CO2和其它C1底物转化为纯素营养素、肥料、生物刺激素的微生
物转化以及用于加速土壤碳封存的系统
[0002] 本申请要求于2017年2月3日提交的美国临时申请第62/454,347号的权益,所述申请通过引用整体并入本文。
技术领域
[0003] 本
发明涉及应用于农业的化学领域,具体地涉及有机
植物和
真菌营养、动物饲养和人类营养。具体地说,本发明涉及用于从由C1底物和其它无机输入产生的有机物质获得营养素和提取物的方法,所述营养素和提取物可以用作农业(特别是
有机农业)中的
生物刺激素和/或
生物肥料和/或用作动物
饲料中的
蛋白质和
营养补充剂和/或用作人类营养中的成分。
背景技术
[0004] 需要可持续并且可再生的
氨基酸、蛋白质、维生素和其它营养素来源以帮助满足不断增长的食品需求。基于食品生产系统中
煤、石油和
天然气的利用,还需要减少排入大气中的二
氧化碳和其它
温室气体(GHG)的量并且减少用
水量和全球
能源消耗。全球经济需求的增加给土地和水资源带来了越来越大的压
力。用于生产食品和其它农业来源产品的传统化石
烃输入也面临增加的压力。包含现代农业在内的许多行业在很大程度上依赖于作为
农作物生产和加工的输入的化石烃资源的可获得性。当前的现有做法的具有成本效益的替代方案可以帮助减轻土地使用、自然栖息地、水、化石资源需求、原材料成本和温室气体排放的上升压力。
[0005] 通过天然的生物化学代谢过程来固定气态碳的生物系统是已知的。基于高等植物作物中的光合作用的当前农业系统是一个明显的例子。还开发了用于通过光合作用反应由CO2产生食品和其它农业来源产品的藻类系统。还存在利用如糖等固定碳原料的异养反应和生产,所述固定碳原料进而由CO2通过光合作用产生。因此,这些异养反应和生产间接依赖于光合作用。然而,当前农业、
畜牧业和
水产养殖业实践以及当前所使用的光合作用来源的营养素和饲料面临许多问题和限制。
[0006] 世界农业系统面临着满足两个相互矛盾的需求的挑战:(A)增加食品产量以满足由于全球人口预计在2050年上升到超过93亿而产生的需求,以及(B)减少农业对人类健康和环境的有害影响[T.Searchinger、C.Hanson、J.Ranganathan、B.Lipinski、R.Waite、R.Winterbottom、A.Dinshaw和R.Heimlich,“伟大的平衡之举(The great balancing act)”《, 世界资源研究所工作论文(World Resources Institute Working Paper)》,华盛顿特区,2013]。过去半个世纪以来,新兴的全球中产阶级一直在推动对高蛋白质饮食的需求上升。人们担心食品蛋白质的日益稀缺以及影响食品生产或由食品生产造成的环境问题,如土地使用限制、水资源短缺、
气候变化以及世界市场上饲料和食品价格的长期通胀[S.Matassa、N.Boon和W.Verstraete(2015)“
废水资源回收:氢氧化细菌的制造能力(Resource recovery from used water:the manufacturing abilities of hydrogen-oxidizing bacteria)”《水资源研究(Water Research)》68:467-478(http://view.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25462753)]。
[0007] 当前所使用的肥料主要由无机化合物和/或合成化合物构成。然而,人们对
有机肥料和调理剂的使用越来越感兴趣。可以将这些有机物质添加到土壤中,其中通过土壤微
生物群落的作用释放出如铵离子、
硝酸根离子和
硫酸根离子等植物营养素[Wainwright,M.、W.Nevell和U.Skiba(1985)“一些可商购形式的
角蛋白
微生物生物质的肥料潜力(Fertilizer potential of some commercially available forms of keratin
microbial biomass)”《酶和微生物技术(Enzyme Microb.Technol.)》7:108-110]。
[0008] 除了提供综合的植物和真菌营养素来源之外,有机肥料还为土壤提供有机物质,对于例如沙质土壤或低活性粘土土壤,这代表由于调理剂效果而产生的物理、化学和生物学性质的改善。用于土壤调理的肥料可以含有微量营养素以及如
酵母、细菌或真菌等有益微生物。中国
专利CN1911870描述了一种增强土壤微生物、促进植物生长、提高肥料的利用率并且增加植物的抗病性和抗逆性的植物营养素。这种营养素包括
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)以及如
马铃薯或咖啡衍生物、
葡萄糖、蛋白胨、
硫酸镁和硫酸锰、
磷酸氢二
钾和
氯化钠等其它组分。
[0009] 土壤中,具体地说,植物的
根际中存在丰富的微生物。众所周知,大量的细菌和真菌物种与植物具有功能关系并且与植物构成整体系统。它们能够对植物生长产生有益的影响。已经发现,由氮
固定剂诱导的固氮效果不仅对豆科植物有显著影响,而且对非豆科植物也有显著影响。此外,一些菌株具有用于实现植物生长的多种功能。固氮螺菌(Azospirillum)的有益效果可能来自其固氮作用和对根发育的刺激作用。类似地,据报道,固氮菌(Azotobacter)不仅提供氮,而且产生多种促生长物质,其中包括吲哚乙酸、赤霉素和B族维生素。这些物质至少在某种程度上刺激根系分泌物的产生。据报道,根系分泌物进而刺激固氮菌将氨分泌到根际中,从而增加土壤氮含量。与植物分泌物赋予的效果类似的效果归因于有机肥料中含有的有机碳。据报道,使用合适的农家肥、
绿肥和其它有机肥和肥料可以增强固氮菌的N2固定作用。这可能是由于固氮反应需要来自可用有机碳的大量
能量以便破坏氮
原子之间的键。
[0010]
磷酸盐(P)和钾(K)溶解性细菌可以通过溶解不溶性P并且由土壤中的
硅酸盐释放K来增强植物对矿物质的摄取。
[0011] 总之,土壤微生物是天然的土壤亚
生态系统中的重要组成部分,因为它们不仅可以促进土壤中的营养素可用性,而且还有助于将土壤颗粒结合成稳定的聚集体,从而改善土壤结构并减少侵蚀可能性。
[0012] 在自然条件下生长的大多数植物与真菌菌根有关。通过连接生态系统的生物部分和地球化学部分,菌根共生也可以被视为将根部与周围土壤微生境连接的
桥梁。根际细菌可以充当提高菌根真菌定殖植物根部的能力的“菌根化辅助细菌”。
[0013] 最近,提出了旨在改善农作物生产的
可持续性同时还提高生产率的新战略。一种有前景的方法是应用还被定义为“生物刺激素”和/或“生物肥料”的物质和/或微生物[P.Calvo、L.Nelson和J.Kloepper(2014)“植物生物刺激素的农业用途(Agricultural uses of plant biostimulants)”《, 植物与土壤(Plant and Soil)》383(1-):3-41,2014(http://dx.doi.org/10.1007/s11104-014-2131-8)]。
[0014] 与农业用常规化学品相比,微生物产品在植物中的应用具有以下优点,包含:(i)微生物产品被认为比现在使用的许多化学品更安全;(ii)有毒物质和微生物本身均未在食物链中积累。
[0015] 最近,除了将肥料施用于土壤之外,人们越来越关注叶面植物肥料。叶面饲养是一种通过将液体肥料直接施用于植物的叶子来饲养植物的技术。在
叶面肥料的施用中,人们认识到植物不仅仅需要如氮、钾、磷、
钙和镁等基本的化学元素。还认识到,可以提高各种元素的效率和可接受性的伴随化合物也是非常重要的。这种增强性化合物包含氨基酸、
粘合剂和
表面活性剂,所述氨基酸、粘合剂和表面活性剂中的许多包含在现代叶面肥料中[“来自由马昆德拟青霉的真菌角蛋白酶
水解的废弃角蛋白的氨基酸和可溶性蛋白质混合物(Amino acid and soluble protein cocktail from waste keratin hydrolysed by a fungal keratinase of Paecilomycesmarquandii)”;Veselá,M和Friedrich J.(2009)《生物技术和生物过程工程(Biotechnology and Bioprocess Engineering)》14:84-90]。
[0016] 植物“生物刺激素”有时指代除肥料外在叶面施用时或当添加到土壤中时影响植物的生长和/或代谢的组分。一些植物生物刺激素通过上调或下调植物激素来起作用。植物生物刺激素通常属于以下三类之一:氨基酸、肽和蛋白质混合物;激素;以及
腐殖质。
[0017] 据报道,生物刺激素提高作物品质参数和营养效率,提高生长速度、光合速率、作物产率、植物根和叶的生长、非生物抗逆性和抗病性,改善栽培土壤并且对抗
杂草生长。示例性植物生物刺激素包含基于海藻提取物、酵母提取物、
腐殖酸、氨基酸、水杨酸、生物固体、水解蛋白质、
硅酸盐和/或合成化合物的组合物。示例性应激源包含热、冷、干旱、磨损、过量水分、盐、
碱或其它不利的土壤pH、营养缺乏、氧化、重金属毒性、
疾病等。
[0018] 人们对微生物来源的生物刺激素和生物肥料的兴趣增加。例如,Kobayashi等人研究了酿酒酵母提取物与
无机肥料的组合对豌豆植物生长的影响[“酵母提取物对高等植物的影响(Effect of yeast extracts on higher plants)”,Kobayashi等人《,植物与土壤》(1980),57(1)4:1-7]。匈牙利专利HU9902060描述了一种用于植物的叶和根的含有酿酒酵母加上微量元素、络合剂、缓冲剂和许多如氨基酸、腐殖酸、酶、糖等其它营养素的含水肥料组合物。
[0019] 蛋白质水解产物(PH)是重要的一类植物生物刺激素,所述植物生物刺激素包括使用部分水解由蛋白质原料制造的多肽、寡肽和氨基酸的混合物[G.Schaafsma(2009)“人类营养中的蛋白质水解产物、其部分和生物活性肽的安全性(Safety of protein hydrolysates,fractions thereof and bioactive peptides in human nutrition)”《欧洲临床营养学杂志(European journal of clinical nutrition)》63(10):1161-1168(http://view.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19623200)]。由于PH对
园艺作物(包含果树、蔬菜、花卉作物和观赏植物)的生产率和
质量具有有益影响,特别是在环境应激条件下,所以人们对PH的兴趣日益增长。已经发现,PH可以增加芽和根的生物质和生产率[K.Edward、G.Aneta、S.Agnieszka和W.Renata“, 品种类型、栽培时间和生物刺激素处理对菠菜产率的影响(The effect of cultivar type,time of cultivation,and biostimulant
treatment on the yield of spinach(spinacia oleracea l.))”,第9+页,2013[网上]可从以下获得:http://dx.doi.org/10.2478/fhort-2013-0153;Lisiecka等人,2011;N.T. I. I. M. 和 “天
然的生物刺激素对产率和
营养品质的影响:甜黄椒(辣椒)植物的实例(Effect of natural biostimulants on yield and nutritional quality:an example of sweet yellow pepper(capsicum annuum l.)plants)”《食品与农业科学杂志(J.Sci.Food Agric.)》,第
91卷,第12期,第2146-2152页,2011年9月。[网上]可从以下获得:http://dx.doi.org/
10.1002/jsfa.4431;G.Colla、Y.Rouphael、R.Canaguier、E.Svecova和M.Cardarelli“, 通过酶促水解产生的植物来源的蛋白质水解产物的生物刺激素作用(Biostimulant action of a plant-derived protein hydrolysate produced through enzymatic
hydrolysis)”《植物科学前沿(Frontiers in Plant Science)》,第5卷,第448页,2014[网上]可从以下获得:http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/
fpls.2014.00448;A.Ertani、D.Pizzeghello、O.Francioso、P.Sambo、S.Sanchez-Cortes和S.Nardi,“生物刺激素长期增强辣椒的生长和营养特性:化学和代谢组学方法(Capsicum chinensis l.growth and nutraceutical properties are enhanced by biostimulants in a long-term period:chemical and metabolomic approaches)”《植物科学前沿(Frontiers in plant science)》,第5卷,2014。[网上]可从以下获得:http://view.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25136346)。PH是用于使园艺更具可持续性的有效工具,并且许多研究已经证明了PH施用对几种园艺作物的生长、产率、产品质量、资源利用效率以及对环境和化学土壤应激的耐受性的益处。
[0020] 已经显示,PH的施用促进几种园艺作物的营养生长以及宏量营养素和微量营养素的摄取,从而提高作物生产率。用PH包覆
种子以增强蔬菜和花卉作物、观叶植物和草坪草的发芽和早期生长也是一种很有前景的应用。
[0021] 氨基酸和小肽被根和叶二者吸收,并且然后转移到植物中。植物通过气孔吸收氨基酸。对于某些植物,氨基酸是氮的主要来源[Chapin,F.S.、L.Moilanen和K.Kielland(1993)“有机氮优先用于实现非菌根北极莎草的生长(Preferential use of organic nitrogen for growth by a non-mycorrhizal arctic sedge)”《自然(Nature)》361:150-153]。事实上,叶面营养是凤梨科植物中的非常重要的氮摄取机理,特别是对于附生凤梨科植物[Endres,L.和H.Mercier(2003)“在体外培养的具有不同习性的凤梨科植物中的氨基酸摄取和分布(Amino acid uptake and profile in bromeliads with different habits cultivated in vitro)”《植物生理与生物化学(Plant Physiol.Biochem.)》41:
181-187]。蛋白质水解产物和叶面喷施形式的叶面营养为蛋白质合成提供了现成的构建
块。
[0022] 在根/叶摄取后,氨基酸和肽从在细胞之间并且通过植物维管系统(木质部和韧皮部)长距离转运,以便支持植物代谢和发育。几类整合膜蛋白参与氨基酸和肽穿过植物中的细胞膜进行的转运。例如,赖氨酸-组氨酸样转运蛋白家族、氨基酸通透酶家族和脯氨酸转运蛋白家族的成员在穿过根的氨基酸摄取中起直接作用。氨基酸和酰胺在大多数植物中代表有机氮的主要转运形式,并且它们可以直接用于蛋白质合成和其它必需的氮化合物或被代谢掉。
[0023] 存活在叶际和根际中的微生物也可能影响作物对PH施用的反应,这不仅是因为微生物与植物争夺氨基酸和肽,而且因为微生物分泌可以将肽水解成可以充当
信号传导化合物的小
片段的酶,从而调节作物反应。此外,最近的研究表明,在莴苣上施用植物来源的PH刺激了令人期望的天然存在的微生物,如N2固定性、P溶解性和吲哚乙酸产生性细菌。上述发现表明,通过微生物介导的增强植物生长,PH还可以充当植物生物刺激素。已经观察到,对植物的叶和根施用PH改善Fe和N代谢和营养素摄取,降低如硝酸盐等不期望的化合物的浓度并且提高宏量和微量元素和水的利用效率[M.Cerdán、A.Sánchez-Sánchez、J.D.Jordá、M.Juárez和J.Sánchez-Andreu(2013)“商业氨基酸对在石灰诱导的
铁缺乏下生长的番茄植物的铁营养的影响(Effect of commercial amino acids on iron nutrition of tomato plants grown under lime-induced iron deficiency)”《, 植物营养与土壤科学(Z. Bodenk.)》176(6):859-866(http://dx.doi.org/10.1002/jpln.201200525);A.Ertani、L.Cavani、D.Pizzeghello、E.Brandellero、A.Altissimo、C.Ciavatta和S.Nardi(2009)“两种蛋白质水解产物在玉米
幼苗生长和氮代谢中的生物刺激素活性(Biostimulant activity of two protein hydrolyzates in the growth and nitrogen metabolism of maize seedlings)”《植物营养与土壤科学》172(2):237-244(http://dx.doi.org/10.1002/jpln.200800174);M.Halpern、A.Bar-Tal、M.Ofek、D.Minz、T.Muller和U.Yermiyahu(2015),“生物刺激素用于增强营养素摄取(The Use of
Biostimulants for Enhancing Nutrient Uptake)”《爱思唯尔(Elsevier)》,第130卷,第
141-174页(http://dx.doi.org/10.1016/bs.agron.2014.10.001))]。补充有PH的植物中的营养素摄取增加的原因包含:(A)土壤酶活性和微生物活性的增加;(B)微量营养素的迁移率和
溶解度的提高,特别是对于Cu、Fe、Mn和Zn;(C)植物根系结构的变化,如根
密度、长度和侧根的数量;以及(D)Fe(III)-螯合还原酶、硝酸盐还原酶和谷氨酰胺合成酶的活性的增加[M.Cerdán等人(2013)同上;A.Ertani等人(2009)同上;A.M.García-Martínez、A.Díaz、M.Tejada、J.Bautista、B.Rodríguez、C.Santa María、E.Revilla和J.Parrado(2010)“由小麦冷凝蒸馏器可溶物酶促产生有机土壤生物刺激素:对土壤生物化学和
生物多样性的影响(Enzymatic production of an organic soil biostimulant from wheat-condensed distiller solubles:Effects on soil biochemistry and biodiversity)”《过程生物化学(Process Biochemistry)》45(7):1127-1133(http://dx.doi.org/10.1016/
j.procbio.2010.04.005);G.Colla、Y.Rouphael、R.Canaguier、E.Svecova和M.Cardarelli(2014)“通过酶促水解产生的植物来源的蛋白质水解产物的生物刺激素作用
(Biostimulant action of a plant-derived protein hydrolysate produced through enzymatic hydrolysis)”《植物科学前沿》5:448(http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fpls.2014.00448);L.Lucini、Y.Rouphael、M.Cardarelli、
R.Canaguier、P.Kumar和G.Colla(2015)“植物来源的生物刺激素对盐水条件下生长的莴苣的代谢分布和作物性能的影响(The effect of a plant-derived biostimulant on metabolic profiling and crop performance of lettuce grown under saline conditions)”《园艺科学(Scientia Horticulturae)》182:124-133,2015年1月(http://dx.doi.org/10.1016/j.scienta.2014.11.022)]。当氨基酸与微量营养素一起施用时,可以促进植物内微量营养素的吸收和运输。
[0024] 已经显示,蛋白质水解产物刺激氮代谢和同化。植物中氮同化增加的可能的解释可以是,PH对碳骨架产生和氨基酸生物合成所需的能量供应具有积极影响。
[0025] 氨基酸和肽可以以信号传导化合物的形式发挥重要作用。细胞膜上的特异性受体与肽(诱导剂)相互作用以进行信号转导,从而导致植物中的形态生理学和生物化学变化。PH可能影响植物的植物激素平衡并且通过特定的肽与如
色氨酸等植物激素生物合成前体的作用影响植物的发育[G.Colla等人(2014)同上]。已经发现,在许多不同植物中产生的生物活性肽具有激素样活性[Y.Ito、I.Nakanomyo、H.Motose、K.Iwamoto、S.Sawa、N.Dohmae和H.Fukuda(2006)“作为植物干细胞分化的
抑制剂的Dodeca-CLE肽(Dodeca-CLE peptides as suppressors of plant stem cell differentiation)”《科学(Science)》313(5788):
842-845,(http://dx.doi.org/10.1126/science.1128436);T.Kondo、S.Sawa、
A.Kinoshita、S.Mizuno、T.Kakimoto、H.Fukuda和Y.Sakagami(2006)“通过原位MALDI-TOF MS分析鉴定的由CLV3编码的植物肽(A plant peptide encoded by CLV3 identified by in situ MALDI-TOF MS analysis)”《科学》313(5788):845-848,2006年8月(http://dx.doi.org/10.1126/science.1128439)]。据报道,植物来源的PH引发改善作物性能的生长素样活性和赤霉素样活性[M.Schiavon、A.Ertani和S.Nardi(2008)“苜蓿蛋白水解物对玉米中三
羧酸(TCA)循环酶和氮代谢酶的基因表达和活性的影响(Effects of an alfalfa protein hydrolysate on the gene expression and activity of enzymes of the tricarboxylic acid(TCA)cycle and nitrogen metabolism in zea mays l)”《农业与食品化学杂志(Journal of agricultural and food chemistry)》56(24):11 800-11 808(http://view.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19053364);A.Ertani等人(2009)同上;G.Colla等人(2014)同上]。
[0026] 据报道,在
葡萄藤中,叶面施用来自
酪蛋白和大豆的PH上调了编码负责叶中
白藜芦醇的生物合成芪合酶(即,白藜芦醇合成酶)的基因。经证明,两种水解产物均充当用于增强葡萄藤对葡萄霜霉病菌(Plasmoparaviticola)——葡萄霜霉病的致病因子的免疫力。中国专利CN1966663(“复合微生物叶面肥菌剂及其生产方法和用途(Composite Microorganism Foliage Fertilizer Bacteria Agent And Its Producing Method And Use)”)描述了由酿酒酵母、植物乳杆菌、总状毛霉(Mucor racemosus)和米曲霉菌(Aspergillus oryzae)组成的抗微生物剂。
[0027] 由植物来源的PH引起的对次级代谢的激活(如参与苯丙烷途径(phenylpropanoid pathway)的苯丙氨酸(酪氨酸)氨解酶的基因表达增加)可以产生有益的营养品特性。在水果和蔬菜中发现的植物化学化合物由于其对健康有益的特性而引起了科学家、食品营养学家和生产者的极大兴趣。植物化学品是能够减少或
预防如心
血管疾病、缺血性中
风、关节炎和
炎症性肠病等慢性疾病以及一些癌症的天然抗氧化化合物。一些研究发现,施用PH能够改变初级和次级代谢,从而刺激抗氧化化合物(类胡萝卜素、多酚、类黄
酮等)的产生和积累。
[0028] 可以基于蛋白质来源和蛋白质水解方法对PH进行分类。目前,PH主要源自动物或植物来源的原料,并且通常通过化学水解和/或酶促水解产生。[P.Maini(2006)“基于氨基酸和肽的第一生物刺激素的经验:实验室研究和实际结果的简短的回顾性研究(The experience of the first biostimulant,based on amino acids and peptides:a short retrospective review on the laboratory researches and the practical results)”《农业肥料(FertilitasAgrorum)》1(1):29-43,2006;M.Schiavon等人(2008)同上;M.Halpern、A.Bar-Tal、M.Ofek、D.Minz、T.Muller和U.Yermiyahu(2015),“生物刺激素用于增强营养素摄取”《爱思唯尔》,第130卷,第141-174页(http://dx.doi.org/10.1016/bs.agron.2014.10.001)]。蛋白质来源和产生过程二者均对PH的化学特性产生强烈影响。[Cavani,L.、C.Ciavatta和C.Gessa(2003)“通过毛细管
电泳法测定水解蛋白质肥料中的游离L-丙氨酸和D-丙氨酸(Determination of free L-and D-alanine in hydrolysed protein fertilizers by capillary electrophoresis)”《色谱法期刊A
(J.Chromatogr.A)》985:463-469]。氨基酸对微量营养素具有螯合作用[Koksal,A.I.、H.Dumanoglu、N.T.Gunes和M.Aktas(1999)“不同氨基酸螯合叶面肥料对威廉梨品种(西洋梨)的产率、果实品质、枝条生长及
叶片的铁、锌、
铜、锰含量的影响(The effects of different amino acid chelate foliar fertilizers on yield,fruit quality,shoot growth and Fe,Zn,Cu,Mn content of leaves in Williams pear cultivar(Pyrus communis L.))”《土
耳其农业与林业杂志(Turk.J.Agric.For.)》23:651-658]。
[0029] PH通常通过酶促水解产生。这是可能源自动物器官的蛋白水解酶(例如,胰、胃蛋白酶)、源自植物的蛋白水解酶(例如,菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶)或源自微生物的蛋白水解酶(例如,碱性蛋白酶、风味蛋白酶酶、角蛋白酶)催化蛋白质水解的地方。蛋白水解酶通常靶向特定的肽键(例如,胰酶在与精氨酸、赖氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸键相邻的键处切割氨基酸链;木瓜蛋白酶在精氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸附近进行切割;胃蛋白酶在存在苯丙氨酸或亮氨酸键的地方进行切割;角蛋白酶主要是丝氨酸或金属蛋白酶)。中国专利CN19191800描述了一种用于植物和动物的营养素,所述营养素通过以下步骤制备:将酿酒酵母
污泥在水中稀释得到乳液;将乳液与木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和氯化钠混合;然后水解所述混合物;使酶失活;并且最后浓缩或干燥所得产物。最终产物含有高含量的快速吸收率营养素。
[0030] 已经开发了组合的化学水解和酶促水解过程,相对于纯化学水解,所述过程可以有助于维持氨基酸的结构并节省能量。
[0031] 除氨基酸和肽外,PH还含有其它可以促进生物刺激素作用的化合物。这些化合物包含脂肪、碳水化合物、酚类、矿物元素、植物激素和其它有机化合物(例如,多胺)。
[0032] 由农工业副产品产生的PH表示可持续废物处置的一种选择,其从环境和经济角度来看都很有意思[V.Kasparkova、K.Kolomaznik、L.Burketova、V.Sasek和L.Simek(2009)“通过酶促水解和酸水解的组合制备的低分子量
胶原蛋白水解产物的表征(Characterization of low-molecular weight collagen hydrolysates prepared by combination of enzymatic and acid hydrolysis)”《美国皮革化学家协会杂志(The Journal of the American Leather Chemists Association)》104(2):46-51,2009;
J.Pecha、T.Fürst、K.Kolomazník、V.Friebrová和P.Svoboda(2012)“蛋白质生物刺激素叶面摄取建模:气候条件的影响(Protein biostimulant foliar uptake modeling:The impact of climatic conditions)”《美国化学工程师学会杂志(AIChE J.)》58(7):2010-
2019(http://dx.doi.org/10.1002/aic.12739);A.Baglieri、V.Cadili、
C.MozzettiMonterumici、M.Gennari、S.Tabasso、E.Montoneri、S.Nardi和M.Negre(2014)“用番茄植物水解产物对豆科植物进行
施肥。对生物质产生、叶绿素含量和氮同化作用的影响(Fertilization of bean plants with tomato plants hydrolysates.effect on biomass production,chlorophyll content and n assimilation)”《园艺科学》176:194-
199(http://dx.doi.org/10.1016/j.scienta.2014.07.002)]。Celus等人(2007)“酿酒厂废弃谷物蛋白质的酶促水解以及所得水解产物的技术性能(Enzymatic Hydrolysis Of Brewer's Spent Grain Proteins And Technofunctional Properties Of The
Resulting Hydrolysates)”《农业与食品化学杂志(J.Agric.Food Chem.)》55(21):8703-
8710)描述了来自酿酒厂废弃谷物或
甘蔗渣(BSG)的蛋白质的酶促水解,所述BSG是来自由在酒精
发酵之前的葡萄汁产生引起的
大麦麦芽的不溶性残余物并且构成酿酒工业的主要副产品。所得的水解产物由于其理想的发泡和乳化剂特性而用于食品和饮料工业。西班牙专利ES2329750A1(“用于从
酿造废物中获得肥料产品的程序(Procedure For Obtaining Fertilizer Products From Brewing Waste)”)描述了用于由在葡萄汁的酒精发酵之后产生的酿造废物制造肥料的多步骤过程。这种过程包含各个阶段,其中将废物碱化、分离以获得液相,然后对所述液相进行酸处理并且进而从其中分离出固相,并且最后对所述固相进行酶促水解或酸水解。
[0033] 人们越来越担心动物来源的PH在
食品安全方面的影响,如欧洲第354/2014号法规表明,所述法规禁止将这些产品应用于有机作物的可食用部分。动物来源的PH的肽分子量应低于10kDa,以防止BSE/TSE
朊病毒向人类传播的任何风险。
[0034] 除了对植物的生物刺激素影响外,PH和蛋白质物质更通常还可以对蘑菇和真菌产生营养和生物刺激素影响并且提高蘑菇产率[Kurbanoglu,E.B.和O.F.Algur(2002)“独角仙水解产物对蘑菇双孢蘑菇的作物产率的影响(The influence of ram horn hydrolyzate on the crop yield of the mushroom Agaricusbisporus)”《园艺科学》94:
351-357]。已知许多主要的栽培蘑菇——双孢蘑菇(Agaricusbisporus)、鳞片墨水帽(Coprinus quadrifidus)、紫丁香蘑(Lepista nuda)和平菇(Pleurotusostreatus)——能够直接溶解和消耗细菌。双孢蘑菇(即,草菇(蘑菇)、小褐菇(crimini)和大褐菇
(portabella))和平菇(即,蚝菇(oyster mushroom))是两种最广泛栽培的食用蘑菇。双孢蘑菇通常在堆肥上生长,其中堆肥的微生物生物质组分充当氮、碳和矿物质的来源,并且充当水储备。已经发现,当富含蛋白质的补充剂被添加到蘑菇堆肥(即,生长底物)中时,其可以刺激蘑菇产率(49%-61%)。这种富含蛋白质的补充剂包含:Pro- H200FG水解大豆蛋白、Remo商业补充剂、异亮氨酸(ile)、蛋清蛋白、氨基共混物HLA-198水解
乳清、
棉籽粕、
豆粕、
脱脂奶粉、鱼粉、麦芽、酿酒酵母产品、酪蛋白、小麦胚芽、葵花籽、玉米麸质和花生蛋白。[L C.Schisler和J.W.Sinden(1962)在题为以下的文章中:“催生中的蘑菇堆肥的营养补充剂(Nutrient Supplementation of Mushroom Compost at Spawning)”《蘑菇科学(Mushroom Science)》5:150-164和“
覆盖中的蘑菇堆肥的营养补充剂(Nutrient Supplementation of Mushroom Compost at Spawning)”《蘑菇科学》5:267-280]。使用这些物质实现的产率增加归因于这些物质的相对高的氮浓度。美国专利第3,942,969号描述了一种使用变性蛋白质物质(即,提取物)的用于蘑菇的营养素组合物。用于生长许多蘑菇的天然木质
纤维素的营养素含量有限,并且通常需要以化学和生物补充剂的形式进行补充。在蘑菇栽培中,在基底物中添加补充剂以提高产率、营养价值和药用价值是一种常见的做法。蚝菇(平菇)可以在各种木质
纤维素底物上生长,包含稻草、玉米秸秆/玉米棒、蔬菜植物残渣、甘蔗渣等。然而,已经发现,理想的底物应含有氮(补充剂)以使蘑菇快速生长。平菇在具有氮营养素补充剂的底物中的生长提高了生产率和营养价值。对蘑菇补充的其它研究也报道,除含氮物质外,向蘑菇堆肥添加植物脂质(脂肪物质)也是有益的[Schisler,L C.和J.W.Sinden(1966)“覆盖中的蘑菇堆肥的营养补充剂——
植物油(Nutrient
Supplementation of Mushroom Compost at Casing—VegetabIe Oils)”《加拿大生物学期刊(Can.J.BOL)》44:1063—1069;Schisler,L C.(1967)“植物油对栽培蘑菇产率15的刺激作用(Stimulation of Yield15in the Cultivated Mushroom by Vegetable Oils)”《应用微生物学(Appl Microbiol)》15:844-850;Schisler,L.C.和T.G.Patton,Jr.(1970)“植物油对栽培蘑菇产率的刺激作用:甾醇和亚油酸乙酯的作用(Stimulation of Yield in the Cultivated Mushroom by Vegetable Oils:Effect of Sterols and Ethyl Linoleate)”《农业与食品化学》18:1102-1103 20]。
[0035] 尽管可商购获得许多肥料、生物肥料和植物生物刺激素,但持续需要能够满足各种需求的经过改进的产品。需要增加植物对应激源的耐受性的植物生物刺激素。需要提高具有经济利益的植物的繁殖率。需要在以比目前可获得的商业产品更低的
频率施用时有效的植物生物刺激素,以及如果发生过度施用则提供降低的植物损伤风险的植物生物刺激素。还需要提高粮食作物的营养素利用效率并且减少营养素渗入到环境中。
[0036] 仍然需要可在商业上大规模使用的真菌和/或蘑菇生长强化剂。需要能够在不刺激竞争性微生物(包含细菌和霉菌)的生长的情况下向将营养素添加到正在生长的蘑菇作物中的生长刺激剂。需要不会将堆肥的
温度升高到可能会抑制菌种和蘑菇菌丝体的生长的非常高水平的营养素补充剂。
[0037] 需要用并非源自自动物或植物的PH增加当前动物和植物来源的蛋白质水解产物。还需要加速土壤中的碳封存,并且需要大部分或全部碳被封存的碳
废物处理,这与通常一半或更多碳在堆肥处理期间随着CO2排放而损失的堆肥处理相反[S.M.Tiquia、
T.L.Richard和M.S.Honeyman(2002)“堆肥处理期间的碳、营养素和质量损失(Carbon,nutrient,and mass loss during composting)”《农业生态系统中的营养素循环(Nutrient Cycling in Agroecosystems)》62(1):15-24]。
[0038] 除了将微生物蛋白质、维生素和其它生物分子作为营养素提供给植物和/或真菌之外,人类直接消耗这些微生物来源的营养素也是一个选项。然而,关于人类直接消耗的一个可能关注方面是营养素的核酸含量。对于人类营养来说,如果SCP包括饮食的相当大一部分,则可能需要将如源自自酵母的单细胞蛋白质的核酸含量降低到较低水平。美国国家研究委员会食品和营养委员会(Food and Nutrition Board,National Research Council)对蛋白质的每日建议摄取量为70公斤成年男性每天65克,并且联合国系统蛋白质咨询小组(Protein Advisory Group of the United Nations System)建议,每天从微生物蛋白质中摄入的核酸量应少于每天两克。因此,根据这些标准,如果SCP是膳食蛋白质的唯一来源,则核酸含量与蛋白质的比率应小于3%。一些SCP来源(如来自物种产朊假丝酵母(Candida utilis)和酿酒酵母的酵母细胞)的核酸含量可以为每100克
