一种模拟粪便移植的生态食品及其制备方法与用途
阅读：52发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种模拟粪便移植的生态食品及其制备方法与用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种模拟 粪便 移植的生态食品及其制备方法与用途，属于 益生菌 发酵 与应用领域。该生态食品是将原料与 水 混合，分三阶段依次加入单一酶： 淀粉 酶、胃蛋白酶、胰酶进行酶解；原料经灭酶后接入枯草芽孢杆菌与 凝结 芽孢杆菌进行好 氧 发酵，再接入鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、副干 酪乳 杆菌、乳酸片球菌与 植物 乳杆菌进行密闭发酵，最后接入青春双歧杆菌、长双岐杆菌与动物双歧杆菌进行严格厌氧发酵，并经冻干获得。该生态食品能够模拟粪便移殖疗法，缓解因肠道菌群失衡而导致的一系列健康问题。所述生态食品可直接食用，不必通过复杂的方法导入患者肠道，降低了 给药 的难度，可用做粪便移殖疗法的补充或部分替代方案。，下面是一种模拟粪便移植的生态食品及其制备方法与用途专利的具体信息内容。
1.一种模拟粪便移植的生态食品，其特征在于：主要由以下步骤制备获得，将原料经烘干、粉碎后与水按质量体积比1：1.5-2.5混匀，分三阶段依次加入单一酶：淀粉酶、胃蛋白酶、胰酶进行酶解；原料经酶解后，进行灭酶，并接入枯草芽孢杆菌与凝结芽孢杆菌进行好氧发酵，再接入鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳酸片球菌与植物乳杆菌进行密闭发酵，最后接入青春双歧杆菌、长双岐杆菌与动物双歧杆菌进行严格厌氧发酵，待原料发酵结束后经冻干获得；所述原料为豆类、谷物类或药食同源类原料中的一种或两种以上。
2.如权利要求1所述的一种模拟粪便移植的生态食品，其特征在于：所述豆类原料为大豆、黑豆、白芸豆、红豆、豌豆、绿豆、豇豆、蚕豆、赤小豆或小扁豆中的一种或两种以上；
所述谷物类原料为花生、燕麦、大米、小米、糯米、薏仁米、大麦、小麦、藜麦、高粱、青稞、苦荞、玉米、黑芝麻中的一种或两种以上；
所述药食同源类原料为姜黄、郁李仁、火麻仁、莲子、桑叶、紫苏籽、枳椇子、余甘子、桃仁、杏仁中的一种或两种以上。
3.如权利要求1所述的一种模拟粪便移植的生态食品，其特征在于：所述原料由黑豆、小扁豆、大米、小米、糯米、薏仁米、大麦、小麦、藜麦、高粱、苦荞、玉米、黑芝麻等重量比组成；
或者所述原料由大豆、赤小豆、白芸豆、燕麦、苦荞、姜黄、郁李仁、桑叶、火麻仁等重量比组成。
4.如权利要求1所述的一种模拟粪便移植的生态食品，其特征在于：所述原料由大豆、苦荞、火麻仁按照重量比2-5：1-4：1-6组成。
5.如权利要求1、2、3或4所述的一种模拟粪便移植的生态食品，其特征在于：所述生态食品的制备步骤如下：
1)将原料经烘干、粉碎后与水按质量体积比1：1.5-2.5混匀，加入淀粉酶20-40U/g原料，于40-50℃，酶解30-60min；
所述原料经淀粉酶酶解后调节pH至1.5-3，加入胃蛋白酶80-110U/g原料，于30-50℃酶解60-120min；
所述原料经胃蛋白酶酶解后调节pH为5-7，加入胰酶1-3g/100g原料，于40-50℃下，酶解60-120min；
2)(1)将所述步骤1)最终得到的酶解原料进行灭菌处理；
(2)将枯草芽孢杆菌与凝结芽孢杆菌经活化后分别接入所述步骤2)-(1)得到的原料中，于温度35-39℃，进行好氧发酵25-50h；
(3)将所述鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳酸片球菌与植物乳杆菌经活化后接种于所述步骤步骤2)-(2)得到的发酵原料中，于35-39℃，密闭发酵
24-36h；
(4)将所述青春双歧杆菌、长双岐杆菌与动物双歧杆菌经活化后接种于所述步骤2)-(3)得到的发酵原料中，通入氮气，于35-39℃，严格密闭厌氧发酵18-30h；
3)将所述步骤2)得到的发酵原料经冻干至含水量为8％-10％以下，得到所述生态食品。
6.如权利要求5所述的一种模拟粪便移植的生态食品，其特征在于：所述步骤2)-(2)中，好氧发酵包括：控制通气量0.15-0.35m3/min，维持搅拌，转速10r/min，发酵20-40h，待原料含水量达到50％-80％时，将通气调至0.01-0.02m3/min，继续发酵5-10h。
7.如权利要求5所述的一种模拟粪便移植的生态食品，其特征在于：所述步骤2)-(2)中，枯草芽孢杆菌与凝结芽孢杆菌的接种量分别为106-107CFU/g、106-107CFU/g；
所述步骤2)-(3)中，所述鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳酸片球菌与植物乳杆菌的接种量分别为105-106CFU/g、106-107CFU/g、105-106CFU/g、106-
107CFU/g、106-107CFU/g、105-106CFU/g；
所述步骤2)-(4)中，所述青春双歧杆菌、长双岐杆菌与动物双歧杆菌的接种量分别为
105-106CFU/g、106-107CFU/g与107-108CFU/g。
8.如权利要求5所述的一种模拟粪便移植的生态食品，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌IOB430，保藏编号为CGMCC No.16024；所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌IOB502，保藏编号为：CGMCC No.16025；所述鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌IOB820，保藏编号为CGMCC No.17522；所述罗伊氏乳杆菌为罗伊氏乳杆菌IOB423，保藏编号为CGMCC No.16023；所述副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌IOB413，保藏编号为CGMCC No.16022；所述乳酸片球菌为乳酸片球菌IOB701，保藏编号为CGMCC No.16077；所述植物乳杆菌为植物乳杆菌IOB602，保藏编号为CGMCC No.16021；所述青春双歧杆菌为青春双歧杆菌IOB506，保藏编号为CGMCC No.16026；所述长双歧杆菌为长双歧杆菌IOB515，保藏编号为CGMCC No.16027；
所述动物双歧杆菌为动物双歧杆菌IOB402，保藏编号为CGMCC No.16028。
9.权利要求1-8任一所述的一种模拟粪便移植的生态食品的用途。
10.如权利要求9所述一种模拟粪便移植的生态食品的用途，其特征在于：所述生态食品在模拟粪便移植中的用途。
一种模拟粪便移植的生态食品及其制备方法与用途
技术领域
背景技术
[0002] 肠道微生物作为人体正常运行的重要参与者，在肠道内组成了一个复杂的微生态系统，通过彼此间及与人体间的相互作用，长期维持一种动态平衡状态，并参与肠道营养、免疫、代谢和屏障作用等生理活动。当这个微生态系统被打破时，人体便会产生一系列的健康问题，如炎症性肠病、复发性艰难梭菌感染、肠易激综合征、代谢相关疾病等。
[0003] 粪便移植又叫粪便菌群移植，是指把健康人的粪便菌群植入到患者肠道内，以此来重构患者肠道菌群，以此来治疗某些疾病的方法，近年来，粪菌移植的临床价值日益得到国内外医学界关注和认可，并已成功应用于复发性难辨梭状芽孢杆菌感染的治疗。此外，粪便移植技术用于治疗炎症性肠病、代谢相关疾病及神经系统相关疾病等也已经在临床或科研上取得了初步的进展。
[0004] 当前，体外模拟消化系统的相关专利较少，多用于科研探索，如公开号：CN108117991A的发明《一种肠道微生物体外模拟培养方法》公开了一种于液态发酵培养基中培养粪便样品，用于评估肠道微生物系统功能的方法。
[0005] 但粪便移植当前仍存在许多问题尚未解决，比如相关供体的筛查和选择、粪菌液制备以及移植流程等方面，尚未形成统一标准。由于心理接受程度的不同，在临床使用上主要受临床医生和患者的主观意愿直接影响。此外关于粪菌移植的疗效和其长期的安全性及医学证据不够充分，因粪菌移殖导致患者耐药菌感染的情况也偶有报道。发明内容：
[0006] 为了解决上述现有技术中的不足，本发明的目的之一在于提供一种模拟粪便移植的生态食品，该生态食品富含后生素和益生菌，且该生态食品能够模拟粪便移殖疗法的过程和原理，缓解因肠道菌群失衡而导致的一系列健康问题，如因肠道菌群失调导致的炎症性肠病、复发性艰难梭菌感染、肠易激综合征、代谢系统疾病等。同时，该生态食品脱离了粪便的范畴，避免了医生及患者心理上难以接受的问题。产品中菌群结构明确，菌种安全有益，生产过程清晰可控，产品质量安全，避免了粪便移殖前一系列的筛查、制备过程，也避免了因粪便中菌群结构复杂难明，制备时难以筛查导致患者耐药菌感染等情况。
[0007] 本发明的目的之二在于提供所述模拟粪便移植生态食品的制备方法，该方法为体外模拟人体消化系统加工豆类、谷物类及药食同源类原料中的一种或多种进行体外仿生消化的制备方法，于体外在严密清晰可控的肠道模拟系统中重构食物的消化过程。通过不同的酶系统，将原料中的淀粉、蛋白质、脂质等水解成易于益生菌和人体吸收的小分子营养成分，再利用发酵技术，模拟食物在肠道中被益生菌降解的过程，得到一种能够模拟粪便移殖疗法辅助缓解肠道菌群失衡导致的健康问题的生态食品。本发明制备的方法能做到生产过程无排放、无浪费、无污染，达到对原料的全部利用。
[0008] 本发明的目的之三在于提供上述模拟粪便移植生态食品用于食品保健领域。所述生态食品可直接食用，不必通过复杂的方法导入患者肠道，降低了给药的难度。因此本方法及本方法制备的生态食品可用做粪便移殖疗法的辅助或部分替代方案。
