检测莲草直胸跳甲CP基因表达特性的引物及其方法
阅读：573发布：2020-05-16
专利汇可以提供检测莲草直胸跳甲CP基因表达特性的引物及其方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了检测莲草直胸跳甲CP基因表达特性的引物及其方法，引物包含两对，其序列如SEQ ID NO.1‑4所示，利用所述引物建立了莲草直胸跳甲雌雄虫取食不同CO2浓度培育的空心莲子草后CP基因表达量检测的 荧光 定量PCR法，并进行了转录组的测序，对CP基因荧光定量的表达量趋势与转录组的表达量趋势做了比较，为研究莲草直胸跳甲受到 环境胁迫 时产生的防御机制及CP基因表达特性奠定了 基础 。，下面是检测莲草直胸跳甲CP基因表达特性的引物及其方法专利的具体信息内容。
1.一种检测莲草直胸跳甲CP基因表达特性的荧光定量PCR特异性引物，其特征在于：所述引物包括符合荧光定量PCR反应特点的上下游引物：
CP-F：5`-TGTAGCAACGGGAGCAGATA-3`，
CP-R：5`-TACGCCGCACCTGTATCATA-3`；
以及作为内参基因的上下游引物：
Tubulin-F: 5`-AGATGTCCGCCACCTTCA-3` ，
Tubulin-R: 5`-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTCA-3`。
2.一种利用权利要求1所述特异性引物检测莲草直胸跳甲CP基因表达特性的荧光定量PCR方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）cDNA第一链合成：提取样本的总RNA并纯化，采用反转录试剂盒得到以提取的RNA为模板反转录得到的cDNA；
（2）利用下述引物进行常规PCR检测
该基因的荧光定量上下游引物：
CP-F：5`-TGTAGCAACGGGAGCAGATA-3`，
CP-R：5`-TACGCCGCACCTGTATCATA-3`；
以及作为内参基因的上下游引物：
Tubulin-F: 5`-AGATGTCCGCCACCTTCA-3`，
Tubulin-R: 5`-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTCA-3`；
常规PCR扩增体系为25µL：10×buffer 2.5µL ，dNTP 1.0µL，上游引物0.5µL，下游引物
0.5µL，100ng/µL cDNA模板1.0µL，Ex-TaqE 0.15µL，水19.35µL；
常规PCR反应程序为：94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s， 56℃退火30 s， 72℃延伸1 min，此条件下35个循环，最后72℃再延伸10min；
（3）实时荧光定量PCR反应：
以步骤（1）得到的cDNA为模板，加入步骤（2）所述的引物，进行荧光定量PCR反应，每个样品设置3个重复，扩增后取平均值；
实时荧光定量PCR扩增体系为：SYBR® Premix Ex TaqTM 12.5µL，上游引物0.5µL，下游引物0.5µL，100ng/µL cDNA 1.0µL，补足水至25µL；
实时荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性 30 s，然后95℃变性5 s 、60℃退火30 s，
40个循环。
检测莲草直胸跳甲CP基因表达特性的引物及其方法
技术领域
背景技术
[0002] 莲草直胸跳甲属鞘翅目，叶甲科，是空心莲子草的主要生防天敌之一。George Vogt于1962年首次发现了莲草直胸跳甲对空心莲子草有很好的控制作用。其后，莲草直胸跳甲在美国、澳大利亚等地被广泛应用于空心莲子草的控制，并取得了较好的防治效果。我国于1986年从美国引进莲草直胸跳甲，并应用于空心莲子草的生物防治，在四川、浙江、福建、广西等地取得一定的成功。
[0003] 昆虫表皮蛋白(cuticular proteins，CP)是结构蛋白，它和几丁质一起组成昆虫抵御外界环境屏障的角质层。环境、激素、转录因子和内含子等共同影响昆虫表皮蛋白基因的表达，使 CP基因具有时期和组织特异性。CP 基因被认为是研究昆虫蜕皮与变态的调控机理和理解昆虫发育期角质层在生物化学、物理化学以及结构上的修饰的重要模型，受到越来越多的重视。
