞因子非依赖性存活/增生[1086]将诱导T细胞及NK细胞的2.0x 106个PBMC一式两份或一式三份接种至各样本的6孔组织培养
盘的各孔中。将这些盘离心并且将各样本再悬浮于2ml完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增
SFM中。不添加细胞因子。在37℃及5%CO2下在标准湿润组织培养箱中培养这些盘6天。在第
3天将各孔的细胞悬浮液的一半(1ml)移除并且在第6天移除剩余细胞以测定细胞数目、存
活百分比及转导细胞百分比,其通过FACS分析定义为FLAG-Tag+细胞的百分比。将第6天的
总细胞计数加倍以解释在第3天移除细胞的一半。
[1466] 通过上述方法转导致效应PBMC的体内增生/存活及靶向杀死肿瘤
[1467] 选择使用NSG或NOD Scid Gamma小鼠的异种移植模型来探测用F1-1-27、F1-1-228、F1-1-228U、F1-3-219及F1-3-219U转导的人类PBMC在体内存活、增生及杀死同源抗原表达肿瘤的能力。NSG为缺乏成熟T细胞、NK细胞及B细胞的小鼠品种且为迄今为止描述的最免疫缺乏的小鼠品系之一。通常对免疫系统的这些细胞组分进行移除以致使人类PBMC能够
在宿主物先天性、体液性或适应性免疫反应的情况下移植。由于不存在小鼠细胞外共同γ
链,所以通常仅在人类中进行辐射或淋巴耗尽化学疗法之后才能实现稳定细胞因子的浓
度,此使得经接受性转移的人类细胞能够接受此类细胞因子。同时,这些动物还可用于移植肿瘤异种移植靶标以检测CAR杀死靶向表达肿瘤的功效。尽管异种反应性T细胞受体抗原在
效应细胞产物中的存在最终会引起移植物抗宿主病,但这些模型能够对动物药理学及急性
耐受性进行短期评估。
[1468] 表达内源性人类CD19的Raji细胞(ATCC,弗吉尼亚州马纳萨斯)及经转染以稳定表达人类ROR2(CHO-ROR2)的CHO细胞(ATCC,弗吉尼亚州马纳萨斯)用于提供抗原来刺激CAR效
应细胞并且产生一致的目标肿瘤以测定CAR效应细胞杀死同源抗原表达肿瘤的功效。Raji
细胞及转基因CHO变体在与Matrigel人造基底组合皮下施用至NSG小鼠中之后快速生长并
伴有散播性恶性肿瘤
[1469] 根据中国科学院生化与细胞所实验动物管理委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准的方案处理小鼠。皮下(sc)肿瘤异种移植物在雌性NOD-
PrkdcscidIl2rgtm1/Begen(B-NSG)小鼠(北京百奥赛图基因生物技术有限公司)之后腹侧建
立。简言之,培养的Raji细胞及培养的CHO-ROR2细胞单独地在DPBS(Thermo Fisher)中洗
涤,计数,再悬浮于冷DPBS中并且与浓度为0.5×106个细胞/200微升的适当体积的
Matrigel ECM(Corning;最终浓度5mg/mL)在冰上混合。在注射之前使用标准批准的麻醉及脱毛(Nair)来制备动物以供注射。分别将Raji及CHO-ROR2细胞的200μl的含细胞悬浮液的
ECM皮下注射至9周龄或10周龄小鼠的后侧面。
[1470] 在肿瘤接种后5天,如下通过尾部静脉注射来静脉内(IV)给药携带有平均77mm3体积的CHO-ROR2肿瘤的小鼠:A组中的NSG小鼠接受含用F1-1-27慢病毒颗粒转导的1×107个
PBMC的200μl DPBS(n=4),或仅200μl DPBS(n=2);B组中的NSG小鼠接受含用F1-1-228慢病毒颗粒转导的0.85×107个PBMC的200μl DPBS(n=2)、含用F1-1-228U慢病毒颗粒转导的
0.85×107个PBMC的200μl DPBS(n=2)或仅200μl DPBS(n=2)。类似地,在肿瘤接种后5天,通过尾部静脉注射仅200μl DPBS(n=4)或用含F1-3-219慢病毒颗粒的200μl DPBS(n=3)
或含F1-3-219U慢病毒颗粒的200μl DPBS(n=3)转导的1×107个PBMC来静脉内(IV)给药携
带有Raji肿瘤的C组中的小鼠(平均76mm3体积)。应注意,使用在离体活化之前且不进行离
体细胞扩增的情况下对静息淋巴细胞的有利快速转导的方案来转导具有F1-1-228、F1-1-
228U、F1-3-219及F1-3-219U的PBMC用于给药这些小鼠。自全部人类血液收集至用经转导的PBMC IV给药小鼠所经历的总时间对于F1-1-228及F1-1-228U为14.5小时,且对于F1-3-219
及F1-3-219U为11.5小时。
[1471] 使用测径规一周2次量测肿瘤并且使用以下等式计算肿瘤体积:(最长直径×最短2