[0009] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0010] 第一方面，本发明提供了一种模拟粪便移植生态食品，主要由以下步骤制备获得，将原料经烘干、粉碎后与水按质量体积比1：1.5-2.5混匀，分三阶段依次加入单一酶：淀粉酶、胃蛋白酶、胰酶进行酶解；原料经灭酶后接入枯草芽孢杆菌与凝结芽孢杆菌进行好氧发酵，再接入鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳酸片球菌与植物乳杆菌进行密闭发酵，最后接入青春双歧杆菌、长双岐杆菌与动物双歧杆菌进行严格厌氧发酵，并经冻干获得；所述原料为豆类、谷物类或药食同源类原料中的一种或两种以上。
[0011] 优选的，所述豆类原料为大豆、黑豆、白芸豆、红豆、豌豆、绿豆、豇豆、蚕豆、赤小豆或小扁豆中的一种或两种以上。
[0013] 优选的，所述药食同源类原料为姜黄、郁李仁、火麻仁、莲子、桑叶、紫苏籽、枳椇子、余甘子、桃仁、杏仁中的一种或两种以上。
[0014] 优选的，所述原料由黑豆、小扁豆、大米、小米、糯米、薏仁米、大麦、小麦、藜麦、高粱、苦荞、玉米、黑芝麻等重量比组成。
[0015] 优选的，所述原料由大豆、赤小豆、白芸豆、燕麦、苦荞、姜黄、郁李仁、桑叶、火麻仁等重量比组成。
[0016] 优选的，所述原料由大豆、白芸豆、绿豆、赤小豆、小扁豆、燕麦、大米按照重量比2.5：2：1.5：1.5：1：1：0.5组成。
[0017] 更优选的，所述原料由大豆、苦荞、火麻仁按照重量比2-5：1-4：1-6组成。
[0018] 更优选的，所述原料由大豆、苦荞、火麻仁按照重量比4.5：3：2.5组成。
[0019] 第二方面，本发明提供了一种模拟粪便移植生态食品的制备方法，步骤如下：
[0020] 1)(1)将原料经烘干、粉碎后与水按质量体积比1：1.5-2.5混匀，加入淀粉酶20-40U/g原料，于40-50℃，酶解30-60min；
[0021] (2)将所述步骤1)-(1)得到的原料，调节pH至1.5-3，加入胃蛋白酶80-110U/g原料，于30-50℃下搅拌震荡60-120min：
[0022] (3)将所述步骤1)-(2)得到的原料，调节pH为5-7，加入胰酶1-3g/100g原料，于40-50℃下，搅拌酶解60-120min；
[0023] 2)(1)将所述步骤1)最终得到的酶解原料进行灭菌处理；
[0024] (2)将枯草芽孢杆菌与凝结芽孢杆菌经活化后分别接入所述步骤2)-(1)得到的原料中，于温度35-39℃，进行好氧发酵25-50h；
[0025] (3)将所述鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳酸片球菌与植物乳杆菌经活化后接种于所述步骤步骤2)-(2)得到的发酵原料中，于35-39℃，密闭发酵24-36h；
[0026] (4)将所述青春双歧杆菌、长双岐杆菌与动物双歧杆菌经活化后接种于所述步骤2)-(3)得到的发酵原料中，通入氮气，于35-39℃，严格密闭厌氧发酵18-30h；
[0027] 3)将所述步骤2)得到的发酵原料经冻干至含水量为8％-10％以下，得到所述生态食品。
[0029] 优选地，所述步骤1)-(1)中，原料烘干条件为60-80℃烘干4-8小时，粉碎至60-80目。
[0030] 优选地，所述步骤1)-(1)中，原料经烘干、粉碎后与水的体积比1：1.8。
[0031] 优选地，所述步骤1)-(1)中，淀粉酶添加量为30U/g，酶解条件为40℃，60min。
[0032] 所述步骤1)-(2)过程是模拟胃部的消化过程。
[0033] 优选地，所述步骤1)-(2)中，调节原料pH为2.5，胃蛋白酶添加量90U/g，酶解条件为35℃，90min。
[0034] 所述步骤1)-(3)过程是模拟食物在十二指肠中进行加工消化的过程。
[0035] 优选地，所述步骤1)-(3)中，胰酶的组成为：胰蛋白酶4000-4100U/g、胰淀粉酶10000-11000U/g、胰脂肪酶20000-21000U/g。
[0036] 优选地，所述步骤1)-(3)中，调节原料的pH为6.5，胰酶添加量为1.5g/100g原料，酶解条件为50℃，120min。
[0037] 本过程通过模拟消化系统的运动及消化酶的协同酶解，使原本完整大块的，分子结构复杂的原料，转化为糜状的，分子结构较简单的物质，更有利于后续步骤中益生菌的生长、代谢、繁殖。
[0038] 在胃部消化与十二指肠消化模拟系统中，虽然人体在正常的消化过程中，胃部消化与十二指肠消化过程是同时进行的，但是在本发明中，由于二者参与消化的酶系与最适酶解条件皆不同，本发明将模拟胃部消化过程与十二指肠消化过程分为两步进行，更好地发挥了不同酶系统中原料的充分酶解过程。
[0039] 所述步骤2)中，模拟下消化道特点对食物进行加工消化(空肠以下)
[0040] 模拟小肠及大肠中食物被肠道菌群发酵的过程进行益生菌三段发酵，食物在下消化道中的分解特点主要是出现了肠道菌群的发酵过程，同时水分被小肠和大肠吸收，经消化的糜状食物在此转为固态。
[0041] 人体消化系统中，上消化道主要对食物进行物理及化学降解，基本无微生物参与，而下消化道中出现了肠道菌群对食物进行分解的过程，本发明将上、下消化道分开模拟，一方面是为了更贴近真实消化过程，另一方面在上下消化道加工的中间，加入了一道灭酶灭菌的过程，使整个后期微生物降解过程中参与的菌群结构明确，使发酵更可控、产品更安全。
[0042] 优选地，所述步骤2)-(1)中，灭酶处理的条件为121℃，30min。
[0043] 优选地，所述步骤2)中，所述枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳酸片球菌、植物乳杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌和动物双歧杆菌的活化步骤为：将所述枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳酸片球菌、植物乳杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌和动物双歧杆菌的甘油管分别按1-2％(v/v活化培养基的体积比)接种于活化培养基进行活化，于36-38℃，培养22-26h后，得到一级种子液，将所述一级种子液按照接种量5-6％(v/v)分别再次转接活化培养基进行二次活化，于36-38℃，培养22-26h后，得到活化种子液。
[0044] 更优选地，所述步骤2)中，活化培养基为食品级原料配制MRS培养基，pH自然，121℃，20min。
[0045] 所述步骤2)中，MRS培养基组成为(g/L)：蛋白胨10g/L，牛肉粉5g/L，葡萄糖20g/L，酵母浸粉4g/L，乙酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，柠檬酸三铵2g/L，吐温80mL/L。
[0046] 所述步骤2)中，三组不同的菌种搭配，分别进行好氧发酵、兼性厌氧发酵及严格厌氧发酵，此三段发酵能保证好氧菌、兼性厌氧菌及严格厌氧菌都得到较好的生长，避免相互竞争抑制，出现单种菌比例过高的情况，增加菌种的多样性，对原料降解的更为彻底，也更接近食物在肠道中的发酵过程。
[0047] 优选地，所述步骤2)-(2)中，好氧发酵包括：控制通气量0.15-0.35m3/min，维持搅拌，转速10r/min，发酵20-40h，待原料含水量达到50％-80％时，将通气调至0.01-0.02m3/min，继续发酵5-10h。
[0048] 更优选地，所述步骤2)-(2)中，好氧发酵包括：控制通气量0.24m3/min，维持搅拌，3
发酵30h，待原料含水量达到60％时，将通气调至0.01m/min，继续发酵6h。
发酵30h，待原料含水量达到60％时，将通气调至0.01m/min，继续发酵6h。
[0049] 所述步骤2)-(2)中，该过程为好氧发酵，降低原料中的含水量；因此前期通气大(0.15-0.35m3/min)是为了在好氧发酵的同时，更快的消耗水分，以模拟食物中水分在肠道中被吸收，变成固态的过程。此外含水量对通气调节起到一个指示的作用，含水量达到适宜的量(即达到50％-80％)就可以进行通气调节。
[0050] 本发明中，发酵过程中通气调节幅度比较大，相比于常规技术中，在发酵过程中稳定通气量不变的参数控制，本发明以含水量作为调节通气的指标，降低通气量，通气量的降低，使得两株芽孢杆菌生成了芽孢，进入休眠状态，降低了对后续发酵的其他益生菌的竞争性抑制，使得后续其它益生菌得到了较好的生长繁殖，另外，其生长过程中水解了原料中多糖和蛋白质，促进了后续其它益生菌的生长繁殖。
[0051] 优选地，所述步骤2)-(3)(4)中，密闭发酵时间为24h，严格密闭厌氧发酵时间为30h。
[0052] 所述步骤2)-(3)中，密闭发酵并非严格厌氧发酵，而是属于兼性厌氧发酵。
[0053] 优选地，所述步骤2)-(2)中，枯草芽孢杆菌与凝结芽孢杆菌的接种量分别为106-107CFU/g、106-107CFU/g。
[0054] 更优选地，所述步骤2)-(2)中，枯草芽孢杆菌与凝结芽孢杆菌的接种量均为4-5×106CFU/g。
[0055] 优选地，所述步骤2)-(3)中，所述鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳酸片球菌与植物乳杆菌的接种量分别为105-106CFU/g、106-107CFU/g、105-106CFU/g、106-107CFU/g、106-107CFU/g、105-106CFU/g。
[0056] 更优选地，所述步骤2)-(3)中，所述鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、副5
干酪乳杆菌、乳酸片球菌与植物乳杆菌的接种量均为5-6×10CFU/g。
