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一株副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38

阅读：384发布：2020-05-11

专利汇可以提供一株副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一株副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38，该菌种已于2019年5月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO:M2019322。副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38（Lactobacillus paracasei subsp. paracasei RP38）具有以下特性：①可在氮源缺失环境中依赖糖碳源代谢产生挥发性风味物质，适应葡萄、银耳龙眼复合汁等原料物性，代谢产生的发酵香浓郁且与原料香协调，是乳酸发酵果汁产品的理想发酵剂。②可应用于海带产品的生物脱腥处理，将1,3-辛二烯、E,Z-3-亚乙基环己烯、正壬醇、正庚醛、碘代辛烷等腥味物质生物转化而使其明显减少，产生β-苯乙醇、桃醛、十四酸乙酯、十二醛、E-2-壬烯-1-醇等具有果香等良好风味的次生代谢产物。③具有较强抗逆特性，诸如可耐受pH2.0高酸和30% 葡萄糖浓度高渗透压的环境胁迫。，下面是一株副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38专利的具体信息内容。

权利要求

1.一株副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38（Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei RP38），该菌为乳酸菌属，已于2019年5月5日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M 2019322。
2.如权利要求1所述的一株副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38在发酵果汁中的应用，其特征在于：所述副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38能在氮源缺失或氮源不足的发酵基质中利用碳源进行代谢。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述发酵基质的碳氮比低于30:1。
4.如权利要求1所述的一株副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38在生产葡萄果汁乳酸发酵饮料中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：将副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38的扩培菌液以1.0×107～5.0×108cfu/mL接种量，接入到无菌发酵罐内，该罐内装有经灭菌处理的葡萄果汁，人工调节发酵温度30℃±5℃、发酵48±10小时后得到果汁发酵液，过滤后进行饮料调配，再灌装即可。
6.如权利要求1所述的一株副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38在银耳龙眼复合果汁发酵中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：将银耳汁和龙眼汁按比例勾兑后，调整其可溶性固形物含量及酸度，然后杀菌、冷却得到银耳龙眼复合汁，然后将副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38活化后以1.0×107～5.0×108cfu/mL的生物量接入银耳龙眼复合汁中，在25±1℃下厌氧培养48±10小时。
8.如权利要求1所述的一株副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38在海带生物脱腥中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：将副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38和酿酒酵母J4活化，分别培养至菌量达109和107 cfu/mL以上，离心后，取菌坭加等体积无菌水振荡悬浮，待用；将海带经清洗脱盐、切条称重，将糖盐水与海带质量按比例加入经臭氧灭菌后的泡菜坛中，接入活化好的副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38菌株和酿酒酵母J4菌株，饱和食盐水封口后于32±1℃下发酵6-8天。

说明书全文

一株副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38及其应用，具有较强耐受高酸高糖渗透压能力，可应用于葡萄、银耳龙眼复合汁等果汁中发酵，以及海带等生物脱腥处理。

背景技术

[0002] 随着食品科学的发展，乳酸发酵也被用于果蔬汁饮料的加工中，乳酸菌发酵果蔬汁不仅可提供愉快的乳酸发酵风味物质，还能消除生青味、保护颜色、促进矿物质吸收、产生人体所必需的多种维生素、乳酸菌素、消化酶等物质，从而赋予果汁饮料整肠、健胃、助消化及提高机体免疫能力的功效。但是，将乳酸菌应用于果蔬汁的发酵加工，面临诸多挑战。由于果蔬汁缺乏乳酸菌增殖的重要促进因子乳糖，有机氮源含量低，碳氮源比例失调，用于果蔬汁乳酸发酵的乳酸菌就必须能克服氮源不足的劣境而优先利用果蔬汁所含的有机酸、葡萄糖等其他单糖及多糖类，获得能量以迅速增殖，并产生与果蔬汁风味协调的发酵香，提高产品的营养与功能。

