技术领域
[0001] 本
发明涉及小麦原生质体的制备，具体涉及一种小麦胚根原生质体悬浮液的制备方法。
背景技术
[0002] 小麦原生质体的分离主要采用酶解法，根据不同的组织，选择不同的酶液成分和比例。其原理是：由
纤维素酶、果胶酶和半
纤维素酶配制而成的溶液对细胞壁成分进行降解，从而使原生质体释放出来。原生质体的产率和活
力与材料来源、生理状态、酶液的组成以及原生质体制备方法有关。
[0003] 目前对于小麦原生质体制备方法的研究相对较少，席海秀等人报道了小麦
幼苗叶肉细胞原生质体的分离方法(席海秀,
艾可筠,佟少明.普通小麦幼苗叶肉细胞原生质体分离方法的优化[J].
生物技术通报,2016,32(4):68-73.)，张小红等人报道了小麦愈伤组织原生质体的分离方法(张小红,闵东红,邵景侠.小麦愈伤组织诱导及原生质体的分离与纯化[J].中国农学通报,2010,26(21):49-53.)。
[0004] 现有的小麦原生质体制备方法中，材料的获得周期较长，且获得量较少，如愈伤组织；材料处理时，需要将其切成较小的细条，如小麦苗
叶片以及胚芽鞘的处理。目前，还未见到小麦胚根原生质体制备的相关报道。
发明内容
[0005] 为弥补上述领域存在的不足，本发明提供一种小麦胚根原生质体悬浮液的制备方法，材料易获得，且周期较短，无需切碎等步骤，酶液成分较简单，酶解时无需抽
真空，且制备的原生质体纯度较高，数量多，活力高。
[0007] 小麦胚根原生质体悬浮液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0008] (1)将预处理液放置于
冰上预冷，然后迅速切下小麦胚根的根尖，将根尖放入预处理液中，冰上预处理1小时；
[0009] (2)将预处理好的根尖放入酶解液中，然后在23℃避光振荡酶解2h；
[0010] (3)酶解后的溶液用300目细胞筛过滤两次，100-300g，4℃离心5-10min；
[0011] (4)小心去除上清，然后加入清洗液清洗细胞，100-300g，4℃离心5-10min；
[0012] (5)小心去除上清，然后用8％g/ml的甘露醇溶液重悬细胞，即得原生质体悬浮液；
[0013] 所述预处理液含有MES，KCL，MgCl2，D-甘露醇，CaCl2，pH 5.5；
[0014] 所述酶解液含有MES，KCL，MgCl2，D-甘露醇，纤维素酶R-10，果胶酶，CaCl2，BSA，pH 5.5；
[0015] 所述清洗液含有MES，KCL，MgCl2，D-甘露醇，BSA，pH 5.5。
[0017] 所述预处理液含有0.08M MES，0.1M KCL，0.02M MgCl2，0.6M D-甘露醇，0.02M CaCl2，pH 5.5；
[0018] 所述酶解液含有0.08M MES，0.1M KCL，0.02M MgCl2，0.6M D-甘露醇，1.5％g/ml纤维素酶R-10，0.1％g/ml果胶酶，0.02M CaCl2，0.1％g/ml BSA，pH 5.5；
[0019] 所述清洗液含有0.08M MES，0.1M KCL，0.02M MgCl2，0.4M D-甘露醇，0.1％g/ml BSA，pH 5.5。
[0020] 优选切下小麦胚根的根尖0.5-1cm。
[0021] 优选使用预处理液15mL，酶解液15mL，清洗液20ml。
[0022] 优选用8％g/ml的甘露醇溶液将原生质体悬浮液定容至500-1000ul。
[0023] 所述步骤(2)中，振荡酶解的振荡速度优选为150rpm/min。
[0024] 所述步骤(3)和(4)中，优选300g，4℃离心5min。
[0025] 本发明针对小麦胚根的原生质体制备优化了酶解液的配方，同时增加了冰浴预处理步骤，在本领域中首次以小麦胚根为材料获得了高产率、高活力的原生质体。采用本发明的方法制备原生质体，每克小麦胚根可获得8.25×106个原生质体，细胞活力高达96.43％。
附图说明
[0026] 图1.采用本发明的方法制备的小麦胚根原生质体；台盼蓝
染色，
显微镜LEICA DM2500，20X。
具体实施方式
[0027] 下面结合实施例对本发明进行详细阐述，需要理解的是，下述实施例仅作为解释和说明，不用于限制本发明的范围。