干酪乳杆菌、乳酸片球菌与植物乳杆菌的接种量均为5-6×10CFU/g。
[0057] 优选地，所述步骤2)-(4)中，所述青春双歧杆菌、长双岐杆菌与动物双歧杆菌的接种量分别为105-106CFU/g、106-107CFU/g与107-108CFU/g。
[0058] 更优选地，所述步骤2)-(4)中，所述青春双歧杆菌、长双岐杆菌与动物双歧杆菌的接种量分别为7-8×105CFU/g、5-6×106CFU/g与3-4×107CFU/g。
[0059] 优选地，所述步骤3)中，冻干时间为30-45h。
[0060] 优选的，所述步骤3)中，冻干时间为36h，至含水量10％以下。
[0061] 优选的，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)IOB430，已于2018年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16024；已于公开号为CN110521939A的发明专利《一种调节肠道健康的益生菌发酵食品及其制备方法》中公开。该株菌从公司益生菌库1000多株菌株中择优筛选而出，其生芽孢率可达到88.2％，其菌体在pH＝3的环境中处理2h，存活率为97.1％，在0.3％的胆盐中培养
24h，活菌数达到初始的81.6％，50℃处理12h，存活率达到78.1％，常温下储存6个月，存活率为84.9％，其芽孢于100℃高温处理20min，存活率达91.2％，本菌产纳豆激酶活力可达
4028U/g。
24h，活菌数达到初始的81.6％，50℃处理12h，存活率达到78.1％，常温下储存6个月，存活率为84.9％，其芽孢于100℃高温处理20min，存活率达91.2％，本菌产纳豆激酶活力可达
4028U/g。
[0062] 优选的，所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)IOB502，已于2018年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：
CGMCC No.16025；已于公开号为CN110521939A的发明专利《一种调节肠道健康的益生菌发酵食品及其制备方法》中公开。本株菌从公司益生菌库1000多株菌株中择优筛选而出，其生芽孢率可达71.6％、其菌体在pH＝3的环境中处理2h，存活率为95.4％，在0.3％的胆盐中培养24h，活菌数达到初始的78.5％，50℃处理12h，存活率达到81.2％，常温下储存6个月，存活率为86.3％，其芽孢于100℃高温处理20min，存活率达93.5％。
CGMCC No.16025；已于公开号为CN110521939A的发明专利《一种调节肠道健康的益生菌发酵食品及其制备方法》中公开。本株菌从公司益生菌库1000多株菌株中择优筛选而出，其生芽孢率可达71.6％、其菌体在pH＝3的环境中处理2h，存活率为95.4％，在0.3％的胆盐中培养24h，活菌数达到初始的78.5％，50℃处理12h，存活率达到81.2％，常温下储存6个月，存活率为86.3％，其芽孢于100℃高温处理20min，存活率达93.5％。
[0063] 优选的，所述鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)IOB820，已于2019年4月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17522；本株菌是2016年8月由梁武筛选于内蒙古传统发酵食品酸面团，在pH＝3的环境中处理2h，存活率为92.1％，在0.3％的胆盐中培养24h，活菌数达到初始的75.3％，常温下储存6个月，存活率为80.9％。由此说明该菌在酸性的胃肠道环境中具有良好的菌株活力，可以在提高胃肠道健康和改善菌群环境中发挥显著的功能。
[0064] 优选的，所述罗伊氏乳杆菌为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)IOB423，已于2018年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16023；已于公开号为CN110521939A的发明专利《一种调节肠道健康的益生菌发酵食品及其制备方法》中公开。本株菌从公司益生菌库1000多株菌株中择优筛选而出，在pH＝3的环境中处理2h，存活率为94.3％，在0.3％的胆盐中培养24h，活菌数达到初始的75.6％，常温下储存6个月，存活率为79.8％。
[0065] 优选的，所述副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)IOB413，已于2018年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16022；已于公开号为CN110521939A的发明专利《一种调节肠道健康的益生菌发酵食品及其制备方法》中公开。本株菌从公司益生菌库1000多株菌株中择优筛选而出，在pH＝3的环境中处理2h，存活率为89.3％，在0.3％的胆盐中培养24h，活菌数达到初始的72.4％，常温下储存6个月，存活率为80.2％，另外，本菌在发酵大豆浸取液的α-糖苷酶抑制率可达76.1％，DPPH-Ⅳ抑制率可达78.06％。
[0066] 优选的，所述乳酸片球菌为乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)IOB701，已于2018年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16077；已于公开号为CN110521939A的发明专利《一种调节肠道健康的益生菌发酵食品及其制备方法》中公开。本株菌从公司益生菌库1000多株菌株中择优筛选而出，在pH＝3的环境中处理2h，存活率为91.4％，在0.3％的胆盐中培养24h，活菌数达到初始的81.5％，常温下储存6个月，存活率为94.8％，本菌具有良好的温度稳定性，发酵大豆60℃烘干12h，菌种存活率为89.61％，另外，本菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等常见有害菌做抑菌实验，在培养皿上均出现明显抑菌圈，表现出明显的抑制效果。
[0067] 优选的，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)IOB602，已于2018年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16021；已于公开号为CN110521939A的发明专利《一种调节肠道健康的益生菌发酵食品及其制备方法》中公开。本株菌从公司益生菌库1000多株菌株中择优筛选而出，在pH＝3的环境中处理2h，存活率为90.7％，在0.3％的胆盐中培养24h，活菌数达到初始的79.2％，常温下储存6个月，存活率为95.1％。
[0068] 优选的，所述青春双歧杆菌为青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)IOB506，已于2018年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16026；已于公开号为CN110521785A的发明专利《益生菌发酵功能性食品及其制备》中公开。本株菌从公司益生菌库1000多株菌株中择优筛选而出，在pH＝3的环境中处理2h，存活率为84.1％，在0.3％的胆盐中培养24h，活菌数达到初始的70.6％，常温下储存6个月，存活率为71.1％。
[0069] 优选的，所述长双歧杆菌为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)IOB515，已于2018年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16027；已于公开号为CN110521939A的发明专利《一种调节肠道健康的益生菌发酵食品及其制备方法》中公开。本株菌从公司益生菌库1000多株菌株中择优筛选而出，在pH＝3的环境中处理2h，存活率为69.4％，在0.3％的胆盐中培养24h，活菌数达到初始的75.8％，常温下储存6个月，存活率为65.7％。
[0070] 优选的，所述动物双歧杆菌为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)IOB402，已于2018年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16028；已于公开号为CN110521939A的发明专利《一种调节肠道健康的益生菌发酵食品及其制备方法》中公开。本株菌从公司益生菌库1000多株菌株中择优筛选而出，在pH＝3的环境中处理2h，存活率为87.5％，在0.3％的胆盐中培养24h，活菌数达到初始的79.6％，常温下储存6个月，存活率为86.5％。
[0071] 本发明的目的之三是提供所述生态食品的用途。
[0072] 所述生态食品的食用量为2-30g/天。
[0073] 优选地，所述生态食品的用途具体为模拟粪便移殖疗法，缓解因肠道微生态失调而导致的一系列健康问题，如因肠道菌群失衡导致的炎症性肠病、代谢相关疾病等。
[0074] 有益效果
[0075] 本发明提供了一种体外模拟人体消化系统加工豆类、谷物类及药食同源类等食物的方法，于体外在严密清晰可控的肠道模拟系统中重构食物的消化过程，由此技术制备的产品脱离了粪便的范畴，避免了医生及患者心理上难以接受的问题。产品中菌群结构明确，菌种安全有益，生产过程清晰可控，产品质量安全，避免了粪便移殖前一系列的筛查、制备过程，也避免了因粪便中菌群结构复杂难明，制备时难以筛查导致患者耐药菌感染等情况。产品可直接食用，不必通过复杂的方法导入患者肠道，降低了治疗难度。因此本方法及本方法制备的生态食品可用做粪便移殖疗法的补充或部分替代方案。