粗蛋白质约12到15克核酸。因此,为了使大量的这些SCP来源用于实现人类营养,已经开发了用于将核酸含量降低数倍的方法。
[0039] 已经应用了细菌、酵母和其它微生物细胞来将糖原料加工成有用的有机化合物,如异养发酵系统中的蛋白质和氨基酸。然而,这些系统存在明显的缺点。异养发酵易受污染,因为周围环境中普遍存在可以在有机碳营养素上生长并且与生产菌株竞争的其它异养微生物。异养技术还通常在与当前食品生产模式竞争的方面受到限制。在许多异养系统中,人们基本上使用一种食品来源来制造另一种食品来源。这可能导致许多负面的环境影响和低效率。
[0040] 最初在人类太空
飞行计划中提出了用于由CO2产生蛋白质或氨基酸的自养微生物系统[G.L.Drake、C.D.King、W.A.Johnson和E.A.Zuraw“, 对持续时间超过一年的空间任务的生命支持系统的研究(Study of life support systems for space missions exceeding one year in duration)”《美国国家航空航天局技术报告(NASA,Tech.Rep)》SP-134,1966年4月]。
[0041] 现在人们对在不同气态和液体底物上(特别是废弃底物和以可持续方式产生的底物上)开发用于蛋白质合成以及其它营养素合成的微生物技术有了新的兴趣。
[0042] 化能自养微生物表示用于由C1原料产生蛋白质、蛋白质来源生品和其它营养素的光合生物的一种少量探索的替代方案。由化能自养生物进行的用于将CO2和其它形式的无机碳固定到有机化合物的化学合成反应由储存在无机化学品中的潜在能量驱动,而不是由光的
辐射能量驱动[J.M.Shively、G.van Keulen和W.G.Meijer(1998)“从无到有:化能自养生物中的二氧化碳固定(Something from almost nothing:carbon dioxide fixation in chemoautotrophs)”《微生物学年度评论(Annual review of microbiology)》52:191-230(http://dx.doi.org/10.1146/annurev.micro.52.1.191);A.J.Smith、J.London和R.Y.Stanier,“蓝绿藻和硫杆菌中的专性自养的生化
基础(Biochemical basis of obligate autotrophy in Blue-Green algae and thiobacilli)”(1967)《细菌学杂志(Journal of Bacteriology)》94(4):972-983(http://jb.asm.org/content/94/4/972.abstract);M.Hügler、C.O.Wirsen、G.Fuchs、C.D.Taylor和S.M.Sievert(2005)“由
变形菌
门的ε细分的成员通过还原性三羧酸循环进行自养CO2固定的证据(Evidence for autotrophic CO2 fixation via the reductive tricarboxylic acid cycle by members of theεsubdivision of proteobacteria)”《细菌学杂志》187(9):3020-3027,(http://dx.doi.org/10.1128/jb.187.9.3020-3027.2005);K.M.Scott和C.M.Cavanaugh,“来自双壳西洋遮阳篷的内共生化能自养生物进行的CO2摄取和固定(CO2 uptake and fixation by endosymbiotic chemoautotrophs from the bivalve solemya velum)”(2007)《应用与环境微生物学(Applied and Environmental Microbiology)》73(4):1174-
1179(http://dx.doi.org/10.1128/aem.01817-06)]。在化能自养生物中发生的固碳生化途径包含还原性三羧酸循环、卡尔文-本森-巴萨姆循环(Calvin-Benson-Bassham cycle)[Jessup Shively、Geertje van Kaulen、Wim Meijer(1998)《微生物学年度评论》191-
230],以及Wood-Ljungdahl途径[L.G.Ljungdahl“, 产乙酸菌中的乙酸合成的自养途径(The autotrophic pathway of acetate synthesis in acetogenic bacteria)”《微生物学年度评论》,第40卷,第1期,第415-450页,1986[网上]可从以下获得:http://dx.doi.org/
10.1146/annurev.mi.40.100186.002215]。
[0043] 化能自养生物尤其适用于将CO2转化为
有机化学品的混合化学/生物学过程,其中生物学步骤仅限于CO2固定。此CO2固定步骤大致对应于光合作用中发生的暗反应。与用于产生生物基产品的更传统的异养或光合生物过程相比,这种混合化学/生物学方法受到的关注要少得多。然而,这种混合方法有许多潜在的优势,包含能够有效地将通过数十亿年的固定CO2的
进程获得的酶能力与多种非生物能量转化技术(如
太阳能PV技术、太阳
热能技术、
风能技术、地热技术、水力发电技术或核技术)相组合,以便高效且清洁地从CO2碳源为整个生化生产过程提供动力。
[0044] 还可以使用甲烷氧化细菌从甲烷和天然气原料中获得类似范围的生物产品(单细胞蛋白(SCP)、聚羟基丁酸酯(PHB))。这些是过去已经在全规模SCP生产系统中实施并且作为
牛和鱼的富含蛋白质的饲料添加剂进行了测试的经过相对充分研究的微生物。可以应用微生物以便利用在污水和
粪肥处理厂处产生的沼气。甲烷氧化细菌可以实现用于将低价值甲烷升级为用作生物产品来源的微生物生物质的技术。
[0045] 化能自养微生物或甲烷氧化微生物捕获含CO2或含甲烷气体并将其转化为固定的碳产品的某些应用是已知的。然而,许多先前报道的方法存在缺点,这些缺点限制了所述方法的有效性、经济可行性、实用性和商业使用。
[0046] 需要在打破与很大规模的可持续的农业产出显著增加相关联的
瓶颈。与横向扩展并且土地和水资源高度密集的传统农业操作相比,需要具有紧凑的纵向扩展的生物生产。需要减轻粮食与自然的冲突以及土地使用与自然栖息地破坏的冲突。
[0047] 需要一种将低成本
合成气、CO2和/或甲烷转化为更高价值的有机化学品的生物过程,所述更高价值的有机化学品包含但不限于氨基酸、蛋白质、维生素、肥料、生物刺激素和其它生物营养素。
[0048] 需要鉴定一组可以在常规且可扩展的反应容器中生长并且以商业上可行的方法产生商业上可行的有机碳链(特别是长度超过四个碳原子的有机碳链)组的微生物。需要鉴定代谢上不受如糖等典型有机碳输入影响的微生物。需要可以另外利用通过H2/CO2气体混合中间体引导的合成气、发生炉煤气、天然气、沼气或各种非生物碳源和能源来合成氨基酸、蛋白质和其它生物营养素的微生物和系统。这将使原料灵活性远远超过相当的异养系统。需要
鉴别并使用可以利用存在于合成气、发生炉煤气中或通过各种非生物可再生和/或低CO2排放能源技术容易地产生的
电子供体(如氢气)来实现生长和固碳的微生物。
发明内容
[0049] 提供了用于由低成本且可持续的原料产生有机化学品的系统、方法和组合物,所述有机化学品包含但不限于氨基酸、蛋白质、维生素和其它生物营养素。在一些
实施例中,这些高价值有机化合物的高效产生与可以产生额外的收益和/或社会价值的对废弃碳源的处置和/或CO2的捕获相结合。
[0050] 使用天然存在的或经过工程化的微生物将CO2气体、合成气、发生炉煤气和/或甲烷转化为更高价值的中高碳链长度的分子,包含但不限于氨基酸、蛋白质、维生素和其它生物营养素。本文所描述的技术允许开发新型天然培育或经典培育的和/或基因增强的微生物菌株,所述微生物菌株可以用于气体制化学品(GTC)生物过程内的合成气生物加工以供产生和/或分泌各种碳链相对较长的有机化合物,所述有机化合物是滴入的并且目前仅高等植物农作物或动物来源大量产生。
[0051] 提供了用于选择、培育和/或工程化微生物的方法,包含但不限于氢氧化微生物、
一氧化碳营养微生物和氢氧混合气微生物,所述微生物具有在如合成气和/或CO2等气态碳源上生长并合成生物质使得生产微生物在气体培养下合成目标化学产品的天然能力。本文所描述的微生物和方法可以实现生物化学品的低成本合成,所述生物化学品可以与石化产品和/或高等植物来源的氨基酸、蛋白质和其它生物营养素在价格上竞争。在某些实施例中,预测这些氨基酸、蛋白质、维生素和其它生物营养素的价格比通过异养或微生物光养合成产生的氨基酸、蛋白质、维生素和其它生物营养素的价格低得多。
[0052] 提供了将合成气、和/或气态CO2、和/或CO2气体与H2气体的混合物、和/或甲烷连同包含但不限于氨、铵和/或尿素在内的氮源一起转化为一种或多种氨基酸、蛋白质、维生素和/或其它生物营养素的微生物。在一些实施例中,所述微生物属于以下组中的一种或多种:氢氧化化能自养微生物、一氧化碳营养微生物、氢氧混合气微生物和/或甲烷氧化微生物。更广泛地,氢氧混合气微生物、氢营养型生物(hydrogenotroph)、一氧化碳营养生物(carboxydotroph)和化能自养生物能够捕获CO2或CO作为其唯一的碳源以支持生物生长。甲烷氧化菌能够捕获CH4作为其唯一的碳源。在一些实施例中,这种微生物生长包含氨基酸和蛋白质的生物合成。氢氧混合气微生物和其它氢营养型生物可以使用H2作为还原电子来源以实现呼吸作用和生化合成。在一些实施例中,在气体流上生长氢氧混合气微生物、氢营养型生物、一氧化碳营养生物、其它化能自养微生物和/或甲烷氧化菌,所述气体包含但不限于以下中的一种或多种:CO2;CO;H2;CH4;以及溶解在水溶液中的无机矿物质。在一些实施例中,利用氢氧混合气微生物、氢营养型微生物、一氧化碳营养微生物、化能自养微生物和/或甲烷氧化微生物将温室气体(GHG)转化为生物分子,所述生物分子包含但不限于以下中的一种或多种:氨基酸和蛋白质以及维生素。
[0053] 还提供了包含本文所公开的微生物中的任何微生物的组合物。所述组合物可以包含包括用于生长和/或生物产品产生的营养素的生长培养基中的微生物。例如,所述组合物可以处于如本文所述的气态底物被引入的
生物反应器内。
[0054] 在一些实施例中,所述微生物选自红球菌属(Rhodococcus)或戈登氏菌属(Gordonia)。在一些实施例中,所述微生物是混浊红球菌(Rhodococcusopacus)。在一些实施例中,所述微生物是混浊红球菌(DSM 43205)或红球菌属(Rhodococcus sp.)(DSM
3346)。在一些实施例中,所述微生物选自雷尔氏菌属(Ralstonia)或贪铜菌属
(Cupriavidus)。在一些实施例中,所述微生物是杀虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)。在一些非限制性实施例中,杀虫贪铜菌的菌株是DSM 531或DSM 541。
[0055] 一方面,提供了一种天然的或经过工程化的微生物,所述微生物能够将气态底物(如发生炉煤气或合成气或含有H2和CO2、和/或CO、和/或CH4的另一种气体混合物)转化为氨基酸、蛋白质和其它生物营养素。所述微生物使用所述气态底物作为碳源和/或能源。在一些实施例中,用编码生物合成氨基酸、蛋白质或其它生物营养素所需的基因的多核苷酸来转化能够在所述气态底物上生长的微生物。在一些实施例中,从微生物细胞或从微生物生长培养基中回收氨基酸、蛋白质、其它生物营养素或全细胞产物。可以用于本文所描述的微生物生长过程的发生炉煤气可以来自包含以下的来源:废弃原料和/或生物质残余物原料的
气化、或来自工业过程的废气或天然气或沼气的
蒸汽重整。
[0056] 一方面,提供了一种非天然存在的微生物,所述微生物能够在作为碳源和/或能源的气态底物上生长,并且其中所述微生物包含至少一种外源核酸。在一些实施例中,所述微生物是细菌细胞。例如,在一些实施例中,所述细菌细胞是贪铜菌属或雷尔氏菌属(Ralstonia sp.),例如但不限于杀虫贪铜菌。在一些非限制性实施例中,所述微生物是杀虫贪铜菌DSM 531或DSM 541。
[0057] 在一些实施例中,所述气态底物包含CO2作为碳源。在一些实施例中,所述气态底物包含H2和/或O2作为能源。在一些实施例中,所述气态底物包含发生炉煤气、合成气或
热解气。在一些实施例中,所述气态底物包含气体的混合物,所述气体包括H2和/或CO2和/或CO和/或CH4。在一些实施例中,当在所述气体底物存在的情况下在适于微生物的生长和生物产品的产生的条件下培养微生物时,所述微生物产生氨基酸、蛋白质和其它生物营养素。
[0058] 另一方面,提供了用于使用如本文所述的微生物产生氨基酸、蛋白质和其它生物营养素的方法,所述微生物能够在作为碳源和/或能源的气态底物上生长。在一些实施例中,在适于微生物的生长的条件下,在包含气态底物和包含用于生长和生物产品产生的其它营养素的培养基(例如,液体生长培养基)的生物反应器中培养如本文所述的微生物,其中所述微生物产生氨基酸、蛋白质和其它生物营养素。
[0059] 在一些实施例中,所述生物反应器中的所述气态底物包含H2和/或CO2。在一些实施例中,所述气态底物是发生炉煤气、合成气或热解气。在一些实施例中,所述气态底物是天然气或沼气。在一些实施例中,所述气态底物源自
城市固体废物、黑液、农业废物、木材废物、闲置天然气、沼气、
酸性气体、甲烷水合物、轮胎、
石油焦、污水、粪肥、秸秆、木质纤维素能源作物、木质素、作物残余物、甘蔗渣、锯屑、林业残余物、食品垃圾、废地毯、废塑料、填埋气体和/或
木质纤维素生物质。
[0060] 在一些实施例中,从所述培养基中回收氨基酸、蛋白质、维生素和/或其它生物营养素。
[0061] 另一方面,提供了用于产生氨基酸、蛋白质、维生素和/或其它生物营养素的微生物和方法。在一些实施例中,提供了一种天然或非天然存在的微生物,其中所述微生物分别包含零种或至少一种外源核酸,并且能够在作为碳源和/或能源的气态底物上生长,并且其中所述微生物生物合成氨基酸、蛋白质、维生素和/或其它生物营养素。在一些实施例中,所述天然或非天然存在的微生物是贪铜菌属或雷尔氏菌属。在一些实施例中,所述微生物是杀虫贪铜菌或耐金属贪铜菌(Cupriavidusmetallidurans)。在一些实施例中,提供了一种用于利用如本文所述的天然或非天然存在的微生物产生氨基酸、蛋白质、维生素和/或其它生物营养素的方法,其中所述微生物分别包含零种或至少一种外源核酸、能够在作为碳源和/或能源的气态底物上生长并且生物合成氨基酸、蛋白质、维生素和/或其它生物营养素,所述方法包含:在适于微生物的生长和氨基酸、蛋白质、维生素和/或其它生物营养素的产生的条件下,在包含气态底物和包含用于生长和生物产品产生的其它营养素的培养基(例如,液体生长培养基)的生物反应器中培养所述天然或非天然存在的微生物,其中所述微生物产生氨基酸、蛋白质和其它生物营养素。
[0062] 在一些实施例中,使用本文所描述的微生物从工业
烟道气中捕获CO2并且产生富含蛋白质的生物质。在一些实施例中,这种富含蛋白质的生物质是商品。在一些实施例中,所述富含蛋白质的生物质用作单细胞蛋白质(SCP)。在一些实施例中,所述富含蛋白质的生物质用于以下应用中的一种或多种中:肥料;生物刺激素;生物肥料;真菌生长强化剂或补充剂;营养素;配料;动物饲料或动物饲料配制品内;人类食品或人类食品配制品内。在一些实施例中,所述富含蛋白质的生物质用作鱼肉和/或其它动物蛋白质的高蛋白质替代物,和/或用于植物肥料产品和/或蘑菇和真菌生长强化剂中。在一些非限制性实施例中,本发明既用于减少GHG又用于产生高蛋白质产品,所述高蛋白质产品的应用包含但不限于植物肥料、和/或生物刺激素、和/或真菌肥料、和/或营养补充剂、和/或人类食品配料。
[0063] 在一些实施例中,对所述高蛋白质产品进行水解。在一些实施例中,通过对所述富含蛋白质的生物质进行蒸汽处理来提高水解产率。当在水分存在的情况下加热时,一些不溶性蛋白质被转化为耐火性较低的形式[Kida,K.、S.Morimura、J.Noda、Y.Nishida、T.Imai和M.Otagiri(1995)“
奶牛和水牛的角和
蹄的酶促水解(Enzymatic hydrolysis of the horn and hoof of cow and buffalo)”《发酵与
生物工程杂志(J.Ferment.Bioeng.)》80:478-484.]。
[0064] 本公开的某些实施例涉及具有降低的核酸含量的微生物蛋白质分离物。在某些实施例中,所述分离物的核酸含量低于9wt%。在某些非限制性实施例中,所述分离物的蛋白质当量比(PER)大于1。
[0065] 在某些实施例中,将与开发用于降低酵母SCP的核酸含量的方法类似的方法应用于如本文所述的原核细胞。酵母的核酸主要是核糖核酸或RNA。在某些实施例中,细胞的核酸也主要是RNA,并且在本申请中,术语RNA和核酸有时可互换使用。在某些实施例中,核酸含量与蛋白质的比率降低至小于3%。在某些实施例中,本领域的普通技术人员根据本领域的知识将核酸与蛋白质的比率降低至被认为对于提供人类饮食中的大部分或全部蛋白质需求而言安全的水平。
[0066] 本公开的某些实施例涉及在其它工业发酵中用作原料或营养源的微生物水解产物。Ummadi,M.和Curic-Bawden,M.(2010)“蛋白质水解产物在工业发酵剂培养发酵中的用途(Use of Protein Hydrolysates in Industrial Starter Culture Fermentations)”《生物技术中的蛋白质水解产物(Protein Hydrolysates In Biotechnology)》91-114,所述文献通过引用整体并入本文。
[0067] 本公开的某些实施例涉及应用于运动医学中的微生物蛋白质分离物和/或水解产物,并且具体地说,在某些非限制性实施例中,所述水解产物的消耗允许氨基酸比完整蛋白质更快地被身体吸收,从而最大限度地向肌肉组织输送营养。Manninen,Anssi H.“,运动和锻炼中的蛋白质水解产物:简要回顾(Protein Hydrolysates In Sports And Exercise:A Brief Review)”(2004)《运动科学与医学杂志(Journal of Sports Science and Medicine)》3:60-63,(2004),所述文献通过引用整体并入本文。
[0068] 一方面,提供了用于产生植物和真菌生物刺激素和营养素的方法。还提供了通过这种过程产生的生物刺激素和营养素。在一些实施例中,提供了产生植物生物刺激素和/或肥料的方法,所述方法包含使细菌细胞水解以获得水解产物,以及将所述水解产物配制为用于叶面施用、作为土壤佐剂施用和/或作为土壤肥料施用的植物生物刺激素和/或肥料。还提供了通过本文所描述的方法获得的植物生物刺激素和/或肥料。还提供了通过施用这种植物或真菌生物刺激素和营养素来生长植物或真菌的方法。还提供了用于由这种植物或真菌制备产品的过程。还提供了通过向生物供给这种植物或真菌来饲养异养生物的方法。
还提供了由这种异养生物产生产品的方法。
[0069] 另一方面,提供了能够增加商业蘑菇的产率和/或生存力的蘑菇生长强化剂。还提供了作为食品来源的竞争性外来微生物不易接近,同时促进商业蘑菇的繁殖的蘑菇生长强化剂。还提供了对制造和使用而言具有经济性的蘑菇生长强化剂。还提供了在低浓度水平下有效的蘑菇生长强化剂。还提供了由容易获得的、低成本的和/或废弃的材料制成的蘑菇生长强化剂。还提供了使用
可再生能源容易地制造的蘑菇生长强化剂。
[0070] 一方面,提供了一种用于将含有一个或多个碳原子的无机和/或有机分子生物转化为包括通过固碳反应或合成代谢生物合成产生的氨基酸、蛋白质和/或维生素的有机分子的生物和化学方法,所述方法包括:将含有一个或多个碳原子的无机和/或有机分子引入到包括处于培养基中的微生物细胞的环境中,所述培养基适合于维持所述微生物细胞;其中所述含有一个或多个碳原子的无机和/或有机分子由所述微生物细胞用作碳源以实现生长和/或生物合成;在所述环境内通过含于所述微生物细胞内的至少一个固碳反应或至少一条合成代谢生物合成途径将所述含有一个或多个碳原子的无机和/或有机分子转化为包括氨基酸、蛋白质和/或维生素的有机分子产物;其中所述固碳反应或所述合成代谢生物合成途径至少部分地由电子供体和/或电子受体提供的化学和/或电
化学能量驱动,所述电子供体和/或所述电子受体已经化学地和/或电化学地和/或热化学地产生和/或从所述环境外部的至少一个来源引入到所述环境中,并且其中所述微生物细胞包括包含所述氨基酸、蛋白质和/或维生素的生物质。在一些实施例中,所述有机分子产物包括具有长度为五个或更多个碳的碳主链的化合物。在一些实施例中,从所述培养基中回收在所述环境中产生的氨基酸和/或蛋白质和/或维生素和/或生物质。
[0071] 在一些实施例中,所述碳源仅含有一个碳原子,并且其中所述仅含有一个碳原子的电子供体和/或分子通过作用于有机物质的热化学过程产生,所述热化学过程包括以下中的至少一种:气化;热解;蒸汽重整;和自动重整。在一些实施例中,所述碳源仅含有一个碳原子,并且所述仅含有一个碳原子的所述电子供体和/或有机分子通过甲烷蒸汽重整产生。在一些实施例中,所述气态底物源自包括H2、CO和CO2的气流,所述气体由气化和/或热解和/或自动重整和/或蒸汽重整产生,其中在所述气流递送到所述微生物之前,使用
水煤气变换反应调节来自气化和/或热解和/或自动重整和/或蒸汽重整的气体输出中的氢气与一氧化碳的比率。
[0072] 在一些实施例中,所述碳源包括从一种或多种来源捕获或引导的C1分子,所述来源包括:有机物质的气化;
煅烧石灰岩CaCO3产生生石灰CaO;甲烷蒸汽重整;燃烧、焚烧或骤燃;糖的厌氧发酵或好氧发酵;甲烷氧化生物过程;其它生物的呼吸作用;废
水处理;填埋气体;磷酸钠生产;地质或地热产生的或排放的气体;酸性气体、含硫气体或天然气;
海水或其它表面或地下
水体;以及大气。
[0073] 在一些实施例中,一种或多种电子供体选自:氨;铵;一氧化碳;连二亚
硫酸盐;元素硫;烃;氢气;偏亚硫酸氢盐;一氧化氮;亚硝酸盐;硫酸盐,如硫代硫酸盐,包含但不限于
硫代硫酸钠(Na2S2O3)或硫代硫酸钙(CaS2O3);硫化物,如
硫化氢;亚硫酸盐;五价硫酸盐(thionate);三价硫酸盐(thionite);溶解相或固相形式的过渡金属或其硫化物、氧化物、硫属化合物、卤化物、氢氧化物、羟基氧化物、磷酸盐、硫酸盐或碳酸盐;以及固态
电极材料中的导带电子或
价带电子。在一些实施例中,一种或多种电子受体选自:二氧化碳;氧气;亚硝酸盐;硝酸盐;三价铁或其它过渡
金属离子;硫酸盐;以及固态电极材料中的价带空穴或导带空穴。
[0074] 在一些实施例中,所述生物转化之前是一个或多个化学预加工步骤,其中所述微生物所需的电子供体和/或电子受体和/或碳源和/或矿物质营养素由至少一种输入化学品产生和/或精制而成,和/或由所述固碳步骤中产生的化学品回收再利用而来和/或由来自其它工业、矿业、农业、污水或废物产生过程的废物流产生或包含在所述废物流内。
[0075] 在一些实施例中,使用温室气体
排放量低的可再生、可替代或常规电力来源产生或回收再利用所述电子供体和/或电子受体,并且其中所述电力来源选自以下中的至少一种:
光伏发电、太阳热能、
风力发电、水力发电、核能、
地热能、增强的地热能、海洋热能、海浪电力和
潮汐能。在一些实施例中,在
电网供电超过电网需求的时段期间使用电网电力产生所述电子供体和/或电子受体,并且其中储存罐缓冲所述电子供体和/或电子受体的所述产生,以及其在所述固碳反应中的消耗。
[0076] 在一些实施例中,所述电子供体包括源自尾气的H2和/或CO和/或甲烷,所述尾气来自以下中的一种或多种:甲烷蒸汽重整;石油精炼;
钢铁生产;
铝生产;锰生产;氯碱过程;
炭黑制造;甲醇合成;氨合成;
冶金过程;化学过程;和电化学过程。
[0077] 在一些实施例中,分子氢气用作电子供体,其中所述氢气通过使用以下中的至少一种的方法产生:水的
电解;水的热化学分解;盐
水电解;硫化氢的电解和/或热化学分解。在一些实施例中,用于产生氢气的水的电解使用以下中的一种或多种进行:
质子交换膜(PEM);液体
电解质,如KOH;碱性电解;固体
聚合物电解质电解;高压电解;和蒸汽高温电解(HTES)。在一些实施例中,用于产生氢气的水的热化学分解使用以下中的一种或多种进行:
氧化铁循环;氧化铈(IV)-氧化铈(III)循环;锌氧化锌循环;硫-碘循环;铜-氯循环;钙-溴-铁循环;混合硫循环。
[0078] 在一个实施例中,所述微生物细胞是细菌细胞。在一些实施例中,所述微生物是贪铜菌属或雷尔氏菌属。在一些实施例中,所述微生物是杀虫贪铜菌或耐金属贪铜菌。在一些实施例中,所述微生物细胞包括选自以下属中的一个或多个的微生物:贪铜菌属、红球菌属、氢弧菌属(Hydrogenovibrio sp.)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)、氢杆菌属(Hydrogenobacter sp.)、戈登氏菌属(Gordonia sp.)、节杆菌属(Arthrobacter sp.)、链霉菌属(Streptomycetes sp.)、红杆菌属(Rhodobacter sp.)和/或黄色杆菌属(Xanthobacter)。
[0079] 在一些实施例中,当在气态底物存在的情况下在适于微生物生长和生物产品产生的条件下培养所述微生物细胞时,所述微生物细胞产生氨基酸和/或蛋白质和/或维生素和/或生物质。在一些实施例中,所述气态底物包括CO2和/或CO和/或CH4作为碳源。在一个实施例中,所述气态底物包括H2。在一个实施例中,气态底物包括H2和/或O2作为能源。在一些实施例中,所述气态底物包括包含H2和/或CO和/或CH4中的一种或多种的电子供体。在一些实施例中,所述气态底物包括热解气或发生炉煤气或合成气或天然气或沼气。在一些实施例中,所述气态底物包括气体的混合物,所述气体包括H2和/或CO2和/或CO。在一些实施例中,所述气态底物源自城市固体废物、黑液、农业废物、木材废物、闲置天然气、沼气、酸性气体、甲烷水合物、轮胎、石油焦、污水、粪肥、秸秆、木质纤维素能源作物、木质素、作物残余物、甘蔗渣、锯屑、林业残余物、食品垃圾、废地毯、废塑料、填埋气体、海带、海藻和/或木质纤维素生物质。
[0080] 在一个实施例中,提供了一种用于产生氨基酸和/或蛋白质和/或维生素和/或生物质的方法,所述方法包括:在适于微生物的生长和氨基酸和/或蛋白质和/或维生素和/或生物质的产生的条件下,在包括包含用于生长和生物产品产生的其它营养素的气态底物和培养基的生物反应器中培养如本文所述的微生物,其中所述微生物产生氨基酸和/或蛋白质和/或维生素和/或生物质。
[0081] 在一些实施例中,所述微生物是氢氧混合气微生物。在一个实施例中,所述气态底物包括H2和/或CO2。在一些实施例中,所述气态底物是热解气或发生炉煤气或合成气。
[0082] 在一个实施例中,所述微生物细胞通过包括分子氢气作为电子供体的化学合成反应产生所述氨基酸、所述蛋白质和/或所述维生素,其中所述氢气通过已知用于产生氢气的具有低二氧化碳排放或无二氧化碳排放的电化学或热化学过程产生,所述过程包括以下中的一种或多种:实现碳捕获和封存(CCS)的甲烷蒸汽重整;实现CCS的
煤气化; 过程和其它产生炭黑产品的过程;实现CCS的生物质的气化或热解;以及产生
生物炭副产品的生物质热解。
[0083] 在一个实施例中,至少一个固碳反应和至少一条合成代谢生物合成途径引起生物产品的形成,所述生物产品包含以下中的至少一种:氨基酸;肽;蛋白质;脂质;多糖;和/或维生素。在一个实施例中,所述至少一个固碳反应和所述至少一条合成代谢生物合成途径包括卡尔文循环(Calvin Cycle)和氨基酸生物合成途径。
[0084] 在一些实施例中,由所述微生物以本文所述的方法产生的生物质和/或有机分子用于饲养一种或多种其它生物或向所述其它生物提供营养。在一些实施例中,以本文所述的方法产生的所述氨基酸和/或所述蛋白质和/或所述维生素用于产生植物生物刺激素或蘑菇生长强化剂。
[0085] 另一方面,提供了一种植物生物刺激素,其包括根据本文所述的方法产生的生物质、氨基酸、蛋白质和/或维生素。在一个实施例中,提供了一种用于处理作物的方法,所述方法包括将本文所述的植物生物刺激素施用于植物、和/或植物生长的土壤和/或用于生长植物的液体培养基中;以及
收获所述植物。在一个实施例中,提供了一种方法,所述方法包括将通过本文所述的固碳反应或合成代谢生物合成产生的生物质、氨基酸、蛋白质和/或维生素施用于植物和/或植物生长的土壤和/或用于生长植物的液体培养基中;以及收获所述植物。在一些实施例中,所述植物是农作物。
[0086] 另一方面,使以本文所述方法培育的微生物细胞裂解,由此产生裂解物。在一些实施例中,所述裂解物用于产生乳液或悬浮液。在一些实施例中,将所述裂解物分离成不可溶部分和可溶部分,可以对所述不可溶部分和所述可溶部分中任一个或两个任选地进行浓缩或干燥。在一些实施例中,提供了一种植物生物刺激素,其包括如本文所述产生的裂解物、乳液、悬浮液或其部分。
[0087] 另一方面,使以本文所述方法产生的蛋白质水解,由此产生水解产物。在一个实施例中,水解包括进行酸水解。在一个实施例中,所述水解包括至少一种能够将蛋白质水解成游离氨基酸和寡肽中的至少一种的酶。在一个实施例中,水解包括进行碱水解。在一些实施例中,所述水解产物用于产生乳液或悬浮液。在一些实施例中,将所述水解产物分离成不可溶部分和可溶部分,可以对所述不可溶部分和所述可溶部分中任一个或两个任选地进行浓缩或干燥。在一些实施例中,对所述水解产物进行过滤,由此产生滤液(渗透物)和滤出物(渗余物;残余物)。在一些实施例中,提供了一种植物生物刺激素,其包括如本文所述产生的水解产物、其乳液、悬浮液、部分、滤液或滤出物。
[0088] 另一方面,以本文所述的方法产生的生物质用于产生植物生物刺激素,所述方法包括:使所述生物质水解以获得水解产物;以及将所述水解产物配制为用于叶面施用和/或作为土壤佐剂或添加剂施用和/或在用于植物生长的液体培养基中使用的植物生物刺激素。在一个实施例中,所述方法进一步包含将所述植物生物刺激素施用于植物和/或植物生长的土壤和/或用于生长植物的液体培养基中;以及收获所述植物。在一个实施例中,所述水解包括至少一种能够将蛋白质水解成游离氨基酸和寡肽中的至少一种的酶。在一个实施例中,水解包括进行酸水解。在一个实施例中,水解包括进行碱水解。在一些实施例中,提供了一种植物生物刺激素,其包括如本文所述的生物质。
[0089] 另一方面,提供了一种用于产生裂解物的方法,所述方法包括:在适于微生物的生长的条件下在生物反应器中培养如本文所述的微生物,其中收获在所述生物反应器中产生的生物质并将所述生物质从所述生物反应器中取出,其中随后使从所述生物反应器中取出的所述生物质裂解,由此产生裂解物。在一些实施例中,所述细胞通过均质化
破碎。在一些实施方例中,所述裂解物包括蛋白质,并且所述方法进一步包括使所述裂解物中的蛋白质水解,由此产生水解产物。
[0090] 另一方面,提供了一种从以本文所述方法培育的微生物中分离的蛋白质浓缩物。在一个实施例中,所述蛋白质浓缩物含有少于约5%的核酸。在一个实施例中,所述蛋白质浓缩物含有少于约3%的核酸。
[0091] 一方面,本文所述的用于将含有一个或多个碳原子的无机和/或有机分子生物转化为包括通过固碳反应或合成代谢生物合成产生的氨基酸、蛋白质和/或维生素的有机分子的方法进一步包括产生经过浓缩的蛋白质产品,所述产生包括以下步骤:a.使所述微生物细胞破碎,其中所述细胞包括一种或多种核酸酶,由此产生包括可溶核酸、核酸酶和蛋白质并且包括不可溶细胞壁碎片的混合物;b.在用所述核酸酶使所述核酸水解的条件下,将所述可溶核酸、核酸酶和蛋白质与所述不可溶细胞壁碎片分离,由此产生经过水解的核酸;d.使所述蛋白质不可溶;以及e.将所述不可溶蛋白质与包括所述经过水解的核酸的剩余可溶物质分离。在一些实施例中,所述细胞通过均质化破碎。在一个实施例中,所述不可溶蛋白质包括少于约5%的核酸。在一个实施例中,所述不可溶蛋白质包括少于约3%的核酸。
[0092] 另一方面,如本文所述那样产生的生物质和/或所述有机分子具有作为以下中的至少一种的应用:用于发酵的有机碳和/或氮源;用于其它微生物或生物的生长的营养源;
益生元;用于人类的营养源或食品配料;动物饲料;用于制造或化学过程的原料或化学中间体;制药、药用或营养物质的来源;肥料;土壤添加剂;土壤稳定剂;土壤佐剂;植物生物刺激素和/或蘑菇生长强化剂。在一个实施例中,所述肥料和/或所述土壤添加剂;和/或所述土壤稳定剂;和/或所述土壤佐剂;和/或所述植物生物刺激素;和/或所述蘑菇生长强化剂向所述土壤添加碳和/或氮,从而引起其中施用有碳和/或氮的所述土壤的碳和/或氮含量增加。在一个实施例中,所述碳源是气态C1分子,并且其中添加到所述土壤中的所述碳代表经过封存的碳,并且从气态C1碳源到土壤碳的端到端过程代表碳封存过程。在一个实施例中,将所述肥料和/或所述生物刺激素施用于
水培生长、气培生长、复合养殖生长或在竖直农场系统中生长的作物。在一个实施例中,所述肥料和/或所述生物刺激素用于
灌溉施肥。在一个实施例中,将所述肥料和/或所述生物刺激素施用于在温室中生长、室内生长和/或使用人工照明生长的作物。在一个实施例中,提供了一种用于微生物和其它生物的生长的方法,其中所述微生物和生物在土壤中在如本文所述产生的营养源上生长。在一个实施例中,提供了一种使用所述有机碳和/或氮源产生包括以下的一种或多种生物产品的发酵方法:商业酶;抗生素;氨基酸;蛋白质;植物生物刺激素;蘑菇生长强化剂;
益生菌;益生元;生物肥料;食品;食品配料;维生素;脂质;生物塑料;多糖;营养品;和/或药物。
[0093] 另一方面,提供了一种用于从C1原料获得有机酶提取物的方法,所述方法包括用于将含有一个或多个碳原子的无机和/或有机分子生物转化为包括通过如本文所述的固碳反应或合成代谢生物合成产生的氨基酸、蛋白质和/或维生素的有机分子的方法,其中所述碳源仅包括一个碳原子,其中所述方法进一步包括使所述微生物细胞经历以下中的一种或多种:机械裂解;酶促裂解;pH调节;压力增加或减小;温度升高或降低;
电场或电
磁场;超声;渗透浓度的变化;和酶促水解,由此产生有机酶提取物。
[0094] 另一方面,提供了一种蘑菇生长强化剂,其包括以本文所述的方法产生的生物质和/或蛋白质。在一个实施例中,提供了一种用于增强蘑菇生长的方法,所述方法包括将所述蘑菇生长强化剂与蘑菇堆肥组合。在一个实施例中,提供了一种蘑菇生长组合物,其包括组合的蘑菇堆肥和蘑菇生长强化剂。
[0095] 根据以下对本发明的一些示例性实施例的详细描述,本文所述的方法、系统、微生物和组合物的各种目的、特征、方面和优点将变得更加明显。
附图说明
[0096] 将参考附图通过举例描述本发明的非限制性实施例,附图中的一些是示意性的并且不旨在按比例绘制。为了清楚起见,未在每个图中标记每个部件,也未示出本发明的每个实施例的每个部件,其中说明对于本领域的普通技术人员理解本发明来说不是必需的。
[0097] 图1描绘了OD与生物质密度之间的相关性。
[0098] 图2描绘了血清瓶中的杀虫贪铜菌在气体上的生长曲线。
[0099] 图3描绘了顶空压力随血清瓶中的杀虫贪铜菌在气体上的生长的时间的变化。
[0100] 图4描绘了血清瓶中的杀虫贪铜菌消耗的每摩尔H2产生的干生物质。
[0101] 图5描绘了生物反应器中在H2/CO2/O2上生长的杀虫贪铜菌的生长曲线。
[0102] 图6展示了化能自养微生物和产油微生物在不同碳源上的生长。在所指示天数(括号内)后使用光密度(OD)检测在650nm下测量细菌生长。下文的实例部分中描述了培养基和生长条件。ND,未完成。
[0103] 图7示出了用于在气体上生长杀虫贪铜菌的生物反应器和支持系统的示意图。
[0104] 图8示出了在
通风橱中在气体上生长杀虫贪铜菌的两个20L生物反应器。
[0105] 图9示出了用于操作20L反应器的Applikon
控制器和控制台以及爆炸性气体检测系统、质量流量计、液位控制器、基底控制储存器、培养基添加储存器和
泡沫控制储存器。
[0106] 图10示出了在超声处理之前呈棕色的杀虫贪铜菌的生物质浆料(左),以及在通过完全细胞破碎进行的超声处理之后的生物质的
颜色从棕色变为奶油色的杀虫贪铜菌的生物质浆料(右)。
[0107] 图11示出了在生物反应器中在H2、CO2和O2气体的混合物上生长的海洋氢弧菌(Hydrogenovibrio marinus)菌株DSM 11271。
[0108] 图12示出了示意性绘制的用于生长荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonascapsulata)菌株DSM 1710的气体递送系统和培养瓶。
[0109] 图13示出了荚膜红假单胞菌的显微照片。
[0110] 图14示出了离心后回收的荚膜红假单胞菌生物质颗粒。
[0111] 图15示出了用于在作为用于生长的唯一能源和碳源的H2、CO2和O2气体的混合物上生长自养黄色杆菌(Xanthobacter autotrophicus)菌株DSM 432的两升玻璃
发酵罐系统的示意图。
[0112] 图16示出了示意性展示的用于生长自养黄色杆菌的两升生物反应器的顶板。
[0113] 图17示出了用于生长自养黄色杆菌的反应器系统的示意图,所述反应器系统包含:压力计;气体流量计;安全和止回
阀;0.2微米
过滤器;生物反应器容器、
传感器、
致动器和控制器;
冷凝器和泡沫收集器;以及出风口。
[0114] 图18示出了用于生长自养黄色杆菌的气体递送系统的示意图。
[0115] 图19描绘了自养黄色杆菌的OD600与细胞干重(CDW)之间的相关性。
[0116] 图20描绘了在H2/CO2/O2上生长的自养黄色杆菌的生长曲线。
[0117] 图21示出了本文所述方法的实施例的
框图,其中对呈水性细胞悬浮液形式的发酵液进行碱处理,然后进行物理处理和酶促水解以获得有机酶提取物。
[0118] 图22示出了本文所述方法的实施例的框图,其中高蛋白低核酸分离物源自如本文所述的细胞。
[0119] 图23示意性地示出了具有化能自养初级生产者的复合多级生命支持系统或生态系统。
[0120] 图24示意性地示出了CO2+再生H2用于产生高蛋白粉的用途,所述高蛋白粉可以用作例如生物刺激素、动物饲料或肥料或用于直接人类营养。