[0003] 海带等水产品的浓烈腥味一直是困扰加工业的瓶颈，目前主要的脱腥方法有三种，即物理脱腥、化学脱腥、生物脱腥。物理脱腥效果较差；化学脱腥存在安全与污染问题；生物脱腥不仅可实现海带的脱腥、改善风味，且可提高营养，但需要筛选合适的菌种及工艺。

[0004] 为了解决上述问题，本申请人已于2012年5月23日已获授权的专利号为“ZL 2009 1 0304966.3”、名称为“一种枇杷果汁乳酸发酵液及其制备方法”的中国专利上已揭露了一种枇杷果汁乳酸发酵液及其制备方法，包括不加乳粉而利用乳酸菌直接发酵的枇杷果汁乳酸发酵液及其制备方法，解决现有技术中枇杷产品的果汁果香不足，风味单调缺陷，保健作用和营养成分不能为人体所充分吸收等等缺点。本申请人还在《热带作物学报》2011年第32卷第3期550-553页的文献上揭示了枇杷乳酸发酵果汁的最适菌株：植物乳杆菌R23(专利申请号2011 1 0281566.2)及干酪乳杆菌R35(专利号ZL 2010 1 0174093.1)，两菌株能快速适应pH3.2以上的酸性环境，并以有机酸为主要碳源进行增殖，突破乳酸发酵的技术瓶颈，同时产生与枇杷果汁相协调的愉快发酵香，并赋予枇杷果汁乳酸发酵特有的营养和益生功能。本申请人还在《食品科学技术》2013年31卷第3期34-38页发表文献《葡萄全汁乳酸发酵菌株筛选及其风味分析》，以“桂葡1号”葡萄果汁为原料，以耐酸性及风味评价为指标，筛选得到适宜葡萄果汁发酵的优良菌株植物乳杆菌R23(专利申请号2011 1 0281566.2)及副干酪乳杆菌RP35(专利申请号2013 1 0019848.4)，其发酵香与葡萄果香协调，增加了葡萄果汁酸、酮、酯类物质的相对含量，增加了酚类和有机酸的成分数量，其复配发酵能赋予葡萄果汁更丰富的发酵风味。本申请人还于2017年10月20日公开了申请号为“201710981772.1”的国家发明专利申请“一种海带复合微生物脱腥方法”，可利用产香的酿酒酵母菌和具有苹果酸、乳酸发酵功能的乳酸菌对海带进行微生物混合发酵，减少海带腥味物质的含量，增加香味物质的含量，产生特殊的发酵香味，经过本技术脱腥的海带原料可以进行即食海带或其他类海带产品的加工。

发明内容

[0005] 为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一株副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38(Lactobacillus paracasei subsp.Paracasei RP38)，能在果汁中快速繁殖，产生与果汁相协调的发酵香，能赋予果汁更多的功能营养物质；能应用于海带等水产品上的生物脱腥处理，减少腥味挥发性物质，产生协调的风味成分，提升水产品的加工品质。

[0006] 所述的副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38，已于2019年5月5日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为：CCTCC NO：M 2019322。

[0007] 所述的副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38，具有以下的形态特征：细胞杆状，菌体大小为0.5μm×1.0～1.67μm(长×宽)，细胞呈单个、成对或短链状排列，无芽孢；菌落直径0.7～1.3mm，呈圆形，湿润，表面光滑，凸起，乳白色，不透明，边缘整齐；液体培养菌液浑浊，无菌膜，无气泡，分层明显、底部有白色沉淀。

[0008] 所述的副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38，具有以下的生理生化特性：菌株能在10℃、40℃下生长，七叶灵水解试验为阳性，兼性厌氧，接触酶试验、氧化酶试验、脲酶试验等均为阴性；糖发酵试验结果表明，所述副干酪乳杆菌副干酪亚种不能代谢核糖醇、L-岩藻糖、肌醇、鼠李糖、D-阿拉伯糖醇、5-酮基-葡萄糖酸盐、D-木糖、卫矛醇、淀粉、L-阿拉伯糖醇、A-甲基-D-甘露糖苷、L-木糖、D-阿拉伯糖、赤藓醇、B-甲基-D-木糖苷、D-岩藻糖、甘油、D-来苏糖、L-阿拉伯糖、2-酮基-葡萄糖酸盐、木糖醇等21种碳源，其它25种碳源均可利用。

