技术领域
[0001] 本
发明属于果树脱毒种苗培育技术领域，特别涉及一种苹果组培苗锈果类病毒脱毒方法。
背景技术
[0002] 苹果作为我国农业部规划的11大优势农产品之一，目前我国栽培总面积3150万亩、总产量2050万吨，总面积以及总产量分别占世界39.8％、34.7％，栽培面积和产量高居世界第一，是世界上最大的苹果生产国。苹果生产在促进我国农业增效、农民增收和农业经济发展中具有举足轻重的地位。
[0003] 苹果锈果病又称花脸病、裂果病,是危害苹果、梨等仁果类果树的主要病毒,在我国各苹果产区均有发生，其中陕西、晋中部分果园病株率高达60％～80％。苹果锈果病是由类病毒引起的一种病毒病。类病毒(viroid)是一种最小的具有侵染性的致病病原，它是由246-371核苷酸组成的单链、共价闭合的环状RNA，具有一个小的富含GC的基因组，不能编码蛋白，能引起许多经济作物产生严重病害。在苹果生产中存在的苹果锈果类病毒、苹果缩果类病毒、苹果凹果类病毒，这3种都属于苹果锈果类病毒属、Pospiviroidae科。其中苹果锈果类病毒曾对中国和日本的苹果和梨生产造成了重要的经济损失。
[0004] 苹果锈果病的症状主要表现在果实上，有些品种的
幼苗和枝干上也可表现症状。果实上的症状主要有三种类型，即锈果型、花脸型及混合型。苹果品种间对锈果病的抗性存在差异。黄魁、黄龙等品种高度耐病，不表现明显症状；金冠、祝光等品种较耐病，发病后损失较小；红玉等品种轻度感病；倭锦、印度、大国光中度感病；而国光、红星、元帅、青香蕉等高度感病，发病后几乎完全失去经济价值。而且苹果树感染后，严重影响树体的生长，降低果实产量和品质，阻碍根系对
土壤营养物质的吸收和利用，对果树生产带来危害严重。由于类病毒在寄主
植物细胞核中复制和累积，在感病寄主的叶、茎、皮、
砧木，以及果实的表皮、果肉和
种子中均可检测出类病毒，属于系统感染，一旦感染便会终身带毒，长期受害，常规防治无法将病毒病根除，目前尚无有效的药剂防治和
治疗方法，因此，培育脱毒苗木是防治苹果病毒病的唯一有效措施。
[0005] 无毒苗木可应用于任何苹果栽培地区，不受自然条件的约束，对果树栽培技术也无特殊要求，果树投产以后，不必增加任何防治措施和生产
费用，便可明显改善品质，提高产量，获得显著的经济效益。目前，应用于果树脱毒的方法主要有
热处理、茎尖组织培养、热处理结合茎尖组织培养、茎尖微体嫁接(MGST)、花药培养、抗病毒药剂、超低温结合茎尖组织培养法。但是在文献报道中，这些方法的对苹果锈果类病毒脱毒效率较低，得到的脱毒品种有限。
[0006]
申请号为“201410608611”，名称为“苹果组培苗热处理结合化学处理的脱毒方法”的中国发明
专利，公开了将苹果组培苗茎尖接种于含15-25μg/mL利巴韦林的培养基中，升温至34-36℃条件下进行恒温热处理。但其
说明书中未说明利用此方法进行苹果锈果类病毒脱除效果及其进行病毒处理的实验材料品种。
发明内容
[0007] 为了解决以上
现有技术中对富士苹果组培苗锈果类病毒脱除效果差，生产中富士苹果脱毒种苗较少的问题，本发明提供了一种对富士苹果组培苗锈果类病毒脱除效果好，植株存活率高，所需时间短的脱毒方法。
[0008] 本发明提供的技术方案如下：
[0009] 一种富士苹果组培苗锈果类病毒脱除方法，其特殊之处在于：包括以下步骤：
[0010] (1)离体植株无菌体系的建立：采集外植体幼芽，经75％酒精和0.1％升汞消毒后；将幼芽接种于灭菌后的初代培养基中，然后置于人工
气候室中培养至18-20d，建立离体植株无菌
营养繁殖体系；
[0011] (2)继代培养：将步骤(1)中获得的离体植株转接继代培养基进行增殖培养，经过30d后可产生大量丛生芽；继代培养：在无菌条件下，将成功入瓶的试管苗转移至继代培养基中，连续继代培养多代，以繁殖获取足量的丛生芽，用于各种脱毒处理；
[0012] (3)茎尖组织的超低温处理结合化学处理脱毒：将步骤(2)中的继代培养的带毒离体植株转入MS+6-BA 1.0mg/mL+IBA 0.2mg/mL培养基上培育20～25d，取株高1.0～2.0cm的再生芽，将其分成单芽后，接种到MS+0.4mol/L
蔗糖+0.4mol/L甘油的培养基上，培养2d；剥取2mm茎尖经过超低温(-196℃)处理后放入含20～25ug/L利巴韦林茎尖分化培养基上培养，至苗高3cm左右。
[0013] (4)RNA提取和病毒检测：取步骤(3)中
叶片进行病毒RT-PCR检测，统计脱毒效率，采用EASY spin植物RNA快速提取
试剂盒的液氮
研磨法提取植物总RNA，反转录成cDNA，利用苹果锈果类病毒引物进行RT-PCR检测。
