绿脓杆菌的AhpF蛋白质的新活性及其应用
阅读：656发布：2020-05-11
专利汇可以提供绿脓杆菌的AhpF蛋白质的新活性及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种来源于绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的AhpF 蛋白质 及其应用，所述AhpF蛋白质具有硫 氧 还蛋白还原酶、过氧化物酶及分子伴侣活性。利用本发明的绿脓杆菌的AhpF的新活性能够制备出对氧化胁迫或热胁迫等多种 环境胁迫 具有强的耐性的 植物 体，从而能够在增加 农作物 的生产性及大量生产有用成分方面做出贡献，并且能够通过开发出对高温和干燥具有抵抗性的转化植物体来防止沙漠化和环境污染。，下面是绿脓杆菌的AhpF蛋白质的新活性及其应用专利的具体信息内容。
1.一种绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的AhpF蛋白质变异体，其特征在于，所述绿脓杆菌的AhpF蛋白质变异体具有硫氧还蛋白还原酶、硫氧还蛋白、过氧化物酶及分子伴侣活性，并且由SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的第342位的氨基酸半胱氨酸被丝氨酸或丙氨酸取代的氨基酸序列组成。
2.一种绿脓杆菌的AhpF蛋白质变异体的高分子性结合体，其特征在于，所述绿脓杆菌的AhpF蛋白质变异体的高分子性结合体为权利要求1中所述的AhpF蛋白质变异体的高分子性结合体，分子量为500-2000kDa。
3.一种绿脓杆菌的AhpF蛋白质变异体的低分子性结合体，其特征在于，所述绿脓杆菌的AhpF蛋白质变异体的低分子性结合体为权利要求1中所述的AhpF蛋白质变异体的低分子性结合体，分子量为100-250kDa。
4.一种用于增强拟南芥的环境胁迫抵抗性的组合物，其特征在于，所述组合物包含一种载体，所述载体导入有编码权利要求1中所述的绿脓杆菌的AhpF蛋白质变异体的多核苷酸。
5.一种农杆菌属(Agrobacterium)微生物，其特征在于，所述农杆菌属微生物转化有表达权利要求1所述的绿脓杆菌的AhpF蛋白质变异体的重组载体。
6.一种制备具有环境胁迫抵抗性的植物体的方法，其特征在于，所述方法是将包含有编码权利要求1所述的AhpF蛋白质变异体的多核苷酸的重组载体转化到植物体中。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法是将所述重组载体导入到根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中，并将其转化到植物体中。
绿脓杆菌的AhpF蛋白质的新活性及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种来源于绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的AhpF蛋白质及其应用，所述AhpF蛋白质具有硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase；TR)、硫氧还蛋白(thioredxoin；Trx)、过氧化物酶(peroxidase；Prx)及分子伴侣(chaperone)活性。更具体地，本发明涉及一种具有环境胁迫耐性的生物体及其制备方法。所述具有环境胁迫耐性的生物体是通过重新确认了绿脓杆菌的AhpF蛋白质除了具有已知的硫氧还蛋白还原酶功能以外，还具有过氧化物酶及分子伴侣活性的基础上，并利用该新的活性将编码所述AhpF蛋白质的基因导入到生物体中而制备的。
背景技术