直径)/2。在第7天、第14天及第21天自各小鼠收集大约100μl血液以供FACS及qPCR分析。当小鼠被安乐死时,还收集血液、脾脏及肿瘤,其与来自肿瘤负荷的尸检指针一致。
[1472] 流式细胞术
[1473] 对于自体外培养物收获的细胞-将细胞离心并再悬浮于0.5ml FACS染色缓冲液(554656,BD)中。将2.5μl人类Fc嵌段(BD,564220)添加至各样本中并且在室温下培育10分钟。在冰上用0.5μl抗FLAG Tag PE((抗DYKDDDDK)637310,Biolegend))及0.5μl Live/Dead Fixable Green Dead细胞染色剂(L34970,Thermo Fisher)对细胞染色30min。将细胞用
FACS缓冲液洗涤两次,固定在FACS缓冲液及BD Cytofix(554655,BD)的1:1混合物中,用
Novocyte(ACEA)处理,并且使用基于正向及侧向散射以及活死染色的活门用
NovoExpress软件(ACEA)分析所得数据。量测经转导的淋巴细胞作为FLAG Tag+细胞。
[1474] 对于自血液获得的细胞—新鲜收集的血液中的红血球使用裂解缓冲液(555899,BD)来裂解并且将剩余细胞再悬浮于100μl的FACS染色缓冲液中。将2.5μl人类Fc嵌段(BD,
564220)添加至各样本中并且在室温下培育10分钟。在冰上用生物素化的西妥昔单抗对细
胞染色30min经染色的细胞用FACS缓冲液洗涤并且用5μl抗人类CD45-PE-Cy7及0.5μl抗小
鼠CD45-FITC进一步染色。将0.4μl SA-PE添加至来自这些组的经用F1-1-27、F1-1-228、F1-
1-228U及PBS对照转导的细胞给药的小鼠的样本中。将1μl抗FLAG Tag PE((抗DYKDDDDK)
637310,Biolegend)添加至来自此组的经用F1-3-219及F1-3-219U以及PBS对照转导的细胞
给药的小鼠的样本中。在冰上培育细胞30min,在FACS缓冲液中洗涤两次,并且再悬浮于具有1μl 7-AAD(420404,Biolegend)的100μl FACS染色缓冲液中。新鲜染色的样本用
Novocyte(ACEA)处理,并且使用基于正向及侧向散射的活阀门、基于7-AAD、人类CD45+的活阀门用NovoExpress软件(ACEA)分析所得数据并且检测FLAG或eTag的表达。
[1475] qPCR
[1476] 通过生物分析qPCR来评估自血液样本分离的基因组DNA(gDNA)的经转导淋巴细胞的存在。使用QIAamp DNA Blood Mini试剂盒(Qiagen 51106)自50μl血液样本分离基因组
DNA并且使用QIAamp DNA Micro试剂盒(56304)进一步清洗该DNA。使用对于慢病毒的5’LTR具有特异性的引物及探针组对分离的基因组DNA进行TaqMan测定(Thermo Fisher)以检测
经转导的细胞。
[1477] 结果
[1478] 在此实验中使用经VSV-G假型化并且编码CAR及淋巴增生性组件的慢病毒颗粒。慢病毒颗粒F1-1-228及F1-1-228U编码MRB-CAR至ROR2并且慢病毒颗粒F1-2-219及F1-3-219U
编码CAR至CD19。慢病毒颗粒F1-1-228U及F1-3-219U还在其表面上呈现UCHT1scFvFc-GPI。
通过用Ficoll-PaqueTM密度梯度离心自人类血液分离PBMC。在细胞离体活化之前,将新鲜
PBMC在标准血袋中用慢病毒颗粒转导。在4小时转导之后,将细胞洗涤并且用于以下实验
中。熟练的技术人员将理解,自血液收集至洗涤细胞的整个过程可在封闭系统中进行。作为对照,将PBMC活化隔夜,用编码CAR而不编码淋巴增生性组件或UCHT1scFvFc-GPI的慢病毒
颗粒转导,并且离体扩增15天(F1-1-27)。
[1479] 将经转导的PBMC在不存在细胞因子下体外培养。图37显示在第6天的转导效率。UCHT1scFvFc-GPI增加F1-1-228及F1-3-219的转导效率。静息PBMC在暴露于F1-1-228U或
F1-3-219U 4小时时的转导效率分别为34%及73%。图38显示在第3天与第6天之间的这些
培养物中的活细胞总数。用F1-1-228U或F1-3-219U转导的静息PBMC在不存在外源性细胞因
子下在第3天与第6天之间存活且甚至增生,而用F1-1-228或F1-3-219转导的PBMC却未存活
且甚至增生。这些结果证实,呈现活化组件并且编码淋巴增生性组件的慢病毒颗粒可在4小时内转导静息PBMC,并且这些经转导的PBMC在不存在外源性细胞因子下培养6天时可体外
