核孔蛋白Nup98a和Nup98b在调控植物开花时间中的应用
阅读：543发布：2021-06-05
专利汇可以提供核孔蛋白Nup98a和Nup98b在调控植物开花时间中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 植物 分子 生物 学技术领域，具体涉及核孔蛋白Nup98a和Nup98b在调控植物开花时间中的应用。本发明鉴定了植物核孔蛋白Nup98在调控植物开花时间和生长周期方面的功能，提供了利用核孔蛋白Nup98改变植物开花时间的方法。Nup98a和Nup98b同时失活会导致拟南芥出现早花，生育期缩短。由于Nup98基因在植物中的高度保守性，核孔蛋白Nup98在调控植物开花时间和生长周期方面的应用和方法在不同植物中具有普遍的推广应用价值，为解决植物杂交育种中的花期不遇问题、各种植物的生育期控制问题、光周期敏感性问题和引种问题提供了方法和依据。，下面是核孔蛋白Nup98a和Nup98b在调控植物开花时间中的应用专利的具体信息内容。
1.核孔蛋白Nup98在调控植物开花时间中的应用。
2.核孔蛋白Nup98在调控植物生长周期中的应用。
3.核孔蛋白Nup98在植物遗传育种或转基因植物构建中的应用。
4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述核孔蛋白Nup98的序列为如下任意一种：
(1)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
(2)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的缺失、替换或插入得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；
(3)与如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少40％的同源性且具有相同功能蛋白的氨基酸序列。
5.核孔蛋白Nup98的编码基因或含有所述编码基因的生物材料在调控植物开花时间、调控植物生长周期、植物遗传育种或转基因植物构建中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述Nup98的编码基因的核苷酸序列为如下任意一种：
(1)如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
(2)如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的缺失、替换或插入得到的编码具有相同功能蛋白的核苷酸序列；
(3)在严格条件下可以与如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列；
所述生物材料包括表达盒、载体、转座子、工程菌、宿主细胞或转基因细胞系。
7.根据权利要求1～6任一项所述的应用，其特征在于，通过失活核孔蛋白Nup98或降低核孔蛋白Nup98的表达，使植物的开花时间提前或生育期缩短。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物包括玉米、大豆、水稻、小麦、拟南芥；
当所述植物为拟南芥时，通过同时失活序列如SEQ ID NO.1所示的Nup98a和序列如SEQ ID NO.2所示的Nup98b，使拟南芥的开花时间提前或生育期缩短。
9.一种调控植物开花时间、调控植物生长周期或构建转基因植物的方法，其特征在于，调控植物的核孔蛋白Nup98的表达。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，通过失活核孔蛋白Nup98或降低核孔蛋白Nup98的表达，使植物的开花时间提前或生育期缩短。
核孔蛋白Nup98a和Nup98b在调控植物开花时间中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 核孔复合物(Nuclear Pore Complex，NPC)是真核细胞核膜上最大的蛋白复合物，它通过调节细胞核与细胞质间的mRNA及蛋白质的运输，广泛参与生物体的多种生长发育过程。研究核孔蛋白在调控植物生长发育过程中的作用，开发对于植物生长发育具有重要功能的核孔蛋白，对于植物的遗传育种和作物种植具有重要的意义。目前，植物中只有少数NPC组分的功能得到了初步分析，其中，核孔蛋白98(Nucleoporin 98，Nup98)的功能研究未见报道。本发明发现，Nup98蛋白在大豆、玉米和水稻等主要农作物中的同源性极高。在拟南芥中存在两个高度同源的Nup98基因a和b，与人的Nup98蛋白具有相同的蛋白结构域，即N端的FG重复结构域及C端的自酶解结构域(autoproteolytic domain，APD)。
