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Method for multiplying baby's-breath

阅读：72发布：2021-10-12

专利汇可以提供Method for multiplying baby's-breath专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且PURPOSE:To produce stable virus-free seedling of baby's-breath having a uniform character and to efficiently yield high-quality baby's-breath by cutting a seedling into plural nod parts, planting each node part to a medium, respectively and culturing the node parts in a sterile air-permeable container. CONSTITUTION:A seedling of baby's-breath sterilely cultured by a tissue culture method is cut into plural nodes of axillary bud and terminal bud. The prepared axillary bud node and the terminal bud node are planted in a hormone-free medium containing no sucrose or，下面是Method for multiplying baby's-breath专利的具体信息内容。

权利要求

【特許請求の範囲】

【請求項１】組織培養法によって無菌的に培養されたカスミソウ苗を複数の腋芽節と頂芽節に切り分ける第１
工程と、得られた腋芽節と頂芽節を、ホルモンフリーでショ糖を含まないかあるいは３重量％以下含む培地に植える第２工程と、腋芽節および頂芽節を植えた該培地を、無菌的雰囲気で通気性を有する容器内で培養して苗を得る第３工程を含むことを特徴とするカスミソウの増殖法。

说明书全文

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、組織培養法を用いて優れた品質のカスミソウを効率よく生産する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】カスミソウのうちでもシュッコンカスミソウは栄養繁殖性の植物であり、おもに挿し芽により増殖がなされている。しかし、開花を繰り返したような大きな株では栄養生長が著しく困難になるという性質を有しており、親株の繁殖機能を維持するために定期的に生長点培養を繰り返す必要がある。

【０００３】ｉｎｖｉｔｒｏにおけるシュッコンカスミソウの増殖方法に関しては、ホルモン添加の培地を用い多芽体を形成させる方法などが報告されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、シュッコンカスミソウをｉｎｖｉｔｒｏで培養する際には、ｖ
ｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（水浸状化）が起こりやすい性質があり、形質が均一でかつ安定しているウイルスフリー苗の生産技術の提供が切望されているが、現在までのところ満足すべき培養技術は提供されていない。

【０００５】本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、形質が均一でかつ安定しているウイルスフリーのカスミソウ苗を生産し、良質のカスミソウを効率よく生産することが可能な方法の提供を目的としている。

【０００６】

【課題を解消するための手段】本発明者らは、カスミソウの小植物体（幼苗）のｉｎｖｉｔｒｏでの増殖を目的として、増殖培養ステージにおける培地の組成や増殖条件等を検討した。その結果、培地中の糖濃度および培養器内への通気を適宜に調節することによって、増殖培養ステージでの水浸状化を抑制できることを知見し、
本発明を完成させた。

【０００７】すなわち、本発明では、組織培養法によって無菌的に培養されたカスミソウ苗を複数の腋芽節と頂芽節に切り分ける第１工程と、得られた腋芽節と頂芽節を、ホルモンフリーでショ糖を含まないかあるいは３重量％（以下、％という）以下含む培地に植える第２工程と、腋芽節および頂芽節を植えた該培地を、無菌的雰囲気で通気性を有する容器内で培養して苗を得る第３工程とを少なくとも含むカスミソウの増殖法によって、上記課題を解消した。

【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。本発明においては、カスミソウ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａｅｌｅ
ｇａｎｓ），シュッコンカスミソウ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉ
ｌａｐａｎｉｃｕｌａｔａＬ．）などのカスミソウ類（以下、カスミソウという）を培養の対象としている。

【０００９】本発明方法では、組織培養法によって無菌的（ウイルスフリー）に培養されたカスミソウ苗を母株として使用する。ウイルスフリーのカスミソウ苗は、好ましくはウイルスフリー苗から無菌的に取り出した生長点を、オーキシンやサイトカイニンなどの生長調節物質、３％程度のショ糖、ゲル化剤などを含むＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ培地）などの組織培養用培地に置いて培養し、苗とすることにより、所望の時期に得ることができる。この苗は、その腋芽節を切り取って培養に供するものであるため、極端に萎縮したり徒長した苗は好ましくなく、腋芽節および頂芽節を切り分けた時に１つの節長が０．５〜３ｃｍ程度であるのが好ましい。なお、幼苗の茎長や節長は、培養時の光条件によって制御することも可能である。