[0121] 图25示出了将废弃CO2和非高峰歇性可再生能源转化为高蛋白生物刺激素、饲料、肥料和/或营养素的集成系统的示意图。除了捕获CO2和产生有价值的营养素之外,所述系统缓解了电网在低需求时段期间因过度可再生能源发电而承受的压力。
具体实施方式
[0122] 本文的公开内容涉及在微生物系统中使用如合成气或发生炉煤气或热解气或H2和CO2气体混合物等气态底物作为碳源和能源生物地产生氨基酸和蛋白质以及其它生物质成分。本公开还涉及微生物氨基酸、蛋白质和其它生物质成分用于饲养其它生物或人类或向其提供营养素的用途。根据所公开的方法产生的氨基酸、蛋白质和其它生物质成分可以被其它生物消耗并且被其用作营养素,以供产生食品和其它生物基产品。
[0123] 本公开还涉及通过培养在含碳气体(如合成气、发生炉煤气、热解气、CO2、一氧化碳和含有氢气的气体混合物)上生长的细菌或其它微生物来产生氨基酸、蛋白质和其它生物质成分的组合物和方法。本公开还涉及含有甲烷的气体混合物,如沼气或天然气。本公开进一步涉及将来自气态输入的碳固定到如氨基酸、蛋白质、维生素和其它营养素等有用的有机分子中的方法。可以对本文公开的细菌和/或微生物进行基因工程化以用于本文所述的方法或其它方面。在本文所述的其它一些方面,微生物不是经过基因工程化的,即,其是野生型的。
[0124] 本公开进一步涉及将来自气体的碳固定到如氨基酸、蛋白质、维生素和其它营养素等有用的有机分子中的方法。本公开进一步描述了通过将二氧化碳或其它无机碳源和无机能量(包含来自无机化学品的化学能,或直接来自电源的化学能)转化为具有商业价值的碳基产品(并且具体地说,氨基酸、蛋白质、维生素和其它具有商业价值的营养素),赋予生物产生和/或增强碳基产品生物生产能力的机制。
[0125] 本公开还涉及人工生态学、工程营养系统、封闭生态系统、微观世界、连续培养系统、生物再生和闭环生命支持系统(Freda B.Taub(1974)《封闭生态系统:生态学与系统学年评(Closed Ecological Systems Annual Review of Ecology and Systematics)》5:139-160;和E.A.Zuraw(1966)“对持续时间超过一年的空间任务的生命支持系统的研究”《美国国家航空航天局技术报告》SP-134,所述文献通过引用整体并入本文。
[0126] 本公开进一步涉及氢气的用途。氢气通常被认为是化石
燃料的可持续替代品或
电能储存的手段。然而,其还可以用作用于培养氢氧化微生物的原料和主要能源。
[0127] 本公开进一步涉及化能自养微生物,并且具体地说,氢氧化细菌的技术应用。这些是过去研究过的作为单细胞蛋白质(SCP)的潜在生产者的特殊的一组细菌(G.L.Drake、C.D.King、W.A.Johnson和E.A.Zuraw“,对持续时间超过一年的空间任务的生命支持系统的研究”《美国国家航空航天局技术报告》SP-134,1966年4月;R.Repaske和R.Mayer,“真养产碱杆菌的致密自养培养物(Dense autotrophic cultures of Alcaligenes eutrophus)”(1976)《应用与环境微生物学》32(4):592-597(http://aem.asm.org/cgi/content/abstract/32/4/592))和聚羟基丁酸酯(PHB)。
[0128] 本公开进一步涉及微生物提取物和蛋白质水解产物。(美国专利第3,887,431号;美国专利第9,416,062号;美国专利申请2012/0129695;欧洲专利申请EP2,752,399通过引用整体并入本文)。本公开还涉及获得对异养微生物、真菌、动物和植物具有高生物刺激性和/或生物肥料能力和高生物吸收能力的提取物,因此它们特别适用于有机农业、发酵、动物饲料和直接人类营养。
[0129] 本公开进一步涉及生物刺激素和生物肥料。本公开还涉及产生植物和真菌营养素、生物刺激素、生物肥料的方法,以及由此产生的生物刺激素和/或生物肥料。本公开还涉及蘑菇生长增强物质。本公开还涉及通过施用此类生物刺激素、生物肥料和/或生长增强物质来生长植物和真菌的方法。本公开进一步涉及用于由这种植物和真菌制备产品、通过向牲畜供给这种植物或真菌来饲养牲畜、以及由这种牲畜产生产品的过程。(Colla,G.等人(2015)“园艺中作为生物刺激素的蛋白质水解产物(Protein hydrolysates as biostimulants in horticulture)”《园艺科学》196:28-38(http://dx.doi.org/10.1016/j.scienta.2015.08.037);美国申请第US20120129695号;欧洲申请第EP2752399A1号;和美国专利第4,776,872号,所述文献通过引用整体并入本文)。
[0130] 本文提供了用于生物合成产生氨基酸、蛋白质、维生素和其它生物营养素的方法和系统。在某些实施例中,提供了在气态底物上产生氨基酸、蛋白质和其它生物营养素的天然的或经过工程化的微生物,所述气态底物包含但不限于发生炉煤气、合成气、尾气、热解气、氢氧混合气、天然气、沼气以及含有H2和CO2、和/或CO和/或CH4的气体混合物。气态底物可以用作碳源和/或能源和/或电子供体和/或电子受体的来源,以实现微生物的生长和生物产品的生物合成。在某些实施例中,氨基酸、肽、蛋白质、维生素和/或其它营养素由简单的C1和无机前体合成,所述无机前体包含但不限于以下中的一种或多种:合成气、发生炉煤气、H2、CO2、CO、H2O、NH3、CH4、CH3OH、HCOH、尿素。
[0131] 还提供了如野生型或经过工程化的微生物等能够在合成气、或发生炉煤气、和/或H2、和/或CO2、和/或CO、和/或CH4、和/或其它废气上生长的微生物,所述微生物能够产生氨基酸(包含但不限于赖氨酸和/或甲硫氨酸)。
[0132] 在某些实施例中,氨基酸、和/或肽、和/或蛋白质和/或维生素由简单的C1和无机前体合成,所述无机前体包含但不限于以下中的一种或多种:H2、CO2、CO、H2O、NH3、CH4、CH3OH、HCOH、尿素。在其它非限制性实施例中,由多碳有机分子(如但不限于糖)异养产生氨基酸、和/或肽、和/或蛋白质和/或维生素。
[0133] 在一些实施例中,本公开涉及一种产生一种或多种氨基酸或蛋白质或维生素的方法,所述方法包括将细菌细胞暴露于合成气和/或发生炉煤气和/或气态CO2和/或H2和/或CO和/或CH4,例如,H2和CO2、和/或CO和/或CH4;其中所述细菌细胞能够将气态CO2和/或其它C1分子固定到一种或多种氨基酸或蛋白质或维生素中,并且其中所述微生物不包括外源核酸或包括至少第一外源核酸。在一些实施例中,细胞利用一种或多种气态底物作为还原等同物和/或
代谢能量的来源,以合成一种或多种氨基酸或蛋白质或维生素。在一些实施例中,微生物通过其天然机制产生氨基酸和/或蛋白质和/或维生素。
[0134] 在一些实施例中,本公开涉及用于产生氨基酸和/或蛋白质和/或蛋白质生物质和/或维生素的方法,其中所述方法包括在生物反应器或具有原料的溶液中培养天然微生物菌株或经过工程化的微生物,所述原料包括合成气和/或发生炉煤气和/或CO2和/或H2和/或CO和/或CH4和/或沼气和/或天然气,例如,H2和CO2、和/或CO和/或CH4。在一些实施例中,本公开涉及包括本文所描述的组合物或细菌或微生物细胞的生物反应器。在一些实施例中,本公开涉及一种用于产生一种或多种氨基酸、蛋白质或营养素的包括生物反应器的系统,所述生物反应器包括:(a)微生物群体,其包括本文描所述的细胞;和(b)连接到原料源的入口,其允许递送包括合成气或发生炉煤气和/或气态CO2和/或H2和/或CO和/或CH4和/或甲醇的原料,例如,H2和CO2、和/或CO、和/或CH4和/或甲醇。
[0135] 在一些实施例中,本公开涉及在包括本文所描述的细胞或组合物的微生物群体中产生氨基酸、或蛋白质或其它营养素的方法,其中所述方法包括:在包括合成气或发生炉煤气和/或气态CO2和/或H2和/或CO和/或CH4和/或甲醇(例如,H2和CO2、和/或CO、和/或CH4和/或甲醇)的原料中培养包括本文所描述细胞或组合物的微生物群体。
[0136] 在一些实施例中,本公开涉及一种制备一种或多种氨基酸、或蛋白质或其它营养素的方法,所述方法包括(a)在合成气或发生炉煤气和/或气态CO2和/或H2和/或CO和/或CH4(例如,H2和CO2、和/或CO、和/或CH4)存在的情况下在反应容器或生物反应器中培养本文所述的细胞,其中所述细胞以等于或大于细胞的总干
细胞质量的至少10%的量产生和/或分泌一种或多种氨基酸、或蛋白质或其它营养素;和(b)从反应容器中分离所述一种或多种氨基酸、或蛋白质、或其它营养素或全细胞产物。在一些实施例中,所述方法进一步包括在从反应容器或生物反应器中分离所述一种或多种氨基酸、或蛋白质、或其它营养素或全细胞产物后对其进行纯化。在一些实施例中,所述一种或多种氨基酸、或蛋白质、或其它营养素或全细胞产物是提供给另一种生物的饲料或营养素供应或肥料的组分或前体或包含在所述饲料或营养素供应或肥料内。在一些实施例中,本公开涉及一种产生一种或多种氨基酸的方法,所述方法包括将细菌细胞、古细菌细胞和/或其它微生物细胞暴露于合成气和/或气态CO2和/或H2和/或CO和/或CH4,例如,H2和CO2、和/或CO和/或CH4;其中所述细胞能够将气态CO2和/或其它C1碳源固定到一种或多种氨基酸和/或蛋白质和/或维生素中;其中从生物反应器中回收所述化合物并且将其供给到第二或更多个另外的反应器和/或过程步骤,其中对所述化合物进行后处理以产生包含但不限于以下中的一种或多种的产物:肥料、生物刺激素、生长补充剂、人类营养或维生素。
[0137] 提供了用于在一个或多个固碳过程步骤中通过利用专性或兼性化能自养微生物(并且具体地说,化能无机自养生物)的化学和生物过程从含二氧化碳的气流和/或大气二氧化碳或溶解的、
液化的或化学结合形式的二氧化碳中捕获二氧化碳的组合物和方法。本公开还提供了用于回收、加工和使用由化能自养生物进行的化学合成反应的化学产物以将无机碳固定到有机化合物中的组合物和方法,所述有机化合物是中间或成品化学品,包含但不限于氨基酸和/或蛋白质和/或维生素和/或生物质。本公开还提供了用于产生、加工和递送化学合成和维持化能自养培养物所需的化学营养素的组合物和方法,包含但不限于提供化学合成所需的电子供体和电子受体。本公开还提供了用于维持有利于化学合成和化能自养生长的环境以及回收和再循环未使用的化学营养素和工艺用水的组合物和方法。
[0138] 本文某些实施例的一个特征是包含一个或多个利用化能自养微生物作为生物催化剂以在C1碳源转化的整个过程中将C1化学品转化为碳链更长的有机分子(即,C2或更长,并且在一些实施例中,C5或更长的碳链分子)的过程步骤,所述C1碳源包含但不限于一氧化碳、甲烷、甲醇、
甲酸盐或甲酸、和/或含有C1化学品的混合物,所述混合物包含但不限于由各种经过气化、热解或蒸汽重整的固定碳原料和/或甲烷原料产生的各种合成气组合物。在一些这种实施例中,将含有合成气、或工艺气体、或液体形式或溶解在溶液中的C1化学品的C1
泵送或以其它方式添加到含有营养素培养基和化能自养微生物的容器或
外壳中。在一些这种情况下,化能自养微生物进行生物化学合成以使用存储在C1化学品中的碳和电子、和/或来自固态电极材料中的分子氢气和/或价电子或传导电子的电子和氢气、和/或泵送或以其它方式提供给营养素培养基的以下电子供体列表中的一种或多种电子供体将C1化学品延长成碳链更长的有机化学品,所述电子供体包含但不限于:氨;铵;一氧化碳;连二亚硫酸盐;元素硫;烃;偏亚硫酸氢盐;一氧化氮;亚硝酸盐;硫酸盐,如硫代硫酸盐,包含但不限于硫代硫酸钠(Na2S2O3)或硫代硫酸钙(CaS2O3);硫化物,如硫化氢;亚硫酸盐;五价硫酸盐;三价硫酸盐;可溶相或固相形式的过渡金属或其硫化物、氧化物、硫属化合物、卤化物、氢氧化物、羟基氧化物、硫酸盐或碳酸盐。电子供体可以在化学合成呼吸反应中被电子受体氧化。在某些实施例中,用于本文所述微生物的呼吸作用的电子受体包含但不限于以下中的一种或多种:氧气、二氧化碳、三价铁或其它过渡金属离子、硝酸盐、亚硝酸盐、氧气或固态电极材料中的空穴。在某些非限制性实施例中,所述化能自养微生物是氢氧混合气微生物或氢氧微生物。
[0139] 在某些实施例中,本公开涉及不包括外源核酸或包括一个或多个外源核酸序列的化能自养细菌菌株。本发明部分地源于这样的发现:化能自养细菌和特定相关的微生物在由气态碳原料和废物碳原料经济且大规模地产生化学品、蛋白质、饲料、肥料、
单体、油、燃料和其它生物物质方面提供了无法预料的优势。
[0140] 由本文所描述的微生物合成的蛋白质、脂质和其它生物化学品可以应用的用途包含但不限于:用于产生生物刺激素、生物肥料或蘑菇生长补充剂的原料;以及用作生物刺激素、生物肥料、肥料、动物饲料、食品、个人护理和
化妆品中的配料。在一些实施例中,可以利用酶促和化学过程产生维生素、氨基酸和/或蛋白质。一些实施例提供了用于产生生物刺激素和/或肥料的方法。此外,本公开提供了用于培养和/或修饰化能自养细菌以改善氨基酸和/或蛋白质产率和/或降低生产成本的方法。
[0141] 本公开涉及在专性或兼性化能自养生物中赋予所关注的碳基产品(包含但不限于化学品、单体、聚合物、氨基酸、蛋白质、多糖,维生素和营养品或药品或其中间体)的产生和/或分泌的方法和机制,使得这些生物将二氧化碳和/或其它形式的无机碳和/或合成气和/或如甲醇等其它C1化合物和/或如热解气和/或油等热解反应的液体、气体和固体产物转化为所关注的碳基产品,并且具体地说,这些生物用于商业地产生化学品、单体、聚合物、氨基酸、蛋白质、多糖、维生素、动物饲料、生物刺激素、肥料和营养品或药品或其中间体的用途。然而,本公开还涉及由多碳有机分子碳源(如但不限于糖)异养产生所述产品的方法。
[0142] 在一些实施例中,本公开还提供了用于与化学合成反应步骤串行和/或并行发生的化学过程步骤的组合物和方法:将未精制的原料输入化学品转化为适于支持化学合成固碳步骤的更精细的化学品;将能量输入转化为可用于驱动化学合成的化学形式,并且具体地说,转化为电子供体和电子受体形式的化学能;在适合支持化学合成固碳的条件下,将从工业或大气或水生来源捕获的无机碳引入到所述过程的一个或多个固碳步骤中;进一步将化学合成固碳步骤的输出产品加工成适于储存、运输和销售的形式,所述产品包含但不限于氨基酸和/或蛋白质和/或维生素和/或生物质。与生物化学合成固碳步骤相结合的完全化学、非生物的过程步骤构成了本发明的整体碳捕获和转化过程。本发明利用将化能自养微生物作为生物催化剂整合到化学过程流内的独特容易性,这与其它生命形式形成对比。
[0143] 除非本文另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。以下文献为本领域的技术人员提供本发明中使用的许多术语的通用词典:Singleton等人,《微生物学与分子生物学词典第二版(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,second ed.)》,约翰·威利父子出版公司(John Wiley and Sons),纽约(1994),和Hale&Markham《,哈珀·柯林斯生物学词典(The Harper Collins Dictionary of Biology)》,哈珀·柯林斯出版社(Harper Perennia),纽约(1991)。类似于或等效于本文所描述的方法和材料的任何方法和材料可以用于实践或测试本文所描述的方法、系统和组合物。
[0144] 除非另外说明,否则本发明的实践将采用本领域技术范围内的分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学和生物化学的常规技术。这些技术在以下文献中有充分说明,例如,《分子克隆:实验手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第二版(Sambrook等人,1989)《;寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(编辑:M.J.Gait,1984);《当代分子生物学实验手册(Current Protocols in Molecular Biology)》(编辑:
F.M.Ausubel等人,1994);《PCR:
聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(编辑:Mullis等人,1994);以及《基因转移与表达:实验手册(Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual)》(Kriegler,1990)。
[0145] 本文提供的数值范围包含定义范围的数字。
[0146] 除非另外说明,否则核酸以5'到3'方向从左向右书写;氨基酸序列分别以氨基到羧基方向从左向右书写。
[0147] 定义
[0148] 除非上下文明确规定,否则“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数引用,因此,除非明确相反地指出,否则如本文在
说明书和
权利要求中所使用的不定冠词“一个/种(a/an)”和“所述(the)”应当理解为是指“至少一个”。
[0149] 如本文在说明书和权利要求中所使用的,短语“和/或”应当理解为是指如此联合的要素中的“任一个或两个”,即,要素在一些情况下共同存在而在其它情况下分离存在。除了用“和/或”短语具体标识的要素,其它要素可以任选地存在,无论是与具体标识的那些要素相关还是不相关,除非明确相反地指出。因此,作为非限制性实例,当与开放式语言,如“包括”结合使用时,对“A和/或B”的引用在一个实施例中可以指代A而没有B(任选地包含除了B之外的要素);在另一个实施例中,指代B而没有A(任选地包含除了A之外的要素);在又另一个实施例中,指代A和B两者(任选地包含其它要素);等等。
[0150] 当提及如量、持续时间等可测量值时,本文所使用的术语“约”意味着涵盖偏离
指定值±20%、±10%、±5%、±1%或±0.1%的变化,因为这些变化适合于执行所公开的方法或与所公开的组合物相关。
[0151] 术语“氨基酸”指代含有与被称为α-碳的碳结合的胺基和羧基的分子。合适的氨基酸包含但不限于天然存在的氨基酸的D-异构体和L-异构体,以及通过有机合成或其它代谢途径制备的非天然存在的氨基酸。在一些实施例中,单个“氨基酸”可能具有多个
侧链部分,如每个延伸的脂肪族或芳香族主链
支架可获得的。除非上下文另外明确指示,否则本文所使用的术语氨基酸旨在包含氨基酸类似物。
[0152] “合成代谢”指代生物从较简单的生命分子合成复杂的生命分子的过程。合成代谢过程产生肽、蛋白质、多糖、脂质和核酸。合成代谢所需的能量由如三磷酸腺苷(ATP)等细胞内能量载体提供。
[0153] “生长素”是一类具有一些形态发生素特征的植物激素(或植物生长物质)。生长素在协调植物生命周期中的许多生长和行为过程中起着核心作用,并且对植物体的发育至关重要。
[0154] “生物吸收”指代物质被生物的组织和器官吸收的过程。
[0155] “生物刺激素(Bio-stimulants或Biostimulant)”指代能够刺激植物(例如,农作物)的生长和发育以及增加和增强土壤的微生物活性的化合物。
[0156] 术语“生物质”指代通过细胞的生长和/或繁殖产生的物质。生物质可以含有细胞和/或细胞内内容物以及细胞外物质,包含但不限于细胞分泌的化合物。
[0157] 术语“生物反应器”或“发酵罐”指代细胞得以生长和维持的封闭或部分封闭的容器。细胞可以但不一定保持处于液体悬浮液中。在一些实施例中,细胞可以可替代地与另一种非液体底物(包含但不限于固体的生长支持物质)
接触、在其上或在其内生长和/或维持,而不是保持处于液体悬浮液中。
[0158] 术语“固碳”反应或途径指代酶促反应或代谢途径,其将在环境条件下呈气态的碳形式(包含但不限于CO2,CO和CH4)转化为在环境条件下呈液体或固体的碳基生物化学品,或者将其溶解在水溶液中或保持悬浮在水溶液中。
[0159] “碳源”指代微生物获得有机生物合成所需的碳的分子类型。
[0160] “一氧化碳营养”微生物是指可以耐受或氧化一氧化碳的微生物。在优选实施例中,一氧化碳营养微生物可以利用CO作为碳源和/或作为还原电子的来源以实现生物合成和/或呼吸作用。
[0161] 术语“催化剂”指代如分子或大分子结构等加速化学反应发生的速度的化学参与者,在所述化学反应中,一种或多种反应物被转化为一种或多种产物,而催化剂本身不会在化学反应完成时变成产物,或以其它方式改变或消耗。在催化剂参与一个化学反应后,由于催化剂未变化,所以其可以参与进一步的化学反应,从而作用于另外的反应物以产生另外的产物。为了加速化学反应,催化剂降低反应途径上的活化能垒,从而使所述反应在较冷的温度下发生,或在给定的温度下更快地发生。以这种方式,可以实现系统更快速地接近化学平衡。催化剂包括作为蛋白质催化剂的酶。
[0162] 术语“纤维素物质”是指具有大量纤维素的任何物质,所述纤维素是具有式(C6H10O5)n的多糖,所述多糖通常由数百至数千个β(1→4)连接的D-葡萄糖单体的线性链组成。纤维素物质的来源包含但不限于纸板、棉花、玉米秸秆、纸、木屑、锯末、甜菜浆、甘蔗渣和柳枝稷。
[0163] “化能自养”指代通过化学电子受体氧化化学电子供体获得能量并且由二氧化碳合成生物生存和生长所需的所有有机化合物的生物。
[0164] 术语“CoA”或“辅酶A”指代用于缩合参与
脂肪酸合成和氧化、丙
酮酸氧化、乙酰基或其它酰基转移并且参与其它乙酰化的酶的有机辅因子。
[0165] 术语“辅因子”包括酶执行其催化活性所需的所有分子。在一些实施例中,辅因子是除去底物以外的任何分子。
[0166] 在权利要求以及说明书中,所有过渡性短语,如“包括”、“包含”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“容纳”等应被理解为是开放式的,即是指包含但不限于。只有过渡短语“由……组成”和“基本上由……组成”应分别是封闭或半封闭的过渡短语。
[0167] 术语“培养”指代使细胞(例如,微生物细胞)群体在合适的生长条件下在液体或固体培养基中生长。
[0168] 术语“源自”涵盖术语“来源于”、“从……获得”、“可从……获得”、“从……中分离”和“由……产生”,并且通常表示一种指定材料源自另一种指定材料,或具有可以参考另一种指定材料描述的特征。
[0169] “诱导剂”是通常与植物
害虫、疾病或协同生物相关的外在或外来分子。诱导剂分子可以附着在
定位于植物细胞膜上的特殊受体蛋白上。
[0170] “能源”指代在有氧呼吸中被氧气氧化的电子供体或被氧化的电子供体与在无氧呼吸中被还原的电子受体的组合。
[0171] “土壤”是指属于土壤或与土壤有关,特别是当其影响活生物和/或与特定类型的土壤相关的活生物。
[0172] 术语“木质纤维素物质”是由纤维素、半纤维素和木质素构成的任何物质,其中碳水化合物聚合物(纤维素和半纤维素)与木质素紧密结合。木质纤维素物质包括农业残余物(包含玉米秸秆和甘蔗渣)、大多数生物质能源作物、木材残余物(包含锯木厂和造纸厂废弃物)以及很大一部分城市垃圾。
[0173] 术语“脂质”指代可以溶解在非极性
溶剂(如氯仿和/或醚)中并且在水中还具有低溶解度或无溶解度的分子类别。脂质分子的疏水特性通常由分子内存在的长链烃部分引起。脂质包括以下分子类型:碳氢化合物、脂肪酸(饱和和不饱和)、脂肪醇、脂肪
醛、羟基酸、二酸、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂、鞘脂、如胆固醇和类固醇激素等甾醇、脂溶性维生素(如维生素A、D、E和K)、聚酮化合物、萜类化合物和蜡。
[0174] 术语“裂解物”指代含有由细胞裂解产生的细胞内容物的混合物和/或溶液的液体。在一些实施例中,本文所描述的方法包括纯化细胞裂解物中的化学品或化学品混合物。在一些实施例中,所述方法包括纯化细胞裂解物中的氨基酸和/或蛋白质。
[0175] 术语“裂解”指代质膜的破碎以及细胞的细胞壁(如果存在)的破碎,使得大量细胞内物质逃逸到细胞外空间。可以使用电化学、机械、渗透、热化或病毒手段进行裂解。在一些实施例中,本文所描述的方法包括对如本文所述的细胞或微生物进行裂解,以从生物反应器的内容物中分离化学品或化学品的混合物。在一些实施例中,所述方法包括对本文所述的细胞或微生物进行裂解,以从生物反应器或细胞生长培养基的内容物中分离氨基酸或氨基酸和/或蛋白质的混合物。
[0176] 如本文中在本说明书和权利要求中所使用的,“或”应被理解为具有与如上所定义的“和/或”的含义相同的含义。例如,当将列表中的项目分开时,“或”或“和/或”应被解释为包含性的,即,包含多个要素或要素列表中的至少一个要素、但是还包含多于一个要素,以及任选地其它未列出的项。只有明确地指示相反的用语,如“……中的仅一个”或“……中的恰好一个”或者在权利要求中使用时“由……组成”将指代包含多个要素或要素列表中的恰好一个要素。一般而言,当之前有排他性术语,如“任一个”、“……之一”、“……中的仅一个”、或“……中的恰好一个”时,本文中使用的术语“或”应当仅被解释为指示排他性替代品(即,“一个或另一个、而不是两个”)。当在权利要求中使用时,“基本上由……组成”应当具有如在专利法领域中所使用的普通含义。
[0177] “滴度”指代在微生物发酵过程中由每单位体积微生物产生的物质的量。例如,生物质滴度可以表示为每升溶液产生的生物质的克数。
[0178] “产率”指代由进料(例如,糖)产生的产物相对于如果所有进料物质转化为产物将产生的物质的总量的量。例如,如果100%的进料物质转化为氨基酸,则氨基酸产率可以表示为相对于理论产率产生的氨基酸的%。
[0179] “生产率”指代微生物发酵过程中每单位时间内由每单位体积微生物产生的物质的量。例如,生物质生产率可以表示为每小时内每升溶液产生的生物质的克数。
[0180] “野生型”指代天然存在的微生物。
[0181] “基因”指代参与产生多肽的DNA区段,并且包含编码区之前和之后的区以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
[0182] 如本文所使用的,术语“回收的”、“分离的”、“纯化的”和“分开的”指代从与材料天然相关的至少一个组分中移除的所述材料(例如,蛋白质、核酸或细胞)。例如,这些术语可以指代基本上或实质上不含在材料天然状态下发现的通常伴随所述材料的组分的材料,如例如完整的生物系统。
[0183] “无机自养”指代特定类型的化能自养,其中生物利用无机化学电子受体对无机化学电子供体的氧化作为能源。
[0184] 术语“氢氧混合气”指代分子氢气和氧气的混合物。“氢氧混合气微生物”是可以在呼吸作用中将氢气用作为电子供体并且将氧气用作电子受体来产生如腺苷-5'-三磷酸(ATP)等细胞内能量载体的微生物。术语“氢氧(oxyhydrogen)”和“氢氧微生物”可以分别与“氢氧混合气”和“氢氧混合气微生物”同义使用。氢氧混合气微生物通常通过氢化酶使用分子氢气,其中一些电子由用于还原NAD+(和/或其它细胞内还原等同物)的H2供应,并且一些电子来自用于有氧呼吸的H2。氢氧混合气微生物通常通过多种途径自养地固定CO2,所述途径包含但不限于卡尔文循环或反向
柠檬酸循环[“嗜热细菌(Thermophilic bacteria)”,Jakob Kristjansson,第5章,第III节,CRC出版社,(1992)]。
[0185] “异养”指代无法合成生物依赖于二氧化碳存活和生长所需的所有有机化合物且必须利用有机化合物进行生长的微生物。异养生物无法产生其自己的食物而是通过摄取和代谢如植物或动物物质等有机物质来获得食物和能量,即,而不是固定来自如二氧化碳等无机来源的碳。
[0186] “烟酰胺腺嘌呤二核苷酸”是存在于所有活细胞中的辅酶,其参与
氧化还原反应,从而将电子从一个反应传递到另一个反应。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸以两种形式存在:氧化形式和还原形式,分别缩写为NAD+和NADH。
[0187] “氢
氧化剂”指代利用还原的H2作为电子供体来产生细胞内还原等同物和/或在呼吸作用中的微生物。
[0188] “产乙酸菌”指代产生乙酸盐和/或至多C4链长的其它短链
有机酸作为无氧呼吸产物的微生物。
[0189] “产甲烷菌”指代产生甲烷作为无氧呼吸产物的微生物。
[0190] “甲基营养生物”指代可以使用还原的一碳化合物(如但不限于甲醇或甲烷)作为碳源和/或作为其生长的电子供体的微生物。
[0191] “极端微生物”指代与存在于地球表面或附近的大多数生命形式普遍耐受的地球表面或海洋的条件相比,在物理或地球化学极端条件(例如,高温或低温、pH或高
盐度)下茁壮成长的微生物。
[0192] “嗜热菌”指代在相对高的温度下终生茁壮成长的极端微生物,所述相对高的温度通常为约45℃到约122℃。
[0193] “超嗜热菌”指代在极端炎热的环境中茁壮成长的极端微生物,所述极端炎热的环境通常为约60℃(140℉)或更高。
[0194] “嗜酸菌”指代在高酸性条件(通常pH值为2.0或更低)下茁壮成长的极端微生物。
[0195] “嗜盐菌”指代在具有非常高浓度的盐的环境中茁壮成长的极端微生物。
[0196] “嗜冷菌”指代能够在低温下生长和繁殖的极端微生物,所述低温通常为约10℃或更低。
[0197] “发生炉煤气”指代含有各种比例的H2、CO和CO2的气体混合物,并且所述气体混合物在标准条件下的热值的范围通常介于每单位体积的天然气的热值的二分之一与十分之一之间。可以由各种原料以各种方式产生发生炉煤气,所述方式包含碳基原料的气化、蒸汽重整或自动重整。除H2、CO和CO2外,发生炉煤气可以含有其它成分,包含但不限于甲烷、硫化氢、可冷凝气体、焦油和灰分,这取决于生成过程和原料。混合物中N2的比例可高可低,这取决于空气是否用作反应器中的氧化剂,以及用于反应的热量是通过直接燃烧还是通过间接热交换提供的。
[0198] “黄酮类化合物”(或生物类黄酮)(来自拉丁文词flavus,意思是黄色,其自然的颜色)是一类植物和真菌
次级代谢产物。化学上,黄酮类化合物的一般结构为15-碳骨架,其由两个苯环(A和B)和杂环(C)组成。所述碳结构可以缩写为C6-C3-C6。
[0199] “肥料”是有机或无机的天然或合成物质,其用于使土壤肥沃以及为植物提供一种或多种用于普通营养生长的必需营养素。在某些实施例中,术语肥料还指代用于真菌和蘑菇生产的营养素。
[0200] “
灌溉施肥”是将肥料、
土壤改良剂和其它
水溶性产品注入到灌溉系统中。
[0201] 术语“气化”指代将碳基材料转化为气体混合物的通常为高温的过程,所述气体混合物包含氢气、一氧化碳和被称为合成气体、合成气或发生炉煤气的二氧化碳。所述方法通常涉及部分燃烧和/或应用外部产生的热量以及可控制地添加氧气和/或蒸汽,使得存在用于使碳基材料完全燃烧的不充足的氧气。
[0202] “赤霉素”(GA)是调节生长并影响各种发育过程的植物激素,所述发育过程包含茎伸长、发芽、休眠、开花、性别表达、酶诱导以及叶和果实衰老。
[0203] “硫代葡萄糖苷”是如芥末、卷心菜和辣根等许多辛辣植物的天然组分。这些植物的刺激性是由于芥子油,当植物物质被咀嚼、切割或以其它方式损坏时,硫代葡萄糖苷产生所述芥子油。
[0204] 术语“微生物(microorganism和microbe)”意指微观单细胞生命形式。
[0205] 术语“分子”意指任何不同的或可区分的物质结构单元,所述物质结构单元包括一个或多个原子,并且包含例如烃、脂质、多肽和多核苷酸。
[0206] 术语“产油的”指代富含油的或产生大量油的物质。
[0207] “寡肽”指代含有相对少量氨基酸残基(例如,约2个到约20个氨基酸)的肽。
[0208] 术语“有机化合物”指代含有碳原子的任何气态、液态或固态化合物,以下被视为无机的例外:碳化物、碳酸盐、碳的简单氧化物、氰化物和纯碳的同素异形体(如金刚石和
石墨)。
[0209] “木瓜蛋白酶”——也被称为木瓜蛋白酶I——是存在于木瓜(番木瓜(Carica papaya))和山木瓜(山番木瓜(Vasconcelleacundinamarcensis))中的半胱氨酸蛋白酶(EC 3.4.22.2)。
[0210] “胃蛋白酶”是将蛋白质分解成较小肽(即,蛋白酶)的酶。胃蛋白酶在胃中产生,并且是人类和许多其它动物消化系统中的主要消化酶之一,它有助于消化食物中的蛋白质。
[0211] “肽”是由连接成链的两个或多个氨基酸(例如,约2个到约50个氨基酸)组成的化合物,每个酸的羧基通过R-OC-NH-R'型键与下一个酸的氨基连接。
[0212] 术语“……的前体(precursor to或precursor of)”是用于产生成品的一个或多个组分的中间体。
[0213] 术语“产生”包含细胞内和细胞外化合物的产生,包含由细胞分泌化合物。
[0214] “叶际”是微生物学中用于指代植物的作为微生物的栖息地的全部地上部分的术语。
[0215] “植物毒性”是化合物对植物生长的毒性作用。这种损害可能是由多种化合物引起的,所述化合物包含微量金属、盐度、
杀虫剂、
植物毒素或
化感物质。
[0216] 如本文所使用的,“多肽”指代包含氨基酸并且被本领域的技术人员视为蛋白质的组合物。本文使用用于氨基酸残基的常规的单字母或三字母代码。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指代任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是直链或支链的,它可以包括经修饰的氨基酸,并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖天然地或通过干预修饰的氨基酸聚合物;例如,二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷
酸化或任何其它操作或修饰,如与标记组分的缀合。此外,所述定义内还包含的是例如含有一个或多个氨基酸类似物(包含例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其它修饰的多肽。
[0217] “根际”是土壤的狭窄区域,所述区域直接受根分泌物和相关土壤微生物的影响。
[0218] “硫氧化剂”指代利用还原的含硫化合物(包含但不限于H2S)作为电子供体来产生细胞内还原等同物和/或在呼吸作用中的微生物。
[0219] “合成气”或“合成气体”指代一种气体混合物,其和发生炉煤气一样含有H2和CO,但更具体地根据H2和CO含量和比例以及杂质的水平来定制所述气体混合物以供合成特定类型的化学产品,如但不限于甲醇或费托柴油。合成气通常含有H2、CO和CO2作为主要组分,并且可以通过既定方法产生所述合成气,所述方法包括:甲烷、
液化石油气或沼气的蒸汽重整;或通过任何有机、易燃、碳基物质的气化,所述物质包含但不限于生物质、废弃有机物、各种聚合物、
泥炭和煤。合成气的氢气组分可以通过水煤气变换反应中CO与蒸汽的反应来增加,所述反应伴随合成气混合物中的CO2的增加。
[0220] “胰蛋白酶”(EC 3.4.21.4)是来自PA氏超家族的丝氨酸蛋白酶,其存在于许多
脊椎动物的消化系统中,在消化系统中所述胰蛋白酶水解蛋白质。当其酶原形式——胰酶产生的胰蛋白酶原被激活时,胰蛋白酶在小肠中形成。胰蛋白酶主要在位于氨基酸赖氨酸或精氨酸的羧基侧切割肽链,除了当所述氨基酸赖氨酸或精氨酸中任何一个接着是脯氨酸时。胰蛋白酶用于许多生物技术过程。此过程通常被称为胰蛋白酶蛋白水解或胰蛋白酶消化,并且已经用胰蛋白酶消化/处理的蛋白质被视为已被胰蛋白酶消化。本文的某些实施例利用如本文所述那样产生的蛋白质的胰蛋白酶消化。
[0221] 如本文所使用的,术语“多核苷酸”指代任何长度和任何三维结构和单链或多链(例如,单链、双链、三螺旋等)的核苷酸的聚合形式,其含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或类似物或经修饰形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸,包含经修饰的核苷酸或碱基或其类似物。因为基因密码是简并的,所以可以使用多于一个密码子来编码特定的氨基酸,并且本发明涵盖编码特定氨基酸序列的多核苷酸。可以使用任何类型的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物,包含增加核酸酶抗性的修饰(例如,脱氧的、2'-O-Me、硫代磷酸酯等),条件是所述经修饰的核苷酸或核苷酸类似物在使用条件下保留期望的功能。出于检测或捕获的目的,还可以掺入标记,例如
放射性或非放射性标记或锚(例如,生物素)。术语多核苷酸还包含肽核酸(PNA)。多核苷酸可以是天然存在的或非天然存在的。术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”在本文中可互换使用。多核苷酸可含有RNA、DNA或两者,和/或其经修饰形式和/或类似物。核苷酸序列可以被非核苷酸组分中断。一个或多个磷酸二酯键可以被替代性连接基团取代。这些替代性连接基团包含但不限于磷酸盐被P(O)S(“硫代化物”)、P(S)S(“二硫代化物”)、(O)NR2(“酰胺化物”、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲缩醛化物”)取代的实施例,其中每个R或R'独立地为H或任选地含有醚(--O--)键的取代或未取代的烷基(1-20C)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。多核苷酸中的所有键并非都是相同的。多核苷酸可以是线性的或环状的或包括线性和环状部分的组合。
[0222] 如本文所使用的,术语“宿主细胞”指代可以将用于产生多肽的重组表达载体
转染到其中以表达多肽的细胞或细胞系。宿主细胞包含单个宿主细胞的后代,并且由于天然的、偶然的或故意的突变,后代(在形态学上或总基因组DNA互补物上)可能不一定与原始亲本细胞完全相同。宿主细胞包含用表达载体体内转染或转化的细胞。
[0223] 术语“重组”指代遗传物质(即,核酸、其编码的多肽、以及包括此类多核苷酸的载体和细胞),通过如以下方式等方式修饰所述遗传物质以改变其序列或表达特性:使编码序列突变以产生经过变更的多肽;将编码序列与另一个基因的编码序列融合;将基因置于不同启动子的控制下;在异源生物中表达基因;以降低或升高的水平表达基因;以与其天然表达谱不同的方式有条件地或组成性地表达基因;等等。通常,人为操纵重组核酸、多肽和以其为基础的细胞,使得它们与天然存在的相关核酸、多肽和细胞不同。重组细胞也可以被称为“经过工程化的”。
[0224] 如本文所使用,“载体”指代被设计成用于将核酸引入到一种或多种细胞类型中的多核苷酸序列。载体包含克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、
噬菌体颗粒、盒等。
[0225] 如本文所使用,术语“表达”指代基于基因的核酸序列产生多肽的过程。此过程包含转录和转译。