发明内容
[0003] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供核孔蛋白Nup98a和Nup98b在调控植物开花时间中的应用。
[0004] 为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
[0005] 本发明通过对拟南芥Nup98a基因(序列如SEQ ID NO.3所示，编码蛋白序列如SEQ ID NO.1所示)和Nup98b基因(序列如SEQ ID NO.4所示，编码蛋白序列如SEQ ID NO.2所示)的启动子分析发现，这两个基因的启动子上包含许多相同的和特异的顺式作用元件。通过蛋白定位实验发现，Nup98a和Nup98b蛋白不仅定位到核膜上，在核质中也分布广泛。通过对Nup98a和Nup98b基因的失活实验发现，Nup98a和Nup98b基因的T-DNA插入单突变体无明显的发育表型，然而，Nup98a Nup98b双突变体(nup98)表现为明显的早花表型，证明拟南芥Nup98a与Nup98b功能冗余并共同调节植物开花过程。
[0006] 具体地，本发明提供核孔蛋白Nup98在调控植物开花时间中的应用。
[0007] 本发明提供核孔蛋白Nup98在调控植物生长周期中的应用。
[0008] 本发明提供核孔蛋白Nup98在植物遗传育种或转基因植物构建中的应用。
[0009] 本发明所述核孔蛋白Nup98的序列为如下任意一种：
[0010] (1)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
[0011] (2)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的缺失、替换或插入得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；
[0012] (3)与如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少40％的同源性且具有相同功能蛋白的氨基酸序列。
[0013] 本发明通过生物信息学分析发现Nup98蛋白在拟南芥中以及在大豆、玉米和水稻等主要农作物中的同源性非常高，因此，根据蛋白序列和功能的保守性可知，大豆、玉米和水稻等主要农作物的Nup98蛋白具有与拟南芥Nup98蛋白相同的功能。
[0014] 因此，上述(2)中具有如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的缺失、替换或插入得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列或(3)中具有与如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少40％的同源性且具有相同功能蛋白的氨基酸序列的蛋白包括但不限于大豆的核孔蛋白Nup98(大豆中存在2个核孔蛋白Nup98，Glyma.12G235000和Glyma.13G26410)、玉米的核孔蛋白Nup98(玉米中存在2个核孔蛋白Nup98，GRMZM2G059015和GRMZM2G344924)、水稻的核孔蛋白Nup98(水稻中存在2个核孔蛋白Nup98，LOC_Os12g06890和LOC_Os12g06870)、以及与Nup98a或Nup98b具有相同功能的Nup98a或Nup98b突变体。
[0015] 进一步地，本发明提供核孔蛋白Nup98的编码基因或含有所述编码基因的生物材料在调控植物开花时间、调控植物生长周期、植物遗传育种或转基因植物构建中的应用。
[0016] 作为优选，所述Nup98的编码基因的核苷酸序列为如下任意一种：
[0017] (1)如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
[0018] (2)如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的缺失、替换或插入得到的编码具有相同功能蛋白的核苷酸序列；
[0019] (3)在严格条件下可以与如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。