[0076] (1)本发明首次提供一种在体外模拟人体消化过程各阶段的特点将食品原料进行加工的仿生消化技术，通过淀粉酶、胃蛋白酶、胰酶，将豆类、谷物类及药食同源类等食物中的淀粉、蛋白质、脂质等水解成易于益生菌和人体吸收的小分子营养成分，再利用发酵技术，模拟食物在肠道中被益生菌降解的过程，得到一种能够模拟粪便移殖疗法辅助缓解肠道菌群失衡导致的健康问题的生态食品。
[0077] (2)本发明为更贴近食物在肠道中的发酵、消化过程，通过大量实验，探索了不同菌种间的互利共生特性，复配摸索出了好氧菌、兼性厌氧菌及厌氧菌三种菌种复配方案，并依据不同菌种复配方案的发酵特性进行分段发酵实验，最终确定不同菌种复配方案的发酵顺序与发酵参数。
[0078] (3)本发明通过此技术，能够实现生产过程无排放、无浪费、无污染，达到对原料的全部利用。
[0079] 优势及有益效果：
[0080] (1)与粪便移殖相比，本发明提供的体外模拟人体消化系统加工豆类、谷物类及药食同源类等食物的方法，过程清晰可控，产品中菌群结构明确，避免了粪便移殖前一系列的筛查、制备过程，也避免了因粪便中菌群结构复杂难明，制备时难以筛查导致患者耐药菌感染等情况。
[0081] (2)由此技术制备的产品脱离了粪便的范畴，避免了医生及患者心理上难以接受的问题。
[0082] (3)产品可直接入口食用，不必通过复杂的方法导入患者肠道，降低了治疗难度。
[0083] (4)生产过程中，菌群代谢产生的大量后生素及活菌，与经发酵的原料一同被保留在产品中，易于人体吸收的同时，也增强了其调节肠道微生态、改善肠道疾病，缓解因肠道微生态失调导致的健康问题的作用。
[0084] (5)发酵产生的多糖等物质，又对菌体形成了天然的包埋作用，增强了产品中菌体的稳定性。
[0086] 图1：发酵顺序对活菌数的影响；
[0087] 图2：通气发酵不同工艺对活菌数的影响；
[0088] 图3：不同原料配比对活菌数的影响；
[0089] 图4：不同接种量对活菌数的影响；
[0090] 图5：发酵时间对活菌数的影响。
[0091] 图6：小鼠炎症因子TNF-a、NF-kB、IL-10表达水平
具体实施方式
[0092] 下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本发明并不限于以下具体实施例，且保护范围不限于此。
[0093] 实施例1：利用在体外模拟人体消化过程各阶段特点的仿生技术制备生态食品的方法
[0094] 步骤如下：
[0095] 1、模拟上消化道特点对食物进行加工(口腔-十二指肠部分)
[0096] (1)模拟口腔研磨、搅拌及唾液淀粉酶酶解：将大豆、苦荞、火麻仁清洗后置于60℃烘箱烘干6小时，磨粉至60目以上，得大豆粉、苦荞粉、火麻仁粉，将大豆粉、苦荞粉、火麻仁粉按照重量比4.5：3：2.5混合，得混合原料粉，将原料粉与水按质量体积比1：1.8的比例混匀，加热后加入淀粉酶进行酶解，淀粉酶添加量为30U/g，酶解条件为40℃，60min，过程中保持搅拌；
[0097] (2)模拟胃部的消化过程：将第一步加工后，已成糜状的原料调节pH至2.5，加入胃蛋白酶进行酶解，同时保持搅拌与震荡，胃蛋白酶添加量90U/g，酶解条件为35℃，90min；
[0098] (3)模拟十二指肠部分进行加工消化：继续将原料调节pH为6.5，加入胰酶(内含：胰蛋白酶4000U/g以上、胰淀粉酶10000U/g以上、胰脂肪酶20000U/g以上)模拟食物在十二指肠中的消化过程，胰酶添加量为50U/g，酶解条件为50℃，120min，过程中保持搅拌；
[0099] 2、模拟下消化道特点对食物进行加工消化(空肠以下)
[0100] (1)模拟上消化道加工完成后，将上述步骤1-(3)经过酶解加工后的原料泵入肠道模拟设备进行加工，首先进行灭酶灭菌，条件为121℃，30min；
[0101] (2)配制活化培养基：以食品级原料配制MRS培养基作为活化培养基，对活化培养基进行灭菌灭酶，条件为：121℃，20min；
[0102] (3)菌种活化：将枯草芽孢杆菌IOB430、凝结芽孢杆菌IOB502、鼠李糖乳杆菌IOB820、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌IOB423、副干酪乳杆菌IOB413、乳酸片球菌IOB701、植物乳杆菌IOB602、青春双歧杆菌IOB506、长双歧杆菌IOB515和动物双歧杆菌IOB402的甘油管分别按1％(v/v活化培养基的体积比)接种于所述活化培养基中进行活化，pH自然，控制温度为37℃；分别静置培养活化24h后，得到一级种子液，将一级种子液按接种量5％(v/v)再次转接活化培养基进行二次活化，于37℃，静置培养24h后，再活化24h后得活化种子液；
[0103] (4)模拟小肠及大肠中食物被肠道菌群降解的过程进行益生菌三段发酵：
[0104] ①好氧发酵，同时模拟肠道对水分的吸收过程，降低原料中的含水量：将上述步骤1-(3)活化完成的枯草芽孢杆菌与凝结芽孢杆菌活化种子液通过接种管路接入肠道模拟设备中的原料，使每克原料中枯草芽孢杆菌的接种量为4×106CFU/g，凝结芽孢杆菌的接种量
6 3
为5×10 CFU/g，维持温度37℃，通气量0.24m /min，维持搅拌，发酵30h，待原料含水量达到
60％时，将通气调至0.01m3/min，继续发酵6h；
6 3
为5×10 CFU/g，维持温度37℃，通气量0.24m /min，维持搅拌，发酵30h，待原料含水量达到
60％时，将通气调至0.01m3/min，继续发酵6h；
[0105] ②密闭发酵：待第①步发酵完成后，将上述步骤1-(3)活化好的鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳酸片球菌与植物乳杆菌活化种子液通过接种管6
路接入肠道模拟设备中，使每克原料中鼠李糖乳杆菌的接种量为5×10CFU/g、嗜酸乳杆菌的接种量为6×106CFU/g、罗伊氏乳杆菌的接种量为6×105CFU/g、副干酪乳杆菌的接种量为
5×106CFU/g，乳酸片球菌的接种量为5×106CFU/g，植物乳杆菌的接种量为6×105CFU/g，维持温度37℃，每隔4小时搅拌一次，密闭发酵24h；
路接入肠道模拟设备中，使每克原料中鼠李糖乳杆菌的接种量为5×10CFU/g、嗜酸乳杆菌的接种量为6×106CFU/g、罗伊氏乳杆菌的接种量为6×105CFU/g、副干酪乳杆菌的接种量为
5×106CFU/g，乳酸片球菌的接种量为5×106CFU/g，植物乳杆菌的接种量为6×105CFU/g，维持温度37℃，每隔4小时搅拌一次，密闭发酵24h；
[0106] ③严格厌氧发酵：待第②步发酵完成后，将上述步骤1-(3)活化好的青春双歧杆菌、长双岐杆菌与动物双歧杆菌活化种子液通过接种管路接入肠道模拟设备中，使每克原料中青春双歧杆菌的接种量为8×105CFU/g，长双岐杆菌的接种量为5×106CFU/g，动物双歧杆菌的接种量为4×107CFU/g，接种完毕后将氮气充入肠道模拟设备中，置换掉空气，创造严格厌氧环境，维持温度37℃，每隔6小时搅拌一次，密闭发酵30h；
[0108] 经测定，所得生态食品中总活菌数达到1.07×1010CFU/g，其中，枯草芽孢杆菌数4.89×109CFU/g，双歧杆菌总数2.38×109CFU/g，其他益生菌总数3.43×109CFU/g。
[0109] 实施例2：利用在体外模拟人体消化过程各阶段特点的仿生技术制备生态食品的方法
[0110] 步骤如下：
[0111] 1、模拟上消化道特点对食物进行加工消化(口腔-十二指肠部分)
[0112] (1)模拟口腔研磨、搅拌及唾液淀粉酶酶解：将大豆、赤小豆、白芸豆、燕麦、苦荞、姜黄、郁李仁、桑叶、火麻仁清洗后置于60℃烘箱烘干6小时，磨粉至60目以上，得大豆粉、赤小豆粉、白芸豆粉、燕麦粉、苦荞粉、姜黄粉、郁李仁粉、桑叶粉、火麻仁粉，等重量比混匀，得混合原料粉，将原料粉与水按1：1.8的比例混匀，加热后加入淀粉酶进行酶解，淀粉酶添加量为40U/g，酶解条件为40℃，45min，过程中保持搅拌；
[0113] (2)模拟胃部的消化过程：将第一步加工后，已成糜状的原料调节pH至2，加入胃蛋白酶进行酶解，同时保持搅拌与震荡，胃蛋白酶添加量100U/g，酶解条件为40℃，100min；
[0114] (3)模拟十二指肠部分进行加工消化：继续将原料调节pH为7，加入胰酶(内含：胰蛋白酶4000U/g以上、胰淀粉酶10000U/g以上、胰脂肪酶20000U/g以上)模拟食物在十二指肠中的消化过程，胰酶添加量为60U/g，酶解条件为50℃，搅拌酶解120min，过程中保持搅拌；
[0115] 2、模拟下消化道特点对食物进行加工消化(空肠以下)
[0116] (1)模拟上消化道加工完成后，将步骤1-(3)加工后的原料泵入肠道模拟设备进行加工，首先进行灭酶灭菌，条件为121℃，30min；
[0117] (2)配制活化培养基：以食品级原料配制MRS培养基作为活化培养基，对活化培养基进行灭菌灭酶，条件为：121℃，20min；
[0118] (3)菌种活化：将枯草芽孢杆菌IOB430、凝结芽孢杆菌IOB502、鼠李糖乳杆菌IOB820、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌IOB423、副干酪乳杆菌IOB413、乳酸片球菌IOB701、植物乳杆菌IOB602、青春双歧杆菌IOB506、长双歧杆菌IOB515和动物双歧杆菌IOB402的甘油管分别按1％(v/v活化培养基的体积比)接种于活化培养基进行活化，pH自然，控制温度为37℃；分别静置培养活化24h后，得到一级种子液，将所述一级种子液按照接种量5％(v/v)再次转接活化培养基进行二次活化，于37℃再次静置培养活化24h后得活化种子液；