【００１０】このようにして生長点を培養して得られた苗のうち、水浸状化していない苗を選択し、クリーンベンチなどの無菌室内に移し、殺菌したメスやハサミを用いて複数（通常は３〜６個）の腋芽節と頂芽節に切り分ける（第１工程）。

【００１１】次に、切り分けた腋芽節と頂芽節（以下、
節部という）を、ホルモンフリーでショ糖を含まないかあるいは３％以下含む培地に植える（第２工程）。この培地としては、ＭＳ培地などの基本培地にジェランガム、寒天などのゲル化剤を添加したものあるいはこれに、３％以下のショ糖を添加したものが使用される。この培地中のショ糖濃度を３％以上とすると、節部を植えて培養した時に、茎葉の伸長が抑制され、発根も見られず、節部の基部にカルスが形成されて、節部から直接幼苗を製造する目的には適さないことになる。また、培地ショ糖濃度を０％、即ちショ糖を含まない培地で培養した場合には、茎葉の伸長や発根は生じるものの、ショ糖を３％以下含む培地での培養結果と比較すると、生育が劣る。後述するが、実験の結果、この培地の最適ショ糖濃度は１％〜２％程度であった。

【００１２】節部を植えた培地は、無菌的でかつ通気性を有する容器内で培養する（第３工程）。容器内を無菌的かつ通気性を有する雰囲気とするには、節部を植えた培地を入れた容器の口部を、除菌フィルタ（通気フィルタ）を用いて塞ぐことにより行なうことができる。このように通気性を有する容器内で節部の培養を行なうことにより、容器内の湿度を、密閉容器内で培養する場合に比べ数％〜十数％程度低くすることができ、また容器内に外気が流入することによって、培養体の光合成を活発にできることから、培養体の水浸状化を抑制しつつ培養体の生長を促進できる効果を奏する。

【００１３】このように、ホルモンフリーでショ糖濃度を低くした培地に節部を植え、無菌的でかつ通気性を有する容器内で培養することにより、２０日〜１ヶ月程度で、複数の節を有する苗が得られる。得られた苗は、容器から取り出して、通常の育苗用培土などに植えて栽培される他、この得られた苗の節部を切り分けて、再び節部の培養を繰り返して行なうことができる。このように節部の培養を繰り返し行なうことにより、無菌的操作によって効率よくウイルスフリー苗を生産することができる。すなわち、１つの苗から節部の培養を繰り返し行なうことにより、１年間で１００本以上のウイルスフリー苗の生産が可能となる。

【００１４】なお、苗を切り分けて得られる節部のうち、頂芽節については、直接培養土に植えて苗を形成することも可能である。

【００１５】

【実施例】

（１）生長点培養によるウイルスフリー苗の培養シュッコンカスミソウ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａｐａｎ
ｉｃｕｌａｔａＬ．）のウイルスフリー苗を生長点採取用の母株とした。この母株から茎頂部７〜８ｃｍを切り取り、次の手順で滅菌し、その生長点を摘出した。中性洗剤で茎葉部表面の洗浄７０％エタノールで１分間の殺菌（超音波洗浄器使用）有効塩素濃度１％水溶液で１０分間浸漬殺菌滅菌水で３回リンス

【００１６】これらの殺菌処理の後、殺菌済み茎頂部を無菌室内で実体顕微鏡を用いて切開し、２枚の葉原基を含む生長点近傍組織を０．５ｍｍ程度の大きさで摘出した。培地は、無機塩類を標準濃度の１／４倍に、有機物濃度を１／２に調整したＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ
＆Ｓｋｏｏｇ培地）とし、ショ糖濃度３％とした。ゲル化剤には市販のジェランガム（０．４重量％）あるいは寒天（０．８重量％）のいずれかを用いた。生長調節物質に関してはＮＡＡ（ナフタレン酢酸）とKinetin
（カイネチン）を組み合わせた条件下で検討した。生長点を含む培養器は、照度約６５００ｌｘ（培養棚面）、
明期時間１５ｈ／ｄ、気温２５℃の条件下で培養した。
生長点置床後約１ヶ月間で、茎長３ｃｍ程度の幼苗が得られた。この時の培地中の生長調節物質の濃度が、生長点の分化に及ぼす影響を表１に示した。