[0002] 在有氧代谢过程或生物个体暴露在多种胁迫条件下产生活性氧(ROS)(Finkel T.，Curr.Opin.Cell Biol.15：247-254，2003)。这种活性氧会对生物性巨分子(蛋白质、脂质、核酸等)带来阻碍氧化功能或结构变化等的严重危害，并成为诸多疾病的原因(Neumann et al.，Nature，424：561-565，2003)。所有的有氧生物体为了使自身免受因氧化胁迫或活性氧而引起的蛋白质的变性(denaturation)，以及为了使自身免受由上述变性诱导的蛋白质的聚集(aggregation)的影响而具有多种抗氧化蛋白质和热冲击蛋白质等多种形态的分子性分子伴侣。其中，具代表性的是革兰阴性菌，然而通过院内感染(nosocomial infections)被发现的、作为人类的伺机性致病菌(opportunistic human pathogen)的绿脓杆菌对活性氧具有强力的防御机制。作为具体的防御机制，可以举例如，具有2个超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、3个过氧化氢酶(catalase，CAT)及4个Ahp还原酶(reductase)。
[0003] 另外，据报道，所述Ahp还原酶系统在除了绿脓杆菌的多种微生物中起到对氧化胁迫的防御系统的作用。Ahp还原酶系统通过催化有机过氧化物或氢过氧化物的NAD(P)H的依赖性还原而在生物体中起到去除有害的活性氧的功能。据报道，Ahp还原酶系统通常由AhpF-AhpC构成，其中，AhpF(烷基过氧化氢还原酶亚基F，alkyl hydroperoxide reductase subunit F)由1566bp的多核苷酸、521个氨基酸组成，其分子量为56kDa。
[0004] 如下图所示，已知在现有的大肠杆菌(E.coli)或鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)等中被报道过的Ahp还原酶系统中的Ahpc和AhpF分别起到了分离的作用。
[0005]
[0006] 即，大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌等的一般的AhpF起到从NAD(P)H接受电子并向AhpC传递电子的还原酶的作用，AhpC起到去除过氧化氢的过氧化物酶的作用。因此，一直认为为了有效地去除活性氧，AhpF和AhpC都是必需的。
[0007] 然而，本发明人第一次确认了绿脓杆菌的AhpF不仅具有已知为现有微生物的一般AhpF功能-还原酶活性，而且还同时具有已知为AhpC的活性的过氧化物酶活性及分子伴侣活性等，即，最先确认了一个AhpF蛋白质具有多种功能，并且确认了这种AhpF蛋白质的活性依赖于结构，从而完成了本发明。
发明内容
[0008] 要解决的技术问题
[0009] 本发明的一个目的在于，提供一种具有硫氧还蛋白还原酶、过氧化物酶及分子伴侣活性的AhpF蛋白质。
[0010] 本发明的另一目的在于，提供一种绿脓杆菌的AhpF蛋白质的硫氧还蛋白还原酶活性得到增加的变异体、分子伴侣活性得到增加的所述AhpF的高分子性结合体、以及过氧化物酶活性得到增加的AhpF的低分子性结合体。
[0011] 本发明的又一目的在于，提供一种包含编码所述绿脓杆菌的AhpF蛋白质的多核苷酸的用于增强生物体环境胁迫抵抗性的组合物及转化了所述多核苷酸的具有环境胁迫抵抗性的植物体。
[0012] 技术方案
[0013] 为了解决本发明的一个目的，本发明提供一种绿脓杆菌的AhpF蛋白质，所述蛋白质同时具有硫氧还蛋白还原酶、硫氧还蛋白、过氧化物酶及分子伴侣活性。
[0014] 本发明的绿脓杆菌的AhpF蛋白质优选具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，但并不限定于此。
[0015] 为了解决本发明的另一目的，本发明提供一种绿脓杆菌的AhpF蛋白质的变异体，所述绿脓杆菌的AhpF蛋白质的变异体是SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的第342位的氨基酸半胱氨酸(cysteine)被丝氨酸(serine)或丙氨酸(alanine)取代的变异体。
[0016] 另外，本发明提供一种所述AhpF蛋白质的高分子性结合体及低分子性结合体。所述AhpF蛋白质的高分子性结合体的特征为，其分子伴侣活性得到增加，分子量至少为500-2000kDa。另外，所述AhpF蛋白质的低分子性结合体的特征为，其过氧化物酶活性得到增加，分子量至少为100-250kDa。