[0014] 进一步地，在步骤(1)中所述初代培养基的配方为：MS+0.1mg/L IBA+0.5mg/L 6-BA+琼脂5.1～5.3g/L+蔗糖30g/L，pH5.8。
[0015] 进一步地，在步骤(1)中所述人工气候室中的培养环境为：
温度25±2℃，光照3000lx，光照16h。
[0016] 进一步地，在步骤(2)中所述继代培养基的配方为：MS+0.3mg/LNAA+0.9mg/L 6-BA+0.6mg/L GA+琼脂5.1～5.3g/L+蔗糖30g/L，pH5.8。
[0017] 进一步地，在步骤(3)中所述茎尖培养基的配方为：MS+0.4mg/L IBA+2.0mg/L 6-BA+琼脂5.1～5.3g/L+蔗糖30g/L，pH5.8。
[0018] 进一步地，步骤(4)中苹果锈果类病毒检测引物序列为：
[0019] 正向引物：5′-AGACCCTTCGTCGACGACGA-3′；
[0020] 反向引物：5′-TGTCCCGCTAGTCGAGCGGA-3′。
[0021] 本发明的有益效果：使用本发明的技术方法，富士苹果锈果类病毒脱除率达到75％以上，褪绿叶斑病毒脱除率达到95％以上，苹果茎沟病毒和苹果茎痘病毒脱除率达到
100％。植株存活率达到93％以上，获得一个脱毒品种仅需要150天左右。
附图说明
具体实施方式
[0023] 为了更好的理解本发明，下面结合附图以及具体
实施例来进一步说明。实验品种为2001富士和美乐富士。
[0024] 实施例1：
[0025] 本发明提供的高效进行富士苹果组培苗锈果类病毒脱除方法，包括以下4个步骤：
[0026] 步骤1、离体植株无菌体系的建立：5月份初，在田间采集幼芽，用无菌
水冲洗3次，在超净
工作台进行无菌操作。将幼芽在75％酒精进行30s～40s的表面消毒，之后无菌水冲洗3次；再利用0.1％氯化汞处理10～12min，处理的时间因材料的木质化程度而有所差异，之后无菌水进行4～6次的充分洗净；将幼芽接种于灭菌后的初代培养基中，本发明采用的初代培养基配方为：MS+琼脂5.1～5.3g/L+蔗糖30g/L，pH5.8，然后置于人工气候室中培养，培养环境为：温度25±2℃，光照3000lx，光照16h。培养至20d左右，外植体开始萌动、生长，由此建立离体植株无菌营养繁殖体系。
[0027] 步骤2、继代培养：在无菌条件下，将成功入瓶的试管苗转移至继代培养基中，本发明采用的继代培养基配方为：MS+0.1mg/L IBA+0.5mg/L 6-BA+琼脂5.1～5.3g/L+蔗糖30g/L，pH5.8，经过30d后可产生大量丛生芽。连续继代培养多代，以繁殖获取足量的丛生芽，用于各种脱毒处理。处理品种为：2001富士和美乐富士。
[0028] 步骤3、茎尖组织的超低温处理结合化学处理脱毒：
[0029] (1)超低温处理：将继代培养的带毒离体植株转入MS+6-BA 1.0mg/mL+IBA 0.2mg/mL培养基上培育20～25d，同时，在培养期间随机取再生芽中的单芽检测确定带毒。取株高1.0～2.0cm的再生芽，在超净工作台上将其分成单芽后，接种到MS+0.4mol/L蔗糖+0.4mol/L甘油的培养基上，预培养时间2d；在解剖镜下剥取含2～3层叶原基大小约2mm的茎尖，将该茎尖放在60％
玻璃化溶液PVS2中，25℃下处理20min；立即将茎尖转入经玻璃化溶液PVS2(MS+30％甘油+15％乙二醇+15％二甲基亚砜+0.4M蔗糖，pH5.8)中，0℃处理100min，更换1次PVS2溶液后，迅速投入液氮，保存70min；从液氮中取出茎尖，快速置于40℃水浴中化冻
90s，然后用1.2M蔗糖培养液处理10min，重复洗涤一次，直至茎尖漂浮于液体表面。
[0030] (2)化学处理：将洗涤后的茎尖放置含利巴韦林20～25ug/L茎尖分化培养基上暗培养7d，然后转移至组培室光照40μmols-1m-2条件下培养。30d后根据茎尖生长情况更换化学培养基。
[0031] 待苗长至3cm时，取叶片进行病毒RT-PCR检测，统计脱毒效率。
[0032] 步骤4、RNA提取和病毒检测
[0033] 采用EASY spin植物RNA快速提取试剂盒的液氮研磨法提取嫩叶的RNA；采用Thermo反转录试剂盒进行RNA反转录。
[0034] 病毒检测所用引物见表1，均由生工
生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0035] 表1病毒检测引物序列
[0036]
[0037] 4种病毒的检测采用RT-PCR技术，以cDNA为模板，在Taq酶的催化下，使用正反引物进行双链DNA的扩增。
