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一种 植物耐低温基因和转基因耐低温植物的培育方法

阅读：846发布：2020-05-08

专利汇可以提供一种植物耐低温基因和转基因耐低温植物的培育方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种植物耐低温基因，植物耐低温基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白，其cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所分离的植物耐低温基因在提高植物对低温环境胁迫抗性或培育抗低温胁迫植物品种等方面具有重要的应用潜力。本发明还提供了含有该基因的重组载体、转基因细胞系以及转基因重组菌。本发明进一步公开了一种转基因耐低温植物的培育方法，将编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示蛋白的植物耐低温基因转入目标植物，得到转基因耐低温植物。本发明提供的培育方法能够培育对低温环境耐受性高的转基因植株，且培育过程经济、快速，在农业领域具有广阔的应用前景。，下面是一种植物耐低温基因和转基因耐低温植物的培育方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种植物耐低温基因在培育转基因耐低温植物中的应用，其特征在于，所述植物耐低温基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白；所述植物为蒙古韭。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物耐低温基因的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种包含如权利要求1或2所述的植物耐低温基因的重组载体、转基因细胞系或转基因重组菌在培育转基因耐低温植物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重组载体是以pCAMBIA3301为空载体构建的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述重组载体是将如权利要求1或2所述的植物耐低温基因连入所述pCAMBIA3301载体上的EcoRI和BamHI酶切位点之间，得到的重组表达载体。
6.一种转基因耐低温植物的培育方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的植物耐低温基因转入目标植物，得到所述转基因耐低温植物；所述目标植物为蒙古韭。
7.根据权利要求6所述的转基因耐低温植物的培育方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）构建如权利要求3、4或5中所述的重组载体；
（2）将步骤（1）构建的重组表达载体转化农杆菌，获得转化体；
（3）利用农杆菌介导法使步骤（2）中制备的转化体感染目标植物，筛选阳性植株，获得与正常植株相比具有高抗寒性的转基因耐低温植物。

说明书全文

一种植物耐低温基因和转基因耐低温植物的培育方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种植物耐低温基因，包含植物耐低温基因的重组载体、转基因细胞系或转基因重组菌，以及转基因耐低温植物的培育方法。

背景技术

[0002] 自然界中，植物不可避免会遭受各种环境因子的胁迫，如低温、高温、干旱和高盐等非生物胁迫都极易通过影响植物细胞膜成分，气孔开度等生理、生化过程对植物造成伤害，严重时会影响作物的产量和种植区域。冷害、干旱、高温、盐溃等非生物逆境是全球农业生产面临的严重问题，也是制约我国农业发展的重要因素。其中低温是一个非常重要的环境因子，很大程度上影响植物的生长发育、生存及分布，是限制作物的地理分布，并造成作物产量与质量下降的重要因素之一。低温胁迫会影响许多基因的表达：一方面低温胁迫直接影响代谢基因的表达；另一方面低温胁迫会引起其它胁迫的发生，由此与该些胁迫相关的基因受到低温胁迫的间接诱导。世界上每年因冷害造成的农业损失高达数千亿美元。

[0003] 蒙古韭(Allium mongolicum Regel)属百合科葱属根茎组，别名为沙葱，为多年生草本旱生植物，分布于陕西、甘肃、宁夏、内蒙古、新疆、青海等6省(区)。蒙古韭富含必需微量元素、维生素和氨基酸等各种营养成分，此外，蒙古韭可入药，能开胃、消食、杀虫，主治消化不良、不思饮食、秃疮、青腿病等多种疾病，具有除瘴气排恶毒等重要的药理作用，被誉为“大漠野菜”、“沙原佳蔬”、“菜中灵芝”。蒙古韭广泛分布于我国西北各省，适生于干旱的荒漠、戈壁、低山山地、砾质砂地、季节性河床，具有抗高温、耐低温、抗旱、耐盐碱等特性，在极端不良环境下也可以生存。蒙古韭的最适生长温度为10～25℃，但蒙古韭的叶片可以忍受-4～-5℃的低温，地下根茎在-45℃时也不受冻，因此，蒙古韭是一种研究植物低温胁迫以及耐低温基因筛选的理想材料。

[0004] 在低温胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并生存。植物在适应低温胁迫的过程中，多种基因得以诱导表达，这些基因的表达在时空上是有序发生的，并相互联系形成了低温应答的分子机制，该些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。与胁迫相关的基因产物包括：一、调节细胞膜膜脂流动性的脂肪酸膜质脱饱和酶或酰基转移酶等；二、离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(庶糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物；三、参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白激酶、转录因子等。