[0017] 为了解决本发明的又一目的，本发明提供一种用于增强生物体的环境胁迫抵抗性的组合物，所述组合物包含一种载体，所述载体导入有编码绿脓杆菌的AhpF蛋白质的多核苷酸。
[0018] 另外，本发明提供一种转化了表达绿脓杆菌的AhpF蛋白质的重组载体的农杆菌属(Agrobacterium)微生物。本发明还提供一种转化植物体，所述转化植物体过量表达本发明所述的AhpF蛋白质，从而具有环境胁迫抵抗性。
[0019] 另外，本发明提供一种制备具有环境胁迫抵抗性的植物体的方法，其特征为，所述方法是将包含有编码所述AhpF蛋白质的多核苷酸的重组载体转化到植物体中。
[0020] 下面，将详细说明本发明。本发明中所使用的术语、技术等在没有被具体限定的情况下，以本发明所属技术领域中通常使用的意思来定义。另外，将对重复的说明进行省略。
[0021] 本发明的一个实施方式涉及一种绿脓杆菌的AhpF蛋白质，所述绿脓杆菌的AhpF蛋白质同时具有硫氧还蛋白还原酶、硫氧还蛋白、过氧化物酶及分子伴侣活性。所述绿脓杆菌的AhpF蛋白质优选具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，但并不限定于此。即使所述AhpF蛋白质的氨基酸的一部分发生变形或受到损失，如果如本发明一样同时具有硫氧还蛋白还原酶、过氧化物酶及分子伴侣活性，并且是普通的技术人员能够容易地导出的、具有90％以上的同源性的绿脓杆菌的AhpF蛋白质，则均包括在本发明的范围内。
[0022] 已知现有的绿脓杆菌的AhpF蛋白质只具有硫氧还蛋白还原酶(TR)及硫氧还蛋白(Trx)活性，本发明第一次确认了绿脓杆菌的AhpF不仅具有TR及Trx活性，还具有已知为作为区别功能的AhpC的过氧化物酶及分子伴侣活性(参照图1)。在本发明的一实施例中确认了绿脓杆菌的AhpF蛋白质同时具有硫氧还蛋白还原酶、硫氧还蛋白、过氧化物酶及分子伴侣的支持酶(Holdase)及折叠酶(Foldase)功能(参照图2～图5)。
[0023] 过氧化物酶活性(Peroxidase activity)是指下述过程：还原型烟酰胺腺嘌呤二+ +核苷酸磷酸(NADPH)转化为NADP的同时，将电子(H)传递给硫氧还蛋白还原酶，所述TR再次将电子传递给硫氧还蛋白的同时被氧化，接受到TR传递的电子而被还原的Trx将电子传递给Prx，而Trx被氧化，被还原的Prx将H2O2分解为O2及H2O。
[0024] 另外，分子伴侣是与蛋白质的折叠(folding)有关的蛋白质，例如是指，当蛋白质受到热冲击(heat shock)等胁迫时，蛋白质处于完整折叠状态的3元结构会被打开，从而无法正常起到自身的作用，这时被命名为分子伴侣的组群的蛋白质识别出上述被打开的蛋白质并与其结合，从而起到防止蛋白质的变性，或者为其制造能够重新再进行折叠的良好环境的蛋白质。分子伴侣活性(molecular chaperone activity)分为支持酶(Holdase)和折叠酶(foldase)活性。例如，支持酶活性是指具有以下作用。当蛋白质暴露在胁迫(氧化胁迫、热胁迫)中时，会发生变性而使得处于折叠状态的3元结构被部分打开，使疏水性氨基酸残基暴露出来，而这种过程加重会使得变性的蛋白质不规则地凝聚在一起而变成结合体(aggregates)而被蛋白质分解酶(protease)分解而消失，在此时，分子伴侣蛋白质(sHSPs，DnaJ)会与因胁迫而被部分打开的蛋白质的疏水性氨基酸进行结合，从而防止结合体的生成，并起到使其重新恢复到原来的3元结构的环境的作用，折叠酶活性是指具有以下功能，当以mRNA作为模板通过核糖体(ribosome)而合成为新的蛋白质时，蛋白质将以原定的3元结构形成折叠，此时，分子伴侣蛋白质(GroEL/ES，DnaK/J/E)与新伸长的氨基酸链或变形的蛋白质进行结合而形成能够使其折叠成正确的三元结构的环境，起到帮助的作用。