[0029] 小麦
种子：品种“东选3号”。该小麦材料本实验室亦有保存，
申请人
声明可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
[0031] MES：英文名2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid的简称，中文名为2-(N-吗啉)乙磺酸，购自北京索莱宝科技有限公司，货号M8010；
[0032] D-甘露醇：购自北京酷来搏科技有限公司，货号GM7091；
[0033] KCL、MgCl2、CaCl2：购自国药集团化学试剂有限公司；
[0034] 纤维素酶R-10：购自北京索莱宝科技有限公司，货号C8260；
[0035] 果胶酶：购自上海源叶生物科技有限公司，货号S10007；
[0036]
离析酶R-10：购自北京索莱宝科技有限公司，货号M8190；
[0037] BSA：购自北京中创宏达科技有限公司，品牌为Biofroxx；
[0038] 300目细胞筛(40um)：购自北京中创宏达科技有限公司；
[0039] 台盼蓝染色剂：购自北京索莱宝科技有限公司，品牌为Gibco。
[0040] 本发明中未特别说明的实验试剂，均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可；未特别说明的实验方法，均按照本领域常规方法。
[0041] 实施例1.配制用于制备原生质体悬浮液的溶液
[0042] ①预处理液
[0043] 配方为：MES(0.08M)、KCL(0.1M)、MgCl2(0.02M)、D-甘露醇(0.6M)、CaCl2(0.02M)。
[0044] 配制方法：按照配方称取各组分；在ddH2O中加入MES、KCL、MgCl2、D-甘露醇，得
混合液；用Tris-Hcl(1M，PH＝8)将混合液的pH调至5.5，然后55℃
水浴10min至溶液透亮；向溶液中加入CaCl2，溶解后得预处理液。
[0045] ②酶解液
[0046] 配方为：MES(0.08M)、KCL(0.1M)、MgCl2(0.02M)、D-甘露醇(0.6M)、纤维素酶R-10(1.5％g/ml)、果胶酶(0.1％g/ml)、CaCl2(0.02M)、BSA(0.1％g/ml)。
[0047] 配制方法：按照配方称取各组分；在ddH2O中加入MES、KCL、MgCl2、D-甘露醇、纤维素酶R-10、果胶酶，得混合液；用Tris-Hcl(1M，PH＝8)将混合液的pH调至5.5，然后55℃水浴10min至溶液透亮；加入CaCl2及BSA，溶解后得酶解液。
[0048] ③清洗液
[0049] 配方为：MES(0.08M)、KCL(0.1M)、MgCl2(0.02M)、D-甘露醇(0.4M)、BSA(0.1％g/ml)。
[0050] 配制方法：按照配方称取各组分；在ddH2O中加入MES、KCL、MgCl2、D-甘露醇，得混合液；用Tris-Hcl(1M，PH＝8)将混合液的pH调至5.5，然后55℃水浴10min至溶液透亮；加入BSA，溶解后得清洗液。
[0051] ④8％的甘露醇溶液：称取80g D-甘露醇，溶解于ddH2O中，定容至1000ml。
[0052] 实施例2.小麦胚根原生质体悬浮液的制备
[0053] 1.培养小麦种子
[0054] 选用小麦品种“东选三号”，将种子放在培养皿中加水中浸泡5～6h后，用30％的
次氯酸钠溶液浸泡5min消毒，用灭菌水重复冲洗3-4次，加入少许灭菌水浸泡，放于5℃
冰箱中黑暗处理3d，再置于
培养箱(
温度25℃，
相对湿度60％，16h光照，8h黑暗)中培养，取培养至第5-7d的麦苗的胚根为材料。
[0055] 2.制备原生质体悬浮液
[0056] 方法一：
[0057] 使用实施例1中配制的各溶液，按照如下步骤制备小麦胚根原生质体悬浮液：
[0058] (1)把15mL的预处理液放置于冰上预冷，然后迅速切下小麦种子胚根，取长度为0.5-1cm的根尖，总重量约1.5g，将根尖放入冰上的预处理液中预处理1小时；