[0119] (4)模拟小肠及大肠中食物被肠道菌群降解的过程进行益生菌三段发酵：
[0120] ①好氧发酵，同时模拟肠道对水分的吸收过程，降低原料中的含水量：将上述步骤2-(3)活化完成的枯草芽孢杆菌与凝结芽孢杆菌活化种子液通过接种管路接入肠道模拟设备中的原料中，使每克原料中的枯草芽孢杆菌的接种量为5×106CFU/g，凝结芽孢杆菌的接种量为5×106CFU/g，维持温度37℃，通气量0.3m3/min，维持搅拌，发酵40h，待原料含水量达到60％时，将通气调至0.01m3/min，继续发酵6h；
[0121] ②密闭发酵：待第①步发酵完成后，将上述步骤2-(3)活化好的鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳酸片球菌与植物乳杆菌活化种子液通过接种管路接入肠道模拟设备中，使每克原料中的鼠李糖乳杆菌的接种量为6×106CFU/g、嗜酸乳杆菌的接种量为5×106CFU/g、罗伊氏乳杆菌的接种量为6×105CFU/g、副干酪乳杆菌的接种量6 6 5
为5×10CFU/g，乳酸片球菌的接种量为5×10CFU/g，植物乳杆菌的接种量为5×10CFU/g，维持温度37℃，每隔4小时搅拌一次，密闭发酵36h；
为5×10CFU/g，乳酸片球菌的接种量为5×10CFU/g，植物乳杆菌的接种量为5×10CFU/g，维持温度37℃，每隔4小时搅拌一次，密闭发酵36h；
[0122] ③严格厌氧发酵：待第②步发酵完成后，将上述步骤2-(3)活化好的青春双歧杆菌、长双岐杆菌与动物双歧杆菌活化种子液通过接种管路接入肠道模拟设备中，使每克原5 6
料中青春双歧杆菌的接种量为7×10CFU/g，长双岐杆菌的接种量为6×10CFU/g，动物双歧杆菌的接种量为4×107CFU/g，接种完毕后将氮气充入肠道模拟设备中，置换掉空气，创造严格厌氧环境，维持温度37℃，每隔6小时搅拌一次，密闭发酵30h；
料中青春双歧杆菌的接种量为7×10CFU/g，长双岐杆菌的接种量为6×10CFU/g，动物双歧杆菌的接种量为4×107CFU/g，接种完毕后将氮气充入肠道模拟设备中，置换掉空气，创造严格厌氧环境，维持温度37℃，每隔6小时搅拌一次，密闭发酵30h；
[0123] 3、加工结束后，将降解后的产物放入真空冷冻干燥机内冻干36h，至含水量为10％以下，制得富含后生素和多种益生菌的生态食品；
[0124] 经测定，所得生态食品中总活菌数达到8.7×109CFU/g，其中，枯草芽孢杆菌数4.51×109CFU/g，双歧杆菌总数1.82×109CFU/g，其他益生菌总数2.37×109CFU/g。
[0125] 实施例3不同发酵参数下生态食品的制备
[0126] (一)仿生消化原料的不同配比
[0127] 将原料大豆、苦荞、火麻仁分为5组不同重量比，设置以下分组：
[0128] 组合一：3：3：4
[0129] 组合二：3.5：2：4.5
[0130] 组合三：4：2.5：3.5
[0131] 组合四：4.5：3：2.5
[0132] 组合五：5：3.5：1.5
[0133] 按照以上五组不同的比重进行以下生态食品的制备，步骤如下：
[0134] 1、模拟上消化道特点对食物进行加工：步骤同实施例1的步骤1的(1)-(3)，唯一不同的是原料的组成是分别按照上述五组不同的组合配比；
[0135] 2、模拟下消化道特点对食物进行加工消化：
[0136] (1)模拟上消化道加工完成后，将上述步骤1-(3)经过酶解加工后的原料泵入肠道模拟设备进行加工，首先进行灭酶灭菌，条件为121℃，30min；
[0137] (2)配制活化培养基：同实施例1的步骤2的(2)；
[0138] (3)菌种活化：菌种来源和活化方法同实施例1的步骤2的(3)；
[0139] (4)模拟小肠及大肠中食物被肠道菌群降解的过程进行益生菌三段发酵：
[0140] 步骤①好氧发酵、②密闭发酵、③严格厌氧发酵方法和过程基本同本发明实施例1的步骤2-(4)，与实施例1略有不同的是发酵参数有所不同，其中：
[0141] (a)三阶段发酵过程中，益生菌的接种量为：枯草芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳酸片球菌、植物乳杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌和动物双歧杆菌的接种量之比为：1：1：0.1：1：0.1：1：1：0.1：0.1：1：10，其比例中，比例为“1”，即数字为“1”表示接种量为4×106CFU/g，“0.1”即为4×105CFU/g，“10”即为4×106CFU/g，所述接种量为每克原料中的菌个数；
[0142] (b)发酵时间：
[0143] ①好氧发酵过程中，通气量为0.24m3/min时发酵30h，待原料含水量达到60％时，将通气调至0.01m3/min，继续发酵5h；
[0144] ②密闭发酵过程中：发酵时间为30h；
[0145] ③严格厌氧发酵过程中，发酵时间为24h。
[0146] 3、加工结束后，将降解后的产物放入真空冷冻干燥机内冻干36h，至含水量为10％以下，进行后续指标检测；
[0147] 实验结果：
[0148] 以活菌数作为指标，结果参照附图3所示，组合一至五的益生菌活力均较为显著，其中组合四的原料配比：大豆粉：苦荞粉：火麻仁粉＝4.5：3：2.5，测得益生菌的总菌数为7.34×109CFU/g，其中，枯草芽孢杆菌数4.01×109CFU/g，双歧杆菌总数1.41×109CFU/g，其他益生菌总数1.92×109CFU/g，其益生菌活力更为显著，在此配方下，组合四各原料提供的碳氮源比例在此工艺中，益生菌的生长繁殖更为显著。
[0149] (二)模拟下消化道消化过程中不同的接种量
[0150] 在三段发酵过程中，通过限定不同益生菌的添加比例来测定对应生态食品中益生菌的菌活力。分别将三段发酵中的微生物菌剂的不同配比进行分组，共分为8组，具体如下：
[0151] 枯草芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳酸片球菌、植物乳杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌和动物双歧杆菌的接种量的配比分组如下：
[0152] 组一：1：1：0.15：1.25：0.1：1.5：1：0.125：0.15：1.5：10
[0153] 组二：1：1.25：0.125：1.5：0.15：1.25：1.25：0.15：0.2：1.25：10[0154] 组三：1：1.5：0.15：1.25：0.125：1.5：1：0.15：0.15：1.5：5
[0155] 组四：1.25：1：0.2：1.5：0.125：1.5：2：0.15：0.2：1.25：5
[0156] 组五：1.5：1.25：0.15：1.5：0.15：2：1.25：0.15：0.2：1.5：10
[0157] 组六：1.5：2：0.125：1.25：0.2：1.25：1.5：0.2：0.2：1.25：5
[0158] 组七：2：1.25：0.15：1.25：0.1：2：1：0.125：0.15：1.5：10
[0159] 组八：2：1.5：0.125：2：0.15：1.25：1：0.15：0.1：1.25：5
[0160] 其比例中，比例为“1”，即数字“1”表示接种量为4×106CFU/g，“0.125”即为5×105CFU/g，“0.1”即为4×105CFU/g，“0.15”即为6×105CFU/g，“0.2”即为8×105CFU/g，
6
“1.25”即为5×10CFU/g，以此类推。
6
“1.25”即为5×10CFU/g，以此类推。
[0161] 按照以上八组不同的益生菌比例进行以下生态食品的制备，步骤如下：
[0162] 1、模拟上消化道特点对食物进行加工：步骤同实施例1的步骤1的(1)-(3)；
[0163] 2、模拟下消化道特点对食物进行加工消化：
[0164] (1)模拟上消化道加工完成后，将上述步骤1的(3)经过酶解加工后的原料泵入肠道模拟设备进行加工，首先进行灭酶灭菌，条件为121℃，30min；
[0165] (2)配制活化培养基：同实施例1的步骤2-(2)；
[0166] (3)菌种活化：菌种来源和活化方法同实施例1的步骤2-(3)；
[0167] (4)模拟小肠及大肠中食物被肠道菌群降解的过程进行益生菌三段发酵：
[0168] 步骤①好氧发酵、②密闭发酵、③严格厌氧发酵方法和过程基本同本发明实施例1的步骤2-(4)，与实施例1略有不同的是发酵参数有所不同，其中：
[0169] (a)三段发酵过程中，益生菌枯草芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳酸片球菌、植物乳杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌和动物双歧杆菌的接种量的配比按照上述八组分组进行接种发酵；
[0170] (b)发酵时间：
[0171] ①好氧发酵过程中，通气量为0.24m3/min时发酵30h，待原料含水量达到60％时，将通气调至0.01m3/min，继续发酵5h；
[0172] ②密闭发酵过程中：发酵时间为30h；
[0173] ③严格厌氧发酵过程中，发酵时间为24h。
[0174] 3、加工结束后，将降解后的产物放入真空冷冻干燥机内冻干36h，至含水量为10％以下，进行后续指标检测；
[0175] 实验结果：
[0176] 以活菌数作为指标，结果参照附图4所示，组一至八的益生菌活力均较为显著，可以看出各菌接种量的比例搭配适宜，各菌种没有出现单一菌种繁殖过快，相互竞争干扰的情况。