[0009] 所述副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38具有较强的抗逆性：能耐受pH值2.0的高酸环境，耐受30％葡萄糖浓度的高渗透压。

[0010] 所述副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38能在氮源缺失或氮源不足的发酵基质中利用碳源进行代谢，比如在发酵基质碳氮比低于30:1的情况下，优先利用碳源进行代谢。

[0011] 所述副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38可应用于生产葡萄果汁乳酸发酵饮料，所生产的发酵型乳酸菌饮料含有所述的副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38益生型代谢产物、细胞碎片或分泌物中的至少一种。方法如下：将该菌株的扩培菌液以1.0×107～5.0×108cfu/mL接种量，接入到无菌发酵罐内，该罐内装有经灭菌处理的葡萄果汁，人工调节发酵温度30℃±5℃、发酵48±10小时后得到适度发酵的果汁发酵液，过滤后进行饮料调配，再灌装即可。

[0012] 所述副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38在银耳龙眼复合果汁发酵中的应用：将银耳汁和龙眼汁按比例勾兑后，调整其可溶性固形物含量及酸度，然后杀菌、冷却得到银耳龙眼复合汁，然后将副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38活化后以1.0×107～5.0×108cfu/mL的生物量接入银耳龙眼复合汁中，在25±1℃下厌氧培养48±10小时。

[0013] 所述副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38能用于海带生物脱腥处理，既能单独使用，也能和酿酒酵母J4共同处理，减少1,3-辛二烯、E,Z-3-亚乙基环己烯、正壬醇、正庚醛、碘代辛烷等腥味物质，产生β-苯乙醇、桃醛、十四酸乙酯、十二醛、E-2-壬烯-1-醇等果香风味的愉悦成分。方法如下：将副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38和酿酒酵母J4活化，分别培养至菌量达9 7
10和10CFU/mL，采用3000r/min、4℃离心10min，取菌坭加等体积无菌水振荡悬浮，待用。将海带经清洗脱盐、切条称重，将糖盐水(3％食盐、3％蔗糖)体积与海带质量1：1的比例加入经臭氧灭菌后的泡菜坛中，接入活化好的菌株，饱和食盐水封口后于32±1℃下发酵6-8天。
附图说明

[0014] 下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。

[0015] 图1是本发明中菌株RP38与相关种的16SrDNA序列系统发育树示意图。

[0016] 图2是本发明中菌株RP38的平板菌落形态图。

[0017] 图3是本发明中菌株RP38的扫描电镜示意图。

[0018] 图4是本发明中菌株RP38的革兰氏染色示意图。

[0019] 图5是本发明中菌株在pH2.0的培养基中培养18h的增殖对比。

[0020] 图6是本发明中菌株在葡萄糖浓度30％的培养基中培养4h的增殖情况。

[0021] 图7是本发明中菌株在葡萄糖浓度30％的培养基中培养27h的增殖情况。

[0022] 图8是本发明中海带感官剖面图。

[0023] 图9是本发明中海带挥发性风味物质种类对比。

[0024] 图10是本发明中海带挥发性风味物质组份相对含量对比。

[0025] 图11是实施例4中总酸变化结果。

[0026] 图12是实施例4中pH变化结果。

[0027] 图13是海带挥发性风味物质HS-SPME-GC-MS分析结果。

具体实施方式

[0028] 以下将结合实施例说明本发明所述的副干酪乳杆菌RP38的形态学、生理生化及分子生物学特性；以及副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38的选育及其在“桂葡1号”、“巨峰”、刺葡萄等葡萄果汁乳酸发酵方面的应用。

[0029] 实施例1菌株RP38的分离选育

[0030] 以自然发酵且发酵香浓郁风味良好的葡萄果汁为菌源，用无菌水进行梯度稀释，涂布到添加1.5％CaCO3的改良TJA培养基，在30℃下培养72h，挑选溶钙圈明显的优势菌落继续划线纯化，挑选革兰氏染色阳性且接触酶阴性、无芽孢符合乳酸菌特征的单菌落，油镜镜检、保存，以备筛选、鉴定使用。将纯化选育出的10株疑是乳酸菌扩大培养至对数稳定期，分别接入已经过灭菌处理的葡萄果汁中，25℃下发酵2d，经感官评价筛选出发酵风味和滋味最佳的菌株，命名为RP38.