[0020] 本领域技术人员应该理解，在已知Nup98蛋白的氨基酸序列的情况下，根据密码子的简并性，可以获得不同的编码基因的核苷酸序列，上述编码与Nup98a或Nup98b蛋白具有相同功能蛋白的基因均在本发明的保护范围内。
[0021] 作为优选，所述生物材料包括表达盒、载体、转座子、工程菌、宿主细胞或转基因细胞系。
[0022] 本发明通过实验证明，核孔蛋白Nup98为植物开花的负调控因子，即失活核孔蛋白Nup98能够提前植物开花时间或缩短生育期。
[0023] 因此，本发明所述的核孔蛋白Nup98的应用，为通过失活核孔蛋白Nup98或降低核孔蛋白Nup98的表达，使植物的开花时间提前或生育期缩短。
[0024] 本发明中，所述植物包括玉米、大豆、水稻、小麦、拟南芥。
[0025] 作为本发明的一种实施方式，当所述植物为拟南芥时，通过同时失活序列如SEQ ID NO.1所示的Nup98a和序列如SEQ ID NO.2所示的Nup98b，使拟南芥的开花时间提前或生育期缩短。
[0026] 进一步地，本发明还提供一种调控植物开花时间、调控生长周期或构建转基因植物的方法，为通过调控植物的核孔蛋白Nup98的表达实现。
[0027] 作为优选，所述调控植物开花时间、调控生长周期或构建转基因植物的方法，通过失活核孔蛋白Nup98或降低核孔蛋白Nup98的表达，使植物的开花时间提前或生育期缩短。
[0028] 本发明的有益效果在于：本发明首次鉴定了植物核孔蛋白Nup98在调控植物开花时间和生长周期方面的功能，提出了利用核孔蛋白Nup98的突变改变植物开花时间的方法。本发明通过实验证明，Nup98a和Nup98b同时失活的nup98双突变体拟南芥表现出早花，生育期缩短等发育表型。由于Nup98基因在植物中、尤其是玉米、水稻、大豆等主要作物中的高度保守，本发明提供的核孔蛋白Nup98在调控植物开花时间和生长周期方面的应用和方法在不同植物中具有普遍的推广应用价值，为解决植物杂交育种中的花期不遇问题、各种作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制问题、光周期敏感性问题和引种问题提供了方法和依据。
附图说明
附图说明
[0029] 图1为本发明实施例1中Nup98蛋白结构模式图及结构域序列比对结果；其中，A为拟南芥Nup98与人类Nup98-96前体结构模式图；B为拟南芥Nup98与人类Nup98蛋白自酶解结构域序列比对；C为拟南芥Nup98与人类Nup98蛋白自酶解结构序列相似性分析；D为拟南芥Nup98与人类Nup98蛋白序列相似性分析。
[0030] 图2为本发明实施例3的克隆中间载体pGWCm的结构示意图。
[0031] 图3为本发明实施例4的克隆中间载体FU79-GFP的结构示意图。
[0032] 图4为本发明实施例4的中间载体FU76-35S的结构示意图。
[0033] 图5为本发明实施例4的植物表达载体FU39-2(intron)的结构示意图。
[0035] 图7为本发明实施例6中拟南芥Nup98基因T-DNA插入突变体的鉴定，其中，a为Nup98基因T-DNA插入突变体的表型，标尺为2厘米；b为Nup98基因的T-DNA插入的结构示意图，倒三角代表T-DNA插入位点，黑色方框和灰色方框分别代表外显子和5’或3’非翻译区，黑色直线代表内含子，基因结构下方的横线代表RT-PCR产物位置；c为RT-PCR分析Nup98基因在野生型和突变体中的转录水平，ACTIN2为内参基因；d为野生型和突变体中Nup98a蛋白表达水平检测，HSP90为内参蛋白。
[0036] 图8为本发明实施例7中在野生型和突变体的开花表型分析，a为野生型(Col)、Nup98a、Nup98b基因单突变体(nup98a1、nup98a2、nup98b1)和双突变体(nup98a1nup98b1和nup98a2nup98b1)以及回补Nup98b基因的转基因植株(35S：GFP:Nup98b nup98a1nup98b1)的开花表型图，标尺为2厘米；b为a中所示野生型和突变体植株的开花时间统计，以开花时的莲座叶片数表示(n≥30)，误差线表示标准偏差，显著水平(P<0.01)。
具体实施方式
[0037] 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
[0038] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0039] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0040] 实施例1 Nup98蛋白结构模式图及结构域序列比对