增生且存活。
[1480] 携带ROR2或CD19肿瘤的免疫缺乏小鼠经静脉内给予分别表达CAR至ROR2或CD19的1×107个PBMC。随着时间检测经转导PBMC在体内存活且增生的能力。图39A-C显示作为经转
导细胞的读数的通过qPCR的每微克基因组DNA的慢病毒拷贝。图39A显示对于F1-1-27的每
微克基因组DNA的慢病毒拷贝,其不编码淋巴增生性组件,自第7天的平均数884降低至低于第21天的定量下限(LLOQ)。图39B显示对于F1-1-228U的慢病毒拷贝低于第7天及第14天的
LLOQ,但第21天增加大于LLOQ并且在第25天增加至平均数1,939。图39C显示当小鼠被安乐
死时,对于F1-3-219U的慢病毒拷贝自低于第7天的LLOQ增加至第14天的20,430。在对照样
本F1-1-228及F1-3-219中的慢病毒拷贝仍低于LLOQ。图40显示在小鼠被安乐死时(最后时
间点显示于图39中)如通过对CAR构建体的eTag或FLAG-Tag的FACS分析所测定的每200ul血
液的经转导细胞数目。每200ul来自用F1-1-228U(5,857)及F1-3-219U(121,324)转导的细
胞给药的小鼠的血液中检测到显著数目的CAR+细胞。用F1-1-228或F1-3-219U转导的淋巴
细胞杀死在体内表达其目标抗原的肿瘤(图41A及B)。在两种情况下,淋巴细胞以延迟方式
减小肿瘤体积。不受理论限制,但此延迟与注射细胞扩增的需求一致,其花费如qPCR所观测的时间。后来的时间点不能在此实验中研究,这是由于携带ROR2肿瘤的小鼠达到了对于肿
瘤负荷的安乐死指针,并且携带Raji肿瘤的小鼠产生了由小鼠中大量经转导及扩增的淋巴
细胞引起的移植物抗宿主病。这些数据一起显示,呈现活化组件并且编码淋巴增生性组件
的反转录病毒颗粒可在4小时内转导静息PBMC,并且这些转导的PMBC可体内增生并存活。在此实验中测试的两种淋巴增生性组件MycTag 2A Jun-IL13Ra-MPL-CD40及IL-7-IL-7Rα-
IL-2Rβ呈现促进体内存活且增生的能力。此外,以此方式转导的表达MRB-CAR(F1-1-228U)或传统CAR(F1-3-219U)的这些淋巴细胞能够体内识别并且杀死肿瘤细胞。
[1481] 所公开的实施例、实例及实验不意欲限制本发明的范畴或表示以下实验为进行的全部或唯一的实验。已努力确保关于所使用的数字(例如,量、温度等)的准确度,但应计入一些实验性误差及偏差。应理解,可在不改变实验意欲说明的基本方面的情况下对如所描
述的方法进行变化。
[1482] 熟习此项技术人员可在本发明的范畴及精神下设计许多修改及其他实施例。实际上,可在不改变本发明的基本方面的情况下由熟练的技术人员对所描述的材料、方法、图
式、实验、实例及实施例进行变化。所公开实施例中的任一者可结合其他所公开的实施例来使用。
[1483] 在一些情况下,参考特定实施例描述一些概念。然而,一般熟练此项技术人员理解,可在不背离如以下申请专利范围所阐述的发明内容的范畴的情况下进行各种修改及改
变。因此,说明书及图式应视为呈说明性意义而非限制性意义,且所有这些修改意欲包括在本发明的范畴内。
[1484] 表6.部分P1-P2、P1、P2、P3及P4的密码、名称、细胞因子受体、ITAM基元及氨基酸序列
[1485]
[1486]
[1487]
[1488]
[1489]
[1490]
[1491]
[1492]
[1493]
[1494]
[1495]
[1496]
[1497]
[1498]
[1499]
[1500]
[1501] 表7.文库1A最优构建体。
[1502]
[1503]
[1504]
[1505] 表8.文库2B最优构建体。
[1506]
[1507]
[1508] 表9.文库1.1A最优构建体。
[1509] 嵌段序列 Norm_D7 富集_D42 嵌段序列 Norm_D7 富集_D42M007-S120-S214 0.00 16.52 M030-S054-S169 0.97 10.42
M001-S117-S105 2.25 15.48 M012-S117-S142 4.31 10.40
M024-S062-S137 0.77 14.07 M042-S038-S053 1.54 10.24
M012-S117-S194 4.25 14.05 M001-S186-S084 3.02 10.17
M012-S117-S126 0.00 13.58 M024-S130-S171 0.00 10.05
M001-S117-S169 0.84 13.18 M042-S190-S042 3.41 9.93