[0005] 随着基因工程技术在作物品种改良方面取得了重大进展，具有可控性强、效率高、周期短、低成本等优点的基因工程技术已经成为新品种选育的一条全新而有效的途径。如通过将CDA基因转入拟南芥中，使CDA基因在叶绿体中定位表达，植株积累大量甜菜碱，增强了拟南芥对低温的抵抗能力。提高植物的抗冻性，培育耐低温作物品种对于农业具有十分重要的意义，为此，需要挖掘更多植物抗低温的优质基因。迄今为止，未见文献报道从蒙古韭中分离得到与低温胁迫相关的基因。

发明内容

[0006] 因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中缺少蒙古韭低温胁迫相关基因的筛选；从而提供一种从蒙古韭中分离的，与蒙古韭耐低温相关的基因。

[0007] 本发明提供一种植物耐低温基因，所述植物耐低温基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白。

[0008] 所述的植物耐低温基因，所述植物耐低温基因的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。

[0009] 本发明提供一种包含上述的植物耐低温基因的重组载体、转基因细胞系或转基因重组菌。

[0010] 所述的重组载体，所述重组载体是以pCAMBIA3301为空载体构建的重组表达载体。

[0011] 所述的重组载体，所述重组载体是将上述的植物耐低温基因连入所述pCAMBIA3301载体上的EcoRI和BamHI酶切位点之间，得到的重组表达载体。

[0012] 所述的植物耐低温基因，所述的重组载体、转基因细胞系或转基因重组菌在培育转基因耐低温植物中的应用。

[0013] 本发明提供一种转基因耐低温植物的培育方法，将上述的植物耐低温基因转入目标植物，得到所述转基因耐低温植物。

[0014] 所述的转基因耐低温植物的培育方法，包括如下步骤：

[0015] (1)构建所述的重组载体；

[0016] (2)将步骤(1)构建的重组表达载体转化农杆菌，获得转化体；

[0017] (3)利用农杆菌介导法使步骤(2)中制备的转化体感染目标植物，筛选阳性植株，获得与正常植株相比具有高抗寒性的转基因耐低温植物。

[0018] 所述的转基因耐低温植物的培育方法，所述目标植物为蒙古韭。

[0019] 使用本发明提供的植物耐低温基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必须与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

[0020] 为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

[0021] 本发明相对现有技术具有如下优点：

[0022] 1、本发明提供了一种植物耐低温基因，植物耐低温基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白。本发明提供的植物耐低温基因筛选自对低温胁迫具有良好耐受性的蒙古韭，首先对蒙古韭进行低温胁迫处理，然后利用cDNA-AFLP技术筛选差异表达基因，并对差异表达基因的蛋白的功能进行推测，最终筛选得到与细胞代谢相关的基因TDF124。TDF124在蒙古韭低温胁迫的初期即呈现高表达量，并随着低温胁迫时间的延长表达量随之提高。本发明提供的植物耐低温基因TDF124对植物的低温胁迫具有应答性，证明其与植物的低温胁迫具有紧密联系，将其命名为AmR-FAD。

[0023] AmR-FAD编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白，对蛋白序列进行分析，证明AmR-FAD编码的蛋白是植物脂肪酸脱饱和酶FAD，FAD能够被低温诱导表达，通过将双键引入脂肪酸，降低植物膜质的饱和度，提高植物膜系统在在低温下的稳定性，进而提高植物在极端环境下的生存率。

[0024] 2、本发明提供了植物耐低温基因的cDNA序列，利用植物耐低温的cDNA序列，对于植物低温胁迫下的抗逆性研究具有重要意义。通过cDNA序列能够进一步获得植物耐低温蛋白，对于通过基因工程技术或者蛋白工程技术培育转基因耐低温植物具有重要作用。

[0025] 3、本发明提供了包含上述植物耐低温基因的重组载体、转基因细胞系或转基因重组菌，其中重组载体为重组表达载体，具体地为pCAMBIA3301为空载体构建的重组表达载体，为获得转基因耐低温植物提供了新的载体、细胞系或重组菌。

[0026] 4、本发明提供了一种转基因耐低温植物的培育方法，将编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示蛋白的植物耐低温基因或cDNA序列如SEQ ID NO.2所示的植物耐低温基因转入目标植物，得到转基因耐低温植物。本发明提供的培育方法通过利用植物耐低温基因对植物低温胁迫抗性的重要影响，为培育转基因耐低温植物提供了一条经济、快速以及有效的途径，在农业领域具有广阔的应用前景和市场前景。