[0041] 在拟南芥基因组中有一对同源性极高的Nup98蛋白：Nup98a和Nup98b。它们分别由Nup98a(At1g10390)和Nup98b(At1g59660)基因编码。上述基因序列可从拟南芥信息资源数据库(The Arabidopsis Information Resource,TAIR,http://www.arabidopsis.org/)中获得。使用序列比对所用软件DNAMAN分析Nup98a和Nup98b的氨基酸序列相似性为60.8％。在国际生物技术信息中心数据库(The National Center for Biotechnology Information,NCBI)中的保守结构域数据库中比对显示，拟南芥Nup98a及Nup98b蛋白与人的Nup98蛋白具有相同的蛋白结构域，即N端的FG重复结构域及C端的自酶解结构域(autoproteolytic domain，APD)(图1的A)。但是，在脊椎动物核孔蛋白功能的研究中发现，Nup98是由Nup98-Nup96前体蛋白经过APD结构域C末端的自酶解位点HFS切割后产生的，且切割发生在F和S之间；而在拟南芥中，Nup98a和Nup98b都由单独的基因编码。值得注意的是，分别将拟南芥Nup98a和Nup98b的APD结构域同人Nup98的APD结构相比，该结构域相似性分别为37.6％和44.2％，而拟南芥Nup98a和Nup98b的APD结构域间的相似性更高达78.5％，并且在拟南芥Nup98蛋白中，APD结构域C端自酶解位点HFS仍然存在(图1的B、C、D)，表明Nup98在进化上可能具有共同的祖先。上述结果表明，虽然在动植物中经过了不同的分化历程，但Nup98功能域却保持了较高的保守性。
[0042] 实施例2 Nup98基因的克隆
[0043] 利用正向引物1：ATGTTTGGCTCATCTAATCCTTT(如SEQ ID NO.5所示)、反向引物1：CTAAACTCCATCTTCTTCATCTTC(如SEQ ID NO.6所示)以及正向引物2：
ATGTTCGGTTCTTCTAATAATAAT(如SEQ ID NO.7所示)、反向引物2：
CTACACATCATATTCATCTCCAAG(如SEQ ID NO.8所示)从拟南芥中分别克隆获得Nup98a和Nup98b并进行测序，Nup98a和Nup98b的基因序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；
由其编码的蛋白质的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
ATGTTCGGTTCTTCTAATAATAAT(如SEQ ID NO.7所示)、反向引物2：
CTACACATCATATTCATCTCCAAG(如SEQ ID NO.8所示)从拟南芥中分别克隆获得Nup98a和Nup98b并进行测序，Nup98a和Nup98b的基因序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；
由其编码的蛋白质的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
[0044] 上述克隆Nup98a和Nup98b基因的PCR反应程序为:95℃5min预变性，94℃30s，55℃35s，72℃1min30s，25个循环，72℃10min延伸。
[0045] 实施例3拟南芥Nup98基因的克隆载体的构建
[0046] 将实施例2中扩增获得的PCR产物直接按照TA克隆方法克隆到pGWGCm(如图2所示)上。克隆前，pGWGCm事先用Ahd I内切酶水解以获得T载体。将上述连接产物转化大肠杆菌DH5α，并在其中扩繁，阳性克隆经过测序筛选获得如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的Nup98a和Nup98b序列。
[0047] 实施例4拟南芥Nup98基因的表达载体的构建
[0048] 以实施例3中得到的Nup98a克隆载体为模板将Nup98a基因酶切并连接至FU79-GFP载体(如图3所示)，然后将FU79-GPF-Nup98a与载体FU76-35S(如图4所示)以及植物表达载体FU39-2(intron)(如图5所示)等比例混合后通过LR反应(反应体系：质粒各50ng，LR酶1μl，补H2O至终体积5μl；反应条件：混匀后25℃反应6小时以上)，构建获得植物表达载体FU39-2-35S:GFP:Nup98a。FU39-2-35S:GFP:Nup98b的构建方法同上。上述两个表达载体用于在植物中过观察Nup98a和Nup98b的定位和表型分析。