M012-S062-S046 2.45 12.77 M036-S143-S194 0.39 9.92
M012-S117-S058 2.96 12.75 M030-S168-S137 7.34 9.81
M048-S054-S076 5.15 12.73 M012-S062-S136 1.29 9.77
M036-S080-S195 3.09 12.44 M030-S084-S143 7.53 9.60
M042-S120-S199 3.09 12.29 M012-S054-S169 2.70 9.51
M030-S080-S197 0.00 12.21 M012-S062-S170 14.22 9.34
M001-S155-S048 1.29 11.96 M030-S062-S143 0.45 9.34
M012-S171-S074 1.09 11.86 M030-S154-S194 3.09 9.28
M030-S117-S049 5.21 11.74 M012-S064-S063 3.35 9.25
M030-S170-S080 6.18 11.63 M030-S170-S194 7.27 9.19
M030-S136-S101 4.38 11.59 M030-S170-S168 3.67 9.14
M024-S130-S063 8.30 11.51 M012-S106-S169 1.35 9.10
M024-S211-S154 4.83 11.45 M001-S117-S052 2.64 9.10
M012-S062-S138 0.90 11.06 M030-S198-S169 1.03 9.04
M030-S102-S191 1.42 10.86 M030-S214-S050 2.32 9.02
M036-S197-S076 0.00 10.82 M036-S199-S038 1.61 9.01
M030-S190-S047 0.00 10.75 M018-S044-S177 4.38 8.85
M012-S062-S169 11.00 10.59 M001-S190-S042 0.00 8.79
M012-S037-S157 0.90 10.52 M036-S175-S059 10.04 8.78
[1510] 表10.文库1.1B最优构建体。
[1511] 嵌段序列 Norm_D7 富集_D28 嵌段序列 Norm_D7 富集_D28M001-S126-S170 2.57 7.68 M042-S141-S120 0.84 6.17
M012-S106-S169 1.35 7.65 M042-S130-S177 0.84 6.17
M007-S194-S100 0.00 7.19 M036-S176-S116 0.58 6.16
M036-S101-S183 0.00 7.11 M007-S109-S212 0.64 6.14
M024-S135-S098 0.00 7.08 M010-S195-S100 0.84 6.10
M024-S038-S098 0.00 7.04 M012-S168-S175 0.00 6.07
M007-S109-S135 0.00 7.02 M018-S102-S117 0.00 6.01
M024-S191-S038 0.00 6.94 M018-S211-S083 0.00 6.00
M012-S064-S116 0.00 6.93 M018-S192-S058 0.00 6.00
M009-S100-S074 0.00 6.84 M042-S143-S168 0.00 5.95
M001-S120-S039 0.00 6.84 M012-S186-S120 0.00 5.95
M018-S154-S085 0.00 6.83 M030-S087-S052 0.00 5.95
M030-S104-S048 0.00 6.79 M008-S186-S085 0.00 5.94
M030-S168-S121 0.00 6.78 M042-S202-S050 0.00 5.93
M042-S120-S171 1.16 6.75 M001-S171-S214 0.00 5.91
M036-S176-S195 0.90 6.62 M001-S138-S037 0.00 5.91
M010-S171-S169 0.00 6.53 M012-S143-S176 0.00 5.91
M030-S175-S120 1.48 6.52 M042-S186-S050 0.00 5.91
M048-S051-S115 0.84 6.52 M012-S192-S076 3.09 5.91