[0226] 如本文所使用的,“表达载体”指代含有DNA编码序列(例如,基因序列)的DNA构建体,其与一种或多种能够实现宿主中编码
序列表达的合适的控制序列可操作地连接。此类控制序列包含实现转录的启动子、控制此类转录的任选的操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、以及控制转录和转译的终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒、或仅仅是潜在的基因组插入物。一旦转化到合适的宿主中,载体就可以独立于宿主基因组复制和起作用,或者在某些情况下可以整合到基因组本身中。质粒是最常用的表达载体形式。然而,本发明旨在包含具有相同的功能并且在本领域中是已知的其它形式的表达载体。
[0227] “启动子”指代参与结合RNA聚合酶以启动基因转录的调节序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。“诱导型启动子”是在环境或发育调节条件下有活性的启动子。
[0228] 术语“可操作地连接”是指代特定元件的并置或布置,所述并置或布置允许元件协同执行以产生效果。例如,如果启动子控制编码序列的转录,则启动子与编码序列可操作地连接。
[0229] “在转录控制下”是本领域熟知的术语,其表明多核苷酸序列的转录取决于其与有助于启动或促进转录的元件可操作地连接。
[0230] 关于多核苷酸或蛋白质,术语“异源的”或“外源的”指代不天然存在于特定细胞(例如,宿主细胞)中的多核苷酸或蛋白质。此术语旨在涵盖由天然存在的基因、突变基因和/或合成基因编码的蛋白质。相反,关于多核苷酸或蛋白质,术语“同源的”指代天然存在于细胞中的多核苷酸或蛋白质。
[0231] 除非本文另外定义,否则结合本公开使用的科学和技术术语应具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。此外,除非上下文另外要求,否则单数术语应包含复数含义并且复数术语应包含单数含义。通常根据本领域熟知的常规方法进行本公开的方法和技术。通常,与本文所述的生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学和蛋白质和核酸化学和杂交学结合使用的术语表以及其技术是本领域熟知和常用的术语表和技术。除非另外说明,否则通常根据本领域熟知的常规方法以及如在本说明书通篇引用和讨论的各个一般和更具体的参考文献中所描述的方法进行本公开的方法和技术。
[0232] 由气态能和碳底物产生氨基酸、蛋白质和其它生物营养素
[0233] 在一些实施例中,提供了能够将发生炉煤气或含有H2和/或CO和/或CO2和/或CH4的气体混合物(例如,H2和CO2、和/或CO和/或CH4)转化为氨基酸、蛋白质和其它生物营养素的天然的或经过工程化的微生物。在一些实施例中,提供了能够将发生炉煤气或含有H2和/或CO和/或CO2和/或CH4的气体混合物(例如,H2和CO2、和/或CO和/或CH4)转化为氨基酸、蛋白质、维生素和/或其它生物营养素的天然的或经过工程化的微生物。在某些实施例中,产生一种或多种B族维生素,所述B族维生素包含但不限于以下中的一种或多种:维生素B1、B2和/或B12。
[0234] 在一些实施例中,提供了一种能够在合成气、H2和CO2、和/或CO、和/或CH4和/或其它废气上生长并且能够使用所述气体作为生长底物以产生氨基酸、蛋白质、维生素(包含但不限于B族维生素)和/或其它生物营养素的天然微生物。
[0235] 在一些实施例中,提供了一种用于通过在生物反应器或溶液中组合含碳气体与天然的或经过工程化的菌株微生物来产生氨基酸、蛋白质和其它生物营养素(包含但不限于维生素(如但不限于B族维生素))的方法,所述天然的或经过工程化的菌株微生物将含碳气体(如合成气、发生炉煤气、CO2、一氧化碳以及其含有氢气的气体混合物);H2和CO2、和/或CO和/或CH4;和/或气态或液态的C1化合物(包含但不限于甲醇或甲烷)转化为氨基酸、蛋白质和/或其它生物营养素(包含但不限于维生素(如但不限于B族维生素))。
[0236] 此过程中使用的发生煤炉气可能来自包含以下的来源:废弃原料和/或生物质残余物原料的气化、或来自工业过程的废气、或含甲烷气体(包含但不限于天然气、沼气,填埋气体、闲置天然气和/或燃烧天然气)的重整。
[0237] 在一些实施例中,可以使用本文所述的经过工程化的或天然的微生物和方法将甲烷转化为氨基酸、蛋白质和/或其它生物营养素(包含但不限于维生素)。
[0238] 微生物
[0239] 在一些实施例中,本文所描述的方法中利用的微生物是化能自养生物。化能自养生物能够进行将CO2和/或其它形式的无机碳固定到有机化合物中的化学合成反应,所述化能自养生物利用储存在无机化学品中的潜在能量来驱动反应,而不像微生物进行光合作用时那样使用来自光的辐射能[J.M.Shively、G.van Keulen和W.G.Meijer“从无到有:化能自养生物中的二氧化碳固定”(1998)《微生物学年度评论》52:191-230(http://dx.doi.org/10.1146/annurev.micro.52.1.191);A.J.Smith、J.London和R.Y.Stanier,(1967)“蓝绿藻和硫杆菌中的专性自养的生化基础”《细菌学杂志》94(4):972-983(http://jb.asm.org/content/94/4/972.abstract);M.Hügler、C.O.Wirsen、G.Fuchs、C.D.Taylor和S.M.Sievert(2005)“由变形菌门的ε细分的成员通过还原性三羧酸循环进行自养CO2固定的证据”《细菌学杂志》187(9):3020-3027,(http://dx.doi.org/10.1128/jb.187.9.3020-
3027.2005);K.M.Scott和C.M.Cavanaugh,(2007)“来自双壳西洋遮阳篷的内共生化能自养生物进行的CO2摄取和固定”《应用与环境微生物学》73(4):1174-1179(http://
dx.doi.org/10.1128/aem.01817-06)]。在化能自养生物中发生的固碳生化途径包含还原性三羧酸循环和卡尔文-本森-巴萨姆循环[J.M.Shively、G.等人(1998),同上]以及Wood-Ljungdahl途径[L.G.Ljungdahl(1986)“产乙酸菌中的乙酸合成的自养途径”《微生物学年度评论》40(1):415-450(http://dx.doi.org/10.1146/annurev.mi.40.100186.002215)]。
[0240] 还提供了包括本文所述的任何微生物(例如,本文所述的一种或多种微生物)的组合物。
[0241] 在一些实施例中,微生物选自氢杆菌属(Hydrogenobacter)。在一些实施例中,微生物是嗜热氢杆菌(Hydrogenobacter thermophilus)。在一些实施例中,微生物含有反向三羧酸循环(rTCA),其也被称为反向柠檬酸循环或反向Krebs循环。[Miura,A.、Kameya,M.、Arai,H.、Ishii,M.和Igarashi,Y.(2008)“可溶性NADH依赖性富马酸盐还原酶在嗜热氢杆菌TK-6的还原性三羧酸循环中的应用(A soluble NADH-dependent fumarate reductase in the reductive tricarboxylic acid cycle of Hydrogenobacter thermophilus TK-6)”《细菌学杂志》190,7170-7177,doi:JB.00747-08[pii]10.1128/JB.00747-08;Shively,J.M.、van Keulen,G.和Meijer,W.G.(1998)“从无到有:化能自养生物中的二氧化碳固定”《微生物学年度评论》52:191-230,doi:10.1146/annurev.micro.52.1.191;所述文献通过引用整体并入本文]。
[0242] 在一些实施例中,微生物是混浊红球菌或约斯塔红球菌(Rhodococcusjostii)或红球菌属。在一些非限制性实施例中,微生物是混浊红球菌DSM 43205、DSM 43206、DSM 44193和/或红球菌属DSM 3346。
[0243] 在一些实施例中,天然的或经过工程化的菌株包含但不限于氢气利用微生物,包含但不限于红球菌属、戈登氏菌属、雷尔氏菌属或贪铜菌属。在一些实施例中,所述组合物包括可以在H2/CO2和/或合成气上自然生长的微生物,并且其中微生物可以自然地将脂质积累至细胞生物质的50wt%或更多。在一些实施例中,微生物具有沿脂肪酸生物合成途径向下发送高通量的碳的天然能力。在一些实施例中,表现出这些性状的微生物是混浊红球菌(DSM 43205或DSM 43206或DSM 44193)。
[0244] 在一些实施例中,微生物属于放线菌(Actinobacteria)类,其不包括外源基因或包括一种或多种外源基因。在一些实施例中,微生物属于放线菌类或诺卡氏菌(Nocardiaceae)科。在一些实施例中,微生物是棒状杆菌属(Corynebacterium)、戈登氏菌属、红球菌属、分枝杆菌属(Mycobacterium)或冢村氏菌属(Tsukamurella)微生物,其不包括外源基因或包括一种或多种外源基因。在一些实施例中,诺卡氏菌科的微生物不包括外源基因或包括一种或多种外源基因,其中所述微生物不是分枝杆菌。在一些实施例中,微生物属于红球菌属,其不包括外源基因或包括一种或多种外源基因,并且在一些实施例中,微生物是以下的菌株:红球菌属、混浊红球菌、食醚红球菌(Rhodococcusaetherivorans)、桔橙红球菌(Rhodococcusaurantiacus);拜科罗尔红球菌(Rhodococcusbaikonurensis);耐
硼红球菌(Rhodococcusboritolerans);马红球菌(rhodococcusequi);嗜粪红球菌(Rhodococcuscoprophilus);类棒杆菌红球菌(Rhodococcuscorynebacterioides);诺卡氏棒状杆菌(Nocardia corynebacterioides)(同义词:诺卡氏棒状杆菌);红串红球菌(Rhodococcuserythropolis);带化红球菌(Rhodococcusfascians);球状红球菌
(Rhodococcusgloberulus);戈登氏红球菌(Rhodococcusgordoniae);约斯塔红球菌;韩国红球菌(Rhodococcuskoreensis);棒杆状红球菌(Rhodococcuskroppenstedtii);
马鞍山红球菌(Rhodococcusmaanshanensis);海生红球菌(Rhodococcusmarinonascens);混浊红球菌;渗滤红球菌(Rhodococcuspercolatus);氯酚红球菌(Rhodococcusphenolicus);蓼属植物红球菌(Rhodococcuspolyvorum);嗜吡啶红球菌(Rhodococcuspyridinivorans);紫红红球菌(Rhodococcusrhodochrous);椿象红球菌(Rhodococcusrhodnii);(同义词:昆虫诺卡氏菌(Nocardia rhodnii));赤红球菌(Rhodococcusruber)(同义词:红链丝菌
(Streptothrix rubra));RHA1红球菌(Rhodococcus sp.RHA1);三瘤红球菌
(Rhodococcustriatomae);Rtukisamuensis红球菌(hodococcustukisamuensis);兰蒂斯拉维红球菌(Rhodococcuswratislaviensis)(同义词:兰蒂斯拉维冢村氏菌
(Tsukamurellawratislaviensis);
云南红球菌(Rhodococcusyunnanensis);佐氏红球菌(Rhodococcuszopfii)。在一些实施例中,提供了对动物和/或植物和/或人类无传染性或非致病性的红球菌微生物。在一些实施例中,微生物是对动物和/或植物无感染性的马红球菌或带化红球菌。在一些实施例中,微生物是混浊红球菌DSM 43205或43206;或红球菌DSM
3346的菌株。在一些实施例中,微生物是红球菌,其不是选自马红球菌和/或带化红球菌的物种。
[0245] 在一些实施例中,微生物来自棒状菌亚目(corynebacterineae)或伯克氏菌科(burkholderiaceae)。在一些实施例中,微生物是大肠杆菌(E.coli)。
[0246] 在一些实施例中,如本文所述的微生物对动物和/或植物和/或人类不具有致病性。
[0247] 在一些实施例中,如本文所述的微生物可以将蛋白质积累至总细胞质量的60%以上。在一些实施例中,所述微生物可以将蛋白质积累至总细胞质量的70%以上。在一些实施例中,所述微生物可以将蛋白质积累至总细胞质量的80%以上。在一些非限制性实施例中,所述微生物是杀虫贪铜菌DSM 531或541。
[0248] 在一些实施例中,如本文所述的微生物可以在H2/CO2和/或合成气上自然生长,并且所述微生物可以自然地将聚羟基丁酸酯(PHB)或聚羟基链烷酸酯(PHA)积累至细胞生物质的50wt%或更多。在一些实施例中,微生物具有引导高通量碳通过乙酰-CoA代谢中间体的天然能力,这可能导致脂肪酸生物合成,以及许多其它合成途径,包含PHA和PHB合成,以及氨基酸。在一些实施例中,表现出这些性状的微生物是杀虫贪铜菌(DSM 531或DSM 541)。
[0249] 在一些非限制性实施例中,天然的或经过工程化的微生物菌株是自养棒杆菌(Corynebacterium autotrophicum)。在一些非限制性实施例中,天然的或经过工程化的微生物是自养棒杆菌和/或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。在一些实施例中,微生物是海洋氢弧菌。在一些实施例中,微生物是荚膜红假单胞菌、
沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)或类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)。
[0250] 在一些实施例中,所述微生物是氢氧菌株或氢氧混合气菌株。在一些实施例中,微生物或包含微生物的组合物包括以下氢氧混合气微生物中的一种或多种:嗜火产水菌(Aquifexpyrophilus)、超嗜热菌(Aquifexaeolicus)或其它产水菌属(Aquifex sp.);杀虫贪铜菌或耐金属贪铜菌或其它贪铜菌属;自养棒杆菌或其它棒杆菌属(Corynebacterium sp.);
脱硫弧戈登氏菌(Gordoniadesulfuricans)、Gordoniapolyisoprenivorans、Gordoniarubripertincta、恐水戈登氏菌(Gordoniahydrophobica)、维斯戈登氏菌(Gordoniawestfalica)或其它戈登氏菌属;自养诺卡氏菌(Nocardia autotrophica)、灰暗诺卡氏菌(Nocardia opaca)或其它诺卡氏菌属(Nocardia sp.);紫色非硫光合细菌,其包含但不限于类球红细菌、沼泽红假单胞菌、荚膜红假单胞菌、绿色红假单胞菌(Rhodopseudomonasviridis)、绿硫红假单胞菌(Rhodopseudomonassulfoviridis)、结晶红假单 胞 菌 (Rh od o ps e ud o mo na s bl as t ic a) 、球形 红 假单 胞 菌(Rhodopseudomonasspheroides)、嗜酸红假单胞菌(Rhodopseudomonasacidophila)或其它红假单胞菌属;红杆菌属、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)或其它红螺菌属(Rhodospirillum sp.);混浊红球菌或其它红球菌属;大豆根瘤杆菌(Rhizobium japonicum)或其它根瘤菌属(Rhizobium sp.);桃红荚硫菌(Thiocapsaroseopersicina)或其它荚硫菌属(Thiocapsa sp.);敏捷假单胞菌(Pseudomonas facilis)、黄假单胞菌(Pseudomonas flava)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、噬氢假单胞菌(Pseudomonas hydrogenovora)、氢噬热假单胞菌(Pseudomonas hydrogenothermophila)、帕氏假单胞菌(Pseudomonas palleronii)、类黄假单胞菌(Pseudomonas pseudoflava)、嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)、噬热假单胞菌(Pseudomonas thermophile)或其它假单胞菌属(Pseudomonas sp.);全养氢丛毛杆菌(Hydrogenomonaspantotropha)、真养氢单胞菌(Hydrogenomonaseutropha)、敏捷氢单胞菌(Hydrogenomonas facilis)或其它氢单胞菌属(Hydrogenomonas sp.);噬热氢杆菌(Hydrogenobacter thermophiles)、嗜盐氢杆菌(Hydrogenobacterhalophilus)、嗜氢氢杆菌(Hydrogenobacterhydrogenophilus)或其它氢杆菌属;
冰岛嗜氢菌(Hydrogenophilusislandicus)或其它嗜氢菌属(Hydrogenophilus sp.);海洋氢弧菌或其它氢弧菌属;海洋氢单胞菌(Hydrogenothermus marinus)或其它氢单胞菌属(Hydrogenothermus sp.);幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)或其它螺杆菌属(Helicobacter sp.);自养黄色杆菌、黄曲霉黄色杆菌(Xanthobacter flavus)或其它黄色杆菌属(Xanthobacter sp.);黄色噬氢菌(Hydrogenophaga flava)、苍白噬氢菌
(Hydrogenophagapalleronii)、类黄色噬氢菌(Hydrogenophagapseudoflava)或其它噬氢菌属(Hydrogenophaga sp.);大豆慢生根瘤杆菌(Bradyrhizobium japonicum)或其它慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium sp.);真氧雷尔氏菌(Ralstoniaeutropha)或其它雷尔氏菌属;
真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)、敏捷产碱菌(lcaligenes facilis)、嗜氢产碱菌(Alcaligenes hydrogenophilus)、广泛产碱菌(Alcaligenes latus)、争论产碱菌(Alcaligenes paradoxus)、吕氏产碱菌(Alcaligenes ruhlandii)或其它产碱菌属(Alcaligenes sp.);无枝酸菌属(Amycolata sp .) ;自养水螺菌
(Aquaspirillumautotrophicum)或其它水螺菌属(Aquaspirillum sp.);11/X节杆菌菌株、嗜甲基节杆菌(Arthrobacter methylotrophus)或其它节杆菌属;生脂固氮螺菌
(Azospirillumlipoferum)或其它固氮螺菌属(Azospirillum sp.);争论贪噬菌
(Variovorax paradoxus)或其它贪噬菌属(Variovorax sp.);敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)或其它食酸菌属(Acidovorax sp.);施氏芽孢杆菌(Bacillus schlegelii)、热泉芽孢杆菌(Bacillus tusciae)或其它芽孢杆菌属(Bacillus sp.);噬氢热杆菌
(Calderobacteriumhydrogenophilum)或其它热杆菌属(Calderobacterium sp.);胶德克斯氏菌(Derxiagummosa)或其它德克斯氏菌属(Derxia sp.);自养黄杆菌(Flavobacterium autothermophilum)或其它黄杆菌属(Flavobacterium sp.);水生微环菌(Microcyclus aquaticus)或其它微环菌属(Microcyclus sp.);戈登氏分枝杆菌(Mycobacterium gordoniae)或其它分枝杆菌属(Mycobacterium sp.);盐脱氮副球菌
(Paracoccusdenitrificans)或其它副球菌属(Paracoccus sp.);Persephonella marina、Persephonellaguaymasensis或其它Persephonella属;
空泡肾形杆菌
(Renobactervacuolatum)或其它肾形杆菌属(Renobacter sp.);氢碳酸塞里伯氏菌(Seliberiacarboxydohydrogena)或其它塞里伯氏菌属(Seliberia sp.)、天蓝黄链霉菌(Streptomycetescoelicoflavus)、灰色链霉菌(Streptomycetesgriseus)、黄质产色链霉菌 (Str ep tom yc et esx an th och ro mog en es) 、热 羧基 链霉 菌
(Streptomycetesthermocarboxydus)和其它链霉菌属;Thermocrinisruber或其它Thermocrinis属;沃特氏菌属(Wautersia sp.);蓝细菌生物,其包含但不限于类颤鱼腥藻(Anabaena oscillarioides)、螺旋鱼腥藻(nabaenaspiroides)、柱形鱼腥藻(Anabaena cylindrica)或其它鱼腥藻属(Anabaena sp.),以及平节螺藻(Arthrospira platensis)、最大节螺藻(Arthrospira maxima)或其它节螺藻属(Arthrospira sp.);绿藻,其包含但不限于斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)或其它栅藻属(Scenedesmus sp.)、雷氏衣藻(Chlamydomonas reinhardii)或其它衣藻属(Chlamydomonas sp.)、纤维藻属
(Ankistrodesmus sp.)、多态微藻(Rhaphidiumpolymorphium)或其它微藻属
(Rhaphidiumsp);以及包含氢氧微生物的微生物联合体。
[0251] 在一些非限制性实施例中,提供了包含化能自养代谢的组合物和使用所述化能自养代谢的方法以通过用于产生ATP的能量保存反应产生ATP以支持ATP消耗生物合成反应和细胞维持,而不共同产生甲烷或如乙酸或丁酸等短链有机酸,所述能量保存反应使用无机电子供体和电子受体,包含但不限于氢氧反应。
[0252] 已经表征了许多能够在作为电子供体和/或碳源的一氧化碳上生长的不同微生物(即,一氧化碳营养微生物)。在一些情况下,一氧化碳营养微生物也可以使用H2作为电子供体和/或以混合营养方式生长。在一些情况下,一氧化碳营养微生物是兼性化能自养生物[《原核生物学(Biology of the Prokaryotes)》,编辑:J Lengeler、G.Drews、H.Schlegel,约翰·威利父子出版公司,2009年7月10日,所述文献通过引用整体并入本文。]。在一些实施例中,微生物或包含微生物的组合物包括以下一氧化碳营养微生物中的一种或多种:不动杆菌属(Acinetobacter sp.);碳酸产碱菌(Alcaligenes carboxydus)或其它产碱菌属;节杆菌属;氮单胞菌属(Azomonas sp.);固氮菌属(Azotobacter sp.);施氏芽孢杆菌或其它芽孢杆菌属;类黄色噬氢菌或其它噬氢菌属;氢碳酸假单胞菌(Pseudomonas
carboxydohydrogena)、噬一氧化碳假单胞菌(Pseudomonas carboxydovorans)、餐伴假单胞菌(Pseudomonas compransoris)、Pseudomonas gazotropha、热食碳酸假单胞菌(Pseudomonas thermocarboxydovorans)或其它假单胞菌属;大豆根瘤杆菌或其它根瘤菌属;G26链霉菌、热自养链霉菌(Streptomyces thermoautotrophicus)或其它链霉菌属。在某些实施例中,使用一氧化碳营养微生物。在某些实施例中,使用能够进行化能自养的一氧化碳营养微生物。在某些实施例中,使用能够在呼吸作用和/或生物合成中利用H2作为电子供体的一氧化碳营养微生物。
[0253] 在一些实施例中,提供了能够在作为唯一的电子供体、氢原子源和碳源的合成气上生长的微生物。
[0254] 在一些实施例中,微生物或包括微生物(包括专性和/或兼性化能自养微生物)的组合物包含以下中的一种或多种:厌氧醋菌属(Acetoanaerobium sp.);醋杆菌属(Acetobacterium sp.);凯伍产醋菌属(Acetogenium sp.)无色杆菌属(Achromobacter sp.);酸杆菌属(Acidianus sp.);不动杆菌属;马杜拉放线菌属(Actinomadura sp.);气单胞菌属(Aeromonas sp.);产碱菌属;产碱菌属;水螺菌属;弓形菌属(Arcobacter sp.);金杆菌属(Aureobacterium sp.);芽孢杆菌属;贝氏硫菌属(Beggiatoa sp.);丁酸杆菌属(Butyribacterium sp.);氧化碳嗜热菌属(Carboxydothermus sp.);梭菌属(Clostridium sp.);丛毛单胞菌属(Comamonas sp.);脱盐杆菌属(Dehalobacter sp.);Dehalococcoide属;Dehalospirillum属;脱硫杆菌属(Desulfobacterium sp.);脱硫念珠菌属(Desulfomonile sp.);脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum sp.);脱硫弧菌属
(Desulfovibrio sp.);脱硫化八球菌属(Desulfrosarcina sp.);外硫红螺菌属
(Ectothiorhodospira sp.);肠杆菌属(Enterobacter sp.);优杆菌属(Eubacterium sp.);铁原体属(Ferroplasma sp.);Halothibacillus属;氢杆菌属;氢单胞菌属;钩端螺菌属(Leptospirillum sp.);生金球菌属(Metallosphaera sp.);甲烷杆菌属
(Methanobacterium sp.);甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter sp.);甲烷球菌属(Methanococcus sp.);拟甲烷球菌属(Methanococcoides sp.);产甲烷菌属
(Methanogenium sp.);甲烷叶菌属(Methanolobus sp.);甲烷微菌属(Methanomicrobium sp.);甲烷盘菌属(Methanoplanus sp.);甲烷八叠球菌属(Methanosarcina sp.);甲烷螺菌属(Methanospirillum sp.);甲烷嗜热菌属(Methanothermus sp.);甲烷丝菌属(Methanothrix sp.);微球菌属(Micrococcus sp.);硝化杆菌属(Nitrobacter sp.);硝化杆菌属(Nitrobacteraceae sp.)、硝化球菌属(Nitrococcus sp.)、亚硝化球菌属(Nitrosococcus sp.);硝化刺菌属(Nitrospina sp.)、硝化螺菌属(Nitrospira sp.)、亚硝化叶菌属(Nitrosolobus sp.);亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas sp.);亚硝化螺菌属(Nitrosospira sp.);亚硝化弧菌属(Nitrosovibrio sp.);硝化刺菌属(Nitrospina sp.);Oleomonas属;副球菌属;消化链球菌属(Peptostreptococcus sp.);类浮霉状菌属(Planctomycetes sp.);假单胞菌属;雷尔氏菌属;红杆菌属;红球菌属(Rhodococcus sp.);红环菌属(Rhodocyclus sp.);红微菌属(Rhodomicrobium sp.);红假单胞菌属;红螺菌属;希瓦氏菌属(Shewanella sp.);铁球菌属(Siderococcus sp.);链霉菌属;硫化杆菌属(Sulfobacillus sp.);硫化叶菌属(Sulfolobus sp.);嗜热丝菌属(Thermothrix sp.)、硫杆菌属(Thiobacillus sp.);硫微螺菌属(Thiomicrospira sp.);辫硫菌属(Thioploca sp.);硫球菌属(Thiosphaera sp.);发硫菌属(Thiothrix sp.);卵硫菌属(Thiovulum sp.);硫氧化剂;氢氧化剂;铁氧化剂;产乙酸菌;产甲烷菌;包含化能自养生物的微生物群;
产自以下中的至少一个的化能自养生物:深海热泉、地热喷口、
温泉、冷泉、地下含水层、盐湖、盐水
地层、矿山、酸性矿山排水、矿山
尾矿、油井、炼油厂废水、
煤层、深亚表面;废水和
污水处理厂;地热
发电厂、硫磺油田和土壤;以及选自嗜热菌、超嗜热菌、嗜酸菌、嗜盐菌和嗜冷菌中的一种或多种的极端微生物。
[0255] 在一些实施例中,提供的微生物是能够承受各种环境参数(如温度、辐射、压力、重力、
真空、干燥、盐度、pH、氧
张力和化学品)的极端情况的极端微生物。所述极端微生物包含:超嗜热菌,如烟孔火叶菌(Pyrolobusfumarii);嗜热菌,如铅色聚球藻(Synechococcuslividis);嗜温菌和嗜冷菌,如嗜冷杆菌(Psychrobacter),和/或极端嗜热的硫代谢产物,如热变形菌属(Thermoproteus sp.)、热网菌属(Pyrodictium sp.)、硫化叶菌属和酸杆菌属;耐辐射生物,如抗辐射奇异球菌(Deinococcusradiodurans);抗压力生物,其包含嗜压菌(piezophiles或barophiles);干燥剂耐受性和脱水生物,其包含如卤虫(Artemia salina)等旱生植物;微生物和真菌;耐盐生物,其包含如盐杆菌
(Halobacteriacea)和杜氏盐藻(Dunaliellasalina)等嗜盐菌;pH耐受性生物,其包含如嗜盐碱杆菌(Natronobacterium)、OF4坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus OF4)、螺旋藻属等嗜碱细菌以及如类蓝藻(Cyanidium caldarium)和铁原体属等嗜酸细菌;耐受纯CO2的耐气体生物 ,其包含类蓝藻 ;以及金属耐受性生物 ,其包含如铁铂
合金类蓝藻
(Ferroplasmaacidarmanus)和雷尔氏菌属等金属耐受剂。
[0256] 在某些实施例中,本文提供的微生物包括选自以下的细胞系:真核植物、藻类、蓝细菌、绿硫细菌、绿色非硫细菌、紫色硫细菌、紫色非硫细菌、极端微生物、酵母、真菌、变形菌、其工程化生物和合成生物。在某些实施例中,利用螺旋藻。
[0257] 在某些实施例中,利用绿色非硫细菌,其包含但不限于以下:绿屈挠菌属(Chloroflexus)、绿丝菌属(Chloronema)、颤绿菌属(Oscillochloris)、螺丝菌属(Heliothrix)、滑柱菌属(Herpetosiphon)、玫瑰弯菌属(Roseiflexus)和高温微菌属(Thermomicrobium)。
[0258] 在某些实施例中,使用绿色硫细菌,其包含但不限于以下:绿硫杆菌属(Chlorobium)、格状绿硫细菌属(Clathrochloris)和突柄绿菌属(Prosthecochloris)。
[0259] 在某些实施例中,使用紫色硫细菌,其包含但不限于以下:着色菌属(Allochromatium)、绿硫杆菌属、盐着色菌属(Halochromatium)、等着色菌属
(Isochromatium)、海洋着色菌属(Marichromatium)、小红卵菌属(Rhodovulum)、热着色菌属(Thermochromatium)、荚硫菌属(Thiocapsa)、硫螺菌属(Thiospirillum)和囊硫菌属(Thiocystis)。
[0260] 在某些实施例中,利用紫色非硫细菌,其包含但不限于以下:褐螺菌属(Phaeospirillum)、Rhodobaca、红杆菌属、红微菌属、红球形菌属(Rhodopila)、红假单胞菌属、玫瑰菌属(Rhodothalassium)、红螺菌属(Rhodospirillum)、Rodovibrio和玫瑰螺旋菌属(Roseospira)。
[0261] 在一些实施例中,微生物是甲烷氧化菌或甲基营养生物。在一些实施例中,微生物属于甲基球菌属(Methylococcus)。在一些实施例中,微生物是荚膜甲基球菌(Methylococcuscapsulatus)。在一些实施例中,微生物是甲基营养生物。在一些实施例中,微生物属于甲基杆菌属(Methylobacterium)。在一些实施例中,微生物来自以下物种中的一种或多种:扎氏甲基杆菌(Methylobacteriumzatmanii);外链甲基杆菌
(Methylobacteriumextorquens);暗绿甲基杆菌(Methylobacteriumchloromethanicum)。
在一些实施例中,提供了组合物,其中微生物是氢氧化化能自养生物和/或一氧化碳营养生物和/或甲基营养生物和/或甲烷氧化菌。
[0262] 在某些实施例中,微生物是天然存在的和/或非基因修饰的(非GMO)微生物和/或是非致病性的和/或依赖于周围环境中不存在的生物过程所提供的特定环境条件。
[0263] 在某些实施例中,微生物或微生物群从环境样品中分离,并且使用微生物学领域中已知的方法通过在目标电子供体和电子受体存在的情况下以及环境条件(例如,温度、pH、压力、溶解氧(DO)、盐度、各种杂质和污染物的存在等)下生长所述微生物或微生物群而使其富含有期望的微生物,所述电子供体包含但不限于以下中的一种或多种:氢、CO、合成气和/或甲烷,所述电子受体包含但不限于以下中的一种或多种:氧、硝酸盐、三价铁和/或CO2。
[0264] 在一些实施例中,用于微生物的生物合成和/或呼吸作用的电子供体包含但不限于以下还原剂中的一种或多种:氨;铵;一氧化碳;连二亚硫酸盐;元素硫;氢气;偏亚硫酸氢盐;一氧化氮;亚硝酸盐;硫酸盐,如硫代硫酸盐,包含但不限于硫代硫酸钠(Na2S2O3)或硫代硫酸钙(CaS2O3);硫化物,如硫化氢;亚硫酸盐;五价硫酸盐;和三价硫酸盐。
[0265] 在一些实施例中,微生物能够由无机电子供体(如但不限于H2和/或CO)产生ATP而不合成甲烷或短链有机酸(包括碳链长度为2-4个碳原子长的短链有机酸),如但不限于乙酸和/或丁酸。在一些非限制性实施例中,微生物由无机电子供体(如但不限于H2和/或CO)产生ATP,所述无机电子供体在呼吸作用中与除CO2外的电子受体偶联。在某些这种实施例中,从电子受体在与呼吸作用中使用的电子供体进行的反应中具有更负的吉布斯自由能的意义上说,电子受体是比CO2更强的电子受体。
[0266] 在一些实施例中,微生物能够将合成气、和/或气态CO2、和/或CO2气体与H2气体的混合物、和/或CO和/或CH4转化为一种或多种有机化合物,其中由微生物产生的小于10wt%的有机化合物是甲烷。在一些实施例中,微生物能够将合成气、和/或气态CO2、和/或CO2气体与H2气体的混合物、和/或CO和/或CH4转化为一种或多种有机化合物,其中由微生物产生的小于10wt%的有机化合物是游离有机酸(即,不包含在聚合物中)和/或游离有机酸的盐,所述游离有机酸的碳链长度为4个碳或更少,不包括氨基酸。在一些实施例中,微生物能够将合成气、和/或气态CO2、和/或CO2气体与H2气体的混合物、和/或CO和/或CH4转化为一种或多种有机化合物,其中由微生物产生的小于10wt%的有机化合物是游离有机酸(即,不包含在聚合物中)和/或游离有机酸的盐,所述游离有机酸的碳链长度为4个碳或更少,不包括以下氨基酸中的一种或多种:丙氨酸;苏氨酸;丝氨酸;甘氨酸;天冬酰胺;天冬氨酸;半胱氨酸。
[0267] 某些实施例利用在用于ATP产生的能量保存反应中使用更多如(不限于)O2等电负性电子受体的氢氧化微生物、和/或CO氧化微生物和/或CH4氧化微生物。
[0268] 在一些实施例中,微生物能够在未处理的作为唯一的电子供体和碳源的粗甘油和/或葡萄糖和/或甲醇和/或乙酸盐上生长。在一些实施例中,微生物能够在有机碳源上混合生长并使用无机电子供体或碳源。
[0269] 在某些实施例中,本文提供的微生物包括选自以下的细胞系:真核植物、藻类、蓝细菌、绿硫细菌、绿色非硫细菌、紫色硫细菌、紫色非硫细菌、极端微生物、酵母、真菌、变形菌、其工程化生物和合成生物。
[0270] 在本文微生物的某些非限制性实施例中,不存在由细胞呼吸作用引起的可检测的酸生成。
[0271] 微生物培养物
[0272] 用于生长本文所述微生物细胞的液体培养物可以安置在本领域已知和使用的培养容器中。在一些实施例中,生物反应器容器中的大规模产生可用于产生大量期望的分子和/或生物质。
[0273] 在某些实施例中,生物反应器容器用于容纳、分离和/或保护培养环境。例如,在一些非限制性实施例中,可以使用培养容器来产生有机化合物,所述有机化合物包含但不限于以下中的一种或多种:氨基酸;肽;蛋白质;维生素,如但不限于维生素B1、B2和B12;和/或其它营养素。所述培养容器包含大规模微生物培养领域的普通技术人员已知的培养容器。这种培养容器包含但不限于以下中的一种或多种:气升式反应器;生物洗涤塔;鼓泡塔;搅拌釜反应器;连续搅拌釜反应器;逆流式反应器、上流式反应器、膨胀床反应器;蒸煮器,并且具体地说,在污水和废水处理或
生物修复的
现有技术中已知的蒸煮器系统;过滤器,其包含但不限于滴滤器、旋转式生物接触器过滤器、旋转盘、土壤过滤器;