[0177] 其中组二：1：1.25：0.125：1.5：0.15：1.25：1.25：0.15：0.2：1.25：10的接种量配比进行的三段发酵，其益生菌活力更为显著，测得益生菌的总菌数为8.71×109CFU/g，其中，枯草芽孢杆菌数5.01×109CFU/g，双歧杆菌总数1.67×109CFU/g，其他益生菌总数2.03×109CFU/g。
[0178] (三)模拟下消化道消化过程中，益生菌不同的消化时间
[0179] 在三段发酵过程中，通过限定三段发酵过程中不同的发酵时间来测定对应生态食品中益生菌的菌活力。
[0180] 将不同阶段的发酵时间进行分组，共分为六组，6组发酵时间按①好氧发酵，通气量为0.24m3/min时的发酵时间，通气调至0.01m3/min时的发酵时间，②密闭发酵过程的发酵时间以及③严格厌氧发酵过程的发酵时间，分组如下：
[0181] 组一：20h，6h，30h，24h；组二：20h，8h，36h，20h
[0182] 组三：25h，8h，30h，24h；组四：30h，6h，24h，30h
[0183] 组五：30h，6h，30h，24h；组六：40h，8h，36h，30h
[0184] 按照以上六组不同的发酵时间进行以下生态食品的制备，步骤如下：
[0185] 1、模拟上消化道特点对食物进行加工：步骤同实施例1的步骤1(1)-(3)；
[0186] 2、模拟下消化道特点对食物进行加工消化：
[0187] (1)模拟上消化道加工完成后，将上述步骤1-(3)经过酶解加工后的原料泵入肠道模拟设备进行加工，首先进行灭酶灭菌，条件为121℃，30min；
[0188] (2)配制活化培养基：同实施例1的步骤2-(2)；
[0189] (3)菌种活化：菌种来源和活化方法同实施例1的步骤2-(3)；
[0190] (4)模拟小肠及大肠中食物被肠道菌群降解的过程进行益生菌三段发酵：
[0191] 步骤①好氧发酵、②密闭发酵、③严格厌氧发酵方法和过程基本同本发明实施例1的步骤2-(4)，与实施例1略有不同的是发酵时间有所不同，其中：
[0192] (a)三阶段发酵过程中，益生菌的接种量为：枯草芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳酸片球菌、植物乳杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌和动物双歧杆菌的接种量之比为：1：1：0.1：1：0.1：1：1：0.1：0.1：1：10，其比例中数字“1”表示接种量为4×106CFU/g，“0.1”即为4×105CFU/g，“10”即为4×106CFU/g，所述接种量为每克原料中的菌个数；
[0193] (b)发酵时间：
[0194] ①好氧发酵、②密闭发酵以及③严格厌氧发酵过程中的发酵时间按照以上六组分组进行。
[0195] 3、加工结束后，将降解后的产物放入真空冷冻干燥机内冻干36h，至含水量为10％以下，进行后续指标检测；
[0196] 实验结果：
[0197] 以活菌数作为指标，结果参照附图5所示，组一至六的益生菌活力均较为显著，由此说明个阶段的发酵时间控制可以使好氧菌和兼性厌氧菌恰好生长至能够消耗后期厌氧阶段残留氧气的水平，又未对其他菌种造成竞争性抑制，使各菌种生长平衡。
[0198] 其中利用组四的发酵时间进行的发酵过程，其益生菌活力更为显著，测得益生菌的总菌数为1.04×1010CFU/g，其中，枯草芽孢杆菌数4.81×109CFU/g，双歧杆菌总数2.47×109CFU/g，其他益生菌总数3.12×109CFU/g。
[0199] 实验例1益生菌三段发酵顺序对于益生菌菌活力的影响
[0200] 本发明中益生菌三段发酵过程中，好氧发酵、兼性厌氧发酵及严格厌氧发酵三个不同阶段的发酵对于益生菌的菌种活力有着较大的影响，本实验例为了验证不同发酵阶段的发酵顺序对于益生菌活力的影响，将好氧发酵、密闭发酵、严格厌氧发酵按照不同顺序，不同发酵时间，分为6组，其中一组为实验组，五组为对照组，分别为：
[0201] 实验组1：好氧发酵40h，密闭发酵30h，严格厌氧发酵24h
[0202] 对照组1：好氧发酵40h，严格厌氧发酵24h，密闭发酵30h
[0203] 对照组2：密闭发酵30h，好氧发酵40h，严格厌氧发酵24h
[0204] 对照组3：密闭发酵30h，严格厌氧发酵24h，好氧发酵40h
[0205] 对照组4：严格厌氧发酵24h，好氧发酵40h，密闭发酵30h
[0206] 对照组5：严格厌氧发酵24h，密闭发酵30h，好氧发酵40h
[0207] 其中好氧发酵通气量为0.2m3/min。
[0208] 以上分组中：涉及好氧发酵阶段接种的菌种均为枯草芽孢杆菌与凝结芽孢杆菌活6
化种子液，每克原料中枯草芽孢杆菌的接种量为4×10CFU/g，凝结芽孢杆菌的接种量为4×106CFU/g，维持温度37℃，通气量0.2m3/min，维持搅拌，发酵数小时，待原料含水量达到
60％时，将通气调至0.01m3/min，继续发酵6h；
化种子液，每克原料中枯草芽孢杆菌的接种量为4×10CFU/g，凝结芽孢杆菌的接种量为4×106CFU/g，维持温度37℃，通气量0.2m3/min，维持搅拌，发酵数小时，待原料含水量达到
60％时，将通气调至0.01m3/min，继续发酵6h；
[0209] 涉及的密闭发酵阶段接种的菌种均为鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳酸片球菌与植物乳杆菌活化种子液，通过接种管路接入肠道模拟设备中，使每克原料中鼠李糖乳杆菌的接种量为4×105CFU/g、嗜酸乳杆菌的接种量为4×106CFU/g、罗伊氏乳杆菌的接种量为4×105CFU/g、副干酪乳杆菌的接种量为4×106CFU/g，乳酸片球菌的接种量为5×106CFU/g，植物乳杆菌的接种量为4×105CFU/g，维持温度37℃，每隔4小时搅拌一次，密闭发酵数小时；
[0210] 涉及的严格厌氧发酵阶段接种的菌种均为青春双歧杆菌、长双岐杆菌与动物双歧杆菌活化种子液，通过接种管路接入肠道模拟设备中，使每克原料中青春双歧杆菌的接种量为4×105CFU/g，长双岐杆菌的接种量为4×106CFU/g，动物双歧杆菌的接种量为4×107CFU/g，接种完毕后将氮气充入肠道模拟设备中，置换掉空气，创造严格厌氧环境，维持温度37℃，每隔6小时搅拌一次，密闭发酵数小时。
[0211] 上述菌种的菌种来源以及活化种子液的活化过程同本发明实施例1步骤2-(3)。
[0212] 上述不同发酵阶段的发酵顺序和发酵时间分别按照实验组和对照组的发酵顺序和发酵时间进行。
[0213] 实验方法如下：
[0214] 1、模拟上消化道特点对食物进行加工消化(口腔-十二指肠部分)
[0215] (1)模拟口腔研磨、搅拌及唾液淀粉酶酶解：以大豆为发酵底物，清洗后置于60℃烘箱烘干6小时，磨粉至60目以上，得混合原料粉，将原料粉与水按1：1.8的比例混匀，加热后加入淀粉酶进行酶解，淀粉酶添加量为30U/g，酶解条件为40℃，60min，过程中保持搅拌；
[0216] (2)模拟胃部消化过程中，将第一步加工后，已成糜状的原料调节pH为2.5，加入胃蛋白酶进行酶解，同时保持搅拌与震荡，胃蛋白酶添加量90U/g，酶解条件为35℃，90min；
[0217] (3)模拟十二指肠部分进行加工消化：操作步骤和试剂添加量同实施例1步骤1-(3)；
[0218] 2、模拟下消化道特点对食物进行加工消化(空肠以下)
[0219] (1)模拟上消化道加工完成后，将上述步骤1-(3)经过酶解加工后的原料泵入肠道模拟设备进行加工，首先进行灭酶灭菌，条件为121℃，30min；
[0220] (2)配制活化培养基：以食品级原料配制MRS培养基作为活化培养基，对活化培养基进行灭菌灭酶，条件为：121℃，20min；
[0221] (3)菌种活化：同实施例1步骤2-(3)
[0222] (4)益生菌三段发酵：按照上述实验组和对照组对应的发酵阶段的发酵顺序和发酵时间进行。
[0223] 3、加工结束后，将降解后的产物放入真空冷冻干燥机内冻干36h，至含水量为10％以下，进行后续指标检测；
[0224] 实验结果：
[0225] 以活菌数作为指标，结果参照图1所示，综合总活菌数及不同菌的平衡性来看，本发明经过好氧发酵、兼性厌氧发酵及严格厌氧发酵三个不同阶段顺序的发酵，获得了显著的益生菌菌活力，在经过好氧发酵40h，密闭发酵30h，严格厌氧发酵24h，测得益生菌的总菌数为7.05×109CFU/g，其中，枯草芽孢杆菌数3.32×109CFU/g，双歧杆菌总数1.71×109CFU/g，其他益生菌总数2.02×109CFU/g。其平均菌种活力均显著高于对照组。本发明中，先进行好氧发酵，使得好氧菌生长至合适水平，在密闭发酵及严格厌氧发酵过程中，通过消耗游离氧气的方式，促进了其他菌的生长，另外，枯草芽孢杆菌初步分解了多糖和蛋白质，更有利于乳酸菌的利用。
[0226] 实验例2好氧发酵阶段不同控氧工艺对于益生菌菌活力的影响
[0227] 为了说明好氧发酵阶段不同控氧工艺对于益生菌菌活力的影响，特将好氧发酵阶段进行不同的分组，以证明不同控制条件下，好氧发酵对于益生菌菌活力的影响，具体分组如下：
[0228] 实验组：先好氧发酵32h，控制通气量为0.2m3/min，后降低通气为0.01m3/min，发酵8h；
[0229] 对照组1：好氧发酵40h，控制通气量为0.2m3/min；
[0230] 对照组2：先好氧发酵32h，控制通气量为0.2m3/min，后关闭通气，密闭发酵8h；
[0231] 对照组3：先好氧发酵32h，控制通气量为0.2m3/min，后通入氮气，严格厌氧发酵8h。
[0232] 具体方法如下：
[0233] 按实验例1的步骤1、步骤2-(1)(2)(3)(4)-①好氧发酵、②密闭发酵、③严格厌氧发酵的工艺进行发酵，与实施例1不同的是，发酵原料是以大豆为发酵底物，其中步骤2-(4)-①好氧发酵阶段，是按照以上实验组和对照组的方法进行发酵。发酵完成后，按上述方法冻干后进行活菌数检测。
[0234] 实验结果：
