技术领域
[0001] 本
发明涉及的是基因工程技术领域，尤其涉及的是一种增强植物抵抗鳞翅目害虫的基因APX1及其应用。
背景技术
[0002] 在农业生产中，害虫是影响作物产量和品质的重要原因之一，每年都会给农民造成巨大经济损失。鳞翅目包括蛾、蝶两类昆虫，属有翅亚纲、全变态类。该目为昆虫纲中仅次于鞘翅目的第2个大目。分布范围极广，以热带种类最为丰富。绝大多数种类的幼虫为害各类栽培植物，体形较大者常食尽
叶片或钻蛀枝干。体形较小者往往卷叶、缀叶、结鞘、吐丝结网或钻入植物组织取食为害。成虫多以花蜜等作为补充营养，或口器退化不再取食，一般不造成直接危害。目前，针对作物害虫的防治主要依赖于化学
农药，但
化学农药具有刺激气味，对环境和人身健康都有严重威胁，所以从自然资源中挖掘天然杀虫材料越来越受到人们重视。众所周知，BT蛋白是一种
生物农药，能有效毒杀
小菜蛾等鳞翅目害虫，得到广泛的应用，但很多研究发现多种鳞翅目害虫已经对BT产生了抗药性，削弱了对虫害的防治效果，因此迫切需要寻找新的抗虫方式。在植物中寻找天然抗虫基因，对于开发新型天然抗虫品系作物具有重要的理论和实践意义。
发明内容
[0003] 本发明的目的在于针对现有研究的不足，提供了一种增强植物抵抗鳞翅目害虫的基因APX1及其应用，为鳞翅目害虫的
生物防治提供新材料，为开发抗鳞翅目害虫的
农作物品系提供理论
基础和基因资源。
[0004] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0005] 一种增强植物抵抗鳞翅目害虫的基因APX1，该基因具有：
[0006] (Ⅰ)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或
[0007] (Ⅱ)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的互补序列；或
[0008] (Ⅲ)与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同
蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的序列；或
[0009] (Ⅳ)具有(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列功能相同或相似的同源基因序列。
[0010] 如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列是从拟南芥植物中克隆获得的拟南芥APX1基因，CDS全长666bp，其
氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该基因可以从作物中直接克隆获得，也可以通过人工合成方式获得。
[0011] 一种上述APX1基因的编码蛋白，该编码蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，共编码221个氨基酸。
[0012] 一种表达载体，所述表达载体为插入了上述重组基因，并以
微生物细胞或植物细胞作为宿主细胞的重组质粒。
[0013] 一种转化子，所述转化子为含有上述表达载体，或整合有上述基因APX1的微生物或植物细胞。
[0014] 一种上述增强植物抵抗鳞翅目害虫的基因APX1在增强植物抵抗鳞翅目害虫能
力中的应用，其中，APX1突变体是隐形突变引起的抗虫性，在育种过程中，利用CRISPR敲除技术或从自然生型中筛选功能缺失的单倍型，获得抗虫品种，达到增强植物抵抗鳞翅目害虫的目的。
[0015] 作为本发明进一步的优化方案，所述植物包括油菜，玉米，
水稻和
高粱等重要经济作物，旨在向这些重要经济作物中推广测试开发新的抗虫品系，提供新型抗虫材料。
[0016] 本发明相比
现有技术具有以下优点：本发明提供了一种增强植物抵抗鳞翅目害虫的基因APX1及其应用，该基因APX1编码一种RNA 5’帽子结合蛋白，本发明通过对拟南芥APX1基因突变体的生测试验，即强制性喂食鳞翅目害虫小菜蛾拟南芥野生型和APX1基因突变体，实验结果发现，食用拟南芥APX1基因突变体后，小菜蛾幼虫死亡率显著上升，体重显著下降，且
化蛹率显著降低，相关解毒酶酶活显著升高；另外突变体对小菜蛾具有显著的驱避效果。本发明基于拟南芥APX1基因新功能开发获得了新型抗虫材料，避免了化学农药对环境的污染和人体的毒害，该抗虫材料属于隐性基因突变引发的杀虫功能，可以利用CRISPR基因敲除等技术在不同的作物中开发新型抗虫品系。
附图说明
[0017] 图1为APX1 CDS全长扩增
电泳图，图中，泳道2为APX1基因
片段，M为Marker(Trans2K)；
[0018] 图2为APX1基因在突变体APX1-1中的表达量结果柱状图；
[0019] 图3为小菜蛾强制性取食死亡率(3a)，体重(3b)和化蛹率(3c)统计结果；