[0031] 实施例2菌株RP38的鉴定

[0032] 1、乳酸菌RP38的形态学与生理生化学特征

[0033] 由表1可知，乳酸菌RP38的细胞杆状，菌体大小为0.5μm×1.0～1.67μm(长×宽)，细胞呈单个、成对或短链状排列，无芽孢；菌落直径0.7～1.3mm，呈圆形，湿润，表面光滑，凸起，乳白色，不透明，边缘整齐；液体培养菌液浑浊，无菌膜，无气泡，分层明显、底部有白色沉淀，详见图2-3。

[0034] 表1菌株RP38的形态学与生理学特征

[0035]

[0036] 注：“+”，阳性；“-”，阴性；“+w”，弱阳性；ND，未测。

[0037] 由表1、表2可以看出，乳酸菌RP38具有以下的生理生化特性：菌株能在10℃、40℃下生长，七叶灵水解与革兰氏染色(见图4)试验为阳性，兼性厌氧，接触酶试验、氧化酶试验、脲酶试验等均为阴性；糖发酵试验结果表明，所述副干酪乳杆菌副干酪亚种不能代谢核糖醇、L-岩藻糖、肌醇、鼠李糖、D-阿拉伯糖醇、5-酮基-葡萄糖酸盐、D-木糖、卫矛醇、淀粉、L-阿拉伯糖醇、A-甲基-D-甘露糖苷、L-木糖、D-阿拉伯糖、赤藓醇、B-甲基-D-木糖苷、D-岩藻糖、甘油、D-来苏糖、L-阿拉伯糖、2-酮基-葡萄糖酸盐、木糖醇等21种碳源，其它25种碳源均可利用。

[0038] 表2糖代谢试验

[0039]

[0040]

[0041] 注：“+”，阳性；“-”，阴性；“+W”，弱阳性；ND，未测。

[0042] 2、16S rDNA序列测定与同源性分析

[0043] 采用TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取纯培养的目标菌株RP38的基因组DNA。以引物F968(5’-GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3’)和L1401(5’-AGA AAG GAG GTG ATC CAG CC-3’)扩增其16S rDNA基因V6～V8可变区。PCR反应体系组成(50μL)：ddH2O 34.6μL，10×PCR反应缓冲溶液5.0μL，dNTP缓冲液4.0μL，引物(F968)2.0μL，引物(L1401)2.0μL，模板DNA2.0μL，Taq TM DNA聚合酶0.4μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。PCR产物检测：取5μL的PCR产物，2μL的上样缓冲液，在1.0％的琼脂糖中凝胶电泳分离,在EB染料上染色10min，用凝胶成像系统进行分析，将含有目标片段的产物进行测序。将RP38的16S rDNA序列输入Genebank以Blast 软件进行序列同源性比较，利用MEGA 4.0软件构建系统发育进化树，进行亲缘关系和系统发育分析，其16S rDNA序列系统发育进化树，如图1。结果显示，菌株RP38与L.casei、L.paracasei subsp.paracasei、L.paracasei subsp.tolerans和L.rhamnosus模式株聚在最近的一个分支，序列同源性均为99.1％以上，Bootstrap支持率为100％。根据分子生物学鉴定结果，结合形态、生理生化特征，最终确定乳酸菌RP38为副干酪乳杆菌副干酪亚种，命名为Lactobacillus paracasei subsp.Paracasei RP38。

[0044] 实施例3：乳酸菌RP38的生理生化特性研究

[0045] 1.耐高酸试验

[0046] 以标准乳酸菌菌种ATCC14917为对照菌，将各对象菌株以5％(v/v)接种量接种至pH值2.0的MRS液体培养基，于37℃培养18h检测OD600值，结果见图5。除RHJ24和RP38，其他菌株均无法增殖，RP38具有明显的高耐受酸胁迫的能力。