[0025] 本发明的另一实施方式涉及一种所述绿脓杆菌的AhpF蛋白质的高分子性结合体及低分子性结合体。本发明的绿脓杆菌的AhpF蛋白质呈具有多种分子量的人-低聚物复合体的结构(homo-oligomeric complex)，在高分子性结合体中分子伴侣功能占优势。尤其是确认了分子伴侣的活性得到了增加。在本发明的一实施例中确认了施加热冲击时，将变成高分子性结合体结构，分子伴侣功能中的支持酶活性得到了增加(参见图8及图10)。另外，确认了本发明的AhpF在低分子性结合体(Low molecular weight，LMW)中过氧化物酶活性占优势。所述AhpF蛋白质的高分子性结合体的特征为，其分子量至少为500-2000kDa。即，表明了所述高分子性结合体的AhpF蛋白质的单体具有至少大于四聚体(tetramer)的结构。优选地，所述高分子性结合体的分子量最小可以为500-2000kDa。
[0026] 另外，所述AhpF蛋白质的低分子性结合体的特征为，其分子量至少为100-250kDa(二聚体-四聚体)。本发明中为了分析AhpF蛋白质的结构而实施的一实施例中，当没有施加高温胁迫时，最为普通的结构为四聚体。
[0027] 本发明的又一实施方式涉及一种绿脓杆菌的AhpF蛋白质的变异体。所述AhpF蛋白质的变异体可以为在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中第342位的氨基酸半胱氨酸被丝氨酸或丙氨酸取代的变异体，但并不限定于此。本发明的AhpF蛋白质中，在氨基酸末端包含有Trx结构域，在羧基末端包含有TR结构域(参见图11)。所述第342位的半胱氨酸包含在TR结构域中。本发明的一实施例中示出了所述AhpF蛋白质的变异体的硫氧还蛋白还原酶活性与野生型相比约高出2倍以上。另外，当TR结构域中其它半胱氨酸，即第344位或第347位的半胱氨酸被丝氨酸取代时，反而几乎没有显示出TR活性。
[0028] 本发明通过确认出所述源自绿脓杆菌的AhpF蛋白质除了起到已知的还原酶功能以外，还能够起到过氧化物酶及分子伴侣功能的新的事实，涉及一种上述这种绿脓杆菌的AhpF蛋白质的特性的应用。
[0029] 与所述AhpF蛋白质的特性的应用相关的本发明的另一实施方式为，涉及一种用于增强生物体的环境胁迫抵抗性的组合物，所述组合物包含一种载体，所述载体导入有编码绿脓杆菌的AhpF蛋白质的多核苷酸。在所述组合物中，作为用于导入编码所述AhpF蛋白质的多核苷酸的载体，可以使用本技术领域中通常使用的载体，优选使用pCAMBIA载体。另外，所述载体可以包含与导入的AhpF的多核苷酸以可操作的方式连接的启动子及选择标记基因( )。所述与AhpF的多核苷酸以可操作的方式连接的启动子能够使AhpF进行表达，或增强AhpF的表达。导入到所述载体中的编码绿脓杆菌的AhpF蛋白质的多核苷酸优选为对由SEQ ID NO：1构成的AhpF蛋白质或本发明的SEQ ID NO：1的第342位的半胱氨酸变异为丝氨酸或丙氨酸的绿脓杆菌的AhpF蛋白质进行编码的多核苷酸，但并不限定于此。本发明的由SEQ ID NO：1构成的AhpF蛋白质同时具有硫氧还蛋白还原酶、硫氧还蛋白、过氧化物酶及分子伴侣活性，从而能够对生物体的环境胁迫显示出优异的抵抗性。另外，SEQ ID NO：1的第342位的半胱氨酸变异为丝氨酸或丙氨酸的绿脓杆菌的AhpF蛋白质的硫氧还蛋白还原酶活性比野生型增加2倍以上，使得生物体能够具有更强的对环境胁迫的抵抗性。另外，由于本发明的另一绿脓杆菌的AhpF蛋白质的高分子性结合体中分子伴侣功能占优势，因此能够利用这种特性来将其有效地用于增加生物体对多种环境胁迫(热冲击、氧化胁迫、病原菌等)的抵抗性方面。
[0030] 另外，本发明涉及一种农杆菌属微生物，所述农杆菌属微生物是转化了表达所述绿脓杆菌的AhpF蛋白质的重组载体。将导入有所述AhpF基因的重组载体导入到农杆菌属微生物中，从而转化农杆菌属微生物，以使其能够表达AhpF蛋白质。所述绿脓杆菌的AhpF蛋白质优选为由SEQ ID NO：1构成的AhpF蛋白质，或本发明的SEQ ID NO：1的第342位的半胱氨酸变异为丝氨酸或丙氨酸的绿脓杆菌的AhpF蛋白质。所述农杆菌属微生物优选为根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumerfaciens)，但并不限定于此。此外，不仅可以使用农杆菌属微生物，还包括能够转化植物体的所有微生物。