[0004] 干燥、高渗透压、季节性光周期等环境胁迫使昆虫产生许多生理生化反应，并由此引起一系列相关基因的激活与沉默，从而反映昆虫对环境胁迫的耐受能力。因此，表皮作为昆虫抵御外界环境的第一道防线，当昆虫受干燥胁迫、渗透胁迫、季节性光周期等环境条件影响时，CP的表达调控功能就会作出相应反应。Zhang等（2008）研究发现干燥处理马铃薯甲虫能诱导CP基因表达，潮湿处理时 CP基因不表达，他们还发现杀虫剂谷硫磷能够高度地诱导马铃薯甲虫表皮蛋白基因的表达，并使该昆虫产生耐药性。Le Trionnaire等（2007）在 豌 豆 蚜 虫头部鉴定到受昼长缩短调控的 59 个不同的转录物，其中有 19 个是编码不同的 CP，由此解释光周期可以影响 CP的表达调控或者说 CP表达受光周期信号的调控，并可能与昆虫的表皮发育相关。
[0005] 关于莲草直胸跳甲CP基因的表达等研究国内外未见报道，因此采用实时荧光定量PCR研究莲草直胸跳甲雌雄虫取食不同CO2浓度培育的空心莲子草后CP基因的表达特性，结果表明，随着CO2浓度的升高，雌雄虫CP基因的表达量均升高，这与转录组表达量上调的变化趋势一致，说明CO2浓度升高可以影响CP基因的表达调控。这为全面深入地开展莲草直胸跳甲CP基因的研究提供基础数据，进一步揭示CP基因表达调控的内在规律，从而推进CP与昆虫变态发育的关联机制。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供检测莲草直胸跳甲CP基因表达特性的引物及其方法。
[0007] 本发明的另一目的是为全面了解莲草直胸跳甲CP基因的表达特性而设计的不同处理CO2浓度。
[0008] 为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：将取食不同CO2浓度培育的空心莲子草的莲草直胸跳甲雌雄虫各采9只到Eppendorf管中，分为3个生物学重复，共12组样品。
[0009] 设计一对检测莲草直胸跳甲CP基因表达特性的引物，包括符合荧光定量PCR反应特点的上下游引物：CP-F：5`-TGTAGCAACGGGAGCAGATA-3`；
CP-R：5`-TACGCCGCACCTGTATCATA-3`；
以及作为内参基因的上下游引物：
Tubulin-F: 5`-AGATGTCCGCCACCTTCA-3`；
Tubulin-R: 5`-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTCA-3`；
本发明所述检测莲草直胸跳甲CP基因表达特性的荧光定量PCR法，按如下步骤进行：
（1）cDNA第一链合成：提取样本的总RNA并纯化，采用反转录试剂盒得到以提取的RNA为模板反转录得到的cDNA；
（2）对下述引物进行常规PCR检测
该基因的荧光定量上下游引物：
CP-F：5`-TGTAGCAACGGGAGCAGATA-3`
CP-R：5`-TACGCCGCACCTGTATCATA-3`
以及作为内参基因的上下游引物：
Tubulin-F: 5`-AGATGTCCGCCACCTTCA-3`
Tubulin-R: 5`-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTCA-3`
常规PCR扩增体系如下：
常规PCR反应程序如下：94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s， 56℃退火30 s，72℃延伸1 min，此条件下35个循环，最后72℃再延伸10min；
（3）实时荧光定量PCR反应：
以步骤（1）得到的cDNA为模板，加入步骤（2）所述的引物，进行荧光定量PCR反应，每个样品设置3个重复，扩增后取平均值。
CP-R：5`-TACGCCGCACCTGTATCATA-3`；
以及作为内参基因的上下游引物：
Tubulin-F: 5`-AGATGTCCGCCACCTTCA-3`；
Tubulin-R: 5`-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTCA-3`；
本发明所述检测莲草直胸跳甲CP基因表达特性的荧光定量PCR法，按如下步骤进行：
（1）cDNA第一链合成：提取样本的总RNA并纯化，采用反转录试剂盒得到以提取的RNA为模板反转录得到的cDNA；
（2）对下述引物进行常规PCR检测
该基因的荧光定量上下游引物：
CP-F：5`-TGTAGCAACGGGAGCAGATA-3`
CP-R：5`-TACGCCGCACCTGTATCATA-3`
以及作为内参基因的上下游引物：
Tubulin-F: 5`-AGATGTCCGCCACCTTCA-3`
Tubulin-R: 5`-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTCA-3`
常规PCR扩增体系如下：