流化床反应器;气举发酵罐;固定化细胞反应器;环管反应器;膜
生物膜反应器;帕丘卡罐;填充床反应器;平推流反应器;静态混合器;滴流床反应器;和/或竖直轴生物反应器。
[0274] 通常在规模大得多的生物反应器(例如,500L、1,000L、5,000L、10,000L、50,000L、100,000L、1,000,000L生物反应器体积和更高)中进行旨在商业化产生有机化合物(并且具体地说,氨基酸、肽、蛋白质和其它营养素)的微生物培养。
[0275] 在某些实施例中,使用本文所述的方法在生物反应器内的液体培养基中生长化能自养微生物和/或异养微生物和/或一氧化碳营养微生物和/或甲烷氧化微生物和/或甲基营养微生物。
[0276] 在一些实施例中,含有微生物的生物反应器由不透明材料构成,所述不透明材料使培养物维持在接近黑暗或完全黑暗的环境中。由不透明材料(如钢和/或其它金属合金和/或
钢筋混凝土和/或玻璃纤维和/或各种高强度塑料材料)构成的生物反应器可以被设计成具有大的工作体积。在一些实施例中,利用体积为50,000升或更大的由钢或其它金属合金构成的发酵罐。在一些实施例中,利用能够容纳高于环境压力的正顶空压力的生物反应器。在一些实施例中,利用体积为3,000,000升和更大的蛋形或圆柱形蒸煮器或竖直轴生物反应器。在一些实施例中,包括微生物的生物反应器不允许光穿透其所含液体体积的一部分或大部分或全部。在某些非限制性实施例中,在CO2固定步骤中使用的微生物不是光合作用的。在某些非限制性实施例中,生物反应器设计不将培养物限制在薄层中或者具有透明的壁以使所有部分都可获得光,因为这通常是光合作用所必需的。在一些实施例中,在不存在显著或任何暴露于光的情况下培养微生物。在某些这种实施例中,由于化能自养代谢和条件,净CO2消耗仍然在不存在光的情况下发生。在某些实施例中,在用于CO2捕获和转化的生物系统中不需要将电转换为人造光。
[0277] 在某些实施例中,缺乏光依赖性促进在所有天气条件下连续(日以继夜、全年)进行CO2捕获操作,而无需任何人工照明。
[0278] 在一些实施例中,在不存在光的情况下,在含有气态碳源(如但不限于合成气、发生炉煤气、尾气、热解气或H2与CO2气体混合物)的培养基中生长和维持微生物以产生氨基酸、蛋白质、或其它营养素或全细胞产物;其中这种生长被称为化能自养生长。
[0279] 在某些实施例中,通过竖直扩展来满足系统容量的增加,而不是仅通过横向扩展。这与使用藻类、蓝细菌或高等植物捕获CO2的光养方法形成对比。尽管已经提出了各种用于光合系统的竖直养殖方案,但实际上和从经济上讲,必须在例如浅池塘或存在藻类的光生物反应器中横向扩展的光养系统。这导致了大量的地理覆盖范围和许多负面的环境影响。
[0280] 用人工照明生长的藻类或高等植物系统受到的挑战是光能的低效利用以及电能到光能的低效转化。在某些实施例中,就CO2捕获和/或生物质产生而言,在人工照明下生长的相当的藻类或高植物培养物需要比本文所述的CO2捕获和/或生物质产生系统更多的电力。在某些实施例中,就每单位CO2捕获和/或生物质产生的功率而言,在人工照明下生长的相当的藻类或高植物培养物需要比本文所述的CO2捕获和/或生物质产生系统多至少十倍的电力。对于在人工照明下生长的藻类或高等植物,排热要求几乎与电输入成正比。在本文所述方法的某些实施例中,就在人工照明下生长时的CO2捕获和/或生物质产生而言,排热要求低于相当的藻类或高等植物系统的排热要求。在某些实施例中,就在人工照明下生长时的CO2捕获和/或生物质产生而言,排热要求比相当的藻类或高等植物系统的排热要求低至少十倍。
[0281] 在示例性但非限制性实施例中,将生产细胞接种到含有营养素培养基的生物反应器中。通常,在细胞开始加倍之前将遵循滞后期。在滞后期后,细胞倍增时间减少并且培养物进入对数期。对数期最终之后是倍增时间的增加,虽然不旨在受理论限制,但认为所述倍增时间的增加是由于以下原因导致的:包含氮或矿物质来源的营养素的传质限制、耗尽;或抑制性化学品的浓度或微生物的群体感应的升高。当培养物进入静止期时,生长减慢并且然后停止。在某些实施例中,在静止期之前存在算术生长期。为了收获细胞团,在对数期和/或算术期和/或静止期中收获某些实施例中的培养物。
[0282] 生物反应器或发酵器用于培养细胞通过其生理周期的各个阶段。利用生物反应器培养细胞,所述细胞可以维持在生长曲线中的特定阶段。使用生物反应器在许多方面有利于培养化能自养生长。对于某些实施例,用于产生蛋白质或蛋白质水解产物的富含蛋白质的细胞团在液体悬浮液中生长到高密度。通常,在生物反应器中促进生长条件的控制,包含控制溶解的二氧化碳、氧气和其它气体(如氢气),以及其它溶解的营养素、微量元素、温度和pH。对于某些实施例,用于产生氨基酸、肽、蛋白质、水解产物、提取物或全细胞产物的富含蛋白质的细胞团在生物反应器内的液体悬浮液中生长到高密度和/或以高生产率生长。
[0283] 可以分批地或周期性地或响应于检测到的消耗或编程设定点,或者在培养物生长和/或
维持期间连续地将营养素培养基以及气体添加到生物反应器中。对于某些实施例,在生长开始时用起始批次的营养素培养基和/或一种或多种气体填充接种时的生物反应器,并且在接种后不添加另外的营养素培养基和/或一种或多种气体。对于某些实施例,在接种后定期添加营养素培养基和/或一种或多种气体。对于某些实施例,响应于检测到的营养素和/或气体的消耗,在接种后添加营养素培养基和/或一种或多种气体。对于某些实施例,在接种后连续添加营养素培养基和/或一种或多种气体。
[0284] 对于某些实施例,添加的营养素培养基不含任何有机化合物。
[0285] 在某些实施例中,将少量微生物细胞(即,接种物)添加到一定体积的培养基中;然后孵育培养物;并且细胞团通过生长的滞后期、指数期、减速期和静止期。
[0286] 在分批培养系统中,培养微生物的条件(例如,营养素浓度、pH等)通常在整个生长期间连续变化。在某些非限制性实施例中,为了避免分批培养中固有的
波动条件并且提高培养系统的总体生产率,在被称为恒化器的连续培养系统中生长用于产生蛋白质和/或维生素和/或其它营养素的微生物。在这种系统中,可以通过以恒定速率[F]饲养新鲜培养基同时维持培养物的体积[V]恒定来使培养物维持在永久的生长指数期。在某些实施例中,连续培养系统确保细胞在维持大致恒定的环境条件下培养。在某些实施例中,通过使用恒化器系统将细胞维持在永久的指数期。在这种情况下,培养物的稀释率(D)等于微生物的生长速率,并且由下式给出:D=F/V。可以通过改变稀释率来改变连续培养中微生物的生长速率。在某些实施例中,通过改变稀释率来改变微生物的生长速率。在某些非限制性实施例中,细胞在恒化器中以约0.2h-1的稀释率生长。
[0287] 在某些实施例中,执行将培养物接种到生物反应器中的方法包含但不限于:从栖居在另一个生物反应器中的现有培养物中转移培养物,或从孵育箱中培养的种子储备中孵育培养物。在某些实例中,可以以包含但不限于粉末、液体、冷冻或
冷冻干燥形式以及任何其它合适形式的形式运输和储存菌株的种子储备,所述形式可以由本领域的技术人员容易地认识到。在某些非限制性实施例中,保留的细菌培养物维持在代谢非活性的冷冻干燥状态下,直到重新启动需要。在某些实施例中,当在非常大的反应器中建立培养物时,培养物在接种到全规模容器之前在逐渐变大的中等规模容器中生长和建立。
[0288] 对于某些实施例,生物反应器具有实现营养素培养基的混合的机制,所述机制包含但不限于以下中的一种或多种:旋转搅拌棒、叶片、
叶轮或
涡轮机;旋转器、摇摆器或转动器;气举、喷射;通过再循环
导管将培养液从容器底部再循环到顶部,使所述培养液流过环和/或静态混合器。可以连续或间歇地混合培养基。
[0289] 在某些实施例中,含微生物的营养素培养基可以部分或完全地、周期性地或连续地从生物反应器中移除,并且在某些实施例中被新鲜的无细胞培养基替换以便将细胞培养物维持于指数生长期、和/或补充生长培养基中耗尽的营养素和/或移除抑制性废弃产物。
[0290] 可以利用生物反应器中标准的端口将气体、液体、固体和/或
浆液递送或排出到封闭微生物的生物反应器容器中和/或从封闭微生物的生物反应器容器中输出。许多生物反应器具有用于不同目的的多个端口(例如,用于添加培养基、添加气体,pH和DO的探针以及取样的端口),并且给定端口可以在发酵过程中用于各种目的。例如,端口在一个时间点可用于向生物反应器中添加营养素培养基,并且在另一时间可用于取样。优选地,可以在不将污染物或入侵物种引入生长环境的情况下进行取样端口的多次使用。可以在取样端口设置阀门或能够控制样品流量或连续取样的其它致动器。对于某些实施例,生物反应器配备有至少一个适于培养物接种的端口,所述端口可以另外用于其它用途,包含添加培养基或气体。生物反应器端口能够控制进入培养环境的气体组合物和流速。例如,端口可以用作进入生物反应器的气体入口,通过所述入口泵送气体。
[0291] 对于一些实施例,可以被泵入生物反应器中的气体包含但不限于以下中的一种或多种:合成气、发生炉煤气、热解气、氢气、CO、CO2、O2、空气、空气/CO2混合物、天然气、沼气、甲烷、氨气、氮气、惰性气体(如氩气)以及其它气体。在一些实施例中,泵入系统中的CO2的来源包含但不限于:有机物质的气化产生的CO2;煅烧石灰岩CaCO3生成生石灰CaO过程中产生的CO2;甲烷蒸汽重整产生的CO2,如来自氨、甲醇或氢气生产的CO2副产品;燃烧、焚烧或骤燃产生的CO2;糖的厌氧发酵或好氧发酵产生的CO2副产品;甲烷氧化生物过程产生的CO2副产品;废水处理产生的CO2;来自磷酸钠生产的CO2副产品;地质或地热产生的或排放的CO2;从酸性气体或天然气中移除的CO2。在某些非限制性实施例中,CO2已从工业烟道气中移除或从地质源拦截,所述地质源将以其它方式自然地排放到大气中。在某些实施例中,碳源是溶解在海水或其它表面或
地下水体中的CO2和/或碳酸氢盐和/或碳酸盐。在某些这种实施例中,可以将无机碳引入到溶解在液态水中和/或作为固体的生物反应器中。在某些实施例中,碳源是从大气中捕获的CO2。在某些非限制性实施例中,使用设备(如但不限于CO2移除组件(CDRA))从封闭的舱室中捕获CO2作为闭环生命支持系统的一部分,所述移除组件在例如国际空间站(ISS)上使用。
[0292] 在某些非限制性实施例中,如(但不限于)发射高浓度能源(例如,H2、H2S、CO气体)和/或碳源(例如,CO2、HCO3-、CO32-)和/或其它溶解的矿物质的地热和/或热液喷口等地质特征可以用作本文微生物的营养源。
[0293] 在某些实施例中,除了二氧化碳外的一种或多种气体,或代替二氧化碳作为替代性碳源的一种或多种气体被溶解到溶液中并送入到培养液中和/或直接溶解到培养液中,所述一种或多种气体包含但不限于气态电子供体和/或碳源(例如,氢和/或CO和/或甲烷气体)。在某些实施例中,输入气体可以包含其它电子供体和/或电子受体和/或碳源和/或矿物质营养素,如但不限于:其它气体成分和合成气的杂质(例如,碳氢化合物);氨;硫化氢;和/或其它酸性气体;和/或O2;和/或含有颗粒和灰分的矿物质。
[0294] 在某些实施例中,将一种或多种气体溶解到培养液中,所述一种或多种气体包含但不限于气态电子供体,如但不限于以下中的一种或多种:氢气、一氧化碳、甲烷、硫化氢或其它酸性气体;气态碳源,如但不限于以下中的一种或多种:CO2、CO、CH4;以及电子受体,如但不限于氧气,所述氧气位于空气中(例如,20.9%氧气)或作为纯O2或作为富含O2的气体。在一些实施例中,使用发酵工程领域的技术人员已知的
压缩机、流量计和流量阀系统实现将这些和其它气体溶解到溶液中,所述压缩机、流量计和流量阀用于以下一种或多种广泛使用的用于将气体分散到溶液中的系统中:喷射设备;扩散器,其包含但不限于圆顶、管状、圆盘或环形几何形状;粗泡或细泡曝气器;文丘里设备(venturi equipment)。在某些实施例中,还可以使用桨式曝气器等进行表面通气和/或气体传质。在某些实施例中,通过与叶轮或
涡轮机以及液压剪切装置进行机械混合来增强气体溶解以减小气泡大小。在某些实施例中,在通过容纳摄取气体的微生物的反应器系统之后,残余气体可以再循环回生物反应器、或燃烧用于产生过程热量、或燃烧、或在地下注入、或释放到大气中。在利用H2作为电子供体的本文的某些实施例中,可以通过将H2鼓泡通过培养基,或通过将其扩散通过本领域已知的与液体培养基交界的氢可渗透水不可渗透膜而将其送入培养容器中。
[0295] 在某些实施例中,微生物在微需氧条件下在H2和CO2以及其它溶解的营养素上生长和繁殖。在某些实施例中,在以下条件中的一种或多种条件下将C1化学品(如但不限于一氧化碳、甲烷、甲醇、甲酸盐或甲酸)和/或含有C1化学品的混合物(包含但不限于由各种气化、热解或蒸汽重整的固定碳原料产生的各种合成气组合物)生化转化为更长链的有机化学品(即,C2或更长的,并且在一些实施例中,C5或更长的碳链分子):需氧、微需氧、缺氧、厌氧和/或兼性条件。
[0296] 受控量的氧气还可以维持在一些实施例的培养液中,并且在某些实施例中,将氧气主动溶解到被送入培养液中的溶液中和/或直接溶解在培养液中。在需要将空气或氧气泵送到培养液中以维持目标DO水平的某些需氧或微需氧实施例中,可以以最佳直径将氧气泡注入培养液中以进行混合和氧气转移。
[0297] 在一些实施例中,微生物转化
燃料气体,所述燃料气体包含但不限于合成气、发生炉煤气、热解气、沼气、尾气、烟道气、CO、CO2、H2、天然气、甲烷及其混合物。在一些实施例中,燃料气体的热含量为每标准立方英尺(scf)至少100BTU。在一些实施例中,用于容纳和生长微生物的生物反应器配备有用于气体递送的细泡扩散器和/或高剪切叶轮。
[0298] 如果气体入口定位在液体培养基的表面下方使得气泡或鼓泡通过培养基,则引入和/或提高进入生物反应器的气体流速可以增强培养物的混合并产生
湍流。在某些实施例中,通过由通过液体培养基的气泡和/或鼓泡和/或气体堵塞提供的湍流来增强混合。在一些实施例中,生物反应器包括用于气体逸出和压力释放的气体出口端。在一些实施例中,气体入口和出口优选地配备有止回阀以防止气体回流。
[0299] 在化学合成反应发生在生物反应器内的某些实施例中,将一种或多种类型的电子供体和一种或多种类型的电子受体泵送或以其它方式作为推注添加,或周期性地或连续地添加到含有反应容器中的化能自养生物的营养素培养基中。由细胞呼吸作用中电子从电子供体转移到电子受体所驱动的化学合成反应将无机二氧化碳和/或其它溶解的碳酸盐和/或其它碳氧化物固定到有机化合物和生物质中。
[0300] 在某些实施例中,使用本领域技术人员已知的用于培养物生长和产生的营养素培养基,所述营养素培养基包括含有合适的矿物质、盐、维生素、辅因子、缓冲剂和微生物生长所需的其它组分的水溶液[Bailey和Ollis,《生物化学工程基础(Biochemical Engineering Fundamentals)》,第2版;第383-384和620-622页;麦格劳希尔出版公司(McGraw-Hill):纽约(1986)]。
[0301] 在某些实施例中,用于维持和生长本领域已知的微生物培养物的化学品包含在营养素培养基中。在某些实施例中,这些化学品可以包含但不限于以下中的一种或多种:氮源,如氨、铵(例如,
氯化铵(NH4Cl))、硫酸铵((NH4)2SO4))、硝酸盐(例如,硝酸钾(KNO3))、尿素或有机氮源;磷酸盐(例如,磷酸二钠(Na2HPO4)、磷酸钾(KH2PO4)、磷酸(H3PO4)、二硫代磷酸钾(K3PS2O2)、正磷酸钾(K3PO4)、
磷酸氢二钾(K2HPO4));硫酸盐;酵母提提物;螯合铁;钾(例如,磷酸钾(KH2PO4)、硝酸钾(KNO3)、碘化钾(KI)、溴化钾(KBr));和其它无机盐、矿物质和微量营养素(例如,氯化钠(NaCl)、硫酸镁(MgSO47H2O)或氯化镁(MgCl2)、
氯化钙(CaCl2)或碳酸钙(CaCO3)、硫酸锰(MnSO47H2O)或氯化锰(MnCl2)、氯化铁(FeCl3)、硫酸亚铁(FeSO4 7H2O)或氯化亚铁(FeCl2 4H2O)、
碳酸氢钠(NaHCO3)或碳酸钠(Na2CO3)、硫酸锌(ZnSO4)或氯化锌(ZnCl2)、钼酸铵(NH4MoO4)或钼酸钠(Na2MoO4 2H2O)、硫酸亚铜(CuSO4)或氯化铜(CuCl2
2H2O)、氯化钴(CoCl2 6H2O)、氯化铝(AlCl3 6H2O)、氯化锂(LiCl)、硼酸(H3BO3)、氯化镍(NiCl2 6H2O)、氯化
锡(SnCl2 H2O)、氯化钡(BaCl2 2H2O)、硒酸铜(CuSeO4 5H2O)或亚硒酸钠(Na2SeO3)、偏
钒酸钠(NaVO3)、铬盐)。在某些实施例中,可以使用由Schlegel等人配制的无机盐培养基(MSM)[“嗜热细菌”,Jakob Kristjansson,第5章,第III节,CRC出版社,(1992)]。
[0302] 本文所描述的方面涉及生物产品与微生物(例如,细菌细胞)的生长和/或表达。在一些实施例中,本文所述的微生物(例如,细菌细胞)可以在任何类型(富含或基础)的培养基中培养,包含发酵培养基和任何组合物。如本领域普通技术人员所理解的,常规优化将允许使用各种类型的培养基。所选择的培养基可以补充有各种另外的组分。补充组分的一些非限制性实例包含葡萄糖、抗生素、用于基因诱导的IPTG和ATCC微量矿物质补充剂。类似地,可通过常规实验优化本文所述微生物的培养基和生长条件的其它方面。例如,pH和温度是可以优化的因素的非限制性实例。在一些实施例中,如培养基的选择、培养基补充剂和温度等因素可以影响期望分子的生产水平。在一些实施例中,可以优化补充组分的浓度和量。在一些实施例中,优化用一种或多种补充组分补充培养基的频率,以及在收获期望分子之前培养培养基的时间量。
[0303] 在某些实施例中,通过气化和/或热解和/或焚烧步骤或一个或多个C1捕获和生物转化步骤之前的步骤将进入所述过程的原始废弃原料中存在的所有致病微生物杀死。
[0304] 在某些实施例中,营养素化学品(例如,电子供体、电子受体、碳源和/或各种矿物质营养素)的浓度在生物反应器内保持处于接近或处于其各自的最佳水平以获得最佳碳吸收和/或固定和/或转化和/或有机化合物的产生,所述浓度根据所用的微生物而变化,但是对于培养微生物领域的普通技术人员而言,无需过度实验便已知或可确定所述浓度。
[0305] 在某些实施例中,在生物反应器中监测和/或控制以下参数中的一个或多个:废弃产物水平;pH;温度;盐度;溶解氧;溶解二氧化碳气体;液体流动速率;搅拌率;气压。在某些实施例中,用传感器(例如,用于测量电子供体/受体浓度的溶解氧探针或氧化还原探针)监测影响化能自养生长的操作参数,和/或通过使用设备基于来自传感器的反馈手动或自动地控制所述操作参数,所述设备包含但不限于致动阀、泵和搅拌器。在某些实施例中,进入的培养液的温度以及进入的气体的温度由如(但不限于)冷却器、加热器和/或
热交换器等系统调节。
[0306] 在某些实施例中,在稳态下使用营养素培养基和/或生物质的连续流入和移除来维持微生物培养和生物反应,所述稳态下细胞群体和环境参数(例如,细胞密度、pH、DO、化学浓度)随着时间的推移保持恒定。在某些实施例中,恒定水平是原料转化和/或目标有机化合物产生的最佳水平。在某些实施例中,可以通过直接取样、通过光密度与细胞密度的相关性和/或用粒度分析仪来监测细胞密度。在某些实施例中,可以解耦水力滞留时间和生物质滞留时间,以允许独立控制培养液化学和细胞密度。在某些实施例中,可以将稀释速率维持在足够高的水平,使得水力滞留时间与生物质滞留时间相比相对较低,从而导致产生用于细胞生长和/或原料转化和/或有机化合物产生的高度补充的培养液。在某些实施例中,将稀释率设定为培养液和营养补充剂和/或废物移除与来自泵送、增加的输入和随稀释率上升而产生的其它需求的增加的过程成本之间的最佳技术经济权衡。
[0307] 在某些实施例中,控制微生物培养物的pH。在某些实施例中,将pH控制在微生物维持和/或生长和/或原料转化和/或有机化合物产生和/或存活的最佳范围内。为了解决pH的降低,在某些实施例中,中和步骤可以在生物反应器环境中直接进行,或者在通过再循环回路将培养基再循环回培养容器之前进行。可以通过添加碱来实现某些实施例的培养液中的酸中和,所述碱包含但不限于以下中的一种或多种:石灰石、石灰、氢氧化钠、氨、
氢氧化铵、苛性钾、氧化镁、氧化铁、碱性灰分。
[0308] 在某些实施例中,化能自养微生物的水性悬浮液将一种或多种电子供体和CO2转化为原生质。在某些实施例中,可以使用氢氧化微生物的水性悬浮液将氢和二氧化碳转化为微生物原生质。在某些实施例中,可以使用一氧化碳营养微生物的水性悬浮液将一氧化碳和氢气和/或水转化为原生质。在某些实施例中,可以使用甲烷氧化微生物的水性悬浮液将甲烷转化为原生质。在某些实施例中,悬浮的微生物是细菌或古细菌。在某些非限制性实施例中,H2氧化化能自养微生物的水性悬浮液或生物膜将H2和CO2以及一些其它溶解的矿物质营养素转化为生物化学品和原生质。在某些实施例中,其它溶解的矿物质营养素包含但不限于氮源、磷源和钾源。在某些实施例中,产生的原生质对人类和/或其它动物和/或其它异养生物具有食物价值。在某些实施例中,可以从原生质和/或细胞外培养液中提取某些生物化学品,所述原生质和/或细胞外培养液具有营养价值和/或各种有机化学或燃料应用中的价值。在某些实施例中,驱动这种原生质产生的细胞内能量来源于电子受体对电子供体的氧化。在某些非限制性实施例中,电子供体包含但不限于以下中的一种或多种:H2;CO;CH4。在某些非限制性实施例中,电子受体包含但不限于O2和/或CO2。在某些非限制性实施例中,能量生成反应或呼吸反应的产物包含但不限于水。在某些实施例中,在生化分子中储存并携带来自用于驱动来自CO2的生物化学品和原生质的这种合成的呼吸作用的细胞内能量,所述细胞内能量包含但不限于ATP。对于本文某些实施例中使用的氢氧混合气微生物,电子受体是O2并且呼吸作用的产物是水。
[0309] 在一些实施例中,通过以下一种或多种方法优化蛋白质的产生和所产生的氨基酸分子的分布:控制生物反应器条件、控制营养素水平和/或细胞的基因修饰。在某些实施例中,通过维持特定的生长条件(例如,氮、氧、磷、硫、如无机离子等微量营养素以及任何通常不被视为营养素或能源的调节分子(如果存在的话)的水平)来控制和优化通向氨基酸、蛋白质、或其它营养素或全细胞产物的途径以供产生化学产品。在某些实施例中,根据微生物的要求,可以通过将培养液维持在需氧、微需氧、缺氧、厌氧或兼性条件下来优化溶解氧(DO)。兼性环境被认为是具有由水柱分层引起的需氧上层和厌氧下层的环境。本文所公开的微生物对氨基酸、或蛋白质、或其它营养素或全细胞产物的生物合成可以在对数期期间发生或之后在细胞倍增停止的静止期期间发生,条件是存在足够的碳和能量供应以及其它营养来源。
[0310] 本文所述的生物反应器、培养条件、异养和化能自养生长、维持以及氨基酸、或蛋白质、或其它营养素或全细胞产物的产生方法的具体实例可以以任何合适的方式组合以提高微生物生长以及氨基酸、或蛋白质、或其它营养素或全细胞产生的效率。
[0311] 电子供体和电子受体
[0312] 在某些非限制性实施例中,CO2的生物合成还原利用通过水的电解产生的O2电子受体和/或H2电子供体。在某些非限制性实施例中,将通过水的电解产生的部分O2和所有H2送入到如本文所述的微生物的水性悬浮液中。在某些非限制性实施例中,送入到微生物水性悬浮液中的H2与O2摩尔数的摩尔比大于2:1。在通过水的电解产生O2电子受体和H2电子供体的某些非限制性实施例中,在满足本文所述的微生物的H2和O2的所有代谢需求之后剩余过剩的O2。在某些这种实施例中,过剩的O2可以供应给人类和/或其它需氧生命形式和/或用于根系通气的水培系统和/或用于气化或部分氧化或燃烧过程和/或作为化学副产品储存和销售。
[0313] 在利用分子氢气作为电子供体的某些实施例中,可以存在在使用可再生和/或无CO2排放的能量输入产生分子氢气时形成的化学副产品。在某些实施例中,用于呼吸作用的氢氧反应与氧化磷酸化酶促连接。在某些实施例中,由此形成的ATP和/或其它细胞内能量载体用于氨基酸和/或蛋白质的合成代谢合成。在某些实施例中,通过水分解产生的氧气超过呼吸作用所需的氧气以便维持用于由氢氧混合气微生物进行的固碳和有机化合物产生的最佳条件,可以通过商业氧气产生领域和科学中已知的过程步骤将所述氧气加工成适于销售的形式。
[0314] 通过合成代谢生物合成途径在生物学上最常见和最有效地完成碳链长度大于C4的有机分子的产生,如脂肪酸生物合成途径[C.R.Fischer、D.Klein-Marcuschamer和G.Stephanopoulos(2008)“用于
生物燃料产生的微生物宿主的选择和优化(Selection and optimization of microbial hosts for biofuels production)”《代谢工程学(Metabolic Engineering)》10(6):295-304(http://dx.doi.org/10.1016/
j.ymben.2008.06.009)],和各种氨基酸生物合成途径。某些实施例适用在用于ATP产生(例如,呼吸作用)的能量保存反应中使用比CO2更多的电负性电子受体(如但不限于O2)的氢氧化微生物、和/或CO氧化微生物和/或CH4氧化微生物。例如,与在呼吸作用中使用CO2作为电子受体的产乙酸菌或产甲烷菌相比,将氢氧反应(2H2+O2->2H2O)与ATP产生相结合的氢营养型、氢氧或氢氧混合气微生物每H2(和/或用于呼吸作用的其它电子供体)产生更多的ATP。
例如,氢氧混合气微生物可以在呼吸作用中消耗每H2产生至少两个ATP[L.Bongers(1970)“氢细菌中的能量产生和利用(Energy generation and utilization in hydrogen bacteria)”《细菌学杂志》104(1):145-151(http://jb.asm.org/content/104/1/
145.abstract),所述文献通过引用整体并入本文],其在呼吸作用中消耗每H2产生的ATP比在呼吸作用中使用H2作为电子供体和CO2作为电子受体的具有产甲烷作用或产乙酸作用的微生物中产生的ATP多8倍。由于这个原因,与使用产乙酸菌或产甲烷菌(如目前生物GTC技术中使用的产乙酸菌或产甲烷菌)来产生短链酸或醇(例如,乙酸或
乙醇)相比,使用可以在呼吸作用和ATP产生中利用更多电负性电子受体的微生物(如但不限于氢氧混合气微生物)来进行合成代谢生物合成(如但不限于来自合成气或H2的氨基酸或蛋白质或脂肪酸生物合成)可能是更有效的。在某些实施例中,用于呼吸作用的氢氧反应与氧化磷酸化酶促连接。
在某些实施例中,本文描所述的微生物细胞利用有氧呼吸来产生ATP。在某些实施例中,由此形成的ATP和/或其它细胞内能量载体用于氨基酸和/或蛋白质的合成代谢生物合成。在一些实施例中,利用氢氧混合气微生物和/或一氧化碳营养微生物和/或甲烷氧化微生物和/或异养微生物或包括这些微生物的组合物,其中所述微生物表达一种或多种能够生物合成有用的所关注的碳基产品的酶,所述碳基产品包含但不限于来自含碳气体原料的化学品、单体、聚合物、蛋白质、多糖、维生素、营养品、抗生素或其药物产品或其中间体,所述含碳气体原料包含但不限于合成气或发生炉煤气或天然气或沼气或与可再生的H2或CO或含甲烷气体相结合的废弃CO2。在一些实施例中,这些所述碳基产品可以由有机多碳原料(如但不限于葡萄糖、果糖和其它它糖)异养生物合成。在一些非限制性实施例中,利用微生物或包括微生物的组合物,其中所述微生物需要少于4个H2或NADH以通过呼吸作用产生一个ATP。在其它非限制性实施例中,利用微生物或包括微生物的组合物,其中所述微生物通过在呼吸作用中消耗每H2或NADH产生多于一个ATP。在其它非限制性实施例中,利用微生物或包括微生物的组合物,其中所述微生物通过在呼吸作用中消耗每H2或NADH产生至少两个ATP,或通过在呼吸作用中消耗每H2或NADH产生至少2.5个ATP。
[0315] 某些非限制性实施例的另一个特征涉及化能自养微生物用来将将二氧化碳和/或其它C1原料固定到有机化合物中的电子供体的来源、产生或再循环。在某些实施例中,可以使用来自许多不同的可再生和/或低碳排放能源技术的电力以电化学或热化学方式产生或再循环用于二氧化碳捕获和固碳的电子供体,所述电力包含但不限于:光伏、太阳能、风能、水电、核能、地热能、增强的地热能、海洋热能、海浪电力、潮汐能。使用化学工程领域和科学中熟知的化学和/或热化学方法可以容易地产生化能自养生物可以生长于其上的许多还原的无机化学品(例如,H2、CO、H2S、亚铁、铵、Mn2+),所述化学和/或热化学方法可以由各种无二氧化碳排放或低碳排放和/或可再生能源提供动力,包含但不限于光伏、太阳能、风能、水电、核能、地热能、增强的地热能、海洋热能、海浪电力或潮汐能。
[0316] 由可再生能源产生氢气正在逐步取代由化石原料系统发电,并且预计能源领域的技术进步将在不久的将来降低绿色氢气产生的价格。例如,商业和工业级
电解槽已经实现了高达73%的电能效率,并且对新材料和电解槽配置的研究表明,可能的效率高达96%。某些实施例利用商业上可获得的电解技术,其用于产生H2电子给体和/或O2电子受体的电能效率超过70%。某些实施例使用具有73%或更高能量效率和/或高达96%或更高能量效率的电解技术。
[0317] 在使用分子氢气作为电子供体的某些实施例中,通过化学和过程工程领域和科学中熟知的方法产生H2,所述方法包含但不限于以下中的一种或多种:通过水的电解,包含但不限于使用质子交换膜(PEM)、液体电解质(如KOH)、碱性电解、固体聚合物电解质电解、高压电解、蒸汽高温电解(HTES)的方法;和/或通过水的热化学分解,包含但不限于氧化铁循环、二氧化铈(IV)-二氧化铈(III)循环、氧化锌循环、硫-碘循环、铜-氯循环、钙-溴-铁循环、混合硫循环;和/或硫化氢的电解;和/或硫化氢的热化学分解;和/或已知具有低二氧化碳排放或无二氧化碳排放的产生氢的电化学或热化学过程,包含但不限于:实现碳捕获和封存(CCS)的甲烷重整;实现CCS的煤气化; 过程和其它产生炭黑产品的过程;实现CCS的生物质的气化或热解。在某些实施例中,产生H2的方法包含但不限于由可再生电能和/或来自低GHG源的电供电的电解。在某些实施例中,电解由以下中的一种或多种提供动力:太阳能,包含但不限于光伏和/或太阳热能;风能、水电;核能;地热能;增强的地热能;海洋热能;海浪电力;潮汐能。
[0318] 在世界范围内存在大量的风能资源,其中只有很小一部分被利用。低
电流利用率主要归因于风力资源的间歇性,其导致发电量随着时间的推移而变化,以及在大多数时间内未充分利用能力来满足能源需求。世界各地的例子都显示了风电供应与电网需求之间的普遍不匹配,例如在苏格兰,由于供过于求,风力发电厂已被支付关闭涡轮机[http://www.mnn.com/earth-matters/energy/blogs/blown-away-wind-turbines-genera te-enough-energy-to-power-every-home-in],以及在德克萨斯州的部分地区,在风力高、电网需求低的夜间,电力是免费供应的[http://www.nytimes.com/2015/11/09/business/energy-environment/a-texas-utility-of fers-a-nighttime-special-free-electricity.html?_r=2]。通过利用在非高峰需求期期间产生的风力来产生用于本文某些实施例中的方法的H2原料,可以解决这个挑战。
[0319] 目前,氢越来越被视为所谓的“电力-气体”方法中的可能的能量储存系统。可以通过水电解产生氢来减轻可再生能源生产(具体地说,太阳能和风能)的固有不
稳定性以及过剩的电网电力(非高峰能量)。根据大多数当前的方案,在需求高峰期间,所产生的氢然后可以通过
燃料电池和/或
燃气轮机转化回电力。或者可替代地,H2可以进料到气网中,或者通过甲烷化作用转
化成甲烷。此外,氢可以用作化学、石化、冶金和食品工业中的原料。某些实施例通过使H2能够在更广泛的产品范围(包含生物化学品,并且具体地说,蛋白质、氨基酸、肥料和生物刺激素)内使用,在动力-气体
框架内提供新的选择。在某些实施例中,使用过量网电和/或非峰值能量产生的氢用作发生在利用氢的微生物中的一种或多种代谢途径的电子供体。在某些实施例中,通过使用可再生能源的水电解产生氢氧化细菌和/或需氧细菌进行微生物生物合成所需的氢和/或氧,并且具体地说,所述可再生能源是非峰值电,即,当能源供应超过需求时可用的电力,并且在目前的情况下,所述电力往往被浪费。
[0320] 在某些实施例中,H2和CO2气体的现场储存仅在可再生发电超过电力需求的时段期间使得来自电网的电力转移。在某些实施例中,允许电力在较高需求期间照常流入电网。在某些实施例中,所述方法不破坏可再生电力供应,而是能够更完全地利用可再生发电容量,如但不限于风能和太阳能。某些实施例甚至在发电超过电网需求期间也允许持续的可再生操作和发电(例如,非高峰风能或太阳能发电)。
[0321] 在某些实施例中,氢电子供体不一定与低二氧化碳或无二氧化碳排放一同产生。然而,在某些这种实施例中,使用化学和过程工程领域中已知的方法由废弃的可持续或低价值的能源和/或碳源产生氢。这些方法包含但不限于原料的气化、热解、蒸汽重整或自热重整,所述原料如但不限于以下中的一种或多种:城市固体废物、黑液、农业废物、木材废物、闲置天然气、沼气、酸性气体、甲烷水合物、液化石油气、石油焦、轮胎、污水、粪肥、秸秆、海藻和海带以及低价值的一般高木质纤维素生物质。在某些实施例中,含有H2和/或CO和/或CO2的合成气或发生炉煤气用作电子供体和/或碳源。在某些实施例中,合成气或发生炉煤气包含的H2和/或CO和/或CO2由使用可再生和/或低GHG能源和转化过程(如本文所述的过程中的一种或多种)产生的H2补充。
[0322] 在某些非限制性实施例中,发生废弃CO2的还原和/或可用作食品源或营养源的细胞材料的合成,和/或发生废弃尿素的处置和利用和/或其它生物废物。
[0323] 在某些实施例中,在将气体递送到微生物培养物之前,可通过水煤气变换反应和/或碳捕获来调节合成气或发生炉煤气中的氢气与一氧化碳的比率。在某些实施例中,C1化合物通过甲烷或天然气(并且具体地说,闲置天然气、或者将以其它方式燃烧或释放到大气中的天然气)、或沼气或填埋气体的甲烷蒸汽重整产生并且作为合成气和/或发生炉煤气或C1化合物的液体流提供给微生物培养物,其中在某些实施例中,在将气体递送到微生物培养物之前,可以通过水煤气变换反应和/或碳捕获来调节合成气或发生炉煤气中的氢气与一氧化碳的比率。
[0324] 在某些实施例中,电子供体也可以从污染物或废物中提取或精制,所述污染物或废物包含但不限于以下中的一种或多种:工艺气体;尾气;强化的采油废气;闲置天然气;沼气;填埋气体;和酸性气体。在某些实施例中,含有H2和/或CH4和/或CO的尾气用作电子供体和/或碳的来源。在某些实施例中,来自炼油厂的尾气用作电子供体和/或碳的来源。
[0325] 产物
[0326] 在一些实施例中,本文所述的微生物每升液体培养物悬浮液产生至少1mg的所关注的碳基产物。在一些实例中,产物由微生物分泌到培养基中。在其它实例中,产物在发酵过程中保留在微生物中。在某些情况下,可以通过使细胞裂解并分离产物来回收产物。在其它情况下,在无需从微生物中显著制备或纯化产物的情况下,所述产物可以在完整的微生物中具有商业价值。
[0327] 在某些实施例中,进行细胞团与液体悬浮液的分离。在某些实施例中,通过微生物培养领域中已知的方法进行所述分离。以下提供了细胞团收集技术的实例:例如PCT申请第WO08/00558号;美国专利第5,807,722号;美国专利第5,593,886号;和美国专利第5,821,111号,分离可以通过一种或多种方法进行,所述方法包含但不限于:离心;絮凝;浮选;使用膜状、中空纤维、螺旋缠绕或陶瓷过滤系统进行过滤;真空过滤;
切向流过滤;
净化;沉淀;水力旋流。在细胞团可以固定在基质上的某些实施例中,可以通过包含但不限于重力沉降或过滤的方法收获细胞团,并且通过刮擦或液体剪切力将细胞团从生长底物中分离。
[0328] 在某些实施例中,可以将移除细胞团后留下的液体泵送到系统中以便除去和/或回收生物过程的溶解的化学产物和/或未反应的营养物。在某些实施例中,未反应的营养物和/或水被回收并且在可能的程度上再循环和/或在某些实施例中作为副产物出售和/或适当处置。在某些实施例中,在将水和/或未反应的营养物返回生物反应器之前使用本领域已知的方法和技术移除废产物和/或污染物和/或任何抑制性和/或有害化合物。
[0329] 在某些实施例中,可以通过包含但不限于细胞排泄或分泌或细胞裂解的方法将游离和/或溶解的有机分子从微生物释放到过程流溶液中。
[0330] 在某些实施例中,可以使用过程工程领域中已知的且针对特定实施例的化学产品的设备和技术来完成从水溶液中回收和/或再循环化学产品和/或未反应的营养物,所述设备和技术包含但不限于:溶剂萃取;水提取;蒸馏;
分馏;胶结;化学沉淀;碱性溶液吸收;在
活性炭、离子交换
树脂或分子筛上吸收或
吸附;改变溶液的pH和/或氧化还原电位;
蒸发器;分级结晶器;固/液分离器;纳滤;
反渗透;及其所有组合。
[0331] 在某些实施例中,化学产品和/或未反应的营养物流入支持其它生物生长的环境中。在某些实施例中,使用污水和未反应的营养物来灌溉和施肥高等植物和/或海藻和/或藻类,和/或饲养如真菌、酵母和/或细菌等异养生物。在某些实施例中,来自生物反应器流出物的无机营养素起到无机肥料的作用,其可以增加池塘和/或水产养殖和/或水栽法中使用的其它
围栏的初级生产。
[0332] 某些化能自养物种可达到的高生长速率可以允许其匹配或超过可通过光合微生物实现的每单位生物质的最高固碳率和/或生物质生产率。在某些实施例中,可以产生过剩的生物质。在某些实施例中,可以从系统中移除细胞团的过剩生长以产生生物质产品。在一些实施例中,可以从系统中移除细胞团的过剩生长,以便在微生物培养物中维持期望的(例如,最佳的)微生物群体和细胞密度,从而获得持续的高碳捕获和固定速率和/或原料转化率。
[0333] 为了帮助将生物质产品加工成有用的产品,在某些实施例中可以使用熟知的方法打破所收获的微生物细胞,所述方法包括含但不限于以下中的一种或多种:球磨碾磨、
空化压力、超声处理、均质化或机械剪切。
[0334] 在一些实施例中,可以在一个或多个过程步骤中干燥所收获的生物质。在某些实施例中,可以使用熟知的技术进行生物质干燥,所述技术包含但不限于以下中的一种或多种:离心、转鼓干燥、蒸发、冷冻干燥、加热、
喷雾干燥、真空干燥和/或真空过滤。在某些实施例中,可以使用废弃热量来干燥生物质。在某些实施例中,可以使用来自作为碳源的工业烟道气源的热量废物来干燥生物质。在某些实施例中,可以使用来自如上所述的电子供体和/或C1碳源的产生的热共产物来干燥生物质。