[0031] 另外，本发明的另一实施方式涉及一种转化植物体，所述转化植物体通过过量表达AhpF蛋白质而具有环境胁迫抵抗性。所述植物体可以为双子叶植物或单子叶植物，优选为拟南芥(Arabidopsis thaliana)、白菜(Brassica rapa)或稻(Oryza sativa)。但并不限定于此，能够使本发明的AhpF蛋白质过量表达的可转化的植物体均包括在本发明中。在所述植物体中能够过量表达的绿脓杆菌的AhpF蛋白质优选为由SEQ ID NO：1构成的AhpF蛋白质，或本发明的在SEQ ID NO：1的第342位半胱氨酸变异为丝氨酸或丙氨酸的绿脓杆菌的AhpF蛋白质。
[0032] 另外，优选通过将表达本发明的AhpF蛋白质的农杆菌属微生物导入到植物细胞系中而生成所述可转化植物体，但并不限定于此。
[0033] 另外，本发明涉及一种制备具有环境胁迫抵抗性的植物体的方法，其特征为，所述方法是将包含有编码本发明的所述AhpF蛋白质的多核苷酸的重组载体转化到植物体中。包含在所述重组载体中的编码绿脓杆菌的AhpF蛋白质的多核苷酸优选为对由SEQ ID NO：1构成的AhpF蛋白质或本发明的SEQ ID NO：1的第342位的半胱氨酸变异为丝氨酸或丙氨酸的绿脓杆菌的AhpF蛋白质进行编码的多核苷酸，但并不限定于此。
[0034] 可以利用土壤杆菌素-介质转化法来实现所述植物体的转化，可以使用文献(Horsch et al.，Science 227：1229-1231，1985)中例示的方法。在所述制备方法中，优选将所述重组载体导入到根癌土壤杆菌中，并将其转化到植物体，但并不限定于此。除了可以使用根癌土壤杆菌以外，能够转化植物体的优选微生物均可以使用，例如可以使用发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)等。
[0035] 有益效果
[0036] 在本发明中，利用绿脓杆菌的AhpF蛋白质的新的活性能够制备对氧化胁迫或热胁迫等多种环境胁迫具有强的耐性的植物体，从而能够在增加农作物的生产性及大量生产有用成分方面做出贡献。另外，对于开发能够适应因地球温室效应所导致的干旱、干燥等严重的气象环境变化的植物体方面，也能够有效地被利用。由此，通过开发出高温及干燥抵抗性转化植物体，不仅能够防止沙漠化和环境污染，而且通过将其导入到有用农作物中，还能够帮助解决人类的粮食短缺问题。附图说明
[0037] 图1为将本发明的绿脓杆菌的AhpF(PaAhpF)活性与现有的大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌中已知的AhpF和AhpC活性进行比较而显示的模拟图。
[0038] 图2是示出了根据本发明的AhpF的浓度的过氧化物酶活性的图。
[0039] 图3是示出了绿脓杆菌的AhpF和AhpC的过氧化物酶活性的影响力的图。
[0040] 图4是示出了根据本发明的AhpF的浓度的分子伴侣的(a)支持酶及(b)折叠酶的活性的图。
[0041] 图5是示出了本发明的AhpF的(a)TR及(b)Trx的活性的图。
[0042] 图6是本发明的AhpF蛋白质的结构的模拟图，其示出了用于制备本发明的包含在各末端的氨基酸的变异体的克隆方法的图。
[0043] 图7为用于说明本发明的AhpF的高分子性结合体或低分子性结合体的形成的AhpF的功能转换的图。
[0044] 图8示出了为了分析本发明的AhpF的结构而使绿脓杆菌的AhpF的重组蛋白质进行表达，并通过尺寸排阻层析法(size exclusion chromatography)来显示出精制的结果的图表(a)，以及利用自然聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)来确认快速蛋白液相色谱(FPLC)的各峰的级分的结果。
[0045] 图9示出了根据AhpF的高分子性结合体(HMW)及低分子性结合体(LMW)的结构的过氧化物酶活性(a)及分子伴侣的支持酶的活性(b)的结果。