[0235] 以活菌数为指标，参照附图2，本发明的实验组中，先好氧发酵32h，后降低通气为0.01m3/min，发酵8h，测得益生菌的总菌数为9.51×109CFU/g，其中，枯草芽孢杆菌数3.72×
109CFU/g，双歧杆菌总数2.37×109CFU/g，其他益生菌总数3.42×109CFU/g，其益生菌平均菌活力显著高于其他对照组，本发明实验组中，通气量的变化，使得两株芽孢杆菌生成了芽孢，进入休眠状态，降低了对后续发酵的其他益生菌的竞争性抑制，使得后续其它益生菌得到了较好的生长繁殖，另外，其生长过程中水解了原料中多糖和蛋白质，促进了后续发酵中其它益生菌的生长繁殖。
109CFU/g，双歧杆菌总数2.37×109CFU/g，其他益生菌总数3.42×109CFU/g，其益生菌平均菌活力显著高于其他对照组，本发明实验组中，通气量的变化，使得两株芽孢杆菌生成了芽孢，进入休眠状态，降低了对后续发酵的其他益生菌的竞争性抑制，使得后续其它益生菌得到了较好的生长繁殖，另外，其生长过程中水解了原料中多糖和蛋白质，促进了后续发酵中其它益生菌的生长繁殖。
[0236] 实验例3生态食品对于改善肠道菌群结构的实验研究
[0237] 为了说明模拟上消化道消化加工过程阶段、下消化道加工过程以及该过程中分段发酵对于生态食品对于机体肠道菌群的影响，通过利用不同方法制备的生态食品进行分组，观察测定不同分组产品对于机体肠道菌群数量的影响，分组如下：
[0238] 对照组1：无模拟上消化道消化加工过程，模拟下消化道加工中，使用单次混菌发酵，不分段；具体方法如下：
[0239] (1)将大豆、苦荞、火麻仁清洗后置于60℃烘箱烘干6小时，磨粉至60目以上，得大豆粉、苦荞粉、火麻仁粉，将大豆粉、苦荞粉、火麻仁粉按照重量比4.5：3：2.5混合，得混合原料粉，将原料粉与水按1：1.8的比例混匀后，进行加热灭菌：121℃，30min；
[0240] (2)配制活化培养基：同实施例1步骤2-(2)；
[0241] (3)菌种活化：同实施例1步骤2-(3)；
[0242] (4)模拟小肠及大肠中食物被肠道菌群降解的过程进行益生菌混菌发酵：
[0243] 将步骤(3)活化的菌种接入步骤(1)的原料中，使每克原料中枯草芽孢杆菌的接种量为4×106CFU/g，凝结芽孢杆菌的接种量为5×106CFU/g，鼠李糖乳杆菌的接种量为5×6 6 5
10CFU/g、嗜酸乳杆菌的接种量为6×10 CFU/g、罗伊氏乳杆菌的接种量为6×10 CFU/g、副干酪乳杆菌的接种量为5×106CFU/g，乳酸片球菌的接种量为5×106CFU/g，植物乳杆菌的接种量为6×105CFU/g，青春双歧杆菌的接种量为8×105CFU/g，长双岐杆菌的接种量为5×
106CFU/g，动物双歧杆菌的接种量为4×107CFU/g，具体发酵条件为：37℃密闭发酵96h，每隔
4h搅拌一次。
10CFU/g、嗜酸乳杆菌的接种量为6×10 CFU/g、罗伊氏乳杆菌的接种量为6×10 CFU/g、副干酪乳杆菌的接种量为5×106CFU/g，乳酸片球菌的接种量为5×106CFU/g，植物乳杆菌的接种量为6×105CFU/g，青春双歧杆菌的接种量为8×105CFU/g，长双岐杆菌的接种量为5×
106CFU/g，动物双歧杆菌的接种量为4×107CFU/g，具体发酵条件为：37℃密闭发酵96h，每隔
4h搅拌一次。
[0244] (5)加工结束后，将降解后的产物放入真空冷冻干燥机内冻干36h，至含水量为10％以下，制得对照组1样品。
[0245] 对照组2：无模拟上消化道消化加工过程，只模拟下消化道消化加工，分段发酵；具体方法如下：(1)将大豆、苦荞、火麻仁清洗后置于60℃烘箱烘干6小时，磨粉至60目以上，得大豆粉、苦荞粉、火麻仁粉，将大豆粉、苦荞粉、火麻仁粉按照重量比4.5：3：2.5混合，得混合原料粉，将原料粉与水按1：1.8的比例混匀后，进行加热处理：121℃，30min；
[0246] (2)配制活化培养基：同实施例1步骤2-(2)；
[0247] (3)菌种活化：同实施例1步骤2-(3)；
[0248] (4)模拟小肠及大肠中食物被肠道菌群降解的过程进行益生菌三段发酵：同实施例1步骤2-(4)；
[0249] (5)加工结束后，将降解后的产物放入真空冷冻干燥机内冻干36h，至含水量为10％以下，制得对照组2样品。
[0250] 对照组3：有模拟上消化道消化加工过程，在模拟下消化道加工中，使用单次混菌发酵，不分段；具体方法如下：
[0251] 1)模拟上消化道特点对食物进行加工：其中步骤(1)模拟口腔研磨、搅拌及唾液淀粉酶酶解、(2)模拟胃部的消化过程、(3)模拟十二指肠部分进行加工消化同实施例1步骤1-(1)(2)(3)；
[0252] 2)模拟下消化道特点对食物进行加工消化：
[0253] (1)模拟上消化道加工完成后，将上述步骤1-(3)经过酶解加工后的原料泵入肠道模拟设备进行加工，首先进行灭酶灭菌，条件为121℃，30min；
[0254] (2)配制活化培养基：同实施例1步骤2-(2)；
[0255] (3)菌种活化：同实施例1步骤2-(3)；
[0256] (4)益生菌混菌发酵：
[0257] 将步骤(3)活化的菌种接入步骤(1)的原料中，使每克原料中枯草芽孢杆菌的接种量为4×106CFU/g，凝结芽孢杆菌的接种量为5×106CFU/g，鼠李糖乳杆菌的接种量为5×106CFU/g、嗜酸乳杆菌的接种量为6×106CFU/g、罗伊氏乳杆菌的接种量为6×105CFU/g、副干酪乳杆菌的接种量为5×106CFU/g，乳酸片球菌的接种量为5×106CFU/g，植物乳杆菌的接种量为6×105CFU/g，青春双歧杆菌的接种量为8×105CFU/g，长双岐杆菌的接种量为5×
106CFU/g，动物双歧杆菌的接种量为4×107CFU/g，具体发酵条件为：37℃密闭发酵96h，每隔
4h搅拌一次。
106CFU/g，动物双歧杆菌的接种量为4×107CFU/g，具体发酵条件为：37℃密闭发酵96h，每隔
4h搅拌一次。
[0258] 3)加工结束后，将降解后的产物放入真空冷冻干燥机内冻干36h，至含水量为10％以下，制得对照组3样品。
[0259] 实验组1：本发明实施例1制备的生态食品；
[0260] 实验方法：
[0261] 1、实验用样品的制备：由以下组1-组8制备的样品进行实验；
[0262] 2、实验动物：取雄性，体重20-25g，离乳一个月的昆明小鼠320只。
[0263] 3、实验试剂：双歧杆菌选择性培养基(BBL)、乳杆菌选择性培养基(Lbs)、伊红美蓝琼脂、叠氮钠-结晶紫-七叶苷琼脂、胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂基础(TSC)、D-环丝氨酸溶液、生理盐水、健康小鼠粪便悬液。
[0264] 4、实验步骤：将320只小鼠随机为8组，一组40只，分别为：
[0265] 组1：灌服生理盐水组；
[0266] 组2：灌服未经酶解、发酵的原料样品组，即由本实验例对照组1步骤(1)制备的原料粉(直接粉碎，不经酶解)；
[0267] 组3：灌服对照1组制备样品；组4：灌服对照2组制备样品；
[0268] 组5：灌服对照3组制备样品；组6：灌服实验1组制备样品；
[0269] 组7：模拟粪菌移殖，灌服健康小鼠粪便悬液；组8：灌服益生菌粉混合物。
[0270] 组7中，健康小鼠粪便悬液的制备方法为：a、选取健康昆明小鼠作为供体；b、收取新鲜排出的小鼠粪便，电子天平立即对新鲜粪便进行称重；c、使用无菌生理盐水将粪便10倍稀释于其中，细致研磨，充分混匀；d、将所得新鲜粪便悬液混合，冰上转运，用于实验小鼠灌胃。
[0271] 组8中，该益生菌粉混合物为利用本发明菌种(即枯草芽孢杆菌IOB430、凝结芽孢杆菌IOB502、鼠李糖乳杆菌IOB820、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌IOB423、副干酪乳杆菌IOB413、乳酸片球菌IOB701、植物乳杆菌IOB602、青春双歧杆菌IOB506、长双歧杆菌IOB515和动物双歧杆菌IOB402)按本发明实施例1步骤2-(2)及2-(3)，分别进行液态培养活化，得到活化种子液，将活化种子液分别按接种量5％(v/v)再次转接至MRS培养基(食品级组分)中，于37℃，静置培养24h后，得到发酵液，将不同菌种的发酵液冷冻干燥、粉碎、等比例混合后制得，总活菌数为1.2×1010CFU/g菌粉混合物。
[0272] 实验前处理步骤：实验前无菌采集各组(组1-组8)小鼠粪便，以10倍梯度稀释分别进行活菌计数。
[0273] 组1以0.10mL/10g鼠重无菌生理盐水每日2次灌胃，连续14d；将组2-组6及组8各样品分别取10g，各加20mL无菌生理盐水稀释，制成稀释液，各组分别以0.10mL/10g鼠重的稀释液每日2次灌胃，连续14d，组7以0.10mL/10g鼠重的小鼠粪便悬液每日2次灌胃，连续14d；
[0274] 以上分组进行最后一次灌服后禁食24h，无菌采集各组小鼠粪便，进行活菌计数。用BBL琼脂检测双歧杆菌，用Lbs琼脂检测乳杆菌，用伊红美兰琼脂检测肠杆菌，用叠氮钠-结晶紫-七叶苷琼脂检测肠球菌，用TSC琼脂检测产气荚膜梭菌。
[0275] 5、小鼠一般状态观测：自接种即开始观察小鼠各组的饮食情况、活动度、毛色、大便状况等。
[0276] 6、实验结论
[0277] 小鼠的一般状况：灌服前后，小鼠均食欲良好，毛色正常，无掉毛脱毛现象，且反应灵敏、活泼好动。
[0278] 7、灌服前后小鼠肠道中双歧杆菌、乳杆菌、肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌数量的影响，见表1。
[0279] 表1灌服前后小鼠肠道菌群数量(CFU/g)
[0280]
[0281]