[0027] 5、本发明提供的转基因耐低温植物的培育方法，通过上述的培育方法，获得了低温耐受性提高的蒙古韭植株，在低温胁迫环境下，野生型蒙古韭的存活率为49％，而本发明培训的转基因蒙古韭的存活率为92％，因此，使用本发明提供的转基因耐低温植物的培育方法能够增强植株对低温环境的耐受性，使植株在低温环境下的存活率显著提高。附图说明

[0028] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0029] 图1为本发明实施例1中提取的蒙古韭叶片总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果；

[0030] 图2为本发明实施例1中利用cDNA-AFLP技术筛选低温胁迫下差异表达基因的银染结果；

[0031] 图3为本发明实施例2中TDF124在低温胁迫处理0h、2h、4h、8h、24h、72h和7d后的相对表达量。

具体实施方式

[0032] 以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术，实施例中所用到的试剂和原料均可由市场购得。

[0033] 实施例1蒙古韭低温胁迫相关基因的筛选

[0034] 本实施例提供一种利用cDNA-AFLP技术，对蒙古韭低温胁迫相关基因进行筛选的方法，具体包括以下步骤：

[0035] 1、低温胁迫处理

[0036] (1)取蒙古韭种子用自来水冲洗干净后，用无菌水浸泡10min。然后用70％的酒精灭菌30s，再用无菌水冲洗3次，接种在无激素的MS基本培养基上。取5cm左右高的无菌苗叶片，由叶尖到基部切成3mm长的切段，依次接种在愈伤组织诱导培养基上，待愈伤组织形成后，将愈伤组织转移到分化培养基中，2周左右，愈伤组织分化成苗；待蒙古韭幼苗长至3cm左右时，转移到生根培养基上，培养20d左右开始生根，在培养至30d时，进行蒙古韭幼苗的低温胁迫处理；

[0037] (2)低温胁迫处理：取蒙古韭幼苗置于0～-5℃的温度环境下培养7d，取蒙古韭叶片，于液氮速冻，-80℃保存备用；对照处理：将蒙古韭幼苗置于室温下培养7d，取蒙古韭叶片，于液氮速冻，-80℃保存备用。

[0038] 2、蒙古韭总RNA的提取

[0039] (1)先将叶片剪切成小块，放入研磨中用液氮研磨3次，将研磨好的组织50-100mg加入1.5mL离心管中然后加入1ml RNAVzol，裂解产物应呈澄清的透明粘稠液体，室温放置5分钟；

[0040] (2)加200μl氯仿，振荡混匀，室温静置5min，12000r/min，4℃离心10min；

[0041] (3)取500μl上清于另一离心管，加等体积异丙醇，室温放置10min，12,000r/min，4℃离心10min；

[0042] (4)加入1ml 75％乙醇洗沉淀，8000r/min，4℃离心5min，重复两次；室温风干10min左右，加20μl左右DEPC处理过的RNase Free水溶解沉淀。

[0043] 蒙古韭叶片总RNA提取结果如图1所示，总RNA的28S、18S和5S三条带条带清晰，说明所得总RNA提取质量好、纯度较高，完整性较好，可用于下一步反转录。

[0044] 3、去除基因组DNA的反应，使用SuperScript III First-Strand Synthesis System Kit，将步骤2中提取的蒙古韭总RNA配制为表1所示的混合体系，将混合体系在42℃下静置2min，去除RNA中混有的基因组DNA。

[0045] 表1去除DNA的反应混合体系

[0046]试剂使用量
5*gDNA Eraser Buffer 2μL
gDNA Eraser 1μL
Total RNA 1μg
RNase Free H2O up to 10μL

[0047] 4、使用 RTase反转录试剂盒，将冷藏储存的反转录试剂盒取出后，放置恢复至室温(20-25℃)，将步骤2中获得的组织总RNA反转录为cDNA，组织总RNA反应液为10μL，反转录的反应程序为：37℃保持15min，85℃保持5s，4℃恒温静置，所述反转录的扩增体系如下所示：

[0048] 表2反转录扩增体系

[0049]试剂使用量
5×PrimeScript Buffer 2μL
PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5μL
Oligo dT Primer(50μM) 0.5μL
Random 6mers(100M) 0.5μL
Total RNA 2μL
RNase Free ddH2O 4.5μL