[0046] 图10为对AhpF蛋白质分别施加热冲击时，利用尺寸排阻层析法来显示精制的结果的图，其显示出根据热冲击而带来的AhpF的结构方面的转换。
[0047] 图11示出了本发明的AhpF的结构及制得的变异体。在图11中，AhpF(PA)表示本发明的绿脓杆菌，AhpF(PP)表示恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。
[0048] 图12为示出本发明的AhpF的第342位半胱氨酸的变异体的TR活性比野生型增加2倍以上的图表。
[0049] 图13为示出被转化为过量表达本发明的AhpF蛋白质的拟南芥具有热抵抗性的照片，示出了通过对转化了包含AhpF基因的载体的拟南芥的T3代及野生型进行高温处理(42℃)2个小时后经过7天后的状态的照片。
[0050] 图14为示出了通过对野生型拟南芥及被转化为过量表达本发明的AhpF蛋白质的拟南芥在37℃下施加胁迫4天后，所述转化的拟南芥是否具有抵抗性的照片。
具体实施方式
[0051] 下面，通过实施例来更加详细地说明本发明。本发明可以以多种不同的形式体现，并不限定于在此说明的实施例。
[0052] 〈实施例1〉克隆绿脓杆菌的AhpF基因
[0053] 利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)将从绿脓杆菌PAO1的基因组DNA得到的PaAhpF基因克隆到作为克隆载体(cloningvector)的pGEM T-easy载体上，并利用碱基序列分析(Sequencing analysis)来确认了基因。为了克隆PaAhpF基因，在如下所述的条件下实施了PCR。对10ng的基因组DNA、0.2μM的脱氧核糖核苷三磷酸(Dntp)、20pmol的正向引物、20pmol的反向引物、1单位(unit)的Taq聚合酶及20μl的蒸馏水混合物实施1周期的预变性(94℃，一分钟)、35周期的变性(94℃，30秒)、退火(50℃，45秒)、延长(72℃，45秒)，以及1周期的延长(72℃，10分钟)，从而使其进行反应。此时，所述正向引物为PaAhpF-F(NdeI)5`-AAGCTCATATGTTGGACGCCAATC-3`(SEQ ID NO：2)，所述反向引物为PaAhpF-R(BamH1)5`-GGGATCCTCACTCCGGCGCG-3`(SEQ ID NO：3)。
[0054] 〈实施例2〉绿脓杆菌的AhpF蛋白质的分离及精制
[0055] 为了分离并精制AhpF蛋白质，利用限制酶的位置将在所述〈实施例1〉中被克隆到pGEM T-easy载体上的PaAhpF基因亚克隆(sub-cloning)到表达载体pET28a上。通过碱基序列分析来确认了pET28a：：PaAhpF的亚克隆。在大肠杆菌(BL21(DE3))中，利用pET28a载体中的T7启动子系统(promoter system)来添加0.2mM的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)来过表达PaAhpF蛋白质。利用镍-氨三乙酸螯合树脂(Ni-NTA chelate resin)来分离出粘有6个组氨酸的过表达的PaAhpF蛋白质。
[0056] 蛋白质的精制过程按照下述方式来实施。在装有500ml的LB的2L三角烧瓶中接种1/100种菌培养(BL21(DE3)中的pET28a：：PaAhpF)后，在30℃下以120rpm的转速来进行培养。在600nm的吸光度下培养到0.5后，最终添加0.2mM的IPTG，并在30℃下用120rpm的转速诱导PaAhpF蛋白质的表达4个小时。进行离心分离(6000rpm，10分钟，4℃)而提取出细胞后，利用PBS缓冲液(137mM NaCl、27mM KCl、10mM Na2HPO4、2mM KH2PO4)来对细胞进行溶解。利用超声波破碎仪(sonicator)来粉碎细胞后，对所述溶解物进行离心分离(15000rpm，40分钟，4℃)而只分离出上层液。利用亲和层析法(Affinity chromatography)在事先进行了平衡化的NTA-螯合树脂中添加细胞溶解物而在树脂上结合粘有组氨酸的被过表达的PaAhpF蛋白质后，用凝血酶(Thrombin)进行处理，从而精制分离出PaAhpF蛋白质。将精制分离出的蛋白质移到膜管(membrane tube)中后，用1L的50mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)(pH8.0)缓冲液反复透析3次并冷冻保存。利用如此分离并精制得到的蛋白质对酶活性进行了分析。