[0047] 为消除培养基自身的氧化褐变等影响OD600的因素，以未加菌种的培养基为对照，增殖能力以(ΔOD600(加菌18h)-ΔOD600(无菌培养基18h))－(ΔOD600(加菌0h)-ΔOD600(无菌培养基0h))表示。

[0048] 2.耐渗透压试验

[0049] 将活化后菌株按5％(v/v)接种量分别接种至葡萄糖浓度30％的MRS液体培养基，37℃培养箱培养，分别检测4h和27h的OD600值，为消除培养基自身的氧化褐变等影响OD600的因素，以未加菌种的培养基为对照，增殖能力以(ΔOD600(加菌18h)-ΔOD600(无菌培养基
18h))－(ΔOD600(加菌0h)-ΔOD600(无菌培养基0h))表示，比较菌株耐高糖渗透压的能力，结果见图6。

[0050] 葡萄糖浓度30％的培养基中培养4h时，R23、RP38、RHJ234的耐受性最强；培养27h时，RPC22、RHJ234、RPC21、RP38耐受性最强，其增殖幅度均大于0.3。综上，RP38和RHJ234适应高渗透压环境的能力最强且耐受性理想，RPC22在经过缓冲期后耐受高渗透压能力最强。

[0051] 实施例4：主要碳源对菌株RP38异型发酵挥发性风味的影响

[0052] LH16培养基：用于乳酸菌的液体保藏；TJA培养基：番茄汁50mL，酵母抽提液5g，牛肉膏10g，乳糖20g，葡萄糖2g，磷酸氢二钾2g，吐温80 1g，乙酸钠5g，加蒸馏水至1L，pH6.8±0.2，121℃下灭菌20min，用于活菌的平板计数。

[0053] 种子液制备：菌株RP38经活化后，接种于液体培养基LH16，培养24h后至菌量达9
10cfu/mL，采用3000rpm/min、4℃离心10min，取菌坭用无菌水洗涤3次去除培养基，加适量无菌水振荡悬浮使菌密度达到109cfu/mL以上，待用。

[0054] 不同碳源发酵风味试验：

[0055] 按照表3配方制备不同碳源发酵液各300mL，用0.3％的Na2HPO4调节处理组1～4的pH＝3.5，并分别添加MgSO40.036％(w/v)、MnSO40.005％(w/v)，各处理组100℃水浴灭菌15min，冷却备用。将1.2.1制备的种子液以20％接种量分别接种至各处理组，在28±1℃下培养，检测0d、1d、2d、3d的pH值、总酸并进行感官评判；以枇杷果汁培养基为对照，对发酵3d挥发性风味物质进行定性分析。设平行试验3组。

[0056] 表3不同碳源的验证试验配方

[0057]

[0058] 注：0.1％苹果酸溶液的pH2.9；0.05％苹果酸溶液的pH3.2。

[0059] 有机酸分析：采用HPLC进行定性定量分析。总酸变化见图11、pH值变化见图12，各处理的总酸和pH值变化趋势基本一致。处理组y1总酸呈下降趋势；处理组y2总酸略有上升；处理组y3和y4总酸呈起伏趋势，这可能是因为菌种能以苹果酸为优先碳源被代谢消耗，糖碳源继而被代谢产酸。说明菌种在无氮源限制性培养基中依然能进行代谢活动。

[0060] 此外，有效鉴定出挥发性成分39种见表2。共有成分13种：3-羟基-2-丁酮、2-壬酮、乙酸、2-壬醇、2-癸酮、壬醇、萜品醇、己酸、丁酸丁酯、β-苯乙醇、庚酸、辛酸、壬酸，说明在缺失氮源的限制性培养基中，RP38依然能代谢产生果汁培养基类似的香气成分。