常规PCR反应程序如下：94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s， 56℃退火30 s，72℃延伸1 min，此条件下35个循环，最后72℃再延伸10min；
（3）实时荧光定量PCR反应：
以步骤（1）得到的cDNA为模板，加入步骤（2）所述的引物，进行荧光定量PCR反应，每个样品设置3个重复，扩增后取平均值。
[0010] 实时荧光定量PCR扩增体系如下：实时荧光定量PCR反应程序如下：95℃预变性 30 s，然后95℃变性5 s 、60℃退火30 s，40个循环。
[0011] 本发明更加详细的试验方法如下：莲草直胸跳甲CP基因的实时荧光定量PCR检测方法可通过以下步骤实现：
（1）引物设计：根据转录组测序结果得到的莲草直胸跳甲CP基因的序列，使用DNAMAN软件设计适合荧光定量PCR检测的特异性引物，引物序列如下：
CP-F：5`-TGTAGCAACGGGAGCAGATA-3`
CP-R：5`-TACGCCGCACCTGTATCATA-3`
同时，根据转录组测序结果得到的莲草直胸跳甲tubulin基因的序列，设计用于荧光定量PCR内对照物的引物，引物序列如下：
Tubulin-F: 5`-AGATGTCCGCCACCTTCA-3`
Tubulin-R: 5`-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTCA-3`
（2）莲草直胸跳甲处理试验：在对照CO2浓度（420μL·L－1）和高CO2浓度（750μL·L－1）的人工气候箱里培育空心莲子草，用于饲养莲草直胸跳甲雌雄虫，不同CO2浓度的雌雄虫各采
9只到Eppendorf管中，分为3个生物学重复，共12组样品。虫样处理后迅速放入液氮中固定，于-80℃保存备用。
（1）引物设计：根据转录组测序结果得到的莲草直胸跳甲CP基因的序列，使用DNAMAN软件设计适合荧光定量PCR检测的特异性引物，引物序列如下：
CP-F：5`-TGTAGCAACGGGAGCAGATA-3`
CP-R：5`-TACGCCGCACCTGTATCATA-3`
同时，根据转录组测序结果得到的莲草直胸跳甲tubulin基因的序列，设计用于荧光定量PCR内对照物的引物，引物序列如下：
Tubulin-F: 5`-AGATGTCCGCCACCTTCA-3`
Tubulin-R: 5`-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTCA-3`
（2）莲草直胸跳甲处理试验：在对照CO2浓度（420μL·L－1）和高CO2浓度（750μL·L－1）的人工气候箱里培育空心莲子草，用于饲养莲草直胸跳甲雌雄虫，不同CO2浓度的雌雄虫各采
9只到Eppendorf管中，分为3个生物学重复，共12组样品。虫样处理后迅速放入液氮中固定，于-80℃保存备用。
[0012] （3）cDNA第一链合成：参照全式金公司的TransZolTM Up Plus RNA Kit试剂盒说明书提取总RNA，按照TransScript公司的 One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒说明书，合成cDNA第一链。
[0013] （4）实时荧光定量PCR反应：实时荧光定量PCR采用Takara公司的SYBR® Premix Ex TaqTM试剂盒进行。以上述合成的cDNA第一链为模板，上述CP-F、CP-R和Tubulin-F、Tubulin-R为特异性引物，进行荧光定量PCR程序，每个样品设3个平行重复，扩增后取所得平行Ct值的平均数。
[0014] 实时荧光定量PCR扩增体系如下：实时荧光定量PCR反应程序如下：：95℃预变性 30 s，然后95℃变性5 s 、60℃退火30 s，40个循环。
[0015] （5）莲草直胸跳甲CP基因相对于tubulin基因的表达量的计算公式为：相对mRNA表达= 2-ΔΔCt×100%，其中Ct值=靶基因Ct值- tubulin Ct值。
[0016] （6）图3和图4分别为莲草直胸跳甲雌雄虫取食不同CO2浓度培育的空心莲子草后CP基因的差异表达。结果表明，随着CO2浓度的升高，雌雄虫CP基因的表达量均升高，并与转录组的表达量变化趋势一致，这为我们深入开展莲草直胸跳甲CP基因的研究提供了重要的基础数据。
[0018] （2）本发明所述高效快捷的荧光定量PCR法，包括荧光定量PCR程序等，实际用时50 min，相对于现有技术大大缩短了反应时间，具有高效快捷的特性。
[0020] 附图为莲草直胸跳甲雌雄虫CP基因转录水平的荧光定量PCR检测结果。