[0335] 在示例性但非限制性实施例中,将生产细胞接种到含有营养素培养基的生物反应器中;通常,在细胞开始加倍之前将遵循滞后期。在滞后期后,细胞倍增时间减少并且培养物进入对数期。对数期最终之后是倍增时间的增加,虽然不旨在受理论限制,但认为所述倍增时间的增加是由于以下原因导致的:包含溶解的气体、氮源或矿物质来源的营养素的耗尽;或抑制性化学品的浓度或微生物的群体感应的升高。在某些情况下,并且具体地说,在好氧生物过程中,静止期开始之前延长的线性或算术生长期可以遵循对数期。所述算术生长阶期是O2限制的特征。为了收获细胞团,在对数期后期、或在算术期期间或在静止期中收获某些实施例中的培养物。在一些实施例中,在对数期中收获细胞。除了碳源或电子源(例如,氢气)之外,通常可以通过耗尽氮源或另一种关键营养素来触发如脂质或PHB等碳储存的积累。这向细胞发出存储由过量碳源和能源产生的还原的碳的信号。
[0336] 在示例性但非限制性实施例中,使用封闭的培养容器,并且在压力下将氢气、氧气和CO2供应到液体工作体积底部的容器中;通过
气体传感器控制进入腔室的气体流量,以保持腔室顶部空间中固定的H2、O2和CO2浓度;通过容器中的机械搅拌将气体与培养基混合,以使气体最大限度地扩散到液体中;通过水电解槽供应氢气和氧气,并且从废物源或舱室空气或通常排放到大气中的点源捕获CO2;过程流从培养容器流入蛋白质和/或蛋白质生物质收获单元;使用离心作用将固体与液体分离;分离的液体流入水回收装置;在水回收单元中移除任何可能以其它方式在系统中积聚的不良物质;在水电解槽中重复使用再生水;将营养成分提供给培养容器以维持目标培养基组合物;在某些这种实施例中,提供尿液作为营养源之一;将回收的脱水生物质进一步加工成营养素和/或肥料和/或配料和/或食品。在某些这种实施例中,鼓泡进入生物反应器顶部空间的未使用的气体再循环回到液体工作体积的底部并且在底部被引回到液体工作体积中。在某些其它实施例中,新输入的H2和/或CO2被直接送入到生物反应器的顶部空间,而不是在工作体积的底部,并且然后与其它顶空气体一起通过再循环系统再循环到液体工作体积的底部,在底部气体被溶解和/或鼓泡到液体工作体积中。
[0337] 在某些实施例中,在干燥之后,或者在不存在先前的干燥步骤的情况下,进一步处理生物质以帮助分离和产生有用的生物化学品。在某些实施例中,这种另外的处理涉及从微生物生物质中分离蛋白质或脂质含量或维生素或其它目标生物化学品。在某些实施例中,可以通过使用非极性溶剂提取脂质来进行脂质的分离,所述非极性溶剂如但不限于以下中的一种或多种:己烷、环己烷、乙醚、醇(异丙醇、乙醇等)、磷酸三丁酯、超临界二氧化碳、三辛基氧化膦、仲胺和叔胺或丙烷。在某些实施例中,可以使用溶剂提取其它有用的生物化学品,所述溶剂包含但不限于以下中的一种或多种:氯仿、丙酮、乙酸乙酯和四氯乙烯。在某些实施例中,进行细胞裂解。
[0338] 在一些实施例中,提供了用于通过在生物反应器或溶液中组合一种或多种生物合成途径(包含但不限于氨基酸生物合成途径、维生素生物合成途径)、含碳气体以及工程化或天然的微生物来产生氨基酸和/或蛋白质和/或维生素的方法,所述工程化或天然的微生物将含碳气体(如合成气、发生炉煤气、CO2、一氧化碳及含有氢气的气体混合物);和/或气态或液态的C1化合物(包含但不限于甲醇或甲烷)转化为氨基酸和/或蛋白质和/或维生素。在一些实施例中,使用化学、化学工程、微生物学、农学和/或食品科学领域和科学中已知的方法,将氨基酸和/或蛋白质和/或维生素包含在以下中的一种或多种中:肥料、生物刺激素、生物肥料、微生物营养素培养基、蘑菇生长强化剂、动物饲料配制品和/或人类食品。在一些非限制性实施例中,所述微生物是杀虫贪铜菌DSM 531或DSM 541。在一些非限制性实施例中,维生素是B族维生素,并且更具体地说,是维生素B1、B2和/或B12。
[0339] 在某些实施例中,提供了用于产生一种或多种氨基酸的方法,所述方法包括将细菌细胞和/或古细菌细胞和/或其它微生物细胞暴露于合成气、和/或发生炉煤气、和/或气态CO2、和/或天然气、和/或沼气、和/或气态CO2和/或气态H2和/或CO和/或CH4的混合物(例如,H2和CO2、和/或CO、和/或CH4);其中所述微生物细胞能够将气态CO2和/或其它C1碳源固定到一种或多种氨基酸和/或蛋白质和/或维生素中;其中将所述化合物从生物反应器中回收并且送入到第二个或更多个另外的反应器中,其中所述化合物经过后处理以产生包含但不限于以下中的一种或多种的产物:肥料、生物刺激素、生物肥料、蘑菇生长强化剂、水产养殖饲料、动物饲料、食品配料、人类营养物(例如,食品或营养补充剂)或维生素。在一些实施例中,组合物包括细菌细胞,其中细菌选自红球菌属。在某些实施例中,所述细菌细胞是混浊红球菌(DSM 43205或43206或44193)或红球菌(DSM 3346)。在一些实施例中,所述细菌细胞选自雷尔氏菌属或贪铜菌属。在一些实施例中,所述细菌细胞是杀虫贪铜菌或耐金属贪铜菌。在一些实施例中,所述细菌细胞来自棒状杆菌属或伯克氏科。
[0340] 在一个实施例中,利用能够在合成气、和/或H2和/或CO2和/或CO和/或CH4的混合物(例如,H2和CO2、和/或CO、和/或CH4)和/或其它废气上生长并且能够产生氨基酸(包含但不限于赖氨酸)的野生型或工程化的微生物。
[0341] 在一些实施例中,提供了用于制备一种或多种氨基酸、肽、蛋白质、维生素或其它营养素的方法,所述方法包括(a)在合成气、和/或发生炉煤气、和/或天然气、和/或沼气、和/或气态CO2和/或气态H2和/或CO和/或CH4的混合物(例如,H2和CO2、和/或CO、和/或CH4)存在的情况下反应容器或生物反应器中培养本文所述的细胞,其中所述细胞以等于或大于细胞的总干细胞质量的至少10%的量产生和/或分泌一种或多种氨基酸、或蛋白质或其它营养素;和(b)从反应容器中分离一种或多种氨基酸、肽、蛋白质、维生素或其它营养素和/或全细胞产物(例如,从反应容器中的培养基中分离)。
[0342] 在一些实施例中,以本文所描述的方法产生的一种或多种氨基酸、或蛋白质、或其它营养素或全细胞产物用作替代性或非常规蛋白质和/或营养源。在一些实施例中,以本文所描述的方法产生的一种或多种氨基酸、或蛋白质、或其它营养素、或全细胞产物是提供给另一种生物的饲料或营养素供应的组分或前体,或包含在所述饲料或营养素供应中。在某些非限制性实施例中,消耗所述营养素供应的其它类型的生物是以下中的一种或多种:细菌、古细菌、酵母、微藻、海藻、海带、浮游动物、真菌、蘑菇、植物、贝类或其它无脊椎动物、鱼、
鸟或
哺乳动物。
[0343] 在某些非限制性实施例中,如本文所述产生的蛋白质生物质用作替代性蛋白质来源。在某些实施例中,其用作鱼粉和/或酪蛋白和/或乳清和/或
大豆粉的替代品。在某些非限制性实施例中,蛋白质产物不缺乏赖氨酸和/或甲硫氨酸。在某些实施例中,如本文所述产生的氨基酸、肽和/或蛋白质代替鱼粉、酪蛋白、乳清、和/或大豆粉和/或其它植物蛋白用于肥料、生物刺激素、生物肥料、蘑菇生长强化剂、饲料配制品和/或人类食品配料中。在某些非限制性实施例中,蛋白质产物不缺乏任何必需的氨基酸。在某些非限制性实施例中,蛋白质产物不缺乏赖氨酸和/或甲硫氨酸。在某些非限制性实施例中,蛋白质生物质不含有显著量的
抗营养因子。在某些实施例中,蛋白质生物质不含有显著量的以下物质中的一种或多种:棉酚、硫代葡萄糖苷、皂苷或胰蛋白酶抑制剂。
[0344] 因为,例如捕获鱼的水受到污染,所以许多目前的蛋白质和营养素来源(包含但不限于鱼粉)可能被如汞(Hg)和/或铅(Pb)等重金属以及其它有毒化学品和有机物污染。某些实施例涉及与蛋白质和其它营养素的当前来源(包含但不限于鱼粉)相比具有特别低水平的有毒污染物(如但不限于重金属和/或有毒有机物)的蛋白质产品。
[0345] 大部分高等植物对许多不同的动物(包含但不限于人类和其它非
反刍动物)是不可食用的。这会导致许多缺点,包含:能量和碳被引入到不期望的副产物或废弃物中;期望产物的产率降低;以及废物处理和处置的额外负担增加。在某些实施例中,就CO2捕获、生物质产生和/或蛋白质产生而言,与相当的高等植物作物相比,更大的碳和/或能量流被引导到目标生物质产品中。在某些实施例中,如本文所述产生的生物质的不可食用部分(例如,对人类)与可食用部分的比率低于相当的高等植物作物的比率。在某些实施例中,与相当的高等植物作物相比,食物浪费量较低。
[0346] 用于产生生物产品和/或生物质的系统
[0347] 某些非限制性实施例涉及具有相对较小的土地覆盖范围的生产设施,从而使得生物过程能够与产生CO2和/或其它碳废弃物的工业设施搭配。在某些非限制性实施例中,所述工业设施包含以下中的一种或多种:化石发电厂;炼油厂;
沥青砂改质设施;天然气或石油钻井作业;乙醇蒸馏厂;
水泥生产厂;铝生产厂;氯碱生产厂;钢铁
铸造厂;地热发电厂。在某些实施例中,紧凑的竖直设计允许与紧邻工业烟道气源方便地搭配,以及产生可在生产过程中进一步利用的相关废热,所述生产过程包含但不限于生物质干燥。
[0348] 在某些实施例中,与用于CO2生物捕获和转化的一些替代性系统相比,通过相对高度控制和包含的系统实现了另外的实际优点。在一些实施例中,所使用的生物反应器是气密和液体密封的,结构坚固,高度隔离并与周围环境隔绝,具有相对严格控制的内部参数(例如,温度、压力等)、输入和输出。这种相对封闭的系统以远远大于实际藻类或传统农业系统中的生物保护的程度保护培养物,在一些实施例中,所述培养物包含氢氧混合气微生物和/或氢营养型微生物和/或一氧化碳营养微生物和/或化能自养微生物和/或甲烷氧化微生物。实用的藻类和传统农业系统必然是生物直接暴露于周围环境和生态系统的非常开放的系统。与实际的藻类或传统农业系统相比,在某些实施例中,所述方法的相对高度控制和包含的方面极大地降低了环境污染、疾病、或害虫和杂草风险的风险。在某些实施例中,所述方法比实际的藻类或传统农业系统更加不受天气和气候变量的影响。在某些实施例中,与实际藻类或传统农业系统相比,所述方法具有减少的批次损失和/或生产率变化。
[0349] 在某些实施例中,由于在某些实施例中由气体和液体密封的生物反应器提供的高
密封性以及对输入和输出的严格控制,极大地促进了水和养分的再循环。在某些实施例中,通过在生物反应器出口下游添加适当的单元来实现水再循环,所述生物反应器出口包含但不限于冷凝器。这些类型的设备和方法在水回收和再循环的领域和科学中是众所周知的。在某些实施例中,与开放式藻类或传统农业系统相比,更大程度地防止蒸发损失和/或水径流和/或营养素径流和/或周围地下水和水道的污染。相反,开放式藻类系统和传统农业具有高蒸发水损失,并且易于发生农业径流,从而导致肥料和水的浪费;湖泊和水道的富营养化;并且甚至出现“死区”(高度耗尽O2的水体)。高等植物通过蒸发损失水分。在某些实施例中,蒸发不会损失水分。开放式藻类和传统农业系统还存在非本地生物‘逃逸’到周围环境和基因交叉污染的高风险。在某些实施例中,与开放式藻类和传统农业系统相比,存在较低的非天然生物逃逸到周围环境或基因交叉污染的风险。在某些实施例中,在生物过程中不使用杀虫剂、
除草剂或抗生素。某些实施例代表一种新型农业,其中化能自养生物取代光合作用植物、藻类或微生物;或异养真菌、细菌或动物;在生物基产品的产生中。在某些实施例中,这些生物基产品补充、增加、替代或扩展常规农业和/或畜牧业的产品。
[0350] 可以通过控制生物反应器条件和/或营养素水平和/或通过细胞的基因修饰来实现蛋白质产生的优化和特定氨基酸分布的靶向。在一些实施例中,通过以下中的一种或多种优化蛋白质的产生和所产生的氨基酸分子的分布:控制生物反应器条件、控制营养素水平、细胞的基因修饰。在某些实施例中,通向氨基酸、蛋白质、维生素和/或其它营养素的途径通常在空间上分离生物反应器系统的有氧和厌氧区域。本文所公开的微生物对氨基酸、蛋白质、或其它营养素或全细胞产物的生物合成可以在对数期、线性期期间发生或之后在细胞倍增停止的静止期期间发生,条件是存在足够的碳和能量供应以及其它营养来源。
[0351] 例如,在2017年3月18日编号为PCT/US17/23110的题为“用于由C1底物产生蛋白质、食品和有用的副产品的微生物和人工生态系统(MICROORGANISMS AND ARTIFICIAL ECOSYSTEMS FOR THE PRODUCTION OF PROTEIN,FOOD,AND USEFUL CO-PRODUCTS FROM C1SUBSTRATES.)”的国际专利申请中描述了用于由包括H2和/或CO2和/或CO和/或CH4的气态原料产生蛋白质、氨基酸和其它营养素的化能自养微生物的用途。出于所有目的,所述申请通过引用整体并入本文。
[0352] 例如,在2012年9月19日提交的题为“用于修饰脂肪酸的工业脂肪酸工程通用系统(INDUSTRIAL FATTY ACID ENGINEERING GENERAL SYSTEM FOR MODIFYING FATTY ACIDS)”的美国专利申请序列号13/623,089中描述了氢氧混合物微生物的工程化。出于所有目的,所述申请通过引用整体并入本文。
[0353] 例如,在2012年10月26日提交美国专利与商标局的编号为13/643,872的题为“用于非光合碳捕获和将无机和/或C1碳源转化为有用的有机化合物的氧磷微生物的用途(USE OF OXYHYDROGEN MICROORGANISMS FOR NON-PHOTOSYNTHETIC CARBON CAPTURE AND CONVERSION OF INORGANIC AND/OR C1 CARBON SOURCES INTO USEFUL ORGANIC COMPOUNDS)”的专利申请中描述了用于将合成气、发生炉煤气或其它含H2和CO2和/或CO的气体混合物转化为中高碳链数分子或合成代谢分子的氢氧混合物微生物的用途。出于所有目的,所述申请通过引用整体并入本文。
[0354] 例如,在2010年5月12日提交的题为“利用化能自养微生物将CO2和/或其它无机碳源固定到有机化合物中并产生另外的有用产品的生物和化学过程(BIOLOGICAL AND CHEMICAL PROCESS UTILIZING CHEMOAUTOTROPHIC MICROORGANISMS FOR THE CHEMOSYTHETIC FIXATION OF CARBON DIOXIDE AND/OR OTHER INORGANIC CARBON SOURCES INTO ORGANIC COMPOUNDS,AND THE GENERATION OF ADDITIONAL USEFUL PRODUCTS)”的PCT申请第PCT/US2010/001402号中描述了将二氧化碳转化为有用的有机化学品的化能自养微生物的用途。出于所有目的,所述申请通过引用整体并入本文。
[0355] 一些实施例的另一个特征包含通过人工程序修饰本文所述的微生物,所述人工程序包含但不限于加速诱变(例如,使用紫外线或化学处理)、基因工程或修饰、杂交、合成生物学或传统的选择性育种。微生物的可能的修饰包含但不限于旨在产生增加的氨基酸数量和/或质量、和/或蛋白质和/或酶和/或维生素的修饰。
[0356] 在某些实施例中,利用包括一种或多种外源核酸序列的化能自养细菌菌株。由本文所描述的微生物合成的生物化学品可以应用于的用途包含但不限于:石化替代物;单体;用于产生聚合物的原料;
润滑剂;作为施肥、动物饲料、食品、个人护理和化妆品中的配料。
在一些实施例中,可以利用酶促和化学过程产生维生素、氨基酸和/或蛋白质。一些实施例能够产生肥料、生物刺激素或动物饲料。此外,提供了用于培养和/或修饰化能自养细菌以改善氨基酸和/或蛋白质和/或维生素产率和/或降低生产成本的方法。在一些实施例中,与未经基因修饰的相同微生物相比,基因修饰的微生物(例如,细菌)产生更多某一种或多种类型的维生素或氨基酸分子或蛋白质或酶。
[0357] 本文所述的生物反应器、培养条件、异养和化能自养生长、维持以及氨基酸、蛋白质、维生素、其它营养素和/或全细胞产物的产生方法的具体实例可以以任何合适的方式组合以提高微生物生长以及氨基酸、蛋白质、维生素、其它营养素和/或全细胞产生的效率。
[0358] 产品的后生物过程回收和应用
[0359] 在某些非限制性实施例中,通过本文的过程获得植物生物刺激素和/或生物肥料和/或有机肥料。某些实施例包括将至少一种氨基酸发酵液和/或微生物细胞添加到植物生物刺激素配制品中。在某些非限制性实施例中,微生物细胞是革兰氏阴性和/或革兰氏阳性细菌。在某些非限制性实施例中,通过转化如本文所述的C1碳源获得微生物细胞。某些实施例的另外的目的是提供一种用于从废弃物和/或低成本原料制备生物刺激素和/或肥料和/或营养素的相对便宜的方法。在某些实施例中,氨基酸和/或寡肽和/或低分子量的肽由废弃物和/或低成本原料(包含但不限于C1碳源)产生。在某些实施例中,由废弃物和/或低成本原料(包含但不限于C1碳源)产生的营养素容易被植物通过叶和/或根吸收和同化。在某些实施例中,吸收的营养素被运输到植物器官,如例如芽、花或果实(Gjalakshimi等人(2004)《生物资源技术(Bioresource Technology)》(92):291-296;Parrado等人(2008)《生物资源技术》99:2312-2318)。在某些实施例中,植物可以使用氨基酸和/或寡肽和/或低分子量的肽来产生其自身的蛋白质。在某些实施例中,这节省了将在植物内能量消耗代谢过程中的一个或多个过程中以其它方式消耗的代谢能量(Higgings,C.F.,Payne,J.W.(1982)《植物肽(Plant peptides)》在:Boulder,D.、Parthier,B.(编辑)《植物生理学百科全书(Encyclopedia of Plant Physiology)》,14A施普林格出版公司(Springer)438-458)。在某些实施例中,如本文所述产生的营养素可以由土壤环境中的微型动物使用,包含但不限于作为碳源和/或氮源。在某些实施例中,微型动物将营养素转化为有益于植物生长和活动的形式。同样,当掺入动物饮食中时,如本文所述产生的氨基酸、寡肽、低分子量的肽和其它营养素也易于被动物吸收和同化。
[0360] 在某些实施例中,微生物细胞作为产生微生物细胞团的工业过程的副产物获得。例如,工业过程可以选自氨基酸、乙醇、其它醇、有机酸、脂质和/或烃的产生,和/或废水处理。在某些非限制性实施例中,在用过的培养基中提供细胞以产生至少一种例如选自赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、天冬酰胺和/或谷氨酰胺的氨基酸。
[0361] 在综合的多营养水产养殖中,以允许一个物种的副产品作为另一物种的饲料进行再循环的方式一起饲养几个物种。在综合的农业(特别是水培)和水产养殖中,池塘或再循环系统用于饲养海产品和其它生物(例如,鱼和莴苣)。在某些实施例中,如本文所述产生的蛋白质和/或其它营养素用于在以下中的一种或多种内生长莴苣和/或鱼的技巧和技术:再循环系统;综合的多营养水产养殖;综合的农业和水产养殖。
[0362] 在一些实施方例中,生物反应器包括包含至少一个内源或外源核酸序列的微生物,所述内源或外源核酸序列编码通向所关注的氨基酸、或蛋白质、维生素或其它营养素的途径酶。在一些实施例中,所述系统包括两个或更多个、三个或更多个、或四个或更多个生物反应器,所述生物反应器中的至少一个生物反应器包括包含至少一个内源或外源核酸序列的微生物,所述内源或外源核酸序列编码通向所关注的氨基酸、或蛋白质、或维生素或其它营养素的途径酶。在一些实施例中,生物反应器系统包括至少第一生物反应器和第二生物反应器,其中所述第一生物反应器包括包含至少一个内源或外源核酸序列的微生物,所述内源或外源核酸序列编码通向所关注的氨基酸、或蛋白质、或维生素或其它营养素的途径酶;并且其中第二生物反应器包括源自不同物种的微生物,其中来自不同物种的微生物可以包括至少一个外源核酸序列。在一些实施例中,生物反应器系统包括第一生物反应器和第二生物反应器,所述第一生物反应器包括如本文所述的微生物,并且所述第二生物反应器包括浮游动物、真菌、微藻、酵母或细菌细胞。在一些实施例中,所述系统包括第一生物反应器和第二储罐或容器,所述第一生物反应器包括如本文所述的微生物,并且所述第二储罐或容器包括多细胞动物和/或水产养殖和/或水培系统。
[0363] 在某些非限制性实施例中,本文所描述的微生物与其它活生物体保持共生关系和/或营养关系。图23展示了这种关系的一个实例。
[0364] 在某些实施例中,可以使用过程工程领域中已知的且针对本文所述的特定实施例的化学产品的设备和技术来完成从水溶液中回收化学产品和/或用过的营养物,所述设备和技术包含但不限于:溶剂萃取;水提取;蒸馏;分馏;胶结;化学沉淀;碱性溶液吸收;在活性炭、离子交换树脂或分子筛上吸收或吸附;改变溶液的pH和/或氧化还原电位,
蒸发器、分级结晶器、固/液分离器、纳滤、反渗透及其所有组合。
[0365] 在一些实施例中,使用化学、化学工程和/或食品科学领域和科学中熟知的方法和过程将如本文所述产生的生物质转化为用于肥料、生物刺激素、生物肥料、蘑菇生长强化剂、动物饲料和/或人类营养应用的高蛋白质和/或高维生素和/或高营养素产品。
[0366] 在某些实施例中,如本文所述产生的生物质用作补充营养素。在某些实施例中,生物质用作有机肥料材料以恢复土壤中的化学和微生物性质和/或提高作物生产率。
[0367] 在一些实施例中,来自由微生物产生的氨基酸和/或肽和/或蛋白质的氮中超过90%的氮随后被消耗如本文所述产生的氨基酸、和/或肽、和/或蛋白质和/或蛋白质生物质的其它微生物、植物、真菌、动物或人类吸收。在一些实施例中,在送入到另一种生物之前将微生物细胞煮沸。在其它实施例中,在送入到另一种生物之前将细胞超声处理或以其它方式裂解或破碎。
[0368] 在某些实施例中,组合来自以下组中的一种或多种的生物质来制备配制品:高蛋白菌株;高油/高脂肪菌株;高碳水化合物/多糖菌株。在某些这种实施例中,与单独使用的菌株集合的任何亚组相比,所得配制品在另一种生物的营养需求的饮食中具有更适当的蛋白质、油和脂肪以及碳水化合物的平衡。
[0369] 在某些实施例中,从生物反应器中回收的生物质是经过水洗的,并且在某些这种实施例中,可以将稀碱加入洗涤液中以移除粘附的颜色和
味道体。在某些实施例中,存在巴氏杀菌步骤。在某些实施例中,巴氏杀菌在约220℉下进行约5分钟。在一些实施例中,在施肥或喂养另一种生物之前将微生物细胞煮沸。
[0370] 为了帮助将生物质产品加工成有用的产品,在某些实施例中可以使用熟知的方法打破所收获的微生物细胞,所述方法包括含但不限于以下中的一种或多种:球磨碾磨、空化压力、超声处理、机械剪切、高压均质化、砂或胶体碾磨、反复冻融循环、裂解酶。在一些实施例中,在施肥或喂养另一种生物之前,细胞经历以下中的一种或多种:球磨碾磨、空化压力、超声处理、机械剪切、高压均质化、砂或胶体碾磨、反复冻融循环、裂解酶。
[0371] 在细胞内发现了大多数蛋白质和其它大生物分子,并且在某些实施例中,这些生物分子是从细胞内环境中提取的[Doelle,H.W《. 微生物工艺过程开发Microbial Process Development)》(世界科学出版社(World Scientific),1994)。URL https://books.google.com/books?id=_qDabLa-0ukC.]。一些蛋白质在结构上与细胞的不溶部分(包含内膜和/或超微结构)相关。通常,为了回收这些产品,首先要求细胞破碎或破裂。在某些实施例中,细胞破碎或破裂。存在许多细胞破碎的方法,并且特定的细胞类型可能最适合于这些方法中的一种或多种。微生物(例如,细菌)从相当脆弱到高弹性不等。在某些实施例中,利用本领域技术人员已知的非常适合特定细胞类型的细胞破碎方法来破坏如本文所述产生的细胞。
[0372] 均质器或压力机是用于使如细菌等微生物裂解的常用装置。压力机通过加压细胞悬浮液并突然释放压力来使细胞裂解。这产生了能够使细胞裂解的液体剪切。在某些实施例中,在细胞破碎过程中使用压力均质器。法国
压力传感器压力机或法式压力机是一种用于通过在高压下使细胞质膜通过狭窄阀门来破坏细胞质膜的设备。Gaulin均质器是一种用于在许多行业(包含食品和乳制品、制药、石油和化学品行业)中产生稳定的乳液和分散体的机器。法式压力机和Manton-Gaulin均质器的典型操作压力为6000psi到10,000psi。通常需要多次(例如,约2-3次)通过以实现充分的裂解。然而,高操作压力导致操作温度升高。因此,压力室通常在使用前冷却(例如,约4℃)。休斯(Hughes)压力机迫使细胞的冷冻悬浮液在700巴到5,500巴的压力下通过接收室中的小间隙。可以使用低至25μm的狭缝宽度。X-压力机是休斯压力机的改编版,因为它也适用于冷冻细胞。在这种情况下,细胞通过盘中的圆柱孔。双插入设置允许细胞多次往返通过以增加细胞损伤。X-压力机在高于2,000巴到6,000巴下操作。
[0373] 在某些实施例中,使用以下均质器或压力机中的一种或多种来使细胞破碎:Gaulin;Manton-Gaulin;法式;Chaikoff;休斯;X-压力机;和/或Sorvall-Ribi分馏器。
Sorvall-Ribi分馏器是法式压力机的改编版,其中针阀具有用于使冷却氮气冷却的设施。
在某些实施例中,在Sorvall-Ribi分馏器中,细胞经受大于1,000巴、或大于1,700巴或大于
2,400巴的压力。一些更现代的均质器通常是连续的,并且可以在比旧型号更高的压力下运行。据报道,Avestin Emulsiflex-C5在一次15,000psi(100Mpa)下的通过中有效地使大肠杆菌细胞裂解。在某些非限制性实施例中,使用Avestin Emulsiflex-C5来使细胞裂解。在某些非限制性实施例中,在单次通过均质器中完成细胞裂解。在某些非限制性实施例中,细胞在均质器中暴露于约15,000psi或更高压力。在某些非限制性实施例中,均质化在以下条件下发生:压力为5000psig到15000psig;l到5次通过均质器;温度为32℉到122℉;pH为
4.5-6.5。
[0374] 已经发现,超声和超声处理是用于使可能除了真菌之外的几乎每种细胞类型的细胞破碎的合适技术。通过液体剪切和空化来使细胞裂解。挑战在于控制温度。这可以通过将悬浮液保持处于冰上并使用一些短脉冲(5-10秒)与暂停(10-30秒)来重新建立低温来解决。在超声处理期间也会剪切DNA。在某些实施例中,不必将DNase加入细胞悬浮液中以进行DNA水解。在某些实施例中,使用超声来破坏细菌和/或古细胞。
[0375] 在某些实施例中,通过将细胞材料抵靠固体表面
研磨来完成细胞破碎。已经证明了珠磨机对大多数细胞类型的有效破坏,所述细胞类型包含植物、酵母和细菌细胞。可获得高达20升的系统,其所报道的在40-70kg/h吞吐量下酵母破碎的产率大于90%并且在200kg/h下高达80%[Doelle,H.W《.微生物工程开发(Microbial Process Development)》(世界科技出版公司(World Scientific),(1994).URL https://books.google.com/books?id=_qDabLa-0ukC.]。在某些实施例中,可以使用一种或多种碾磨方法使细胞破碎,所述碾磨方法包含但不限于:研杵和研钵(有或没有
磨料粉);Potter-Elvehjiem均质器;博朗(Braun)均质器;珠磨机和/或胶磨机。在某些实施例中,优化一种或多种因子以便最有效和/或成本有效地破坏细胞,所述因子包含但不限于:系统中的
停留时间;珠粒的大小和密度,以及数量和组成;
转子转速;叶片和/或转子轴的设计;细胞浓度;
粘度;和温度。
[0376] 在某些实施例中,除机械方法外,或在无另外的机械方法的情况下,可以使用非机械方法进行细胞裂解,所述非机械方法包括细胞的物理和/或化学和/或酶促裂解。
[0377] 当细胞悬浮在低渗溶液中时发生渗透压休克;水会扩散到细胞内,迫使细胞膨胀并最终爆裂。此技术相对温和且可控。典型的溶液包含例如1M甘油、1M
蔗糖、蒸馏水、或简单地稀释上清液。在某些非限制性实施例中,渗透压休克用作细胞裂解过程的一部分。
[0378] 在某些非限制性实施例中,压力释放用作细胞裂解过程的一部分。在某些实施例中,将细胞悬浮液在气体下加压,并且使其平衡。在培养液和细胞质中,气体张力增加。在突然释放压力时,气体从溶液中
解吸并且细胞内的膨胀导致其爆炸。在某些这种实施例中,将细胞悬浮液加压至60巴。在某些非限制性实施例中,将细胞悬浮液在35巴或更高的氧化亚氮下平衡3分钟或更长时间。在其它非限制性实施例中,将细胞悬浮液在35巴或更高的氮气下平衡3分钟或更长时间。
[0379] 在某些非限制性实施例中,冷冻和解冻用作细胞裂解过程的一部分。冷冻细胞然后解冻通常会通过冰晶的作用使膜破碎,从而刺穿细胞。在某些实施例中,利用一个或多个冻融循环。
[0380] 在某些实施例中,冷冻和研磨的组合用作细胞裂解过程的一部分。在某些实施例中,使
用例如但不限于液氮来冷冻细胞,然后使用上述研磨和碾磨方法中的一种或多种将冷冻的细胞研磨成粉末。在某些实施例中,使用也已用液氮冷却的研钵和研杵。在某些实施例中,通过将所述冷冻研磨粉末加入5体积的缓冲液中来制备细胞裂解物。
[0381] 干化或干燥通常用于破坏微生物细胞,其通常使细胞易受缓冲作用的影响。在某些非限制性实施例中,干化或干燥和/或缓冲作用用作细胞裂解过程的一部分。在某些实施例中,可以应用真空来加速此过程。在某些实施例中,可以采用冷冻干燥,并且在其它实施例中,可以采用慢速空气干燥。在某些实施例中,可以使用挥发性化学品干燥。如丙酮、乙醇和乙醚等
试剂可以提高产品在缓冲液中的溶解度。在某些非限制性实施例中,丙酮和/或乙醇和/或乙醚用作细胞裂解过程的一部分。
[0382] 在某些非限制性实施例中,酶促裂解用作细胞裂解过程的一部分。可以使用一个或多个酶通过攻击特定键来使细胞壁裂解。酶促裂解可以基于例如细菌细胞的肽聚糖层的消化。尽管在某些情况下可以将酶与大分子结合并通过
超滤法回收酶,但所述酶通常在每个破碎批次中丢失。在某些非限制性实施例中,一个或多个裂解酶与大分子缀合和/或通过超滤法回收。常用的酶是溶菌酶,其是从蛋清中获得的。所述溶菌酶攻击细胞壁中的胞壁肽,并且已被发现对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌有效。然而,革兰氏阴性细菌具有外膜,所述外膜位于细胞壁外部并且需要进行透化处理以暴露肽聚糖层。Tris通常用作裂解方法中的缓冲液,其有效地透化外膜。通过加入
乙二胺四乙酸盐(EDTA)(例如,约1mM)可以增强这种效果。EDTA螯合使膜稳定的镁离子。在在某些非限制性实施例中,一个或多个溶菌酶用作细胞裂解过程的一部分。在某些非限制性实施例中,Tris用作裂解中的缓冲液。在某些非限制性实施例中,EDTA用作裂解中的螯合剂。在某些非限制性实施例中,酶促裂解与超声处理一起进行。
[0383] 在某些非限制性实施例中,
洗涤剂和/或溶剂和/或其它化学品用作细胞裂解过程的一部分。阳离子和阴离子洗涤剂、碱、酸以及如氯仿和
甲苯等溶剂可以有效破坏细胞膜的脂质或脂蛋白。在某些非限制性实施例中,阳离子和/或阴离子洗涤剂和/或碱和/或酸和/或溶剂(如但不限于氯仿或甲苯)用作细胞裂解过程的一部分。在某些这种实施例中,选择化学试剂以便在细胞裂解过程下游的最终产物中不产生对植物和/或真菌和/或动物和/或环境有毒或有害的残留物。在某些这种实施例中,在细胞裂解过程下游实施如本领域熟知的过程等用于移除可能对植物和/或真菌和/或动物和/或环境具有有害作用的任何化学品的安全水平的过程。
[0384] 如多粘菌素、两性霉素B和/或制霉菌素等抗生素增加细菌膜的渗透性并可以诱导裂解。基于青霉素的抗生素是细菌细胞壁合成的有效抑制剂,但仅对细胞仍处于活跃生长的细胞破坏有价值。在某些非限制性实施例中,包含但不限于多粘菌素、两性霉素B、制霉菌素和/或青霉素中的一种或多种的抗生素用作细胞裂解过程的一部分。在某些这种实施例中,选择抗生素以便在细胞裂解过程下游的最终产物中不产生对植物和/或真菌和/或动物和/或环境有毒或有害的残留物和/或可能会加剧抗生素抗性微生物的医学问题的残留物。
[0385] 在某些非限制性实施例中,噬菌体用作细胞裂解过程的一部分。大多数细菌群对噬菌体敏感。噬菌体携带酶,所述酶使细胞膜水解以进行核酸渗透。重感染可以导致裂解。在这种实施例中,将这种噬菌体污染物再循环到
发酵容器中是一个很大的风险,并且实施本领域技术人员已知的防止这种污染的步骤以防止这种污染。
[0386] 当通过任何方法使细胞破碎时,通常获得细胞碎片部分和可溶细胞质成分部分。可以通过如但不限于离心或过滤的方法分离这些部分。可溶细胞质成分中存在单独的核酸和蛋白质或或缀合的核酸和蛋白质。通过细胞裂解可以释放大量的DNA,从而增加粘度。在某些非限制性实施例中,加入DNase(例如,约1mg/ml)以降低裂解制剂的粘度。细胞裂解后,通过等电沉淀回收蛋白质可能导致产生在某些实施例中不期望的具有核酸含量的蛋白质产物。在某些实施例中,进行本领域熟知的减少或消除蛋白质材料的核酸含量的措施。
[0387] 在某些实施例中,获得细胞材料的提取物。在某些这种实施例中,提取物是有机提取物。在某些这种实施例中,提取物是酶提取物。提供了通过这些方法获得的或可获得的细胞提取物。在一些实施例中,细胞提取物(例如,有机提取物)用于农业、动物饲养和/或直接人类营养。
[0388] 如本文所述,表达培养物和/或培养液指代通过本文所公开的生物过程获得的细胞悬浮液,所述细胞悬浮液可以使用C1碳源和/或有机碳源进行微生物生长和产生。更具体地说,培养物和/或培养液包含微生物细胞和/或其代谢产物和/或未消耗的营养素,所述营养素可以包含但不限于以下中的一种或多种:蛋白质、水溶性B-
复合维生素、其它维生素、磷酸盐、矿物质(如但不限于钾、硫、镁、钙和/或钠)、饱和和/或不
饱和脂肪酸、卵磷脂、脑磷脂、碳水化合物(如糖原、海藻糖、葡聚糖和/或甘露聚糖)、乙醇、二氧化碳、酯类、醛类、酮类和高级醇类等。在未进行干化或浓缩的情况下,这些残留物可以悬浮和/或溶解在水溶液中,正如它们从生物反应器中出来一样,或者在移除水后以浓缩的液体或固体形式存在。可以通过任何常规方法(如但不限于过滤、沉降或离心)分离残余的水。
[0389] 美国专利申请第2003/022357号描述了一种基于酵母属的酵母细胞和来自废水储存或处理厂的污泥的生物肥料,其制造酵母细胞通过施加磁场而被激活。在本文的某些非限制性实施例中,通过施加磁场激活在C1原料上生长的微生物细胞。美国专利申请第US2002/187900号描述了一种包括与牛粪结合的酿酒酵母属的电磁活化酵母细胞的生物肥料,并且美国专利申请第US2002/187552号公开了一种包括与鸟粪结合的电磁活化酵母细胞的生物肥料。在本文的某些非限制性实施例中,已经在气态底物上生长的微生物细胞被电磁激活,所述气态底物包含但不限于H2、CO2、CO和CH4中的一种或多种。在某些实施例中,细胞与一种或多种其它配料组合,所述配料包含但不限于牛和/或鸟粪和/或其它粪肥和/或来自植物、海藻、和/或海带、和/或动物废产品的提取物。
[0390] 蛋白质水解
[0391] 在某些非限制性实施例中,来自如本文所述的微生物(微生物)细胞的有机提取物含有几乎所有处于水解状态的蛋白质含量(包含游离氨基酸、寡肽和/或其它较高分子量的肽中的一种或多种)以及基本上所有起始全细胞物质的营养素。在某些这种实施例中,提取物对真菌和/或动物和/或植物具有高生物肥料和/或生物刺激能力以及更高的生物吸收能力。在某些实施例中,这些提取的产物可以用于有机农业、和/或动物饲料、和/或水培农业、和/或作为用于牲畜和/或水产养殖的具有高营养价值的添加剂、和/或作为用于异养微生物和/或大生物的生长的营养素、和/或作为用于直接人类消耗的营养素。
[0392] 在某些非限制性实施例中,使本文所述的微生物细胞水解以获得水解产物。在各个示例性实施例中,产生植物生物刺激素的方法包含使微生物细胞水解以获得水解产物,以及将水解产物配制为用于叶面施用和/或作为土壤佐剂施用和/或作为土壤肥料施用的植物生物刺激素和/或植物营养素和/或肥料。在某些非限制性实施例中,水解产物用于种子包衣中以增强蔬菜和花卉作物、观叶植物和草坪草的发芽和早期生长。某些非限制性实施例包含产生植物生物刺激素和/或肥料的方法,所述方法包括:使例如如本文所述生长的微生物细胞水解以获得水解产物;以及将水解产物配制为用于叶面施用或用作土壤佐剂施用或在种子包衣中施用的植物生物刺激素。在某些非限制性实施例中,使微生物细胞水解包括使固体含量为约1wt%到约30wt%的细胞乳膏水解。在某些非限制性实施例中,使微生物细胞水解包括使氮含量为约0.12wt到约4wt%的细胞乳膏水解。与完整细胞或部分裂解的细胞相比,微生物细胞可以通过水解加工以产生粘度大大降低的较短链化合物。虽然使用其它细胞是可能的,但是根据本文所述的某些实施例,采用微生物细胞(优选原核细胞并且更优选细菌或真细菌细胞)来制备植物生物刺激素和/或真菌营养素。可以通过使植物或动物细胞水解获得含胺化合物。其中使微生物细胞水解的本文的示例性方法还可以产生生物活性化合物,如肽聚糖、脂多糖、脂肪、脂质、维生素、碳水化合物、酚类、矿物元素、植物激素、含胺化合物和可以充当植物生物刺激素的多胺。
[0393] 可以通过任何已知的方法进行微生物细胞的水解,所述方法基本上将细胞组分裂解成短链或单一化合物。可替代地,可以利用部分水解通过利用较低的
能量密度和较短的水解时间从细胞中产生植物生物刺激素和/或肥料。
[0394] 可以在其中微生物细胞适合酶促水解的实施例中采用这种酶促水解。在某些非限制性实施例中,使微生物细胞水解包括进行酶促水解。在最终酶促水解后,获得可以被称为“有机酶提取物”的产物。有机酶可以用于如农业、牲畜和/或人类营养目的。在一些实施例中,如本文所述的有机酶提取物用于农业、动物饲养和/或异养发酵的应用中。在某些实施例中,鉴于有机酶提取物具有氨基酸、寡肽和低分子量的肽的特殊组合物,有机酶提取物可以用作有机农业中的生物刺激素和/或作为生物肥料,所述组合物能够使植物和/或土壤生物吸收这些分子。在某些实施例中,根据本文所述方法产生并且施用于作物的生物刺激素实现以下结果中的一种或多种:作物品质参数和/或营养效率提高;生长率增加;光合速率提高;作物产率提高;植物的根和叶的生长增加;非生物抗逆性增加;疾病耐受性增加;土壤质量改善;杂草生长减少。在某些实施例中,根据本文所述方法产生的生物刺激素提高施用所述生物刺激素的作物的营养素利用效率,和/或减少营养素从种植作物的田地中
浸出到环境中。在某些非限制性实施例中,根据本文所述方法产生的生物刺激素增加植物对应激物的耐受性、和/或增加植物的繁殖率、和/或每剂量具有比目前可获得的商业产品更高的功效、和/或如果发生过度施用则提供比目前可获得的商业产品更少的植物损伤风险。在某些实施例中,本文所述的蛋白质水解产物或有机提取物刺激期望的天然存在的土壤微生物,如N2固定性、P溶解性和吲哚乙酸产生性细菌。在某些非限制性实施例中,受刺激的微生物包含固氮螺菌属和/或固氮菌属。在某些实施例中,有机酶提取物可以用作真菌(例如,蘑菇)的营养素或补充剂。在某些实施例中,有机酶提取物可以用作具有高附加值的营养添加剂作为动物饲料,更具体地说,用于牲畜饲料(牛、
绵羊、山羊等)、和/或用于水产养殖、和/或用于昆虫(例如,
蜜蜂)或其它无脊椎动物(例如,红虫)、和/或用于异养发酵、和/或用于
家畜或宠物和/或直接供人食用。