[0061] 本实施例表明菌株RP38能在氮源缺失或氮源不足的发酵基质中优先利用碳源进行代谢。

[0062] 表4发酵3d的挥发性成分(相对含量％)

[0063]

[0064]

[0065] 实施例5：菌株RP38在葡萄乳酸发酵果汁中的应用

[0066] 1风味乳酸菌筛选

[0067] 分别将商业菌株干酪乳杆菌20986、嗜热链球菌20379、德氏乳杆菌保加利亚亚种6045、乳酸菌发酵剂Lac 101及本实验室保藏的副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38
(Lactobacillus paracasei subsp.Paracasei RP38)接种于液体培养基LH16，25±1℃培养24h后，采用3000r/min、4℃离心10min，取菌坭加适量预处理葡萄汁振荡悬浮，菌密度达到109cfu/mL以上，分别以107cfu/mL的生物量接入3种葡萄汁中，25±1℃控温培养，感官评判发酵1-3d的风味变化，筛选乳酸发酵适宜菌株，结果见表5。试验表明，副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38的发酵风味明显优于其他几株乳酸菌，在3种葡萄果汁中发酵至第2-3天达最佳，发酵香浓郁且与原果香协调，是适宜葡萄果汁物性的乳酸菌发酵剂。

[0068] 表5各菌株在3种葡萄果汁中的发酵风味评价

[0069]

[0070] 2副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38在“桂葡1号”葡萄果汁中的生长曲线

[0071] 将菌株RP38以107cfu/mL的接种量接入“桂葡1号”葡萄果汁中，25℃控温发酵。菌株RP38在葡萄果汁中的适应性好，无明显延滞期，接种后快速进入对数增长期，发酵120h也未出现衰减期，其对数增长期的生长曲线分别符合方程：Y＝7.2027+0.031651*X-0.000119*X2(F值354.58，P<0.01)。

[0072] 3副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38的酸代谢

[0073] 将菌株RP38以107cfu/mL的接种量接入“桂葡1号”葡萄果汁中，25℃控温发酵，其总酸代谢情况见表6。结果表明，RP38在发酵前期主要进行苹果酸乳酸发酵(MLF)，将发酵基质中的苹果酸转化为乳酸而使总酸下降，后期主要进行糖酵解使总酸上升。

[0074] 表6乳酸菌RP38的酸代谢

[0075]

[0076] 4副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38的糖代谢

[0077] 将菌株RP38以107cfu/mL的接种量接入“桂葡1号”葡萄果汁中，25℃控温发酵，其总糖代谢情况见表7。从表7可以看出，果汁的可溶性总糖含量在发酵过程中始终呈下降趋势。RP38刚接入葡萄果汁后总糖含量迅速下降，12h内下降了3.51％，而后总糖含量保持缓慢下降的趋势。

[0078] 表7乳酸菌RP38的糖代谢

[0079]

[0080] 上述试验的试验方法如下：

[0081] ⑴风味评价：发酵样品按其风味特征分为5级。一级为有葡萄果香，发酵香浓郁，滋味好，90-100分；二级为有葡萄果香，发酵香较浓郁，滋味好，80-89分；三级为有葡萄果香，发酵香一般，滋味较好，70-79分；四级为葡萄果香淡，发酵香不明显，60-69分；五级为香气及滋味均不愉快，分值小于60分。请12个经培训过的专业人士进行独立打分，取平均值统计分析。

[0082] ⑵菌落总数：参照GB/T4789.35-2003(食品卫生微生物学检验—乳酸菌饮料中乳酸菌检验)，平板菌落计数法。

[0083] 实施例6：菌株RP38在银耳龙眼复合果汁的乳酸发酵中的应用

[0084] 银耳龙眼复合汁：干银耳按料液比1:50加水破碎，微沸10min后冷却，200目过滤，待用；龙眼肉按料液比1:10加水破碎，微沸10min后冷却，200目过滤，待用；将银耳汁和龙眼汁按1:2勾兑，调整可溶性固形物8％、酸度0.2％，沸水浴杀菌，冷却待用。