[0021] 图1：莲草直胸跳甲CP基因荧光定量引物常规PCR产物电泳结果：产物长度为102 bp，Marker条带从上到下依次为：2000、1000、750、500、250、100bp。
[0022] 图2：莲草直胸跳甲tubulin基因荧光定量引物常规PCR产物电泳结果：产物长度为199 bp，
Marker条带从上到下依次为：2000、1000、750、500、250、100bp。
Marker条带从上到下依次为：2000、1000、750、500、250、100bp。
[0023] 图3：莲草直胸跳甲雌虫（F）取食不同CO2浓度培育的空心莲子草后CP基因的差异表达，柱形和左边坐标轴为荧光定量的表达量，散点和右边坐标轴为转录组的表达量。
[0024] 图4：莲草直胸跳甲雄虫（M）取食不同CO2浓度培育的空心莲子草后CP基因的差异表达，柱形和左边坐标轴为荧光定量的表达量，散点和右边坐标轴为转录组的表达量。具体实施方案
[0025] 以下结合具体实施例及附图说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制发明，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
[0026] 实施例1试验材料的处理
－1 －1
在对照CO2浓度（420μL·L ）和高CO2浓度（750μL·L ）的人工气候箱里培育空心莲子草，用于饲养莲草直胸跳甲雌雄虫，不同CO2浓度的雌雄虫各采9只到Eppendorf管中，分为3个生物学重复，共12组样品。虫样收集后迅速放入液氮中固定，于-80℃保存备用。
－1 －1
在对照CO2浓度（420μL·L ）和高CO2浓度（750μL·L ）的人工气候箱里培育空心莲子草，用于饲养莲草直胸跳甲雌雄虫，不同CO2浓度的雌雄虫各采9只到Eppendorf管中，分为3个生物学重复，共12组样品。虫样收集后迅速放入液氮中固定，于-80℃保存备用。
[0027] 实施例2 引物的设计（1）引物设计：根据转录组测序得到的莲草直胸跳甲CP基因的序列，使用DNAMAN软件设计适合荧光定量PCR检测的特异性引物，引物序列如下：
CP-F：5`-TGTAGCAACGGGAGCAGATA-3`
CP-R：5`-TACGCCGCACCTGTATCATA-3`
莲草直胸跳甲CP基因荧光定量PCR产物长度为102 bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光定量PCR检测，琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。
CP-F：5`-TGTAGCAACGGGAGCAGATA-3`
CP-R：5`-TACGCCGCACCTGTATCATA-3`
莲草直胸跳甲CP基因荧光定量PCR产物长度为102 bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光定量PCR检测，琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。
[0028] （2）同时，根据转录组测序得到的莲草直胸跳甲tubulin基因的序列，设计用于荧光定量PCR内对照物的引物，引物序列如下：Tubulin-F: 5`-AGATGTCCGCCACCTTCA-3`
Tubulin-R: 5`-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTCA-3`
莲草直胸跳甲tubulin基因荧光定量PCR产物长度为199 bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光定量PCR检测，琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。
Tubulin-R: 5`-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTCA-3`
莲草直胸跳甲tubulin基因荧光定量PCR产物长度为199 bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光定量PCR检测，琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。
[0029] 实施例3 总RNA的提取参照全式金公司的TransZolTM Up Plus RNA Kit试剂盒说明书提取总RNA，用液氮将虫体研磨成粉，加入1ml TransZolTM Up，转到1.5 ml 转离心管中，室温静置5 min后，加入