M024-S047-S080 0.00 6.50 M048-S098-S074 0.00 5.90
M009-S199-S141 0.77 6.39 M042-S186-S215 0.00 5.90
M018-S136-S183 0.39 6.34 M048-S050-S211 0.00 5.90
M036-S062-S212 1.03 6.30 M010-S074-S169 1.35 5.88
M012-S211-S137 0.71 6.21 M008-S212-S099 3.22 5.88
M010-S064-S171 0.71 6.19 M001-S074-S197 0.00 5.88
[1512] 表11.文库2.1B最优构建体。
[1513] 嵌段序列 Norm_D7 富集_D28 嵌段序列 Norm_D7 富集_D28M042-S186-S044 0.78 8.65 M010-S177-S215 1.63 5.85
M048-S100-S045 0.98 8.51 M024-S193-S193 0.33 5.83
M001-S186-S170 2.21 8.24 M012-S049-S192 0.20 5.80
M024-S039-S052 6.24 7.53 M048-S130-S170 0.39 5.80
M001-S214-S058 0.26 7.27 M018-S175-S171 1.56 5.80
M042-S080-S074 2.02 7.04 M030-S051-S080 2.28 5.79
M030-S170-S115 2.60 6.96 M012-S121-S072 0.13 5.76
M009-S083-S138 1.04 6.44 M009-S183-S161 1.50 5.75
M042-S154-S075 2.73 6.44 M007-S077-S059 0.33 5.75
M030-S214-S143 4.49 6.33 M018-S058-S062 1.76 5.73
M012-S213-S211 1.63 6.23 M008-S170-S168 0.33 5.73
M036-S212-S214 0.78 6.17 M018-S050-S043 0.33 5.73
M030-S036-S106 2.86 6.05 M012-S215-S126 1.17 5.69
M001-S169-S083 1.30 6.04 M024-S083-S047 3.58 5.68
M007-S105-S064 0.13 5.95 M048-S052-S084 0.52 5.68
M009-S039-S183 1.56 5.95 M042-S052-S130 1.56 5.67
M009-S074-S050 1.63 5.94 M036-S064-S047 1.95 5.65
M012-S076-S051 1.43 5.94 M008-S148-S137 0.52 5.65
M010-S072-S186 1.30 5.92 M036-S198-S135 0.52 5.64
M008-S142-S075 0.13 5.91 M018-S043-S051 1.11 5.64
M001-S175-S168 0.33 5.87 M042-S105-S104 0.46 5.62
M036-S170-S175 0.13 5.87 M030-S074-S082 0.39 5.61
M018-S194-S116 1.43 5.87 M036-S083-S130 0.52 5.59
M042-S115-S121 0.33 5.85 M001-S137-S157 0.46 5.58
M018-S043-S086 0.00 5.85 M008-S083-S104 0.72 5.57
[1514] 表12.文库3A最优构建体。
[1515]
[1516]
[1517]
[1518] 表13.文库3B最优构建体。
[1519]
[1520]
[1521] 表14.文库3.1A最优构建体。
[1522] 嵌段序列 Norm_D7 富集_D35 嵌段序列 Norm_D7 富集_D35E006-T074-S194-S211 0.00 15.37 E007-T065-S106-S053 1.23 11.32
E010-T073-S186-S211 3.27 14.82 E008-T001-S190-S053 0.00 11.30
E009-T049-S106-S037 0.00 13.34 E007-T032-S138-S052 0.00 11.24