[0085] 将本实验室保藏的乳酸菌(植物乳杆菌RWK2、干酪乳杆菌R32、植物乳杆菌RLJ21、瑞士乳杆菌RCQ722、植物乳杆菌RPC22、植物乳杆菌RPC21、干酪乳杆菌R35、鼠李糖乳杆菌RCQ4、植物乳杆菌R23、副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38、戊糖片球菌RHJ68、植物乳杆菌RHJ234)和CICC购买的标准菌(约氏乳杆菌6084、类干酪乳杆菌20252、粪肠球菌20430、乳酸乳球菌乳脂亚种20406、类干酪乳杆菌7000、类干酪乳杆菌20278、瑞士乳杆菌20243、粪肠球菌20422、)活化后，分别以107cfu/mL的生物量接入银耳龙眼复合汁中，在25±1℃下厌氧培养2d，发酵风味的感官评价结果见表8。评价得分大于7分的菌株有3株，分别是RWK2、R23、RP38，均为银耳龙眼复合汁适宜的发酵菌株。

[0086] 表8不同乳酸菌发酵复合果汁的简单模糊评判

[0087]

[0088] 本试验风味评价的检测方法为：选用有经验的品评员10人，对发酵风味按照等级域Y(y1很喜欢、y2喜欢、y3一般喜欢、y4不喜欢)进行选择，统计每级比例，并根据轶值(很喜欢9、喜欢7、一般喜欢5、不喜欢3)进行换算，评价总分＝等级比例×轶值。

[0089] 实施例7：菌株RP38在海带产品的生物脱腥中的应用

[0090] 将副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38和酿酒酵母J4活化，分别培养至菌量达109和108CFU/mL，采用3000r/min、4℃离心10min，取菌坭加等体积无菌水振荡悬浮，待用。将海带经清洗脱盐、切条称重，将糖盐水(3％食盐、3％蔗糖)体积与海带质量1：1的比例加入经臭氧灭菌后的泡菜坛中，接入活化好的菌株，接种量为5％，饱和食盐水封口后于32±1℃下发酵8天。

[0091] 1.酿酒酵母J4的分离选育

[0092] 以福建省福安市溪塔葡萄沟采摘的新鲜刺葡萄为原料，经挑选、清洗、破碎等工艺，制成刺葡萄果浆，在20-25℃下自然发酵作为菌源。待样品在发酵罐中有大量气泡时，取发酵液10％接入酵母富集培养基中，28℃培养1d。在无菌条件下将发酵液进行10倍梯度稀释，选取3个适宜的稀释度涂布于麦芽汁培养基平板上，28℃恒温培养2d。挑取具有典型酵母菌落形态的菌落单菌落，在麦芽汁培养基平板上进行4～5次划线传代，挑选具有典型酵母菌菌落特征的菌株进行杜氏小管产气试验，得到大量气泡、酒香浓郁的纯菌。以降酸能力、发酵速率、产酒能力、产香水平、感官评价等为指标，通过葡萄果浆酿造试验，筛选出适于果酒发酵、具有酸代谢能力且综合性能优良的酿酒酵母J4。酿酒酵母J4已保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCCM 2010215。

[0093] 2挥发性风味物质测定方法

[0094] ⑴固相微萃取(SPME)取样

[0095] 取海带样品4g置于20mL的顶空进样瓶中进行萃取。萃取条件：萃取头老化温度250℃；老化时间15min；平衡温度60℃；平衡时间30min；250℃解吸附3min。

[0096] ⑵GC-MS分析条件

[0097] GC条件：DB-5MS(30m×0.25mm，膜厚0.25μm)；采用程序升温方式，起始温度50℃，保持3min，以10℃/min的速率上升至90℃，保持5min，以10℃/min的速率上升至230℃，保持2min；以20℃/min的速率上升至280℃，保持5min；载气为He，流速1.0mL/min；不分流进样。

[0098] MS条件：电子电离源；电子能量70eV；离子源温度230℃；质量扫描范围m/z 35～550；发射电流100μA。

[0099] ⑶GC-MS数据分析

[0100] 对不同海带样品挥发性物质的定性分析主要采用GC-MS联用仪NIST 14谱库对照，选择相似度大于80％的物质，另外结合保留指数(retention index，RI)进行确定。按公式计算