[0038] 4种病毒的PCR反应条件分别为：
[0039] ASGV：94℃45s，58.6℃45s，72℃1min；
[0040] ACLSV：94℃45s，59℃45s，72℃1min；
[0041] ASPV：94℃45s，54.4℃45s，72℃1min；
[0042] ASSVd：94℃45s，58℃45s，72℃1min；
[0043] 4种病毒的检测均循环35次，最后72℃延伸10min。检测结果统计，带毒率(％)＝(检出病毒苗木树/抽检苗木总数)×100％。
[0044] 以下选用3组不同处理方式的对照组与经过实施例1处理后选取的叶片进行对比，对本实施例的处理效果进行说明。
[0045] 对照组1：
[0046] 与实施例1相比，除操作步骤3中将超低温(-196℃)处理后的茎尖放入不含20～25ug/L利巴韦林的茎尖培养基上培养，待苗长至3cm时，取叶片进行病毒RT-PCR检测，统计脱毒效率；其余操作步骤1、2、4与实施例1完全相同。
[0047] 对照组2：
[0048] 与实施例1相比，操作步骤3中将继代培养的植株直接剥取含2～3层叶原基、大小约2mm的茎尖放入含利巴韦林20～25ug/L茎尖培养基中培养，待苗长至3cm时，取叶片进行病毒RT-PCR检测，统计脱毒效率；其余操作步骤1、2、4与实施例1完全相同。
[0049] 对照组3：
[0050] 与实施例1相比，操作步骤3中选取继代培养后无污染、无玻璃化现象并长势一致的离体植株(约2cm)，移入光照
培养箱，缓慢升高温度直至达到所需处理温度(39℃/33℃，16h/8h)，培养30～60d。处理完成时，在超净工作台上进行无菌操作，剥取植株茎尖，接种于茎尖分化培养基(MS+0.4mg/L IBA+2.0mg/L 6-BA+琼脂5.1～5.3g/L+蔗糖30g/L，pH5.8)中置于人工气候室中(温度25±2℃，光照3000lx，光照16h)培养。待苗长至3cm时，取叶片进行病毒RT-PCR检测，统计脱毒效率；其余操作步骤1、2、4与实施例1完全相同。
[0052] 以带苹果锈果类病毒的红富士为试材，研究不同脱毒方法对苹果锈果类病毒脱除效率。
[0053] 实验材料：苹果品种为美乐富士。
[0054] 试验处理：试验设4个处理组，每个处理组剥取30个茎尖，重复3次。
[0055] T1处理组使用对照组1脱毒方法：超低温处理脱毒；
[0056] T2处理组使用对照组2脱毒方法：化学处理脱毒；
[0057] T3处理组使用实施例1脱毒方法：超低温处理脱毒+化学处理脱毒；
[0058] T4处理组使用对照组3脱毒方法：高温热处理；
[0059] 1、不同处理对接种茎尖成活率和分化率的影响
[0060]处理 接种茎尖数 茎尖成活率(％) 茎尖分化率(％)
T1 90 84 97.62
T2 83 83.13 88.41
T3 89 93.88 95.30
T4 85 97.14 95.89
[0061] 与其它处理相比较，超低温处理(T1)对茎尖的影响较大，处理后的茎尖生长十分缓慢，处理完成2周后才可确定成活率，2～3个月才能够明显观察到茎尖的生长。但表中的数据显示，超低温处理虽然影响茎尖的生长速度，但对茎尖的成活和分化影响较小。
[0062] 与对照组相比，超低温+化学处理(T3)的茎尖成活率茎尖达到93.88％，茎尖分化率达到了95.3％。
[0063] 2、不同处理对苹果锈果类病毒脱除效果
[0064] 不同脱毒处理对苹果锈果类病毒脱除效果差异较大，以超低温结合化学培养(T3)的对富士苹果Assvd的脱除效果最好，达到75.61％，其次为超低温处理(T1)，以高温热处理(T4)对Assvd的脱除效率最低。
[0065]处理 检测总株数 Assvd阳性株数 Assvd脱除率(％)
T1 78 30 61.54
T2 61 29 52.46
T3 82 20 75.61
T4 85 45 47.05
[0066] 3、超低温结合化学处理对3种潜隐性病毒的脱除效果
[0067]
[0068] 超低温结合化学处理对3种潜隐性病毒的脱除效果较好，其中对ASGV和ASPV的脱除效果达到100％，对ACLSV的脱除效果也达到92％以上。
[0069] 对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附
权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0070] 此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