【００１７】

【表１】

【００１８】本試験条件下において、シュート（側芽）
が発生したのは、ＮＡＡが０．１ｐｐｍでKinetinが０．２，０．５および１．０ｐｐｍの３条件であった。
ＮＡＡ濃度が０．５および１．０ｐｐｍの場合にはカルスの誘導が顕著であった。一方、シュートからの発根および不定根の発生は、Kinetin濃度が低いほど大となる傾向にあった。

【００１９】（２）増殖培養生長点培養で得られた幼苗のうち水浸状を呈していないものを選び、１節および２枚の小葉を持つ長さが２ｃｍ
程度の腋芽節に切り分け、増殖培地に植えて培養した。
このとき、１幼苗は３〜４個の腋芽節に分割できた。増殖培地には、基本成分としてＭＳの無機塩類だけを標準濃度の１／２倍に調整したものを用いた。ゲル化剤はジェランガム（濃度０．４重量％）とし培地のショ糖濃度は、３％，１．５％および０％の３種類とした。培養器（口径２５ｍｍ、管長１００または１２５ｍｍの平底試験管）の閉栓は、通気性のフィルタ（ミリポア製ミリシール；商品名）を貼付したアルミフォイルキャップを用いて行なった。アルミフォイルキャップに設けた通気孔の径は約４．５ｍｍであった。培養時の気温は２３
℃、棚面の照度は１０００〜１５００ｌｘであった。

【００２０】表２に、生長点培養で得られた幼苗を切り分けた腋芽節を外植体とし、培地の糖濃度および通気の有無が生長に及ぼす影響を調べた結果を示した。（培養３０日）。

【００２１】

【表２】

【００２２】増殖培養時に発生する水浸状化は、通気フィルタ付きのキャップを用いることによりほぼ抑制できた。通気フィルタを用いた試験区では、培養開始直後に葉が萎れるのが観察されたが、１〜２日後には回復していた。これは、キャップに通気フィルタを貼付したことによって培養器内の湿度が低下したことによると考えられ、通気フィルタの有無により培養器内の湿度環境が大きく変化することが分かる。

【００２３】培地ショ糖濃度１．５％で通気フィルタを用いた試験区では、培養を開始してから１週間後には、
腋芽節の基部から根が伸びるとともに、腋芽が伸長した。さらに２週間後には茎長約５ｃｍで４〜５節を持つ幼苗にまで生長し、この間水浸状になる個体は見られなかった。一方、アルミフォイルキャップで閉栓し、フィルタによる通気をしなかった試験区では、殆どの腋芽節が水浸状を呈した。

【００２４】培地ショ糖濃度が３％の場合、通気フィルタを用いた試験区においては、茎葉の伸長は著しく抑制された。この場合、葉には紫色の色素の沈着が観察された。発根は殆ど観察されず、腋芽節基部はカルス化するものが多かった。

【００２５】培地ショ糖濃度０％では、茎葉の伸長は認められたものの、ショ糖濃度１．５％試験区と比較するとその生育は劣っていた。発根については、通気フィルタの有無に係わらず観察された。また腋芽節基部にカルスは生じなかった。

【００２６】以上のことから、増殖培養時における水浸状化の抑制に関しては、通気フィルタの利用が効果的であることが実証されるとともに、通気フィルタを用いる場合、培地ショ糖濃度は３％よりも低くする必要があることが判明した。

【００２７】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
１つの苗を複数の節部に切り分けて、それぞれをホルモンフリーでショ糖濃度を３％以下とした培地に植え、無菌的かつ通気性を有するする容器内で培養することによって、培養体が水浸状化する事無く苗を得ることができる。また得られた苗を節部に切り分けて繰り返し培養することができ、ウイルスフリー苗を効率よく生産することができる。

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