[0050] 5、cDNA-AFLP筛选差异基因

[0051] (1)采用EcoRI和MseI两种限制性内切酶对双链cDNA进行分步酶切，然后对酶切产物加上相应的EcoRI和MseI连接接头，EcoRI接头序列如SEQ NO.2和SEQ NO.3所示，MseI接头序列如SEQ NO.4和SEQ NO.5所示。作为预扩增的模板。根据所用的内切酶酶切位点以及所加的接头引物序列设计预扩增引物E0(序列：5’-GACTGCGTACCAATTCA-3’)和M0(序列：5’-GATGAGTCCTGAGTAAC-3’)，PCR预扩增体系如表3所示：

[0052] 表3 PCR预扩增体系

[0053]

[0054]

[0055] PCR预扩增程序：94℃保持3min；94℃保持30s，56℃保持30s，72℃保持1min(25个循环)；72℃保持10min；

[0056] (2)采用选择性扩增引物(E1～E16)/(M1～M16)(5’-GACTGCGTACCAATTCANN-3’)/(5’-GATGAGTCCTGAGTAACNN-3’)N代表ACGT任意一种，E1-E16共16条引物，M1-M16共16条引物进行选择性扩增，将步骤(1)中得到的预扩增产物稀释10倍后用作选择性PCR扩增的模板，扩增体系同PCR预扩增体系；

[0057] 选择性PCR扩增程序：94℃保持3min；94℃保持30s，65℃保持30s，72℃，保持1min(12个循环，每个循环降0.7℃)；94℃保持3min；94℃保持30s，56℃保持30s，72℃保持1min(20个循环)；72℃保持10min；

[0058] (3)分别取选择性扩增产物4μL与变性液3μL进行充分混匀，并于95℃变性5min，然后用6％变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析。电泳条件为60W，3h。所用电泳系统为Sequi-Gen/Power Pac 3000(美国，BIO-RAD)。银染参照Silver sequence DNA sequencing system(美国，Promega)说明书进行，部分银染结果如图2所示；

[0059] (4)使用灭菌刀片，切下变性聚丙烯酰胺凝胶上差异表达条带，放入1.5mL无菌的离心管中，加入40μL ddH2O，于80℃水浴30min，离心后取上清液5μL作为模板，进行二次PCR扩增，其扩增程序同选择性扩增。扩增产物回收后连接到pMD18-T vector，并转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞内，利用菌落PCR进行验证，鉴定出阳性克隆并送去测序。将温度相关的TDFs与GeneBank已知的序列信息比对，预测TDFs的功能，选择其中的细胞代谢相关TDF124进行进一步验证。

[0060] 实施例2蒙古韭低温胁迫相关TDF124的验证

[0061] 本实施例提供了一种利用RT-PCR技术，对低温胁迫相关TDF124进行验证的方法，具体包括以下步骤：

[0062] 1、蒙古韭幼苗的低温胁迫处理

[0063] 按照实施例1中所示的低温胁迫处理方法，将蒙古韭幼苗置于0～-5℃的温度环境下培养0h、2h、4h、8h、24h、72h和7d。

[0064] 2、TDF124的半定量扩增

[0065] 取步骤1中处理后的蒙古韭叶片，按照实施例1中所示的方法提取叶片总RNA，反转录得cDNA。以上述cDNA作为模板，基于实施例1中TDF124的序列信息设计引物TDF124-F和TDF124-R，TDF124-F的核苷酸序列为5’-TTGGGCTTGGACTGCCCCGGC-3’，TDF124-R的核苷酸序列为5’-TGGGGATACAGGGTGCCAAG-3’。以18srRNA为内參，使用TaKaRa公司出品的SYBR Premix ExTagTM进行定量PCR分析。在20μL体系中加入cDNA模板2μL、正反向引物各O.4μL、SYBRPrimix Ex taqTM(2X)10μL、ROX Reference Dye II(50X)0.4μL、ddH20 6.8μL。扩增程序为：95℃30s；95℃5s,60℃34s,45cycles；95℃15s，60℃lmin，95℃15s；扩增程序为：95℃保持30s；95℃保持5s，60℃保持34s(30个循环)；95℃保持15s，60℃保持1min，95℃保持15s；

[0066] 结果如图3所示，横坐标为低温处理的时间点，纵坐标为TDF124基因的相对表达量；低温处理2h后TDF124基因的表达受到显著诱导，低温处理时间延长可以明显上调TDF124基因的表达，在处理8h后，TDF124基因的表达量达到相对最高值，之后随处理时间的延长TDF124表达相对稳定；结果表明，TDF124基因参与了蒙古韭对低温胁迫的响应过程。TDF124基因对于提高植物在低温胁迫下的耐受性具有重要的研究价值与应用潜力。