[0282] 由表1可以得到看出，组6使用本发明工艺得到的样品，给小鼠灌服后，小鼠肠道中的有益菌双歧杆菌和乳杆菌有明显增多，且增多的数量明显大于灌服其他样品组和空白组的小鼠，而有害菌肠杆菌、肠球菌和产气荚膜梭菌与灌服其他样品组和空白组相比明显减少。与组7模拟粪便移殖组相比，本发明产品增殖有益菌、抑制有害菌的能力已非常接近，这说明应用本发明技术生产的产品能够达到模拟粪便移殖疗法，调节肠道菌群平衡的目的，同时也消除了粪便移殖疗法本身的诸多不便，可作为粪便移殖疗法的替代或补充方案。组6与组8相比，在同时利用本发明的益生菌中，本发明产品效果明显高于益生菌粉混合物，由此说明本发明益生菌可以有效利用原料酶解产物，显著提升益生菌菌株活力，同时益生菌产生的后生素协同益生菌能更有效地抑制肠道的有害菌群，维护肠道健康，而组8在菌株活力和抑制有害菌上显然较组1和2具有显著的提高，但是由于利用常规的培养基，其产品的性能显著低于组6。
[0283] 本发明通过进行酶解工艺以及分段发酵技术，使得各菌种生长均衡，能够更好的发挥其益生作用，这些益生菌本身的生长及分泌的某些细菌素对肠道中的有害菌产生了抑制作用，如凝结芽孢杆菌所产苯乳酸、乳酸片球菌所产乳酸片球菌素等。而在仿生消化加工完成后，原料整体包入成品中，又使得众多益生菌发酵产生的后生素被整体保留下来，后生素(即益生菌的代谢产物)是参与肠道调节的重要因素，这一点与常规使用的益生菌粉在工艺上有较大区别，因单纯的菌体经消化道时易失活，这可能是限制益生菌粉发挥功效的原因。
[0284] 而本发明中，实施例1中的益生菌利用经过酶解后的大豆、苦荞、火麻仁，在经过三段发酵后，积累了丰富的后生素，即包括短链脂肪酸、细菌素、酶类等，从而有效地参与了肠道调节、平衡肠道菌群等重要作用，因此本发明益生菌与经过酶解后的原料具有显著的协同性。而组8虽然利用本发明菌粉，由于发酵基质不同，利用的是MRS培养基，因此其菌株活力和所产生的后生素功能显著低于本发明实施例1制备的产品。
[0285] 同时，本发明中，益生菌的高效菌活力同样是在有效维持肠道菌群环境、抑制有害病菌中起到十分重要的作用。需要说明的是，本发明实施例2、实施例3不同参数条件下发酵制备的产品同样具有与实施例1相近的技术效果。
[0286] 实验例4：生态食品在改善动物肠道炎症方面的应用
[0287] 实验方法：
[0288] 选取同一批次成年昆明小鼠100只，雌雄各半。将100只小鼠分为5组，每组20只，雌雄各半。分为空白对照组、肠炎模型对照组、模型实验组1、模型实验组2、模型实验组3，其中：
[0289] 空白对照组：生理盐水，
[0290] 肠炎模型对照组：生理盐水，
[0291] 模型实验组1：美沙拉秦稀释液(1g/L)，
[0292] 模型实验组2：益生菌混合粉，制备方法与实验例3的实验方法-组8的制备方法相同(以10g/20mL无菌生理盐水稀释)；
[0293] 模型实验组3：本发明实施例1制备的生态食品(以10g/20mL无菌生理盐水稀释)。
[0294] 将肠炎模型对照组、模型实验组1、模型实验组2、模型实验组3的小鼠以浓度为3％的葡聚糖硫酸钠(DSS)喂食小鼠8天。如果小鼠半稀便、腹泻、大便隐血，出现以上任何一种症状连续观察两天后情况仍然没有好转，表明建模成功。进行接下来的给药实验：
[0295] 空白对照组给予生理盐水，0.2mL/10g鼠重，每日灌胃两次，连续灌胃14天；肠炎模型对照组、模型实验组1、模型实验组2、模型实验组3分别给药，剂量为0.2mL/10g鼠重，每日灌胃两次，连续灌胃14天。
[0296] 检测指标：
[0297] 将小鼠处死后检测小鼠结肠中炎症因子TNF-a、NF-kB、IL-10表达水平的变化。
[0298] TNF-a是一种主要由活化的单核-巨噬细胞所产生的一种具有多种生物活性的细胞因子，可以导致组织炎症的损伤。而在1996年就有专家证明了结肠炎小鼠模型中NF-kB明显激活。IL-10主要是由单核巨噬细胞产生，被称为细胞因子合成抑制因子，主要免疫调节作用是有效的抑制活化的单核细胞产生的IL-1B、IL-8、IL-6、TNF-a等促炎症细胞因子，在调节肠道免疫平衡中起着重要作用。
[0299] 实验结果如图6及表2所示，
[0300] 表2小鼠炎症因子TNF-a、NF-kB、IL-10表达水平
[0301] 检验项目 空白对照组 肠炎模型对照组 模型实验组1 模型实验组2 模型实验组3NF-KB 81.4±6.27 191.1±5.61 85.8±6.21 147.3±9.12 109.2±5.06TNF-a 69.1±7.45 185.2±4.52 71.5±6.51 155.8±8.65 102.4±5.54
IL-10 177.2±5.34 66.3±6.24 172.4±7.02 139.5±7.72 151.2±6.01
IL-10 177.2±5.34 66.3±6.24 172.4±7.02 139.5±7.72 151.2±6.01
[0302] 本实验结果证明，应用本发明提供的生态食品可以有效改善小鼠肠炎症状，减轻肠粘膜的损害，肠粘膜TNF-a和NF-kB表达明显减少，而IL-10的表达增加，与药物治疗组有差异，但是差异较小，治疗效果较好，说明本发明提供的生态食品确实有效，分析益生菌的作用机理主要有以下几种：(1)益生菌利用经过酶解后的原料，在经过三段发酵后，积累了丰富的后生素物质，而该后生素物质具有大量小分子的多肽类物质，该类物质具有促进淋巴细胞的增殖，而淋巴细胞的能够恢复吞噬细胞的功能，从而杀灭和消除有害微生物；而相比于模型实验组2，其虽然添加的也为益生菌混合粉，但是其菌株活力、后生素所发挥的功能显著低于本发明实施例的技术效果，由此说明本发明实施例1益生菌利用特殊的酶解产物经过发酵后产生的后生素具有显著的功效。
[0303] (2)益生菌经发酵后具有显著活力，同时与肠粘膜免疫系统相互协作，维持对炎症的生理性控制和激活肠道相关性淋巴组织。
[0304] 需要说明的是，本发明实施例2、实施例3不同参数条件下发酵制备的产品同样具有与实施例1相近的技术效果。
[0305] 实验例5：生态食品对代谢疾病的辅助调节效果
[0306] 为了探究本发明制备的生态食品对于代谢疾病的辅助调节作用，通过构建Ⅱ型糖尿病模型来进行。
[0307] 动物模型的建立及实验方法：
[0308] 本实验采用链脲佐菌素(STZ)低剂量多次注射诱导大鼠Ⅱ型糖尿病模型，具体做法为：实验方法：
[0309] 选取同一批次成年昆明小鼠100只，雌雄各半。将100只小鼠分为5组，每组20只，雌雄各半。分为空白对照组、模型对照组、模型实验组1、2、3组，其中：
[0310] 空白对照组为：无菌生理盐水；
[0311] 模型对照组为：无菌生理盐水；
[0312] 模型实验组1为：二甲基双胍，用无菌生理盐水稀释至0.9g/L的浓度；
[0313] 模型实验组2为：益生菌混合粉，制备方法与实验例3的实验方法-组8的制备方法相同；
[0314] 模型实验组3为：本发明实施例2制备的产品组。
[0315] 分组中，模型组对照组、模型实验组1、2、3在正常饲喂4周后，提前禁食(不禁水)12h，腹腔注射链脲佐菌素(STZ)溶液，以40mg/kg注射，STZ用柠檬酸钠缓冲液配置为1％浓度，现配现用，并保证在20min内完成所有小鼠的注射。保持相同的剂量及时间点，连续注射
3天。一周后测量空腹血糖≥8.5mmol/L为造模成功。空白对照组小鼠正常饲喂。
3天。一周后测量空腹血糖≥8.5mmol/L为造模成功。空白对照组小鼠正常饲喂。
[0316] 造模结束后，各组正常饲喂，空白对照组、模型对照组，每日两次，每次灌胃2mL/kg无菌生理盐水，药物组(模型实验组1)使用二甲基双胍每日两次灌胃，使用无菌生理盐水将二甲基双胍稀释至0.9g/L的浓度，每次灌胃为2mL/kg鼠重。模型实验组2和模型实验组3，使用无菌生理盐水将益生菌混合粉以及本发明实施例2产品均稀释至0.5g/mL的浓度，每次灌胃浓度2.0mL/kg鼠重，每日两次。
[0317] 以上分组进行连续8周给药后，进行相关指标的测定。具体结果见表3。
[0319] 表3本发明产品对Ⅱ型糖尿病大鼠血清中中TC、TG、HDL-C、LDL-C的影响
[0320]
[0321] Ⅱ型糖尿病大鼠体内血糖代谢异常同时会引起血脂代谢紊乱，如上表所示，与空白对照组相比，模型对照组大鼠的TC、TG均明显升高，HDL-C含量降低，LDL-C含量升高。模型实验组3使用实施例2中制得的生态食品灌胃可显著降低糖尿病大鼠血清中TC、TG、LDL-C含量，提高HDL-C的含量，缓解Ⅱ型糖尿病大鼠高血脂症状，改善血脂代谢紊乱，与模型实验组2只灌服益生菌混合粉相比，本发明产品效果要更为显著，与药物组(模型实验组1)相比，本发明制得的生态食品在大鼠血清中总胆固醇(TC)方面已较为接近，同时在其他方面也体现出了较好的缓解效果，可以作为代谢病人的辅助调理食品。
[0322] 从动物实验效果来看，应用本发明生产的产品，对于某些代谢系统疾病有辅助调控的效果。主要由以下两方面原因，一方面是，本发明中的产品，复合益生菌利用本发明酶解的原料，产生大量的益生菌后生素，例如短链脂肪酸、细胞表面蛋白等，作为信号分子参与到了机体的代谢调控中来，所以本产品会具有辅助调控糖尿病等某些代谢疾病的效果。另一方面是，补充的益生菌定殖在肠道中，与肠道菌群协同作用使肠道菌群结构趋于稳态、正常，使得肠道参与的代谢活动回归正常的范围。
[0323] 需要说明的是，本发明实施例1、实施例3不同参数条件下发酵制备的产品同样具有与实施例2相近的技术效果。
[0324] 但本发明的保护范围并不局限于此，应当指出的是，任何熟悉本领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思及原理加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内，因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
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