[0020] 图4为小菜蛾强制性取食谷胱甘肽-S转移酶(GST)酶活(4a)和细胞色素C450(CYP450)酶活(4b)检测结果。
[0021] 图5为小菜蛾选择性取食拟南芥野生型与APX1突变体实验结果。
具体实施方式
[0023] 1、材料
[0024] 本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的
试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
[0025] 2、方法
[0026] 2.1拟南芥APX1基因的克隆
[0027] 2.1.1以拟南芥野生型Col-0品种为材料，提取RNA，并将提取的总RNA进行反转录合成cDNA第一链，作为PCR扩增的模板。
[0028] 2.1.2用设计的特异性引物：
[0029] APX1-F：(5'>GGTTGAAGGATTTTG<3')
[0030] APX1-R：(5'>ATTGTGGGAGGATGGTGCC<3')
[0031] 进行扩增，得到666bp的基因片段(电泳结果如图1所示)，连接到T克隆载体PEASY-T5 simple vector上，获得T5-APX1转化进入大肠杆菌，挑取阳性克隆并测序，测序结果与预测结果一致，获得如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
[0032] 2.2拟南芥突变体基因鉴定与基因的功能
[0033] 2.2.1根据APX1基因序列，从英国诺丁汉拟南芥
种子中心(Nottingham Arabidopsis Stock Center)订购独立的T-DNA插入突变体种子号(PL32)，获得拟南芥APX1基因突变体，根据TAIR
网站提供的T-DNA引物鉴定方法合成鉴定引物：
[0034] Salk_131503(PL32)：
[0035] LP:5'>AAAATTTGATTCCCGTTCGTC<3'
[0036] RP:5'>AAAATTTGATTCCCGTTCGTC<3'
[0037] LBb1.3:5'>ATTTTGCCGATTTCGGAAC<3'
[0038] 通过旁侧序列测序结果分析，该T-DNA插入突变体种子号(PL32)可插入APX1基因4号外显子上导致APX1基因功能缺失。RT-PCR结果显示，在突变体中该基因表达量显著下调(图2)。
[0039] 2.2.2利用长日照生长两周的野生型col与APX1基因突变体，强制性喂食刚进入暴食期的小菜蛾，统计小菜蛾的存活情况、体重和化蛹情况，结果如图3所示，从图3的强制性取食实验结果可以看出，喂食APX1基因突变体的小菜蛾在存活情况，体重和化蛹等多项指标显著低于对照组。因此，拟南芥APX1突变体能够显著抑制小菜蛾的生长发育且具有毒杀功能。
[0040] 2.3相关解毒酶酶活检测
[0041] 2.3.1谷胱甘肽-S转移酶(GST)测定方法
[0042] 对小菜进行强制性取食拟南芥野生型col和APX1基因突变体，24h后将小菜蛾取样，检测GST解毒酶活力。酶活检测方法采用南京建成生物科技有限公司谷胱甘肽-S转移酶(GSH-TS)
试剂盒方法完成。
[0043] 结果如图4a所示，取食拟南芥APX1基因突变体后，GST酶活显著上调。
[0044] 2.3.2细胞色素P450(CYP450)测定方法
[0045] 对小菜进行强制性取食拟南芥野生型和col和APX1基因突变体，24h后将小菜蛾取样，检测CYP450解毒酶活力。酶活检测方法采用北京华泰生物科技有限公司细胞色素P450(CYP450)酶联试剂盒方法完成。
[0046] 结果如图4b所示，取食拟南芥APX1基因突变体后，CYP450酶活显著上调。
[0047] 2.3.2拟南芥APX1突变体对小菜蛾的驱避性试验
[0048] 如图5所示，使用驱避试验仪器对拟南芥野生型和APX1突变体散发的气味进行富集，随后在仪器中间放入小菜蛾幼虫，随着抽气
泵抽吸气体，小菜蛾幼虫根据气味进行方向的选择。
[0049] 结果如图5所示，随着时间的推移，小菜蛾选择拟南芥野生型的幼虫个数显著高于选择APX1突变体的幼虫。得出结论，APX1突变体对小菜蛾具有驱避效果。
[0050] 3、结论
[0051] 小菜蛾取食拟南芥APX1基因突变体后，其体重，化蛹和
羽化率显著降低表明APX1基因突变体材料能够显著抑制鳞翅目害虫小菜蛾的生长发育，两种解毒酶GST和CYP450酶活和死亡率显著上调表明APX1基因突变体对小菜蛾具有毒杀功能。此外，突变体APX1-1对小菜蛾具有驱避效果。
[0052] 本文所描述的具体实施例仅仅是对本发明作举例说明，本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各式各样的
修改，例如以拟南芥APX1基因突变体材料为研究基础，利用CRISPR等技术手段在油菜，玉米，水稻和高粱等经济作物中敲除APX1同源基因而获得的具有抗虫性能品系材料的方法，均在本发明的保护范围之内。