[0067] 实施例3蒙古韭低温胁迫相关TDF124的全长cDNA序列扩增

[0068] 本实施例提供一种蒙古韭低温胁迫相关TDF124的全长cDNA序列扩增方法，使用SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(clontech，USA)。具体包括以下步骤：

[0069] 1、准备RACE-Ready cDNA

[0070] (1)向反应管中加入表4所示的试剂，混匀后瞬时离心，得到RACE-Ready cDNA制备所需的Buffer Mix；

[0071] 表4 Buffer Mix

[0072] 5XFirst-Strand Buffer 2.0μLDTT(20mM) 1.0μL
dNTP Mix(10mM) 1.0μL

[0073] (2)另取两个反应管，向其中一个反应管内加入2.0μL实施例1中制备的RNA和1.0μL 5'-CDS Primer A，作为5’-RACE-Ready cDNA的制备体系；向另一个反应管中加入3.0μL实施例1中制备的RNA和1.0μL 3'-CDS Primer A，作为3’-RACE-Ready cDNA的制备体系；

[0074] (3)将步骤(2)中的5'-RACE-Ready cDNA定容至3.75μL；将3'-RACE-Ready cDNA定容至4.75μL；然后将试剂混匀，瞬时离心后在72℃孵育3min，然后42℃冷却2min。最后14,000rpm离心10sec；

[0075] (4)向步骤(3)中得到的5'-RACE-Ready cDNA的反应管中加入1μL SMARTer IIA oligo，混匀后瞬时离心；

[0076] (5)室温下，按顺序混匀表5所示的cDNA制备试剂：

[0077] 表5 cDNA制备试剂

[0078] Buffer Mix(由步骤(1)制得) 4.0μLRNase Inhibitor(40U/μl) 0.25μL
SMARTScribeTMReverse ranscriptase(100U) 1.0μL

[0079] (6)向步骤(3)和步骤(4)中的RNA反应物管中加入步骤(5)中制备的5.25μL的混合物，最终每反应管中cDNA制备体系为10μL，将混合试剂混匀后瞬时离心，42℃孵育90min，72℃加热10min终止反应，得到5'-RACE-Ready cDNA和3'-RACE-Ready cDNA。

[0080] 2、cDNA末端扩增

[0081] (1)按照表6所示的RACE反应试剂，分别准备5'-RACE和3'-RACE所需的反应试剂，按顺序将表4中所示试剂混匀；

[0082] 表6 RACE反应试剂

[0083] PCR-Grade Water 34.5μL10X Advantage 2PCR Buffer 5.0μL
dNTP Mix(10mM) 1.0μL
50X Advantage 2Polymerase Mix 1.0μL

[0084] (2)分别按照表7所示的试剂准备5'-RACE反应体系，按照表8所示的试剂准备3'-RACE反应体系，在0.5ml PCR离心管中按顺序加入试剂，轻柔混匀，然后进行PCR扩增反应；

[0085] 表7 5'-RACE反应体系

[0086]5'-RACE-Ready cDNA 2.5μL
UPM(10X) 5.0μL
GSP1(10μM) 1.0μL
RACE反应试剂(步骤(1)制得) 41.5μL

[0087] 表8 3'-RACE反应体系

[0088]3'-RACE-Ready cDNA 2.5μL
UPM(10X) 5.0μL
GSP2(10μM) 1.0μL
RACE反应试剂(步骤(1)制得) 41.5μL

[0089] PCR扩增程序为：94℃保持30sec，72℃保持3min(5个循环)；94℃保持30sec，70℃保持30sec，72℃保持3min(5个循环)；94℃保持30sec，66℃保持30sec，72℃保持3min(20个循环)。

[0090] 3、根据扩增得到的5’末端序列、3’末端序列和已知的部分序列进行拼接，得到TDF124的全长cDNA序列，利用网站NCBI(http://www.ncbi.njh.Gov)提供的Blast功能进行同源序列比对，根据ORF Finder获得的氨基酸序列进行蛋白序列同源蛋白比对，初步预测得到TDF124与脂肪酸代谢合成相关，将TDF124命名为AmR-FAD。