[0057] 〈实施例3〉对于本发明的AhpF蛋白质的酶功能的分析
[0058] 〈3-1〉测定过氧化物酶活性
[0059] 为了测定过氧化物酶的活性，利用了Ahp还原酶系统。过氧化氢的消除是通过在340nm下的吸光度的变化来间接地测定了NADH氧化为NAD+的程度。在340nm下测定了500μl的反应液(0.3mM NADH、PaAhpF(1～4μM)、PaAhpC(1～4μM)、1mM的H2O2)的吸光度的变化，共测定10分钟。
[0060] 〈3-2〉测定硫氧还蛋白还原酶的活性
[0061] 为了测定硫氧还蛋白还原酶的活性，利用了二硫代二硝基苯甲酸(Di-thio-bisnitrobenzoic acid，DTNB)的还原。具体地，对于硫氧还蛋白还原酶活性的测定，首先，作为对照组测定了在没有AhpF状态下，DTNB在412mm下被还原而成为2个分子的2-硝基硫代苯甲酸阴离子(2-nitro thiobenzoate anion，TNB)的还原率。在412nm下测定总500μl的反应液(50mM的硝酸钾缓冲液(pH8.0)、2mM的EDTA、5mM DTNB、0.3mM的NADH、AhpF(0.1～1μM)的吸光度的变化，共测定5分钟。将酵母的硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin Reductase(yTR))用作阳性对照组。
[0062] 〈3-3〉测定硫氧还蛋白的活性
[0063] 利用胰岛素还原(Insulin reductase)来测定了硫氧还蛋白的活性。通常，胰岛素以α和β链通过二硫键(Disulfide bond)而结合的形态存在，当硫氧还蛋白还原二硫键时，β链会变性而变成凝聚体。通过在650nm下测定吸光度而获知了这种凝聚体的形成程度。在650nm下测定总500μl的反应液(100mM的磷酸钾缓冲液(pH7.5)、2mM的EDTA、500μg的胰岛素、2mM二硫苏糖醇(DTT)、PaPrx(1～10μM))的吸光度的变化，共测定30分钟。
[0064] 〈3-4〉测定分子伴侣的活性
[0065] 分子伴侣的活性测定通常分为支持酶和折叠酶活性，本实验中对上述两种活性均进行了分析。首先，对于支持酶的活性分析，将对热胁迫敏感的苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase，MDH)加热到43℃时，会引起变性而产生MDH的聚集(aggregation)，从而使吸光度增加。然而，在与具有分子伴侣活性的蛋白质共存的状态下，能够防止MDH变性而抑制凝聚体的形成，从而不会使吸光度增加。本实验利用这种原理，在340nm下测定了总反应液(50mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液(Hepes buffer)(pH7.5)、52μg的MDH，多种浓度的PaAhpF)的吸光度的变化，共测定15分钟。