[0059] (2)将预处理好的小麦胚根放入15mL酶解液中，之后将其放置摇床中避光酶解2h，23℃，150rpm/min；
[0060] (3)酶解后的溶液用300目细胞筛(40um)过滤两次，300g，4℃离心5min；
[0061] (4)离心后的溶液小心的去除上清，之后加入20ml清洗液清洗细胞，再次300g，4℃离心5min；
[0062] (5)去除上清后用8％的甘露醇溶液定容至500-1000ul即可。
[0063] 方法二：
[0064] 使用实施例1中配制的各溶液，按照如下步骤制备小麦胚根原生质体悬浮液：
[0065] (1)迅速切下小麦种子胚根，取长度为0.5-1cm的根尖，总重量约1.5g，将根尖放入15mL酶解液中，之后将其放置摇床中避光酶解2h，23℃，150rpm/min；
[0066] (2)酶解后的溶液用300目细胞筛(40um)过滤两次，300g，4℃离心5min；
[0067] (3)离心后的溶液小心的去除上清，之后加入20ml清洗液清洗细胞，再次300g，4℃离心5min；
[0068] (4)去除上清后用8％的甘露醇溶液定容至500-1000ul即可。
[0069] 方法三：
[0070] 使用实施例1中配制的各溶液制备小麦胚根原生质体悬浮液，除了预处理时间设置为30分钟，其余步骤同方法一。
[0071] 方法四：
[0072] 使用实施例1中配制的各溶液制备小麦胚根原生质体悬浮液，除了预处理时间设置为1.5小时，其余步骤同方法一。
[0073] 方法五：
[0074] 首先，配制如下溶液：
[0075] ①预处理液
[0076] 配方为：MES(0.02M)、D-甘露醇(0.4M)。
[0077] 配制方法：按照配方称取各组分；在ddH2O中加入MES、D-甘露醇，得混合液；用Tris-Hcl(1M，PH＝8)将混合液的pH调至5.5，然后55℃水浴10min至溶液透亮，得预处理液。
[0078] ②酶解液
[0079] 配方为：MES(0.02M)、KCL(0.02M)、D-甘露醇(0.4M)、纤维素酶R-10(1.5％g/ml)、离析酶R-10(0.45％g/ml)、CaCl2(0.01M)、BSA(0.1％g/ml)。
[0080] 配制方法：按照配方称取各组分；在ddH2O中加入MES、KCL、D-甘露醇、纤维素酶R-10、离析酶R-10，得混合液；用Tris-Hcl(1M，PH＝8)将混合液的pH调至5.5，然后55℃水浴
10min至溶液透亮；加入CaCl2及BSA，溶解后得酶解液。
[0081] ③清洗液
[0082] 配方为：MES(0.02M)、KCL(0.02M)、D-甘露醇(0.4M)、BSA(0.1％g/ml)。
[0083] 配制方法：按照配方称取各组分；在ddH2O中加入MES、KCL、D-甘露醇，得混合液；用Tris-Hcl(1M，PH＝8)将混合液的pH调至5.5，然后55℃水浴10min至溶液透亮；加入BSA，溶解后得清洗液。
[0084] 然后按照方法二中的步骤(1)－(4)制备小麦胚根原生质体悬浮液。
[0085] 3.台盼蓝染色计数
[0086] 将制备的小麦胚根原生质体悬浮液与4％台盼蓝染色剂按照9:1的体积比混匀，然后滴入0.1mm，25×16型血球计数板计数槽中，制成临时装片后置于普通
光学显微镜下，在三分钟内分别统计活细胞数及死细胞数(死细胞为蓝色，活细胞呈无色透明状)，每个样品计数3个重复，取平均值。利用以下公式计算原生质体总数和活力：
[0087] 原生质体总数＝活细胞总数+死细胞总数；
[0088] 原生质体活力＝活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100％。
[0089] 结果如表1所示，采用方法一制备的小麦胚根原生质体悬浮液的原生质体总数最多，活力最高。
[0090] 表1.不同方法制备的小麦胚根原生质体的数量和活力对比
[0091] 制备方法 原生质体总数 原生质体活力方法一 8.25×106个/g 96.43％
方法二 5.72×106个/g 92.06％
方法三 7.65×106个/g 94.25％
方法四 8.19×106个/g 94.02％
方法五 2.08×106个/g 87.31％