[0395] 在某些实施例中,提取物含有基本上所有水解形式的起始蛋白质。在某些非限制性实施例中,超过90wt%的起始蛋白质是水解形式,例如,游离氨基酸、寡肽和具有更高分子量的其它肽的形式。在某些非限制性实施例中,基本上所有来自进入水解过程的培养物中的细胞的营养素都包含在水解产物中。在某些实施例中,来自液体溶液或有机物悬浮液的细胞外营养素也包含在产物中。在一些实施例中,提供了通过本文所述的方法获得的或可获得的水解产物和/或有机酶提取物。在某些实施例中,提取物富含蛋白质,例如主要以肽(例如,寡肽和具有低于10,000道尔顿的低分子量的肽)的形式,以及游离氨基酸。在某些实施例中,游离氨基酸具有高生物吸收。在某些实施例中,提取物含有碳水化合物。通过采用如本文所述的这种酶,在水解中使用强酸或碱的替代物来获得植物生物刺激素是可能的。在各个示例性实施例中,可以使用任何合适的酶或酶组合物进行微生物(例如,细菌)细胞的酶促水解。
[0396] 在某些非限制性实施例中,用至少一个能够将微生物(例如,细菌)蛋白质水解成游离氨基酸和/或短肽的酶促水解微生物。在某些实施例中,酶促水解包括用纯化的酶进行水解。在某些实施例中,酶促水解包括用酶与其中制备酶的培养基的混合物进行水解。在某些实施例中,酶促水解包括用植物和/或动物和/或细菌和/或古细菌和/或真菌来源的酶进行水解。在某些实施例中,酶促水解包括用一种或多种植物、动物、细菌、古细菌和/或真菌来源的酶的混合物进行水解。在某些实施例中,水解酶由本文所述的微生物菌株产生。在某些实施例中,水解酶由C1底物和/或H2和/或合成气原料产生。在示例性实施例中,可以用蛋白酶、脂肪酶和
淀粉酶中的一种或多种使细菌细胞水解。在某些实施例中,酶促水解包括一种或多种微生物、植物、真菌和/或动物来源的蛋白水解酶。在某些实施例中,所述方法包含使用碱性蛋白酶。在某些实施例中,酶促水解包括用选自以下中的一种或多种进行水解:胰酶;木瓜蛋白酶;菠萝蛋白酶;无花果蛋白酶;细菌蛋白酶;真菌蛋白酶;由芽孢杆菌属碱性蛋白酶2.4L、内生地衣芽孢杆菌和/或嘉士伯枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin carlesberg)产生的中性蛋白酶;来自伦特斯芽孢杆菌(B.lentus)的益瑞蛋白酶;来自amyloliquifacus芽孢杆菌的中性蛋白酶;来自芽孢杆菌属的复合蛋白酶;来自热溶蛋白芽孢杆菌(B.thermoproteolyticus)的嗜热菌蛋白酶;来自米曲霉菌的复合风味蛋白酶;来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的蛋白酶N;胰蛋白酶;胰凝
乳蛋白酶;角蛋白酶;胃蛋白酶;枯草杆菌蛋白酶和/或
凝乳酶。如本领域普通技术人员所熟知的,胰酶包含消化酶、蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的混合物。
[0397] 对微生物(例如,细菌)细胞进行酶促水解可以包含在任何合适的条件下将酶和细菌细胞以任何合适的量组合。通常,选择反应物的量、反应条件和反应步骤的顺序以实现理想的酶活性。在某些实施例中,酶促水解的压力、温度、pH和时间的条件是其中实现最大或适当水平的酶活性的条件。在某些实施例中,进行酶促水解包括将酶和细菌细胞以每100g微生物(例如,细菌)细胞的氮含量约0.1g到约10g酶的重量比组合。在另一个特定实施例中,使用浓度为0.05体积%-0.5体积%的酶原液进行酶促水解,用偶氮酪蛋白测定法测得的活性为约70,000单位。在各个示例性实施例中,可以采用任何合适的方法来提高微生物(例如,细菌)细胞的酶促水解效率。在某些实施例中,酶促水解包括将酶和微生物细胞组合,并通过任何合适的方法搅拌组合的酶和微生物细胞。可以在本领域技术人员已知的任何合适的装置(如具有
温度控制和搅拌的反应器)中进行酶处理。
[0398] 如上所述,可以在任何合适的条件下进行水解,然而在各个示例性实施例中,可以在2到约10的pH范围下进行水解。在某些实施例中,在pH条件处于pH 4到pH 12的范围下进行酶促水解。在其它实施例中,在5到9.5的pH范围内或介于pH 6与pH 8的之间的范围内,或在pH 7下进行水解。应当理解的是,每种类型的酶在其自身的最佳pH下水解,并且最佳pH可以根据期望的水解速率和程度而变化。在某些特定实施例中,通过添加碱(如例如氢氧化铵或氢氧化钾)使pH值在酶促水解期间保持恒定,并且在其它实施例中,通过添加酸来维持pH。在各个示例性实施例中,可以在15.5℃到55℃的温度下并且在2小时到120小时的时间内进行水解。在某些实施例中,在10℃到80℃的温度条件下进行酶促水解,并且在其它实施例中,在10到65℃或10到55℃的温度下进行酶促水解。
[0399] 在某些实施例中,进行酶促水解包括在催化剂存在的情况下使酶与微生物细胞反应。可以采用任何提高一种或多种酶的效率的催化剂,如多相催化剂、均相催化剂和/或电催化剂。在某些这种实施例中,催化剂包括铁、铜、钴、镍、硼、镁、钙和
稀土金属(如但不限于镧)中的至少一种。在某些实施例中,酶促水解包括在施加电流的同时使酶与微生物细胞反应。在某些实施例中,酶促水解包括在酶促水解微生物细胞之前和/或期间用电流处理微生物细胞。可以通过任何合适的方法并且在任何合适的条件下将电流施加到细胞上。例如,在以下文献中描述了用于施加电流的示例性方法和条件:Tokuda等人(2006)“电预处理对农业废物的水解的影响(Effects of electrical pre-treatment on the hydrolysis of agricultural Wastes)”《日本酿酒学会期刊(J.Brewing Soc.Jap.)》,101(10):769-775,所述文献通过引用整体并入本文。在各个示例性实施例中,在1分钟到60分钟的时间内以2V到120V的量施加电流。
[0400] 本文方法的各个示例性实施例可以进一步包含在酶促水解微生物(例如,细菌)细胞之前的预处理。通过使用各种预处理方法可以提高使用酶的微生物蛋白质水解的效率。据信这种预处理方法降解细胞的结构,并且因此增加通过酶进行的水解的速率和程度。通过提高蛋白质水解的效率,使用较少的酶进行水解或在比给定量的酶通常所需的时间更短的时间内进行水解是可能的。特别期望的是,使用较少的酶进行水解,因为所用酶量的减少可以显著降低生产成本。
[0401] 在某些实施例中,进行酶促水解包括在酶促水解微生物细胞之前用弱酸或弱碱处理微生物(例如,细菌)细胞。在各个示例性实施例中,通过使用酸(如但不限于
盐酸或硫酸)将培养液的pH调节至3到5的范围来进行温和的酸性预处理。在某些实施例中,可以在100℃到130℃的温度下进行0.25小时到10小时的温和酸性预处理。在各个示例性实施例中,通过使用碱(如但不限于氢氧化钠、氢氧化钾或氨)将细菌细胞的pH调节至9到12来进行温和的碱性预处理。在某些实施例中,可以在100℃到130℃的温度下进行0.25小时到10小时的温和碱性预处理。在某些实施例中,酶促水解包括在酶促水解微生物细胞之前和/或期间用超声振动处理微生物细胞。在某些实施例中,酶促水解包括在酶促水解微生物细胞之前用
超临界水和/或超临界二氧化碳处理微生物细胞。
[0402] 某些实施例包含用于通过“一锅法”合成获得水解产物或有机酶提取物的方法。在本发明的上下文中,表述“一锅”意指在不存在中间分离步骤的情况下进行所述程序。在某些实施例中,在不存在相分离的情况下,细胞培养液的物理处理在超
大气压和高温下发生,其中在进行酶促水解之前用浓碱处理细胞培养液。在某些实施例中,对细胞培养液进行一种类型的“一锅法”合成,在某些非限制性实施例中,所述“一锅法”合成包括以下步骤:(a)将浓缩的碱加入到包括细胞悬浮液的培养液中以调节其pH;(b)将步骤(a)中得到的混合物置于超大气压和高温下;(c)对步骤(b)中得到的混合物进行酶促水解,得到有机酶提取物。在某些实施例中,步骤(a)的碱处理使用选自氢氧化铵、氢氧化钾和/或氢
氧化钙中的一种或多种的合适的碱。在某些实施例中,以浓缩形式使用碱以避免过量增加反应体积,反应体积过量会增加加热、浓缩等能量成本以及设备成本。在某些实施例中,根据随后的酶促水解的期望pH范围来选择浓度。在某些非限制性实施例中,使用约28wt%的氢氧化铵,并且在其它实施例中,使用约10M的氢氧化钾。
[0403] 在某些实施例中,在对培养液进行碱性处理之后,在超大气压和/或高温下进行混合物的物理处理。在一个特定的非限制性实施例中,在升高的温度下在步骤(b)中施加102kPa-141kPa的压力。在一些特定实施例中,在物理处理中使用90℃-140℃的温度。在一些特定实施例中,在步骤(b)中在90℃-140℃的温度下施加102kPa-141kPa的压力。在本领域技术人员选择的任何合适的装置(如例如
高压釜)进行所述物理处理。
[0404] 在某些实施例中,在物理处理后进行酶处理。在某些实施例中,在物理处理之后并且在酶处理之前,加入浓缩的碱和/或酸,使得待处理的混合物具有所用酶的最佳pH值。在某些实施例中,步骤(c)的酶促水解中使用的一种或多种酶是微生物、植物、真菌或动物来源的蛋白水解酶。在特定实施例中,步骤(c)的酶促水解在40℃-70℃的温度和8-11的pH下进行2小时-48小时的时间。在某些实施例中,一锅法合成增加过程容易性和/或降低
费用和/或与相当的多罐过程相比污染更少。
[0405] 在有或没有酶的帮助下,可以通过应用酸或碱水解以及足够的热和压力条件来实现微生物(例如,细菌)细胞的水解。在某些非限制性实施例中,使微生物细胞水解包括进行酸水解。在某些这种实施例中,酸水解包括用至少一种选自硫酸、盐酸、磷酸、碳酸、硼酸、乙酸、丙酸和柠檬酸的试剂调节包括微生物细胞的组合物的pH。在各个示例性实施例中,通过将微生物细胞乳膏的pH调节至约0.5到约5的pH来进行酸水解。在某些这种实施例中,酸水解包括调节包括微生物(例如,细菌)细胞的组合物的pH,以及在约10分钟到约48小时的时间内将pH调节的组合物加热至30℃到200℃的温度。在某些这种实施例中,酸水解包括调节包括微生物(例如,细菌)细胞的组合物的pH以及在压力下加热pH调节的组合物。在某些非限制性实施例中,使微生物细胞水解包括进行碱水解。在某些这种实施例中,进行碱水解包括将包括微生物细胞的组合物的pH调节至约8到约14的pH。在某些这种实施例中,碱水解包括用至少一种选自氢氧化钾、氢氧化钠、氧化钙、氧化镁和氨的试剂调节包括微生物细胞的组合物的pH。在某些这种实施例中,碱水解包括调节包括微生物(例如,细菌)细胞的组合物的pH,以及在约10分钟到约48小时的时间内将pH调节的组合物加热至30℃到200℃的温度。在某些这种实施例中,碱水解包括调节包括微生物(例如,细菌)细胞的组合物的pH以及在压力下加热pH调节的组合物。如本文所述的这种酸或碱水解技术通常产生包含可溶物和细胞壁碎片的水解产物。
[0406] 单细胞蛋白和微生物蛋白质分离物
[0407] 本公开的某些实施例涉及具有降低的核酸含量的单细胞蛋白(SCP)和/或微生物蛋白质分离物。在一些实施例中,提供了相对不含核酸但仍提供良好营养价值和可接受的进食(即,消耗)质量的蛋白质产品。在某些实施例中,核酸含量降低至低于9wt%。在某些实施例中,降低RNA含量以满足世界卫生组织[WHO]人类食用指南。在某些实施例中,SCP的RNA含量低于2%干重;在一些实施例中,其低于1%干重。在某些实施例中,包含了产生细胞材料的核酸还原方法,所述细胞材料含有2到3克核酸/100克蛋白质,或含有更少的核酸。在某些非限制性实施例中,细胞分离物的蛋白质功效比值(PER)大于1。某些非限制性实施例中,细胞分离物的组成以重量百分比计为65%-85%蛋白质,或更高;0.5%-9%核酸;7%-15%脂质;1%-5%灰分;和5%-20%碳水化合物和/或其它不含N的非脂质有机物质。
[0408] 在某些实施例中,使细胞经受使蛋白酶失活并且阻止蛋白酶分解蛋白质,但仍允许RNase(RNA消化酶)分解核糖体RNA的温度。在某些这种实施例中,此温度至少为约64℃。在某些这种实施例中,此RNA消化的小产物通过细胞壁扩散到培养液中,并且因此从最终的SCP产物中移除。在某些这种实施例中,所述RNA移除步骤发生在与生物反应器
流体连接的RNA还原容器中。在某些这种实施例中,从生物反应器连续收获培养物。在某些这种实施例中,在降低RNA含量后,将细胞团扩散到大的移动过滤器上,通过所述过滤器,大部分液体被真空抽出。在某些这种实施例中,这留下了一层薄片高蛋白质材料,例如,核酸含量低的高蛋白质材料薄片。
[0409] 可以通过涉及使细胞破碎并移除细胞壁残余物的过程制备本文某些实施例的细胞分离物。在某些这种实施例中,在碱性培养基中进行所述细胞破碎。在某些实施例中,可以通过将细胞内的核酸水解成可以从细胞远离蛋白质扩散的大小的片段来实现核酸含量的降低。
[0410] 已知存在于许多不同微生物(包含酵母)中的核酸酶将核酸分子水解或分解成较小的片段。通过酶促方法水解核酸允许在pH和温度方面使用比化学水解方法通常所需的条件更温和的条件,其中较温和分别意味着pH接近7,并且温度接近
环境温度。在某些实施例中,温和条件消除了对耐酸或耐碱设备的需要。在某些实施例中,利用酶促过程和温和条件,与相当的水解化学方法相比,所述酶促过程和温和条件更好地保持蛋白质的营养质量。在文献中已经描述了几种核酸酶来源。本文的某些实施例利用一个或多个核酸酶使核酸聚合物水解,所述核酸聚合物是本领域普通技术人员熟知的。在某些实施例中,这种一个或多个核酸酶不含如蛋白酶等二级酶系统,所述蛋白酶可以通过氨基酸和/或小肽与水解核酸的共扩散导致蛋白质回收率降低。在某些实施例中,核酸酶制剂不会对源自核酸还原过程的产物产生不期望的风味。在某些实施例中,使用的核酸酶制剂是可商购的。在某些实施例中,核酸酶是食品级的。在某些实施例中,使用来自酵母的核酸酶将核酸分子分解成小片段。在某些实施例中,利用内源和/或外源核酸酶将核酸分子分解成小片段。
[0411] 在一些实施例中,提供了一种用于制备蛋白质分离物的方法,其中使用内源核酸酶使核酸水解,使得核酸片段可以通过例如蛋白质的沉淀与蛋白质分离。本领域还已知,可以通过多步骤加热过程完成细胞
内核酸的水解以活化自含和/或内源核酸酶,从而将不可溶核酸聚合物转化为可溶核酸。在某些实施例中,使用多步骤加热过程活化自含和/或内源核酸酶以将不可溶核酸聚合物转化为可溶核酸。在某些实施例中,细胞裂解物以这样的方式孵育:可溶部分中含有的内源核酸酶将细胞中存在的核酸降解为可溶形式。
[0412] 也可以通过将细胞暴露于外部核酸酶而将核酸水解。在某些实施例中,细胞和/或细胞裂解物暴露于外部(外源)核酸酶。
[0413] 已知核酸酶可以在高于某一pH下被提取到可溶部分中。在某些实施例中,核酸酶在大于4的pH下是可溶的。在某些实施例中,核酸酶在大于5.5的pH下是可溶的。在某些实施例中,优化用于核酸酶提取的pH以便在足够的可溶核酸酶产率下使碱添加和/或盐含量最小化。在某些实施例中,在核酸酶可溶但无活性的pH下提取核酸酶,并且将所述核酸酶保持处于无活性状态直至其需要活性,此时降低pH以恢复核酸酶活性。
[0414] 在某些实施例中,改善和/或改造细胞菌株以增加核酸酶活性。在某些实施例中,通过基因和/或环境操作增加细胞的核酸酶含量。在某些实施例中,菌株需要超出内源核酸酶的额外核酸酶以充分还原RNA。在某些实施例中,所述外源核酸酶由外部来源提供和/或通过选择性开发用于增加内部核酸酶的菌株提供。
[0415] 已知核酸酶通常具有用于获得最大的聚集活性(即,每个活性酶的转化率乘以活性酶的数量)的最佳pH和温度。反应速率随温度升高而增加;然而,失活的酶的部分通常也随着温度的升高而增加。这两种抵消作用通常导致酶在一定温度范围内表现出最大活性。在某些实施例中,遵循本领域技术人员已知的标准实验方法鉴定和使用所述最佳值。
[0416] 在某些实施例中,优化了用于通过核酸酶进行RNA分解的孵育时间。
[0417] 已知核酸聚合物和蛋白质可以在低于某一pH下共沉淀,从而产生核蛋白混合物。在某些实施例中,裂解物暴露于其中的pH保持处于所述pH以上,以避免形成核蛋白混合物。
[0418] Chargaff在《核酸(The Nucleic Acids)》第I卷中指出核糖核酸(RNA)可以通过1N HCl在100℃下作用1小时或通过0.1N NaOH在100℃下作用而水解。在某些实施例中,将酸性或碱性条件应用于由细胞破碎释放的微生物细胞质成分导致核酸的水解。在某些实施例中,HCl或NaOH用于RNA的水解。在某些非限制性实施例中,使用约1N HCl或约0.1N NaOH在约100℃下将RNA水解约1小时。
[0419] 在某些实施例中,在核酸聚合物水解后,获得两个部分:一个部分包括含有降低的核酸含量的固体;并且另一个部分是含有溶解的核酸片段和其它可扩散材料的周围培养基。在某些实施例中,使蛋白质不溶,以便将其与水解和溶解的核酸分离。在某些实施例中,将不可溶蛋白质部分与含有可溶核酸的部分分离。在某些实施例中,将反应条件(包含但不限于pH、时间、温度和/或浓度)优化成回收具有低核酸含量和可接受的蛋白质产率的蛋白质产物,和/或优化成使可接受的核酸含量下的蛋白质产率最大化。某些实施例还包括制备低核酸含量且不含细胞壁碎片的蛋白质的方法。在某些这种实施例中,使用核酸酶溶解核酸,所述核酸酶包含但不限于内源核酸酶。图22中提供的附图是此特定方面的过程的实施例的框图。
[0420] 蛋白质水解产物及其用途
[0421] 水解产物已经作为细胞培养的补充剂被用于生物技术工业[M.S.Ummadi和M.Curic-Bawden(2010)“工业发酵剂培养物发酵中的蛋白质水解产物的用途(Use of protein hydrolysates in industrial starter culture fermentations)”《生物技术中的蛋白质水解产物(Protein Hydrolysates in Biotechnology)》,编辑:V.K.Pasupuleti和A.L.Demain施普林格荷兰出版公司,第91-114页(http://dx.doi.org/10.1007/978-1-
4020-6674-0_6)]。本公开的某些实施例涉及如本文所述产生的微生物水解产物,其用作其它工业发酵和生物过程中的原料或营养源。在某些实施例中,如本文所述产生的水解产物用作细胞培养物中的补充剂。
[0422] 蛋白质水解物已经在运动医学中得到特殊应用,因为所述水解产物的消耗使得氨基酸比完整蛋白质更快地被身体吸收,从而最大限度地向肌肉组织输送营养[Manninen,Anssi H.(2004)“运动和锻炼中的蛋白质水解产物:简要回顾”《运动科学与医学杂志》3:60-63]。本公开的某些实施例涉及微生物蛋白质分离物和/或水解产物和/或提取物,其应用于运动医学中,并且具体地说,在某些非限制性实施例中,所述分离物和/或水解产物和/或提取物的消耗允许氨基酸比完整蛋白质更快地被身体吸收,从而最大限度地向肌肉组织输送营养。在某些实施例中,水解产物和/或分离物和/或提取物富含抗氧化剂和/或L-天冬氨酸和/或锰和/或硒。某些实施例涉及在
宠物食品中使用微生物蛋白质分离物和/或水解产物和/或提取物,所述宠物食品包含但不限于如狗或马等哺乳动物的食品。
[0423] 可以通过任何常规技术(如例如,直接施用于土壤或通过叶子或通过灌溉施肥)进行将本文所述的有机酶提取物和/或水解产物施用于农作物的方法。在某些实施例中,施用根据本文所述方法产生的水解产物生物刺激素导致接受所述生物刺激素的植物的一级和/或二级代谢的改变。在某些实施例中,施用根据本文所述方法产生的水解产物生物刺激素刺激抗氧化剂化合物的产生和积累,所述抗氧化剂化合物如但不限于接受所述生物刺激素的植物中的类胡萝卜素、多酚和/或类黄酮。除氨基酸和肽之外,根据本文所述的某些实施例制备的水解产物含有可有助于生物刺激素作用的其它化合物,所述其它化合物包含脂肪、脂质、维生素、碳水化合物、酚类、矿物元素、植物激素、多胺和其它有机化合物。
[0424] 此外,可替代地,本文所述的水解产物可以经历进一步的浓缩和/或分离步骤以稳定化。在某些实施例中,本文所述的方法包括水解后的另外的步骤,其中将水解产物进行浓缩以获得浓缩的水解产物。在某些实施例中,浓缩的水解产物具有至少40wt%的干物质,在其它实施例中具有至少50wt%的干物质,并且在其它实施例中具有50-55wt%的干物质或更高。可以通过本领域已知的任何常规方法实现此浓度,例如通过加热和使用具有恒温浴或反渗透的
旋转蒸发器,或任何其它合适的装置。
[0425] 在另一个特定实施例中,所述方法包括蛋白质水解后的另外的步骤,其中将水解后获得的蛋白质水解产物进行分离以获得:(i)可溶水解产物部分,和(ii)固相的不可溶水解产物部分。可以通过本领域已知的任何常规固液分离方法完成这种分离,例如通过使用滗析器或其它合适的工业设备进行的过滤或离心。在本文所述方法的各个实施例中,配制水解产物包含收集水解产物的液体和固体部分。在某些实施例中,水解产物可以作为生物刺激素和/或肥料按原样施用。例如,配制水解产物可以包含简单地收集水解产物的所有部分并且将水解产物的组合的液体或固体部分作为植物生物刺激素和/或肥料施用于作物。在其它实施例中,配制水解产物包括分离水解产物的液体和固体部分并且保留液体部分和/或固体部分作为植物生物刺激素和/或肥料。在其它实施例中,可以将水解产物分别分离成可溶部分和不可溶部分,以供用于叶面和土壤施用。在某些实施例中,可溶水解产物部分实际上含有所有水解的起始蛋白质,并且在某些实施例中超过90wt%。在某些实施例中,在水分或蒸汽处理存在的情况下通过加热作用降低不可溶部分。
[0426] 在某些实施例中,鉴于可溶水解产物部分具有氨基酸、寡肽和低分子量的肽的特殊组合物,可溶水解产物部分提供适合于农业和家畜目的的组合物,并且更具体地说,作为有机农业中的生物刺激素和/或生物肥料。
[0427] 在某些实施例中,水解产物还可以用作动物饲料的高附加值的营养添加剂,更具体地说,用于牲畜(牛、绵羊、山羊等)、或水产养殖、或昆虫(例如,蜜蜂)或无脊椎动物(例如,蠕虫)、或异养微生物(例如,酵母;大肠杆菌)的动物饲料、或用于家畜或宠物或直接供人食用。
[0428] 任选地,可溶水解产物部分可以经历进一步浓缩。在某些实施例中,在如上所述的液固分离步骤之后,对可溶水解产物部分进行另外的浓缩步骤,以获得浓缩的可溶水解产物部分。在某些实施例中,浓缩的可溶水解产物部分具有至少40wt%的干物质,并且在其它实施例中具有至少50wt%的干物质、或50-55wt%的干物质或更高。可以通过本领域已知的任何常规方法执行此浓度,例如通过使用具有恒温浴或反渗透的旋转蒸发器或任何其它合适的装置的加热和真空。某些实施例的浓缩的可溶水解产物具有使其适合于农业和家畜目的的组合物;具体地说,在某些实施例中,鉴于浓缩的可溶水解产物具有氨基酸、寡肽和低分子量的肽的特殊组合物,浓缩的可溶水解产物可以用作有机农业中的生物激活素和/或生物肥料,所述组合物能够使植物和/或土壤生物吸收这些分子。在某些实施例中,本文所述的蛋白质水解产物或有机提取物刺激期望的天然存在的土壤微生物,如N2固定性、P溶解性和吲哚乙酸产生性细菌。在某些实施例中,根据本文所述方法产生的氨基酸对植物微量营养素具有螯合作用。在某些实施例中,浓缩的可溶水解产物可以用作真菌(例如,蘑菇)的营养素或补充剂。在某些实施例中,浓缩的可溶水解产物可以用作动物饲料的营养添加剂,更具体地说,用于牲畜(牛、绵羊、山羊等)、或水产养殖(有鳍鱼类、贝类)、或昆虫(例如,蜜蜂)或无脊椎动物(例如,红虫)的动物饲料、或用于异养微生物(例如,酵母;大肠杆菌)、或用于家畜或宠物或用于直接人类营养。
[0429] 植物生物刺激素和肥料
[0430] 如上所述获得的水解产物的固体部分可以以固体形式或在重新溶解在合适的溶剂(如水性培养基)中之后作为植物生物刺激素和/或肥料施用于作物。在某些实施例中,水解产物的不可溶部分可以经历最终干燥过程以获得糊状或粉末形式的固体,其水分含量为10-15wt%或更低。可以通过任何常规方法进行这种干燥过程,如例如通过使用热空气循环烘箱,或通
过冷冻干燥。干燥或未干燥的不可溶水解产物可以用作动物饲料的具有高附加值的营养添加剂,更具体地说,用于牲畜(牛、绵羊、山羊等)、或水产养殖(有鳍鱼类、贝类)、或昆虫(例如,蜜蜂)或无脊椎动物(例如,红虫)的动物饲料、或用于异养微生物(例如,酵母;大肠杆菌)的动物饲料、或用于家畜或宠物或直接供人食用。
[0431] 在某些非限制性实施例中,水解产物的固体部分是颗粒状的,其中将固体部分
造粒包括使用选自饲料造粒机、针式混合器、圆盘造粒机、鼓式造粒机和
压实造粒机的设备。在某些实施例中,将固体部分造粒包括获得大小为约0.25mm到约5mm的颗粒。在某些实施例中,将固体部分分散或溶解在水性培养基中。
[0432] 粒状产品可以原样施用于作物,或者可以通过添加溶剂重构为液体,然后施用于作物。在某些实施例中,配制水解产物包含仅收集水解产物的液体和固体部分中的一个。例如,配制水解产物可以包含将水解产物分离成固体和液体部分并且仅保留这些部分中的一个。在这种情况下,液体或固体部分可以作为植物生物刺激素和/或肥料施用于作物。配制水解产物还可以包含收集水解产物的固体部分和液体部分中一个部分的全部,并且仅收集另一部分的一部分。可替代地,配制水解产物可以包含仅收集固体部分和液体部分中每一个部分的一部分。
[0433] 以本文所述方式产生的植物生物刺激素可以归类为含氨基酸的植物生物刺激素和/或肥料。应当理解的是,有机肥料或粪肥传统上包含所有植物和动物材料,并且所述植物和动物材料的肥料价值(忽略生物刺激素或生物肥料方面)主要取决于其各自的碳(C)、氮(N)、磷(P)和钾(K)含量。常见的有机肥包含鱼粉、
家禽、牛和猪粪、棉籽粕、稻草和其它农业废物。在本文的某些实施例中,得到一种新型非植物非动物有机肥料。在某些实施例中,有机肥料另外是生物刺激素和/或生物肥料。在某些实施例中,在本文所述的微生物过程中产生的营养素用于施肥实施混养的池塘。在某些实施例中,营养素用于施肥植物作物,所述植物作物包含但不限于水稻。
[0434] 在某些实施例中,将如本文所述获得的水解产物配制为用于叶面施用的液体产品和/或用与土壤施用的干燥产品。在某些非限制性实施例中,配制水解产物包括在不螯合水解产物和/或不从水解产物中分离氨基酸的情况下进行配制。在某些非限制性实施例中,按干物质计,植物生物刺激素的总氮含量为约0.5wt%到约15wt%和/或其总固体含量为约2wt%到约100wt%。在某些实施例中,植物生物刺激素的pH为约2到约10。
[0435] 在某些实施例中,施用如本文所述产生的生物刺激素和/或生物肥料和/或水解产物的植物使用所述材料中所含的氮以产生以下中的一种或多种:蛋白质、核酸、叶绿素等。在某些实施例中,所述施用的氮源增强植物和/或真菌和/或微生物的代谢活性。
[0436] 在某些实施例中,土壤微生物使用如本文所述产生的生物刺激素和/或生物肥料和/或水解产物中所含的碳以产生细胞团和/或用于呼吸作用,和/或固定N2,和/或增强磷酸盐的溶解,和/或刺激产生吲哚乙酸的细菌。在某些实施例中,如本文所述产生的生物刺激素和/或生物肥料和/或水解产物中所含的碳被隔离在土壤中和/或增加土壤的碳含量。在从将以其它方式将排放到大气中的CO2源中捕获CO2的实施例中,或者从大气中捕获CO2的实施例中,本文所描述的方法可以被认为是一种形式的碳捕获和封存,其中碳被隔离为土壤碳。本文的某些实施例代表废碳和其它元素可持续地转化为有价值的生物质,或如裂解物、水解产物、蛋白质、肽、维生素和/或氨基酸等生物基产品。在某些实施例中,与有机碳输入转化为堆肥相比,较大部分的输入碳保留在最终的肥料或生物刺激素产品中。在某些实施例中,在转化为最终肥料或生物刺激素产品时,少于一半的输入碳由于CO2排放而损失。
在某些实施例中,在转化为最终肥料或生物刺激素产品时,少于10%的输入碳由于CO2排放而损失。
[0437] 在某些实施例中,本文的方法包含将另外的组分混合到获得的植物生物刺激素和/或肥料中。可以在水解期间和/或在配制期间和/或在配制之后添加这些另外的组分。在某些实施例中,向植物生物刺激素中加入至少一种
防腐剂,所述防腐剂包括选自柠檬酸、
苯甲酸、丙二醇、丙酸、山梨酸、硫酸锌、硫酸铁、硫酸铜和氯化
银中的至少一种成分。某些实施例包括向植物生物刺激素中加入至少一种肥料和/或植物主要养分,其中肥料或植物主要养分包括选自氮、钾、磷、铁、铜、锌、硼、锰、钙、钼和镁中的至少一种元素。某些实施例包括向植物生物刺激素中加入至少一种选自除草剂、杀虫剂和杀真菌剂的组合物,其中至少一种组合物选自甲基托布津、百菌清、克菌丹、哌嗪、氯苯嘧啶醇、甲霜灵、三氟甲磺酸、乙氧基噻二唑、解热剂、杀藻剂、氨磺乐灵、aldxylarypolyethoxyethanol、草甘膦和樟脑丸。某些其它实施例包括不向配制品中添加除草剂、杀虫剂、杀真菌剂或合成肥料,使得配制品被认为是有机肥和/或有机生物刺激素并且施用有机肥料和/或生物刺激素的作物被相关监管机构认为是有机种植的。
[0438] 在一些实施例中,提供了用于将本文所述的植物生物刺激素施用于作物的方法。可以施用植物生物刺激素和/或肥料的作物不受特别限制;然而,示例性作物可以包含粮食作物和观赏作物。示例性粮食作物可以包含水果、蔬菜、块茎和谷物。示例性观赏作物可以包含草坪草、树木、灌木和花。某些实施例代表用于处理作物的过程,所述过程包括将如本文所述产生的植物生物刺激素施用于作物。某些非限制性实施例包括以每1,000平方英尺约0.001lbs到约3.0lbs氮气的量施用如本文所述产生的植物生物刺激素的过程。在某些实施例中,将如本文所述产生的植物生物刺激素和/或肥料施用于作物。在某些实施例中,将植物生物刺激素和/或肥料施用于作物包括将植物生物刺激素和/或肥料和至少一种选自除草剂、杀虫剂和杀真菌剂的组合物施用于作物。在其它实施例中,将植物生物刺激素和/或肥料施用于作物包括施用植物生物刺激素和/或肥料,而不向作物施用任何合成除草剂、杀虫剂和杀真菌剂。在某些这种实施例中,在根据相关监管机构的要求种植符合有机食品资格的作物的背景下将植物生物刺激素和/或肥料施用于作物。
[0439] 在一些实施例中,提供了一种制备农产品和/或消费品和/或工业产品的过程,所述过程包括:通过本文所述的方法制备植物生物刺激素和/或肥料和/或真菌补充剂;将如本文所述产生的植物生物刺激素和/或肥料和/或真菌补充剂施用于作物;以及收获作物以获得农产品;并且在某些情况下,进一步加工农产品以获得消费者或工业产品。在某些这种实施例中,作物是食物作物。在某些这种实施例中,食物作物包括选自水果、蔬菜、块茎和谷物中的至少一种成分。农产品的实例包含但不限于:蔬菜,如西兰花、花椰菜、朝鲜蓟、豌豆、豆类、羽衣甘蓝、芥蓝菜、菠菜、芝麻菜、甜菜叶、白菜、莙荙菜、菜心、芜菁叶、菊苣、生菜、芥末、青菜、豆瓣菜、蒜韭菜、盖兰、韭菜、布鲁塞尔豆芽、刺山柑、大头菜、芹菜、大黄、刺菜蓟、香芹、柠檬草、芦笋、竹笋、高良姜、姜、大豆、绿豆、黑豆(urad)、胡萝卜、防风草、甜菜、水萝卜、芜菁甘蓝、红萝卜、牛蒡、洋葱、青葱、大葱、大蒜、青豆、扁豆和
雪豆;水果,如西红柿、黄瓜、面瓜、西葫芦、南瓜、甜瓜、小辣椒、茄子、粘果酸浆、佛手瓜、秋葵、面包果、鳄梨、黑醋栗、红醋栗、醋栗、番石榴、蛋黄果、红辣椒、石榴、猕猴桃、葡萄、蔓越莓、
蓝莓、橙子、柠檬、酸橙、葡萄柚、黑莓、覆盆子、波森莓、菠萝、无花果、桑椹、山楂果、苹果、玫瑰果和草莓;坚果,如杏仁、山核桃、核桃、巴西坚果,石栗、腰果、智利坚果、马栗子、澳洲坚果、马拉巴栗、芒刚果、花生、松子和开心果;块茎,如土豆、红薯、木薯、山药和大丽花;以及谷物或谷粒,如玉米、大米、小麦、大麦、
高粱、小米、燕麦、黑麦、黑小麦、福尼奥米、荞麦和藜麦。在其它实施例中,作物是观赏作物。在某些这种实施例中,观赏作物包括选自草坪草、树木、灌木和花中的至少一种成分。在其它实施例中,作物是蘑菇或真菌。观赏作物的实例包含但不限于:双孢蘑菇(草菇、小褐菇和大褐菇)、鳞片墨水帽、紫丁香蘑和平菇(蚝菇)。在某些实施例中,将如本文所述的蛋白质水解产物施用于蘑菇或真菌。在某些实施例中,将如本文所述的全细胞生物质(即,未裂解的细胞)饲喂给具有裂解和消耗细菌能力的蘑菇或真菌。在某些这种实施例中,裂解和消耗如本文所述产生的细菌细胞的蘑菇包含以下中的一种或多种:双孢蘑菇、鳞片墨水帽、紫丁香蘑和平菇。
[0440] 已知在收获蘑菇之前暴露于紫外线可以产生超过FDA每日值的两倍的维生素D2含量——即,维生素D的纯素饮食来源。在某些实施例中,如本文所述产生的蘑菇暴露于紫外线,导致产生高维生素D2含量。
[0441] 在某些实施例中,提供了增加产品、作物或其它植物的产率的方法。在某些实施例中,在接受如本文所述产生的生物刺激素或肥料的植物的生长季中,产品、作物或其它植物的产率与在相同条件下生长但不使用生物刺激素的相同类型的植物相比增加至少5%、或至少10%或至少40%。在某些实施例中,在生长季中,使用如本文所述产生的肥料和/或生物刺激素使作物产率增加至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、或55%或大于55%。
[0442] 本文的某些实施例能够减少或消除使用常规化学氮肥,如但不限于硝酸脲肥料、硝酸铵肥料、硝酸钙铵肥料和/或其它硝酸盐肥料或铵肥料。在某些非限制性实施例中,可以通过施用如本文所述产生的肥料和/或生物刺激素来减少或消除这种常规化学氮肥的使用,同时保持产品、作物或其它植物的相同产率。在某些实施例中,施用如本文所述的肥料和/或生物刺激素可能伴随着常规化学氮肥减少至少约5%、10%、20%、30%、40%或50%。在某些这种实施例中,常规化学氮肥的减少可能超过50%或高达100%(即,完全消除)。
[0443] 在某些实施例中,本文所述的组合物可以使土壤有机物质增加一倍以上。在另一个实施例中,本文所述的组合物可以使土壤有机质增加高达约140%或约150%或更多。在其它实施例中,取决于土壤有机质的初始水平,所述组合物可以使土壤有机质增加约40%到约150%。
[0444] 食物产品
[0445] 消费品的实例包含但不限于加工食品,如薯片、玉米片、果酱、果冻、早餐谷物、面包、饼干、蛋糕、薄脆饼干、面粉、蛋白质粉末、蛋白质棒、运动和/或能量饮料、蛋白质奶昔和/或冰沙、动物饲料、宠物食品等。将如本文所述的农产品加工成这种消费品的能力完全在本领域技术人员的能力范围内。
[0446] 在一些实施例中,提供了用于制备营养产品和/或食品配料和/或食品的方法。在某些实施例中,高蛋白和/或高维生素配料源自本文所述的微生物细胞。在某些实施例中,产品不含动物蛋白质或脂肪。在某些实施例中,将高蛋白质和/或高维生素配料掺入食品中,所述食品包含但不限于乳制品、乳制品替代品、肉制品、肉类替代品和/或仿制肉制品、
烘焙产品、糖果、健康棒和蛋白质棒、蛋白质粉末、运动和/或能量饮料、和/或蛋白质奶昔和/或冰沙。在某些实施例中,将高蛋白质和/或高维生素配料纹理化以便掺入肉制品和/或仿制肉制品中。在某些实施例中,高蛋白质配料可以用作牛肉饼中的肉类增量剂。
[0447] 在某些实施例中,如本文所述的微生物细胞和/或有机物质用于产生素食或纯素食品。在某些实施例中,所述微生物细胞和/或有机物质用于产生有机食品和/或无
农药和/或无除草剂和/或无杀真菌剂和/或无抗生素和/或非转基因(非GMO)食品。在某些实施例中,所述微生物细胞和/或有机物质用于本地生产的食品中。在某些实施例中,所述微生物细胞和/或有机物质用于益生菌食品或益生元食品或营养产品中。
[0448] 在某些非限制性实施例中,不进行蛋白质水解。在这些非限制性实施例中,巴氏杀菌、相对完整的蛋白质和/或防腐剂添加的组合提供了蘑菇生长产品,当作为蘑菇生长强化剂施用时,所述蘑菇生长产品表现出延迟的营养物释放特性和/或阻碍竞争性微生物的特性和/或防止蘑菇基质中不期望的温度升高的特性。
[0449] 本发明的应用不限于说明书中阐述的或附图中示出的构造细节和部件布置。本发明能够具有其它实施例并且能够以不同的方式实践或实施。而且,本文所使用的措辞和术语是出于说明的目的并且不应当被视为是限制性的。本文中对“包含”、“包括”或“具有”、“含有”、“涉及”及其变化的使用意在涵盖其后列出的项及其等同物以及另外的项。
[0450] 通过以下实例进一步说明了本发明,但是这些实例决不应被解释为进一步的限制。本申请中引用的所有参考文献(包含文献参考、授权专利、公布的专利申请和共同未决的专利申请)的全部内容通过引用的方式明确并入本文,特别是用于上文引用的教导。然而,对任何参考文献的引用并非旨在承认所述参考文献是现有技术。
[0451] 在以下实例的描述过程中,本发明的其它特征将变得显而易见。以下实例旨在说明而非限制本发明。
[0452] 实例
[0453] 实例1
[0454] 在作为用于生长的唯一的能源和碳源的H2和CO2和O2气体的混合物上生长杀虫贪铜菌菌株DSM 531。
[0455] 遵循以下针对使用气密血清瓶中的气体混合物进行实验的方案。
[0456] 实验接种物:5体积%,取自另一个H2生长的血清瓶培养物。
[0457] 进而,从溶菌培养液(LB)生长的杀虫贪铜菌接种物中对初始H2生长的血清瓶培养物进行5%接种,并且在从原始LB生长的培养物中接种后将所述初始H2生长的血清瓶培养物在H2/CO2/O2气体混合物上生长约72小时。从储存在-80℃下的甘油原料中回收原始LB生长的接种物。
[0458] 在160-ml带塞且密封的Wheaton玻璃血清瓶(VWR产品号16171-385)中进行气体上的血清瓶生长。液体培养基的体积为20ml。使用Wheaton手动压接器(VWR#80078-996)、用
橡胶塞(VWR#100483-774)和铝密封(VWR#89047-008)塞住瓶子。20ml工作体积包含19ml基础盐培养基(MSM)(如以下文献中所描述的:《嗜热细菌》,CRC出版社,布卡拉顿,佛罗里达州,编辑:Jacob K.Kristjansson,1992,第87页,表4)+1ml接种物(即,5%接种物)。
[0459] 将MSM分配在瓶中,并且如下添加气态化合物:在无菌条件下将无菌MSM转移到瓶中。在无菌条件下将5%气体培养的接种物接种到瓶中,并且用橡胶塞塞住瓶子并密封。通过
歧管在15psig下将气体混合物加入瓶中。在加入气体混合物后,将
密封件用铝卷曲以密封血清瓶。然后将瓶子置于振荡孵育箱中。
[0460] 从在30℃下以250RPM孵育的16个血清瓶(14个实验复制,2个对照)中获得以下实验结果。使用如上所述的歧管,用67%H2、24%空气(4.8%O2)、9%CO2气体混合物同时吹扫所有16个血清瓶。在连接血清瓶之前,使用气相色谱(GC)确认流过歧管的气体组成。在7个时间点处牺牲瓶子用于分析。在T0和最后一个时间点分别牺牲两个阴性对照。阴性对照瓶的制备方法与实验瓶相同,但不含接种物,并且使用阴性对照瓶检测来自瓶顶部空间的任何污染和/或非生物损失或气体
泄漏。在阴性对照上采集气体顶空压力读数样品以观察任何非生物CO2和H2吸附到液体培养基中和/或由于泄漏导致的气体损失。
[0461] 取样和分析程序
[0462] 使用
注射器和针头在无菌条件下采集所有样品以进行瓶子实验。使用贝克曼库尔特(Beckman Coulter)DU720 UV/Vis分光光度计在650nm处使用100微升样品测量光密度(OD)。