E009-T073-S190-S215 2.10 13.00 E010-T044-S190-S080 2.28 11.20
E009-T009-S165-S052 0.80 12.98 E009-T044-S129-S053 1.23 11.18
E009-T066-S168-S053 2.10 12.85 E008-T073-S186-S080 0.00 11.17
E010-T024-S197-S214 0.00 12.59 E007-T020-S082-S211 0.00 11.16
E009-T072-S186-S039 0.00 12.42 E007-T006-S195-S052 0.00 11.11
E009-T038-S105-S050 0.00 12.38 E008-T027-S190-S050 1.61 11.08
E006-T057-S105-S039 0.00 12.38 E007-T056-S143-S050 0.68 10.99
E007-T017-S197-S047 1.79 12.25 E010-T042-S177-S049 1.85 10.96
E010-T045-S138-S074 0.00 12.20 E008-T034-S064-S039 0.00 10.95
E008-T024-S197-S039 0.00 12.16 E007-T040-S054-S052 1.85 10.83
E006-T077-S202-S053 0.00 12.09 E010-T019-S054-S051 1.48 10.80
E009-T032-S105-S048 1.85 12.05 E007-T058-S086-S052 1.48 10.78
E008-T056-S197-S050 0.00 12.02 E009-T019-S192-S214 0.86 10.69
E006-T008-S170-S075 1.36 12.01 E010-T066-S192-S037 1.91 10.67
E010-T017-S084-S052 0.00 11.96 E006-T048-S194-S074 0.00 10.57
E009-T032-S129-S047 0.00 11.69 E006-T078-S102-S075 1.05 10.55
E010-T053-S194-S211 1.30 11.69 E010-T017-S197-S053 1.17 10.55
E008-T010-S064-S037 0.00 11.68 E010-T041-S169-S074 0.00 10.50
E009-T060-S175-S053 0.00 11.50 E006-T038-S192-S053 1.79 10.47
E008-T073-S169-X002 0.00 11.39 E007-T032-S129-S212 0.49 10.46
E009-T071-S186-S211 4.08 11.38 E007-T035-S189-S051 4.08 10.45
E006-T077-S069-S050 4.94 11.35 E006-T006-S116-S214 0.00 10.44
[1523] 表15.文库3.1B最优构建体。
[1524]
[1525]
[1526] 表16.文库4B最优构建体。
[1527]
[1528]
[1529] 表17.文库4.1B最优构建体。
[1530]
[1531]
[1532] 表18.Lib3 P4终止。
[1533]
[1534]
[1535]
[1536]
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[1539]
[1540]
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[1564]
[1565]
[1566]
[1567]
[1568]
[1569]
[1570]
[1571] 表19.文库1A及1.1A中具有特别值得注意的富集度的构建体。
[1572]
[1573] 表20.文库2B及2.1B中具有特别值得注意的富集度的构建体。
[1574]
[1575] 表21.文库3A及3.1A中具有特别值得注意的富集度的构建体。
[1576]
[1577]
[1578] 表22.文库3B及3.1B中具有特别值得注意的富集度的构建体。
[1579]
[1580]
[1581]
[1582] 表23.文库4B及4.1B中具有特别值得注意的富集度的构建体。
[1583]
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