[0066] 对于折叠酶的活性测定，测定了用胍-HCl(guanidine-HCl)处理葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)进行变性后而恢复为G6PDH的活性。测定了总反应液再次折叠(refolding)的程度。具体地，在变性缓冲液条件(50mM的三羟甲基氨基甲烷-HCl)(Tris-HCl(pH7.5)、4M的胍-HCl)下，在室温下使40μM的G6PDH产生化学变性后，在再生缓冲液(50mM的Tris-HCl(pH7.5)、多种浓度的AhpF蛋白质或GroEL蛋白质、10mM的ATP、10mM KCl，2.5mM MgCl2)中稀释50倍，反应6小时、12小时、24小时，并测定了反应6小时、12小时、24小时后的再生的G6PDH活性。具体地，对于在总500μl的反应液(50mM的Tris-HCl(pH7.5)、1mM的NADP、2mM的葡萄糖-6-磷酸(Glucose-6-P)、4nM的再生的G6PDH)中5分钟内生成的NADPH，通过在340nm下测定的吸光度来计算出。将GroEL用作阳性对照组。
[0067]
[0068] 如在图2～5中能够确认的那样，分析AhpF的酶活性的结果为，可以确认绿脓杆菌的AhpF同时具有硫氧还蛋白还原酶、硫氧还蛋白、过氧化物酶及分子伴侣活性。
[0069] 〈实施例4〉分析本发明的AhpF蛋白质的结构变化及由此带来的活性
[0070] 为了分析AhpF的蛋白质结构，使用了尺寸排阻层析法(Sise Exclusion Chromatography；SEC)。具体地，利用快速蛋白液相色谱(FPLC)(Amersham Biosciences；AKTA)以一定的速度(0.5ml/min)使AhpF蛋白质和Tris-HCl(pH8.0)缓冲液通过休珀代克斯(Superdex)200 10/300GL柱，然后分别收取以每小时0.5ml的量通过柱的缓冲液和AhpF蛋白质。然后，根据在280nm下的吸光度下所检测出的蛋白质峰来大致分为3组(F1、F2、F3)并进行分级。为了验证蛋白质活性，浓缩了各级分蛋白质。
[0071] 〈实施例5〉制备AhpF蛋白质的变异体及对其活性进行分析
[0072] 如图6及图11所示，制备了具有AhpF蛋白质的TR区域(AhpF_C)、Trx区域(AhpF_N)的突变及活性半胱氨酸残基被丝氨酸取代的多种突变体(C128S、C131S、C342S、C344S、C347S、C342A、C128/131S、C342/344/347S、所有的C～S_AhpF)。根据〈实施例2〉中的方式，通过亲和层析法来精制分离出该突变体的各蛋白质，并通过与〈实施例3〉的方法相同的方法来测定了各酶的活性。
[0073] 结果为，其它突变体的TR活性相比于野生型均得到了降低，而C342S及C342A突变体的活性比野生型的增加了两倍以上(参照图12)。
[0074] *〈实施例6〉制备转化了导入有AhpF的基因的重组载体的拟南芥，并确认该拟南芥对热冲击的抵抗性
[0075] 为了制备PaAhpF过表达的转化拟南芥，将PaAhpF基因构建(construction)在作为转化载体的pCAMBIA1302载体上(Pcambia1302：：PaAhpF)，并将该构建体(construct)转化到农杆菌属上后转化到拟南芥上。为了确认转化体，选出在潮霉素选择培养基中具有抵抗性的转化体，并通过反复筛选而确保了第3代转化体(T3)。另外，通过蛋白免疫印迹(western blotting)实验来确认了在T3转化体中过表达的PaAhpF蛋白质。在培养基和土壤中对选出的PaAhpF过表达转化拟南芥的热冲击抵抗性进行了验证。在培养基中对热冲击的抵抗性实验的过程如下所述。将于22℃下培养10天的拟南芥在42℃下施加热冲击2个小时后，在22℃下观察了恢复程度3～7天。在土壤中对热冲击的抵抗性实验过程如下所述。将在22℃下培养3周的拟南芥在37℃下施加热冲击4天后，在22℃下观察了恢复程度5天。PaAhpF过表达的转化植物体，不仅在培养基中显示出对热的抵抗性，在土壤中也显示出了对热的抵抗性(参照图13、图14)。
[0076] 虽然结合附图对本发明的几个实施例进行了说明，但是本发明所属技术领域的具有通常的知识的技术人员应知道在不超过本发明的原则或主旨的范围内，可以对本发明的实施例进行变形，本发明的范围由附加的权利要求所决定。
[0077] 【序列目录预制文本】
[0079] 序列表2为绿脓杆菌的AhpF的正向引物。
[0080] 序列表3为绿脓杆菌的AhpF的反向引物。
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