200 μL氯仿/1 ml TransZolTM Up，剧烈振荡30 s ，室温孵育3 min。 4℃ 10000 g 离心15 min后，移上层水相（一般<80%）于新的离心管中，加入1/3体积的无水乙醇，轻轻颠倒混匀。
将RNA离心柱套于2 ml收集管中，将上步混合物全部转入离心柱中，12000 g，30 60 s离心，~
弃流动相，重复使用收集管。加入500 μLCB9，室温12000 g离心30 s，弃流动相，再加入500 μLCB9，室温12000 g离心30 s，弃流动相。加入稀释的500 μLWB9，12000 g 离心30 s，弃流动相，再加入稀释的500 μLWB9，12000 g 离心30 s，弃流动相。12000 g 离心2 min，彻底去除残留的乙醇，在室温静置数分钟彻底晾干离心柱。将离心柱放入RNase-free Tube中，加
50 μLRNase-free Water在离心柱的中央，室温静置1 min，12000 g离心1 min，洗脱RNA。所得的RNA置于-80℃备用。
200 μL氯仿/1 ml TransZolTM Up，剧烈振荡30 s ，室温孵育3 min。 4℃ 10000 g 离心15 min后，移上层水相（一般<80%）于新的离心管中，加入1/3体积的无水乙醇，轻轻颠倒混匀。
将RNA离心柱套于2 ml收集管中，将上步混合物全部转入离心柱中，12000 g，30 60 s离心，~
弃流动相，重复使用收集管。加入500 μLCB9，室温12000 g离心30 s，弃流动相，再加入500 μLCB9，室温12000 g离心30 s，弃流动相。加入稀释的500 μLWB9，12000 g 离心30 s，弃流动相，再加入稀释的500 μLWB9，12000 g 离心30 s，弃流动相。12000 g 离心2 min，彻底去除残留的乙醇，在室温静置数分钟彻底晾干离心柱。将离心柱放入RNase-free Tube中，加
50 μLRNase-free Water在离心柱的中央，室温静置1 min，12000 g离心1 min，洗脱RNA。所得的RNA置于-80℃备用。
[0030] 实施例4cDNA第一链合成：按照TransScript公司的 One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒说明书步骤，以实施例3中的RNA为模板，反转录生成cDNA第一链，具体步骤如下：
（1）反转录体系
（2）42℃温育30 min。
（1）反转录体系
（2）42℃温育30 min。
[0031] （3）85℃加热5 min，产物可放在-20℃、-80℃保存。
[0032] 实施例5进行荧光定量PCR反应。实时荧光定量PCR采用Takara公司的SYBR® Premix Ex TaqTM试剂盒进行。以实施例4中的cDNA为模板，用实施例2中的引物进行实时荧光定量PCR扩增反应，每个样品设3个平行重复，扩增后取所得平行Ct值的平均数。
[0033] （1）实时荧光定量PCR扩增体系如下：（2）实时荧光定量PCR反应程序如下： 95℃预变性 30 s，然后95℃变性5 s 、60℃退火
30 s，40个循环。
30 s，40个循环。
[0034] （3）实时荧光定量PCR完成后，根据Ct值计算不同处理条件下相对表达量的比值2-ΔΔCt。莲草直胸跳甲CP基因相对于tubulin基因的表达量的计算公式为：相对mRNA表达= 2-ΔΔCt×100%，其中Ct值=靶基因Ct值- tubulin Ct值。
[0035] 表1：莲草直胸跳甲雌虫取食不同CO2浓度培育的空心莲子草后CP基因的C(T)值、平均值、标准偏差、荧光定量表达量及转录组的表达量表2：莲草直胸跳甲雄虫取食不同CO2浓度培育的空心莲子草后CP基因的C(T)值、平均值、标准偏差、荧光定量表达量及转录组的表达量
（4）图3和图4分别为莲草直胸跳甲雌雄虫取食不同CO2浓度培育的空心莲子草后CP基因的差异表达。结果表明，随着CO2浓度的升高，雌雄虫CP基因的表达量均升高，与转录组的表达量上调的变化趋势一致。这为我们深入开展莲草直胸跳甲CP基因的研究提供了重要的基础数据。
（4）图3和图4分别为莲草直胸跳甲雌雄虫取食不同CO2浓度培育的空心莲子草后CP基因的差异表达。结果表明，随着CO2浓度的升高，雌雄虫CP基因的表达量均升高，与转录组的表达量上调的变化趋势一致。这为我们深入开展莲草直胸跳甲CP基因的研究提供了重要的基础数据。
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