[0049] 实施例5拟南芥Nup98基因的亚细胞定位
[0050] 利用实施例4构建的表达载体，通过拟南芥蘸花法分别获得了35S::GFP:Nup98a和35S::GFP:Nup98b的过表达拟南芥植株。利用激光共聚焦显微镜观察了GFP-Nup98a和GFP-Nup98b蛋白在转基因植株中的定位情况，结果如图6所示，拟南芥中Nup98a和Nup98b蛋白不仅定位到核膜上，在核质中也分布广泛，这与现有技术报道的后生动物的Nup98的亚细胞分布特征一致。
[0051] 实施例6拟南芥Nup98基因T-DNA插入突变体的鉴定
[0052] 从拟南芥生物资源中心(ABRC)分别订购了nup98a和nup98b的T-DNA插入单突变体：并将它们分别命名为nup98a-1(SALK_015016)、nup98a-2(SALK_103803)和nup98b-1(GABI_288A08)，其中nup98a-1和nup98a-2两种突变体中，T-DNA分别插入在Nup98a基因第3个和第2个外显子上，而在nup98b-1突变体中，T-DNA插入在Nup98b的最后一个内含子上(图7的b)。通过PCR筛选得到纯合突变体后，经表型分析发现，所得到的各个Nup98a和Nup98b的单突变体与野生型相比没有任何明显的发育表型方面的差异(图7的a)。
[0053] 对上述三种单突变体进行了分子鉴定，RT-PCR结果显示，在各个单突变体中，均未检测出与其对应的基因的转录本(nup98a-1和nup98a-2两种突变体中未检测到nup98a基因的转录本，nup98b-1突变体中未检测到nup98b基因的转录本)。并且，在野生型中Nup98a基因的表达水平显著高于Nup98b基因，当Nup98a基因突变后，体内Nup98b基因的表达水平上升；Nup98b基因突变后，Nup98a基因表达量也明显提高(图7的c)。
[0054] 利用Nup98a蛋白特异单克隆抗体进行蛋白水平的检测，发现在nup98a-1和nup98a-2单突变体中均没有检测到Nup98a蛋白的积累，而在nup98b-1突变体中Nup98a蛋白表达量显著提高(图7的d)。以上结果表明，Nup98a基因和Nup98b基因可能功能冗余共同调节拟南芥的生长发育过程。
[0055] 为进一步研究Nup98a基因和Nup98b基因的功能，通过杂交分别构建了nup98a-1nup98b-1(nup98-1)和nup98a-2nup98b-1(nup98-2)两种Nup98a基因和Nup98b基因同时失活的nup98双突变体。
[0056] 上述杂交采用的方法如下：将即将开花的拟南芥母本花蕾去雄，将已经开花的父本的雄蕊取下，人工将父本花粉授到母本柱头上。待角果成熟，收获杂交种子，即F1代，F1代自交获得F2代，F2代用PCR方法鉴定杂交后植株基因型。
[0057] 实施例7 nup98突变体的开花时间统计
[0058] 分析实施例6中Nup98a基因和Nup98b基因单独失活以及同时失活的各种nup98突变体的开花时间，结果如图8所示，在长日条件下，与野生型开花时莲座叶片数目(11.7±0.5片)相比，nup98a-1、nup98a-2和nup98b-1三种单突变体开花时间并没有发生明显的变化，开花时莲座叶片数分别为12±0.7片、11.3±1.1片和11.3±0.5片。但是nup98-1(9.8±
0.4片)和nup98-2(9.1±0.8片)两种Nup98a和Nup98b基因同时失活的nup98双突变体均表现出早花表型。在双突变体背景下，用35S启动子调控Nup98b基因表达可以互补双突变体的早花表型，其开花时莲座叶片数为10.8±1.1片。
0.4片)和nup98-2(9.1±0.8片)两种Nup98a和Nup98b基因同时失活的nup98双突变体均表现出早花表型。在双突变体背景下，用35S启动子调控Nup98b基因表达可以互补双突变体的早花表型，其开花时莲座叶片数为10.8±1.1片。
[0059] 结果表明，在拟南芥中，Nup98扮演开花的负调控因子，并且拟南芥nup98双突变体的早花表型确实是由Nup98功能缺失(Nup98a基因和Nup98b基因同时失活)引起的。
[0060] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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