[0091] 实施例4利用AmR-FAD基因培育转基因耐低温植物

[0092] 1、AmR-FAD基因的克隆

[0093] (1)扩增AmR-FAD基因

[0094] 根据AmR-FAD基因的cDNA序列设计引物对，根据载体pCAMBIA3301的多克隆位点，引物末端分别引入EcoRI和BamHI酶切识别位点，以蒙古韭幼苗的cDNA为模板进行PCR，扩增AmR-FAD基因；其中上游扩增引物AmR-FAD-F的序列如SEQ ID NO.7所示，下游扩增引物AmR-FAD-R的序列如SEQ ID NO.8所示；PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化1.4Kb左右的条带；连T载体(pMD19-T，Takara)，挑阳性克隆，摇菌(37℃，200转/分)，上海生工测序；

[0095] PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化2Kb左右的条带；连T载体(pMD19-T，Takara)，挑阳性克隆，摇菌(37℃，200转/分)，上海生工测序；

[0096] (2)构建重组表达载体

[0097] ①将步骤(1)中测序正确的T载用限制性内切酶EcoRI和BamHI酶切，回收酶切产物；

[0098] ②用限制性内切酶EcoRI和BamHI酶切空载体pCAMBIA3301，回收载体骨架；

[0099] ③用T4连接酶将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架连接；

[0100] ④将步骤③的连接产物热激转化感受态DH5α菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒pCAMBIA3301-AmR-FAD。

[0101] 2、转基因蒙古韭的获得：

[0102] (1)用重组质粒pCAMBIA3301-AmR-FAD转化农杆菌GV3101:

[0103] ①取出冻存的200μL感受态细胞的Eppendorf管，融化后加入5-10μL质粒DNA，轻弹管壁混匀，冰上放20-30min；

[0104] ②将Eppendorf管放入液氮中5min；

[0105] ③取出，将管转入37℃热击5min后，加入1ml YEP液体培养基，28℃低速振荡(150r/min)4h；

[0106] ④10,000r/min，30s，去上清，加100μL YEP液体培养基，悬浮菌体后涂YEP固体平板(含50mg/ml卡那霉素，50mg/ml利福平)；

[0107] ⑤倒置培养皿，28℃培养至转化子长出，菌落PCR鉴定出的阳性克隆于含抗生素的YEP培养基中，28℃活化12天；

[0108] ⑥按1∶100比例接入100ml YEP培养基中，加入乙酰丁香酮(终浓度100μg/ml)，振荡培养至OD600为2.0；

[0109] ⑦5,000r/min转速下离心6min，室温收集菌体，弃上清；

[0110] ⑧将菌体悬浮于转化介质(2.2g/L Ms salt，50g/L蔗糖，0.5g/L MES，10μg/L 6-BA，pH 5.7)中，使OD600为0.6，倒在平皿里，加入14％Silwet L-77，准备植物转化；

[0111] (2)转化受体的获得

[0112] 蒙古韭种子表面灭菌后，以MS+2.5mg/L 2,4-D+0.5mg/L BA+8g/L琼脂为诱导培养基，诱导蒙古韭愈伤组织；以MS+1.0mg/L 2,4-D+2.0mg/L BA+9g/L琼脂作为继代培养基，继代培养的时间间隔为15d时，获得具有较强分化能力的淡黄色、紧密的愈伤组织；

[0113] (3)转化

[0114] 使用步骤(1)制得的菌体悬液感染愈伤组织30min，共培养3d。后用无菌水冲洗愈伤3～5次，然后在含头孢噻肟钠300mg/L的无菌水中浸泡30min，最后冲洗3次，置于无菌滤纸上晾干，在继代培养基上培养10d以恢复愈伤组织的生活力。

[0115] 将转化所得的愈伤组织置于MS+2.0mg/L BA的分化培养基上进行分化培养，然后于不添加任何激素的MS培养基上进行生根培养，最终得到转基因蒙古韭植株。

[0116] 3、转基因植物的PCR鉴定

[0117] 提取转基因蒙古韭的RNA，同时提取野生型蒙古韭的RNA为对照，反转录成cDNA，RT-PCR检测AmR-FAD基因的表达情况，转基因蒙古韭中AmR-FAD表达量显著高于野生型蒙古韭，因此，所制备的转基因蒙古韭为高基因转化率的转基因植物。

[0118] 4、转基因植物的耐寒性鉴定

[0119] 种植转基因蒙古韭，同时种植野生型为对照，生长3周后4℃冷驯化一周，然后-12℃处理24h，统计存活植株，比较成活率；低温培养后，野生型蒙古韭成活率为49％，转基因蒙古韭成活率为92％，说明利用本发明的基因能够培育出具有高抗寒性的转基因作物。

[0120] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

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