[0101] 式中：n和n+1为未知物流出前、后正构烷烃碳原子数；tn+1和tn为正构烷烃的保留时间/min；tr为未知物的保留时间/min(tn＜tr＜tn+1)。采用面积归一化法进行定量分析，求得各挥发性成分的相对含量。

[0102] 3定量描述感官评价

[0103] 邀请10位经过培训的感官评定分析员组成评价小组，将搜集到的描述词整理总结后，用M值法首次筛选。提供给评价员一系列有差别的样品，对使用的每一描述词要求评价员在标度“0～5”的范围内标出评价位置，来判断感受到的强度。根据感官评定小组成员实际的评价情况删除M值较低的描述词。最终整理出的气味感官描述词分别是藻腥味、泥土味、乳酸味、水果味、酒精味、花香味。

[0104] 感官剖面分析法计算

[0105] 式中：F为描述词实际被述及的次数占该描述词所有可能被述及总次数的百分率/％；I为评价小组实际给出的一个描述词的强度和占该描述词最大可能所得强度的百分率./％。

[0106] 4海带感官风味评价

[0107] 海带原料经发酵处理都可达到脱除腥味的效果，但不同微生物发酵处理，其效果产生差异，见图8。经副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38和酿酒酵母J4单菌发酵都可明显脱除藻腥味，前者具有乳酸发酵香，后者具有酵母发酵的醇香、水果香、花香。以副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38及酿酒酵母J4组合发酵的处理，脱腥味效果最佳，发酵的海带乳酸发酵香、果香及花香协调，香味愉悦。

[0108] 5海带挥发性风味物质组分种类间的比较分析

[0109] CK组和3组发酵处理海带的挥发性风味化合物的种类和相对含量的差异如图9和图10所示。较CK组相比，RP38发酵组的醇类、醛类、酮类和酸类化合物物质种类和相对含量均增加，烃类和酯类化合物物质种类未变化，但相对含量减少；J4组海带醇类、醛类、酸类和其他类化合物物质种类和相对含量均增加，烃类、酮类和酯类化合物物质种类增加，但相对含量下降；RP38+J4组海带醇类、醛类、酯类和酸类化合物物质种类和相对含量均增加，烃类和酮类化合物物质种类增加，但相对含量下降。不同发酵处理间，以RP38发酵组海带醛类、酮类化合物物质相对含量最高；J4组海带酯类、醛类化合物物质种类最多；RP38+J4组的烃类、醛类、酯类、酸类化合物物质种类最多，醇类、酯类、酸类化合物物质相对含量最高，酮类化合物物质种类和相对含量最低。正由于这些风味物质种类及相对含量的差异构成了不同的发酵风味和脱腥效果。

[0110] 6海带挥发性风味物质的消长分析

[0111] 本试验共解析出75种海带挥发性风味物质，采用生物脱腥处理前后的各物质定性解析结果见图13。

[0112] 海带经副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38和酿酒酵母J4发酵后，1,3-辛二烯、E,Z-3-亚乙基环己烯、正壬醇、正庚醛、碘代辛烷等腥味物质经微生物转化利用，其相对含量明显下降或未检出，产生了次生代谢产物，如：β-苯乙醇、桃醛、十四酸乙酯、十二醛、E-2-壬烯-1-醇等，这些物质大多具有果香味，对发酵海带风味的形成具有很大贡献。而海带分别经酿酒酵母J4和副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38发酵后产生的风味不同，副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38的代谢产物是Z-2-庚烯醛、E-2-癸烯醛、E-2-壬烯-1-醇、β-紫罗酮、2-壬酮等，酿酒酵母J4的代谢产物是β-苯乙醇、桃醛、十四酸乙酯、E-2-辛烯醛等，组合后风味更柔和，更协调。因此，副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38和酿酒酵母J4是海带生物发酵脱腥的优良微生物菌种。

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一株副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38

一株副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38

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