[0463] 在每个时间点牺牲一到三个实验复制瓶以进行分析。使用连接到针头的压力计测量血清瓶内的气体消耗。测量每个牺牲瓶的顶空气体压力,并且通过气密注射器取出顶空气体样品以进行气相色谱(GC)分析。通过GC分析气体顶空样品使用通过气密注射器注入GC的100-uL顶空气体样品。在每个时间点量化血清瓶中的H2、CO2、O2和N2的气体顶空含量。为了对培养液进行取样,用EtOH擦拭血清瓶的隔膜,并且使用瓶压将瓶子的全部液体内容物取出到30mL注射器中。移取100μL样品以用于650nm处的OD测量。在4℃下将样品以12,000G离心15分钟。将颗粒重悬于10mL无菌PBS中,使其涡旋,并且通过预先称重的0.45μm过滤器对其进行真空过滤。将过滤器干燥并称重过滤器+生物质保留物以测定生物质干重。通过在60℃下干燥24小时并在干燥器中冷却至室温并称重,测定在
膜过滤器(0.45μm)上收集的细胞的干重。继续这种干燥和重新称重的循环,直到重量保持恒定。在OD与生物质密度(每单位体积的干细胞重量)之间建立了相关性。
[0464] 图1示出了OD与生物质密度之间的相关性。图2示出了此实验的生长曲线。对于各个实验复制测量的OD由菱形符号表示,并且平均OD由实线表示。对数生长发生在9到30小时之间。图3示出了由于生长培养物消耗气体导致的顶空气体压力随时间的变化。
[0465] 假设顶空气体的
理想气体定律(PV=nRT),在考虑样品点的温度变化的情况下计算气体的总摩尔数。通过GC测定每个瓶子顶部空间中各自气体的比例。使用气体顶空结果和测得的干重确定细胞重量与消耗的H2摩尔数的比例。图4示出了通过每个相应瓶子的顶空压力测量和GC分析确定的被牺牲的每个瓶子的测得的干生物质相对于消耗的H2的摩尔数的绘图。这些结果表明,每消耗一摩尔H2则合成6.7克到7.2克干细胞质量,或每克H2合成3.3-3.6克细胞质量。
[0466] 实例2
[0467] 在作为用于生长的唯一的能源和碳源的H2、CO2和O2气体的混合物上将杀虫贪铜菌菌株DSM 531生长至38克/升干细胞密度。
[0468] 遵循以下针对在搅拌釜生物反应器中使用含有H2、CO2和O2的气体混合物进行实验的方案。
[0469] 设备:使用定制的具有PEEK顶板的500mL玻璃发酵罐分批生长培养物。用商业控制器(易克来博公司(Electrolab),Fermac 360,英国)控制和监测温度和pH。使用磁力搅拌棒与280mL/min下的连续循环的组合进行混合。再循环可以从反应器的底部液体部分取出并通
过喷雾器返回顶部空间以控制泡沫,或反向运行以将顶部空间气体和泡沫再循环到发酵液的底部。气体供应来自压缩的H2、压缩的CO2和室内空气,每个气体都调节到20psi。将H2和空气递送到流量配比器(Matheson G2-4D151-E401/E401,20psi),所述流量配比器设定气体的相对分数。然后通过可变面积流量计将H2/空气混合物递送到每个发酵罐;可以通过流量计的针阀调节相同H2/空气组合物的每个发酵罐的流速。将CO2气体分流并递送到每个发酵罐的各个可变面积流量计。将CO2和H2/空气管线引入递送到发酵罐的单一管线中。使用压力计监测发酵罐的气体递送压力。通过四个2微米扩散石(p/n KEG592,http://morebeer.com/products/diffusion-stone-2-micron-oxygen.html)将气体混合到发酵液中,并且通过冷凝器将所述气体从反应器排到一个泡沫溢流瓶,然后到排气系统。
[0470] 培养基:实例1描述了用于此实验的培养基。用2N NH4OH或2N NaOH进行pH控制。由5M NH4OH、Fluke 318612(保持处于4℃)(120mL)和高压灭菌的milliQ-H2O(180mL)制备2N NH4OH。
[0471] 自养制备的接种物:从H2/CO2/O2生长的血清瓶培养物中取出杀虫贪铜菌DSM 531接种物。进而由储存在-80℃下用于DSMZ 531菌株的保存的0.5mL甘油原液制备血清瓶的接种物。根据实例1中描述的血清瓶方案,在H2/CO2/O2气体混合物上开始复苏培养,在气密血清瓶中将0.5mL甘油原液加入20mL基础盐培养基(MSM)中。然后将初始血清瓶(1mL到20mL新鲜MSM)传代培养到标准H2/CO2/O2气体顶空下的2个血清瓶中。在30℃下以250RPM孵育这些血清瓶。甘油原液在天然气中的初始复苏需要2天,并且传代培养物需要另外一天才能生长。提供两个血清瓶培养物作为生物反应器的接种物。获取接种物的光密度(OD)和用于DNA分析的样品。气体生长的接种物的OD为约1。接种发酵罐以得到约0.1的初始OD。换句话说,血清瓶培养液在生物反应器中以1:10的比率稀释。使用60mL注射器将接种物从血清瓶转移至生物反应器。接种后,得到T0 OD。通常,所有OD测量均使用贝克曼库尔特DU720 UV/Vis分光光度计进行。
[0472] 发酵罐操作:
[0473] 碱添加——用2N NH4OH控制pH
[0474] 泡沫控制——如果泡沫填充超过1/2顶空并且不受顶空
喷涂或再循环控制,则然后使用消沫剂。(A8011,Sigma Antifoam C Emulsion,http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8011?lang=en®ion=US)
[0475] 营养素修正——除了通过碱添加NH4OH提供的氮营养素之外,在运行期间添加其它矿物质营养素以延长生长并防止发生任何矿物质营养限制。
[0476] 图5给出了根据此方案在H2/CO2/O2气体底物上生长的氢氧混合气微生物杀虫贪铜菌的生长曲线的实例。Y轴单位是在650nm处测量的光密度(OD),并且x轴是以天测量的时间。在650nm处测量的最终OD为132,并且来自H2/CO2/O2气体底物上的生长的最终干生物质密度为38克/升。对数生长持续了一天半,但是在第五天运行结束时生物质仍然以线性速率积累。
[0477] 实例3
[0478] 接种和生长条件
[0479] 测试来自红球菌属和贪铜菌属的生物在不同碳源上生长的能力(图6)。将来自在30℃下在LB琼脂平板上生长的菌株的菌落转移到含有10%(v/v)指定培养基(即,异养或化能自养)的烧瓶中,在30℃和250rpm下培养3-20天。混浊红球菌菌株DSM 44193仅在异养生长条件下表现出生长,如通过补充有40g/L葡萄糖的MSM培养基(1L培养基A:9g
Na2HPO4.12H2O、1.5g H2PO4、1.0g NH4Cl和0.2g MgSO4.7H2O/1L;10ml培养基B:50mg柠檬酸铁铵和100mg CaCl2/100ml;10ml培养基C:5g NaHCO3/100ml;以及1ml微量矿物质溶液:100mg ZnSO4.7H2O、30mg MnCl2.4H2O、300mg H3BO3、200mg CoCl2.6H2O、10mg CuCl2.2H2O、20mg NiCl2.6H2O和30mg Na2MoO4.2H2O/1L)上的650nm处的光密度(OD)所测量的。混浊红球菌菌株DSM 43205在达到O.D=9.0的异养条件下显示相同的生长速率。菌株DSM 43205也能够在化能自养条件下生长(补充有66.7%H2、9.5%CO2、5%O2和18.8%N2的MSM培养基)。红球菌属(DSM 3346)在异养条件和化能自养条件下表现出生长(DSMZ培养基81:用于化能自养生长的1L矿物培养基:2.9g Na2HPO4.2H2O、2.3g KH2PO4、1.0g NH4Cl、0.5g MgSO4.7H2O、0.5g NaHCO3、0.01g CaCl2.H2O和0.05g Fe(NH4)柠檬酸盐/1L;以及5ml微量矿物质溶液,所述培养基补充有80%H2、10%CO2和10%O2)。杀虫贪铜菌(DSM 531)能够在异养和化能自养条件下生长(针对菌株DSM 43205描述的培养基)(图6)。
[0480] 实例4
[0481] 在一组实验中,将来自在30℃下在LB琼脂平板上生长的红球菌菌株的菌落转移到含有指定生长培养基和气体混合物的气密血清瓶中。(从预先储存在-80℃下的甘油原料中回收原始LB生长的接种物)。在160-ml带塞且密封的Wheaton玻璃血清瓶(VWR产品号16171-385)中进行气体上的血清瓶生长。液体培养基的体积为10ml到20ml。使用Wheaton手动压接器(VWR#80078-996)、用橡胶塞(VWR#100483-774)和铝密封(VWR#89047-008)塞住瓶子。在无菌条件下将无菌生长培养基转移到瓶中。在无菌条件下将接种物引入瓶中,并且用橡胶塞塞住瓶子并密封。将气体混合物加入瓶中。在加入气体混合物后,将密封件用铝卷曲以密封血清瓶。然后将瓶子置于振荡孵育箱中。在30℃下以250RPM孵育所述瓶子。使用注射器和针头在无菌条件下采集所有样品。通过在650nm处在分光光度计中测量光密度(OD)来评估生长。
[0482] 遵循上述程序,混浊红球菌菌株DSM 43205在化能自养条件下在以下培养基中表现出生长:MSM培养基(1L培养基A:9g Na2HPO4.12H2O、1.5g H2PO4、1.0g NH4Cl和0.2g MgSO4.7H2O/1L;10ml培养基B:50mg柠檬酸铁铵和100mg CaCl2/100ml;10ml培养基C:5g NaHCO3/100ml;以及1ml微量矿物质溶液:100mg ZnSO4.7H2O、30mg MnCl2.4H2O、300mg H3BO3、200mg CoCl2.6H2O、10mg CuCl2.2H2O、20mg NiCl2.6H2O和30mg Na2MoO4.2H2O/1L),所述培养基补充有含66.7%H2、9.5%CO2、5%O2和18.8%N2的气体混合物。液体体积为20mL并且气体顶空体积为140mL。
[0483] 红球菌属DSM 3346在化能自养条件下在以下培养基中表现出生长:DSMZ培养基81(用于化能自养生长的1L矿物培养基:2.9g Na2HPO4.2H2O、2.3g KH2PO4、1.0g NH4Cl、0.5g MgSO4.7H2O、0.5g NaHCO3、0.01g CaCl2.2H2O和0.05g Fe(NH4)柠檬酸盐/1L;以及5ml微量矿物质溶液),所述培养基补充有含80%H2、10%CO2和10%O2的气体混合物)。液体体积为10mL并且气体顶空体积为150mL。
[0484] 72小时后收获细胞,并且通过气相色谱和质谱(GC/MS)确定每种菌株产生的中性脂质(如三酰基甘油(TAG))中包含的脂肪酸的分布。
[0485] 实例5
[0486] 在另一个实验中,在1升瓶中在作为用于生长的唯一的能源和碳源的H2和CO2和O2气体的混合物上生长混浊红球菌菌株DSM 43205。从储存在-80℃下的水+MSM原液等分中回收接种物。如上所述,使用的培养基是MSM。将来自储存在-80℃下的原液的等分接种到小血清瓶中的MSM(20ml)中。在160-ml带塞且密封的Wheaton玻璃血清瓶中如上所述进行气体上的血清瓶生长,其中气体混合物由67%H2、24%空气(4.8%O2)、9%CO2组成。将瓶子置于振荡孵育箱中并且在30℃下以250RPM孵育瓶子。
[0487] 在大约72小时的生长之后,通过离心并重新悬浮在新鲜的MSM中,由气体血清瓶培养物制备高密度的传代培养物接种物。将高密度的接种物接种到带有气密盖的1L玻璃瓶中的100ml MSM中,所述玻璃瓶具有两个允许气体流入和流出的阀门。将以下比率的气体混合物提供给1L瓶的顶部空间:H2:71%;O2:4.2%;N2:15.8%;CO2:9.0%。
[0488] 加入气体后,将密封的1升瓶置于28℃和200rpm下的振荡孵育箱中。每天更新一次气体。培养物在气体上生长,直至达到650nm处的最终OD为OD=1.27。
[0489] 在1L瓶中的气体上生长后,对最终回收的细胞进行DNA测序,以确认最终培养物的菌株特性。使用27F和800R引物确定16S rRNA序列。使用两种引物,将顶部BLAST序列分别鉴定为红球菌属、混浊红球菌、wrastislaviensis红球菌,其基因库编号分别为EU127452.1、AB032565.1和AY940038.1。
[0490] 实例6
[0491] 许多氢氧物种是公开可获得的或可以使用本文所述的技术进行分离。例如,至少238种不同的红球菌菌株和至少55种不同的贪铜菌菌株可从公共DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH))菌株储库中获得,来自许多其它属的包含氢氧化微生物的菌株也是如此,所述菌株包含氢弧菌、红假单胞菌、氢杆菌、黄色杆菌和氢单胞菌。也可以通过常规方法获得氢氧菌株,如使用富集方法从土壤样品或
地热流体样品中进行分离。在要求保护的化学合成条件下测试用于氢氧生长的菌株和产生有机化合物(包含碳数为C5或更高的化合物,包含但不限于氨基酸和蛋白质)的能力是本领域常规的。例如,红球菌菌株在使用CO2作为碳源的氢氧条件下生长的能力可以如前面实例中所述进行。以下文献中描述了用于在使用CO2作为碳源的氢氧(氢氧混合气)条件下生长的其它方法:《嗜热细菌》,Jakob Kristjansson,第5章,第III节,CRC出版社,1992,第86-88页,并且已经发现所述其它方法适用于来自各种属的各种菌株。评估有机化合物(如由氢氧物种化学合成产生的化合物)的产生在本领域中也是常规的。例如,如实例5所述,可以使用气相色谱和质谱(GC/MS)。其它方法包含脂质提取、薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS),如以下文献中所描述的:
Waltermann等人(2000)“混浊红球菌菌株PD630作为高价值单细胞油的新来源?三酰基甘油和其它储存脂质的分离和表征(Rhodococcusopacus strain PD630 as a new source of high-value single-cell oil?Isolation and characterization of triacylglycerols and other storage lipids)”《微生物学(Microbiology)》146:1143-1149。
[0492] 实例7
[0493] 通过杀虫贪铜菌菌株DSM 531产生大约5千克生物质(干重),所述杀虫贪铜菌菌株在作为用于生长的唯一的能源和碳源的H2和CO2和O2气体的混合物上生长。从所述生物质中提取并分析己烷可溶性油。以下方案用于在搅拌釜生物反应器中由H2、CO2和O2原料产生物质,并且然后从生物质中提取油。
[0494] 设备:使用来自Applikon生物技术公司(Applikon)的两个20升反应器(图7和图8)分批生长杀虫贪铜菌培养物。
[0495] 生物反应器:每个生物反应器由安装在
支撑架上的玻璃容器组成,其具有带有弹性密封件的
不锈钢头板。顶板具有用于多个馈通件的端口,所有端口都具有弹性密封件以防止气体泄漏进入或离开反应器。这些馈通件允许将
热电偶套管、pH探针、溶解氧探针、进气口、液体入口、气体出口、液体取样口以及更多都安装在顶板上。
[0496] 生物反应器传感器:使用定位在热电偶套管中的温度探针监测温度并控制加热器。使用pH探针监测pH,并且如果需要的话,控制向反应器中添加更高或更低pH的缓冲溶液。使用泡沫传感器控制消沫剂的添加。使用溶解氧探针测量反应器液体中的氧气水平,并且可以控制搅拌或打开/关闭进入反应器的气流。所有传感器均由生物反应器控制器/控制台供电、控制并且向生物反应器控制器/控制台提供输入。
[0497] 搅拌:搅拌器通过具有完全密封和磁耦合的顶板。搅拌器具有外部
发动机,所述外部发动机是围绕搅拌轴的外部部分的单独件。发动机速度由外部控制器控制,所述外部控制器允许精确控制转速。
[0498] 加热/冷却:通过外部电加热毯加热反应器,所述外部电加热毯使用由Pt 100温度探针经由生物反应器系统控制器控制的闭环比例积分微分控制器(PID)。为了维持温度,还插入了冷却指状物以防止搅拌器发动机使培养基
过热。
[0499] 生物反应器安装:将生物反应器系统安装在金属三
脚架支架上。使用夹具或链条将所述三脚架连接到定位在通风橱内部的支柱安装件上,以防止反应器被撞倒。将整个三脚架和反应器装置放在浅塑料容器中以提供二次隔离。
[0500] 图7示出了生物反应器和支持系统的示意图。图8示出了定位在通风橱中的两个20L生物反应器。将生物反应器安装在通风橱内以控制氢气的释放。所有控制器和气源都定位在通风橱外,
气缸、反应器控制器、质量流量计、氢传感器和气体
控制阀也是如此。图8示出了在杀虫贪铜菌在作为唯一能源和碳源的H2、CO2和O2气体上生长期间使用的两个20升反应器。
[0501] 控制器/控制台:生物反应器系统控制器/控制台含有控制和操作生物反应器系统的组件。这些单元提供电源、温度控制、搅拌控制,接收来自传感器的输入,根据传感器输入打开和关闭进料泵(酸、碱、消沫剂和其它营养素),并且用于用
电磁阀和转子流量计打开/关闭气流。由于缺乏所有不锈钢组件,这些单元不用于控制氢气以使氢气泄漏的风险最小化。控制器/控制台单元定位在通风橱外远离生物反应器,以在泄漏的情况下使氢气暴露最小化并且使操作员直接在生物反应器周围工作的时间最小化。图9示出了用于操作反应器的Applikon控制器和控制台。图9中包含控制器、控制台、搅拌器控制器、爆炸性气体检测系统、质量流量计、液位控制器、基底控制储存器、培养基添加储存器和泡沫控制储存器。所述反应器控制器中的所有均定位在通风橱外。
[0502] 气体递送:通过穿过顶板的喷洒器装置将气体递送到生物反应器的下部。定位在反应器外部的阀使得能够在每个反应器处分别手动关闭气流。插入到反应器的气体进料管线是柔性不锈钢管线,在反应器头部安装有0.2微米过滤器以使可能的污染最小化。使用定位在通风橱外的质量流量计控制到反应器的流速。气缸与质量流量计之间的管线具有手动阀和电磁阀以供手动和自动关闭气体。所述电磁阀与爆炸性气体传感器连接,当在实验室或通风橱中检测到氢气时,所述爆炸性气体传感器会自动切断气流。
[0503] 气体储存:使用气柜储存氢气缸。气柜安装在适当
位置并且包含
通风口和洒水器。机柜包含足够的空间来储放多个气缸,以便在旧气缸和新气缸之间轻松切换。
[0504] 安全控制:使用爆炸性气体检测器确定实验室中氢的存在。多个传感器定位在实验室和通风橱周围的战略位置。这些气体检测器被配置成如果检测到氢气则关闭气体递送管线上的电磁阀,这关闭了到反应器的气流。
[0505]
蠕动泵:另外的蠕动泵定位在通风橱内。使用所述泵在批次运行开始时将新鲜培养基转移到反应器中,并且在批次运行结束
时移除培养基和生物质。
[0506] 培养基储存:使用塑料广口瓶或玻璃瓶储存新鲜培养基和在批次运行后回收的生物质。
[0507] 培养基:以下文献中描述了用于此实验的MSM培养基《:嗜热细菌》,CRC出版社,布卡拉顿,佛罗里达州,编辑:Jacob K.Kristjansson,1992,第87页,表4。
[0508] 接种物:由储存在-80℃下用于DSMZ 531菌株的保存的0.5mL甘油原液制备杀虫贪铜菌接种物。根据实例1中描述的血清瓶方案,在H2/CO2/O2气体混合物上开始复苏培养,在气密血清瓶中将0.5mL甘油原液加入20mL基础盐培养基(MSM)中。在多个容器中提供接种物,将所述容器在生物安全柜内部组合到装有无菌转移帽组合件的单个无菌培养基瓶中。得到接种物的OD和条纹。然后使用无菌转移管和蠕动泵将接种物转移到反应器中。接种反应器后,使用样品组合件取出批次的起始OD。
[0509] 培养基制备和添加:使用以下文献中提供的配方制备所以培养基:《嗜热细菌》,CRC出版社,布卡拉顿,佛罗里达州,编辑:Jacob K.Kristjansson,1992,第87页,表4,除了20升规模所需的较大数量。在20升乐基因(Nalgene)广口瓶中制备主要培养基组分(A),所述广口瓶装有无菌液体转移帽和过滤器组件。将培养基在广口瓶中高压灭菌,并使用无菌管和蠕动泵将其转移到高压灭菌后的反应器中以避免污染。在大型储存器中制备较小的培养基组分(B和D),并通过使用隔垫将溶液喷洒通过一次性无菌0.2微米过滤器直接注入反应器中进行灭菌。使用隔垫可以使污染风险最小化,因为其可以避免打开反应器。以类似于A的方式处理第四小的培养基组分(C),其中用培养基制备装有无菌转移帽的较大储存器,对所述储存器进行高压灭菌,并使用无菌管和蠕动泵转移培养基。
[0510] 生物反应器的制备和启动:在开始新接种的批次之前,制备生物反应器以进行高压灭菌。将反应器顶板安装在适当位置。连接、夹紧传输线,并且用箔覆盖末端并用高压灭菌带密封末端。将0.2微米过滤器连接到喷洒器的气体入口以对进入的气体进行灭菌。将通气管线夹紧并用箔密封。安装热电偶套管、冷凝器、泡沫液位探针、冷却盘管、取样装置、可调液体
抽取管和溶解氧探针。覆盖pH探针的端口并用箔密封。然后用干燥循环将反应器在131℃下高压灭菌60分钟。用快速燃烧、乙醇和紫外线的组合对pH探针进行灭菌。在将生物反应器高压灭菌并冷却至室温后,将pH探针插入反应器中,同时反应器和探针都在生物安全柜内。然后将反应器安装在通风橱中;即,冷却线、传输线、电子控制器、加热器、搅拌发动机等都连接在一起。尽可能快地将培养基组分A转移到反应器中以使pH探针干燥的时间最小化。开启温度控制和搅拌,并且如果需要的话,也开启
冷却水。一旦培养基的温度达到期望的温度,就通过上述方法将培养基组分B、C和D转移到反应器中。然后开始pH控制。
[0511] 接种生物反应器:如上所述进行新鲜接种。在多次运行中,通过蠕动泵移除来自前一批次的培养基和生物质,除了用于接种下一批次的残余体积,所述体积通常小于1升。当接种来自前一批次的剩余体积时,在移除大部分培养物后,在室温下将无菌培养基组分A转移到生物反应器中并开启加热。然后通过上述方法转移其余的培养基组分B、C和D。然后开启气流、搅拌,并且开始pH控制。此时,认为运行已经开始并且已经取得了起始OD。在反应器达到操作温度后,开启冷却。
[0512] 气体组成和流速:使用的气体组合物是第5节中规定的气体组合物。使用
质量流量控制器控制比率。气体流速范围为总气流的0.05VVM到0.3VVM。典型的流速在周末为0.05VVM,并且在两个反应器均在运行中并具有泡沫控制的工作周内为0.2VVM。在不使用泡沫控制的运行中,使用0.05VVM到0.075VVM的典型值来将泡沫降低至可控制的水平。
[0513] pH控制:使用氢氧化铵(2.0M)来控制生物反应器中培养基的pH。通过以下方法制备氢氧化铵溶液:在装有无菌转移帽和过滤器组合件的2升培养瓶中对1200mL MilliQ水进行高压灭菌,并在生物安全柜内加入800mL过滤灭菌的5.0M氢氧化铵。通过蠕动泵将氢氧化铵自动转移到反应器中,所述蠕动泵由生物反应器控制器使用pH探针信号控制。
[0514] 营养素添加/修正:使用的营养物修正溶液与用于初始培养基的营养物修正溶液相同,但具有不同的量。在运行期间添加矿物质营养素以延长生长并防止发生任何矿物质营养限制。使用注射器将修正溶液直接添加到反应器中并通过0.2微米过滤器进行灭菌,或通过使用蠕动泵保持与反应器连接的无菌管添加所述修正溶液。还通过移除一小部分反应器培养基和生物质定期(通常每天)手动调节总反应器体积,以维持大约15.5L的工作体积。这样做是为了补偿来自营养物修正的水添加和通过细胞呼吸产生的水生成,以维持稳定的混合动力学并防止溢出。
[0515] 取样:通过液体样品组合件从生物反应器中以规则的间隔取出小等份的培养基溶液。使用这些小等份的培养基溶液在
艾本德核酸蛋白测定仪(Eppendorf Biophotometer Plus)上进行OD600测量,并提供用于DNA分析的微量样品。将微量样品以10000rpm旋转10分钟,将其倾析,并储存在-20℃下。
[0516] 泡沫控制:在达到约15的OD之后,泡沫将开始填充顶部空间,并且如果不控制,当使用0.2VVM的气体流速时泡沫将容易地在一夜之间把2升的溢流罐填满。使用泡沫传感器确定泡沫的存在并且打开泵,所述泵将提供硅基消泡剂乳液的溶液。在批次11和12中根据需要调节气体流速和搅拌器速度,以防止过多的泡沫积聚。在0.05VVM到0.075VVM的气体流速下,生物反应器能够在不存在消泡剂的情况下运行。但是,泡沫会填满顶部空间;导致少量泡沫通过气体出口流入泡沫溢流容器。
[0517] 在批次期间,监测并记录温度、pH和OD。使用条纹板监测细胞纯度。进行使用杀虫贪铜菌的20升规模的总共9个批次。所述批次的最终光密度(OD)通常介于30和50之间。表1总结了这些20升批次的结果。
[0518] 表1.
[0519] 在3升和20升规模下针对杀虫贪铜菌的一系列批次运行的结果。
[0520]
[0521] 所述批次中的其中八个批次达到最终OD高于39,一个用较低气流运行的批次(#11)OD达到30,一个仅限于低搅拌速率的批次(#5)OD为6.7。批次#7中达到的最高OD为50。将生长的所有生物质从培养液中离心。
[0522] 生物质离心和储存:使用贝克曼库尔特Allegra X-12R离心机将从分批运行中收获的培养液离心以回收生物质。Allegra-12R的制冷温度可降至-10℃并且装有SX4750摆动转子,所述摆动转子的转速为3,750rpm且容量为3升。在一批之后,使用蠕动泵将生物质和培养基从生物反应器中转移到10升聚丙烯罐中。将生物质和培养基的罐子储存在
冰箱中直至它们被离心。将生物质在四个750-mL聚碳酸酯离心瓶之间一次分离离心3升。离心机在4℃下以3,750rpm运转30分钟。轻轻倒出上清液,并在处理前用
漂白剂灭菌。将单批次的脱水生物质合并,并储存在冰箱中的聚丙烯瓶中。
[0523] 实例8
[0524] 细胞破碎以及从杀虫贪铜菌菌株的湿生物质中提取油
[0525] 我们确定,使用细胞裂解,然后使用下述异丙醇/己烷油提取程序,可以从湿细胞材料样品中有效地提取油。使用此方法,从作为唯一碳源的CO2生长的杀虫贪铜菌生物质中回收粗己烷提取物,从中获得微生物油。
[0526] 为了估计湿生物质的水分含量,标记两个空的小瓶并记录它们的重量,并且将1克湿生物质分配到每个小瓶中并使用真空烘箱(Binder真空安全烘箱,型号VDL 115-9030-0040)在60℃下干燥12小时。为了具有统计学上显著的数字,样品一式两份运行。
[0527] 为了研究使用己烷和2-丙醇溶剂提取脂质的过程参数和操作条件,将10g(A1)和9.4g(A2)湿生物质分别混合到33.5mL和31.5mL的2-丙醇中。然后将细胞悬浮液转移到
250mL烧杯中,将烧杯保持处于冰浴上,并以分批模式超声处理20分钟。用2-丙烷对湿生物质进行超声处理以便使细胞完全破碎、使细胞裂解并且从微生物细胞中回收油。使用QSonica Q700
超声波仪。将温度探针浸入烧杯中以记录超声处理期间的温度变化。使用
超声波仪或超声波破坏细胞是一种非常常见的细胞裂解方法;超声是一种频率从20kHz到几千兆赫的循环声压波。在低压循环期间,高强度超声波在液体中产生小的真空气泡。当气泡达到不再能够吸收能量的体积时,它们在高压循环期间剧烈地塌陷并且所产生的剪切力破坏细胞外壳。如图10所示,在完全破碎细胞后,生物质的颜色从棕色变为奶油色。图10的左侧示出了超声处理前的生物质浆料,并且右侧示出了超声处理后的生物质浆料。初始生物质悬浮液是粘性的,但在超声处理后,样品的粘度降低,这可能是由于大分子剪切作用。
[0528] 在通过2-丙醇中的超声处理使细胞裂解后,将33.5mL和31.5mL己烷分别加入A1和A2中,并在60℃下孵育1小时。以100rpm搅拌混合物。在一小时的反应时间后,将样品转移到离心管中并使用台式离心机(Eppendorf离心机R)以3200g离心15分钟。将上清液(己烷、2-丙醇以及溶解的油、脂质和聚合物的混合物)转移到Rotavap烧瓶中,并使用旋转蒸发器(Rotavap R-210/215)在60℃下蒸馏。在60℃和低于200mbar的真空压力下蒸发己烷和2-丙醇。蒸发己烷和2-丙醇后,回收约4克黄色油状物。
[0529] 每批200g到250克湿生物质提取
[0530] 确认小规模提取结果后,开始进行大规模提取工作。将4kg湿的杀虫贪铜菌生物质分成20批(每批0.2kg)进行提取,并将每批转移到摇瓶中。向每个烧瓶中加入650ml异丙醇。每1.5克湿生物质使用5mL的2-丙醇溶剂。将生物质与2-丙醇充分混合以产生均匀的悬浮液。
[0531] 在产生均匀的悬浮液后,使用超声处理使细胞裂解。以连续模式运行QSonica Q700超声波仪以便完全破坏细胞。超声波仪的流通池附接到喇叭,并且管子连接到流通池的入口和出口。将流通池上的入口管通过蠕动泵并将其浸入含有生物质悬浮液的烧瓶中,同时将来自流通池的出口管置于同一烧瓶中以允许循环。为了进行完全的细胞裂解,每克湿生物质消耗1kJ到1.2kJ的能量。将温度探针浸入样品烧杯中以记录超声处理期间的温度变化。
[0532] 将由4kg输入物制成的20个部分中的每一个部分以100%振幅以分批模式超声处理30分钟,每个1分钟超声爆裂之间间隔30秒。
[0533] 在用2-丙醇超声处理后,加入每克湿生物质5mL己烷,然后使用Kuhner Shaker X将样品在60℃下孵育1小时。每批加入650ml己烷,然后在60℃下孵育60分钟。
[0534] 将样品转移到离心管中,并使用Eppendorf离心机R以3200g离心15分钟。将每批生物质分配到4×400mL的Eppendorf离心机R管中。将离心机转速设定为4000rpm,相当于18cm转子半径的3200g。
[0535] 分离细胞团块后,将有机提取物(即上清液)转移到旋转蒸发器(Rotavap)混合烧瓶中。使用Rotavap将油和聚合物与己烷和2-丙醇分离。将己烷和2-丙醇在60℃和200-100mbar下蒸发,并将油状物用溶剂干燥。通过60℃的加热浴的方式加热己烷和2-丙醇。
[0536] 对于较大规模的提取,在100-mbar的真空压力和60℃的水加热浴中达到最佳蒸馏条件;然而,在蒸发己烷和2-丙醇后,将黄色聚合物/油混合物留在混合烧瓶内。为了将油与黄色聚合物分离,重新应用己烷,并且然后通过离心分离聚合物。
[0537] 将聚合物/油/己烷混合物在10分钟内再加热至60℃,转移到离心管中并以3200rpm旋转5分钟。在再加热和离心后,将分离的油独立出来并进行分析。发现油提取物主要含有饱和和单不饱和的C16和C18脂肪酸,所述脂肪酸包含棕榈酸——
棕榈油的主要成分。从4kg湿的杀虫贪铜菌生物质(对应于约1kg干生物质)中回收80g粗己烷提取物(即己烷可溶性油)。
[0538] 根据本节中描述的方法,从由作为氢、电子和碳的唯一来源的H2和CO2产生的杀虫贪铜菌的各个样品中总共提取约230ml油。这对应于约210克油。在此总量中,从由本节中所描述的20升批次运行产生的样品中提取约160ml(140克)油,并且其余的油来自在H2/CO2底物上的其它连续和分批运行。
[0539] 发现油提取后留下的残余生物质具有高PHB和蛋白质。
[0540] 实例9
[0541] 由合成气或其组分组成的原料产生氨基酸
[0542] 使用H2/CO2/O2气体混合物和无机盐发酵培养基培养杀虫贪铜菌菌株DSM531和DSM 541。在30℃和200rpm下将培养物在血清瓶中的20ml MSM培养基(1L培养基A:9g
Na2HPO4.12H2O、1.5g H2PO4、1.0g NH4Cl和0.2g MgSO4.7H2O/1L;10ml培养基B:50mg柠檬酸铁铵和100mg CaCl2/100ml;10ml培养基C:5g NaHCO3/100ml;以及1ml微量矿物质溶液:100mg ZnSO4.7H2O、30mg MnCl2.4H2O、300mg H3BO3、200mg CoCl2.6H2O、10mg CuCl2.2H2O、20mg NiCl2.6H2O和30mg Na2MoO4.2H2O/1L)中生长96小时,所述血清瓶补充有66.7%H2、2.5%CO2、5%O2和18.8%N2。
[0543] 为了进行生长培养基中的赖氨酸检测,通过离心(10,000rpm,室温下5分钟)并进一步过滤上清液(200微升)(0.22微米)来分离1ml细胞(O.D=0.1)。如表2所示,收集上清液样品并分析含氨基化合物(如包含赖氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的氨基酸)的分泌。
[0544] 表2.由杀虫贪铜菌分泌的含氨基酸化合物
[0545]
[0546]
[0547] 赖氨酸是六碳分子,并且酪氨酸和苯丙氨酸是九碳分子。观察到与杀虫贪铜菌DSM531相比,杀虫贪铜菌菌株DSM541将更高浓度的赖氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸分泌到培养基中。在200μl无菌过滤的发酵培养基上进行分析。使用清洁和衍生化
试剂盒(例如EZ-FaaST(Phenomenex))分离和衍生化合物,然后通过液相色谱-质谱法分离和鉴定细菌菌株分泌到培养基中的化合物(表2)。在来自DSM 541的培养基中发现的赖氨酸水平比DSM 531高125倍。
[0548] 实例10
[0549] 在作为用于生长的唯一的能源和碳源的H2、CO2和O2气体的混合物上将海洋氢弧菌菌株DSM 11271生长至超过8克/升干细胞密度(图11)。遵循以下针对在搅拌釜生物反应器中使用含有H2、CO2和O2的气体混合物进行实验的方案。
[0550] 设备:使用定制的具有PEEK顶板的500mL玻璃发酵罐分批生长培养物;具有一个多孔玻璃熔块的喷射管,所述喷射管连接到用于气体递送的管道,其具有0.2μm的过滤器;用于修正递送的隔膜端口;带有无菌取样组合件的通向底部的浸管,通过管道与溢流容器连接的冷凝器,其中气体出口上有0.2μm的过滤器;用于基础递送的端口和用于基础递送的管道,其中鲁尔
接口连接到无菌注射器;接地探针;用于消泡剂递送的端口;pH/温度探针;氧化/还原探针(ORP)。使用商业控制器(易克来博公司(Electrolab),Fermac 360,英国)将温度控制在37℃,将pH控制为6.5。通过反应器底部的加热垫和用于冷却水的整体玻璃夹套来维持目标温度。使用6N NH4OH将pH维持在6.5。将反应器置于搅拌板(VWR 12365-344)上,并使用磁力搅拌棒(十字形,VWR‘spinplus’#58947-828)进行混合。将搅拌板设定为300-400RPM。进入生物反应器的气体流速为1VVM。气体供应来自压缩的H2、压缩的CO2和室内空气,每个气体都调节到20psi。将H2和CO2递送到流量配比器(Matheson G2-4D151-E401/E401,20psi),所述流量配比器设定气体的相对分数。将空气递送到可变面积流量计(Key Instruments 1G03_R5)。将来自流量配比器的H2/CO2气体混合物吹入空气中,然后通过可变面积流量计将其递送到发酵罐。使用压力计监测发酵罐的气体递送压力。入口气体流过0.2μm过滤器(Pall,p/n 4251),然后通过一个多孔派莱克斯(pyrex)玻璃熔块(40-60μm,Sigma-Aldrich CLS3953312-C)分散到发酵液中,并通过冷凝器(夹套和冷却)从反应器中排入到2L泡沫溢流瓶,然后通过另一个0.2μm过滤器(Pall,p/n4251)并最后到达排气系统。
将CO2流量设定为最小值c.l.=5(c.l.=浮子的中心线),并且设定其它气体以实现目标气体成分,根据流量计表计算,通过GC测量成分并调整和重新测量。使用c.l.H2=25,c.l.空气=45提供各自CO2/O2/H2比例为11/6.3/59的气体混合物。使用Foxy探针对进水管线和出水管线中的O2进行持续监测。取出临时气体样品以进行GC分析(在1L箔袋中,skcinc.com p/n 262-01)。
[0551] 培养基:1升基础培养基含有2.0g K2HPO4、1.0g KH2PO4、5.0g(NH4)2SO4、29.3g NaCl、0.2g MgSO4-7H20、10.0mg CaCl2、10.0mg FeSO4.7H2O、0.6mg NiSO4.7H2O和2.0ml微量元素溶液。微量元素溶液取自以下文献:《嗜热细菌》,CRC出版社,布卡拉顿,佛罗里达州,编辑:Jacob K.Kristjansson,1992,第87页,表4。
[0552] 自养接种物:在两个500ml带塞的瓶中制备10%接种气体生长的接种物,所述瓶中含有50mL液体培养基。通过浸管将体积为61.5mL的接种物(OD6000.75)注入生物反应器中至液面以下,以防止在顶空中分散。接种后,用经过滤的空气冲洗管线以移除浸管中受困的接种物。
[0553] 发酵罐操作:碱添加——用6N NH4OH控制pH;营养素修正——除了通过碱添加NH4OH提供的氮营养素之外,当培养液OD=3时加入0.2克FeSO4.7H2O,并且当培养液OD=10时加入2克MgSO4.7H2O。测量到流入的O2为约5%,并且流出的O2范围为3-4%。使用带有25mL瓶的无菌取样系统将样品从延伸至反应器底部的管中取出。DNA测序结果证实了海洋氢弧菌,并且在整个运行过程中,每天划线的琼脂平板上未发现任何污染物的生长。
[0554] 表3示出了在运行期间的各个时间点测量的细胞干重(CDW)密度。在第5天时,CDW密度超过8克/升。表3还给出了氯仿/甲醇可溶性脂质和己烷可溶性脂质的含量,分别作为在不同时间点取样的生物质的百分比。使用上述方法通过GC/MS分析脂质,并且发现其含有长度范围为14到20个碳的脂肪酸。
[0555] 表3
[0556]
[0557] 在海洋氢弧菌在气体上生长期间的不同时间点处测得的细胞干重(CDW)密度。还提供了了氯仿/甲醇可溶性脂质和己烷可溶性脂质的含量,分别作为取样的生物质的百分比。
[0558] 实例11
[0559] 在作为用于生长的唯一的能源和碳源的H2、CO2和O2气体的混合物上将荚膜红假单胞菌菌株DSM 1710生长至OD为4.5。遵循以下针对在供给连续气流的1升密封瓶中使用含有H2、CO2和O2的气体混合物进行实验的方案。
[0560] 设备:使用包括1升高压液相色谱(HPLC)溶剂递送瓶的定制系统分批生长培养物,所述溶剂递送瓶被重新用作培养瓶。将气体连续不断地供给这些1升培养瓶,所述气体通过气罐系统;气体混合器;过滤器(0.2微米);流量计;和
加湿器。图12示意性地展示了此气体递送系统和培养瓶。使用多孔玻璃熔块将气体分配并混合到溶液中。培养瓶中含有200mL液体培养基,并用铝箔包裹,以防止光线穿透培养基。通过将培养瓶浸入水浴中来控制温度。pH控制不超出化学缓冲液进入培养基的范围。气体通过0.2微米过滤器从培养瓶中排出,并且整个系统安装在通风橱内。气体供应来自压缩的H2和CO2气体混合物,以及单独的压缩O2罐。用于实验的目标气体混合物是10%O2、5%CO2和85%H2。将来自H2/CO2气罐混合物的流量计设定为25,并且将来自O2罐的流量计设定为34。这导致如通过GC测量的(岛津(Shimadzu)GC-8A、TCD检测器和奥泰(Alltech)CTR I柱)10.5%O2、5%CO2和84.5%H2的气体混合物,其被认为足够接近用于进行实验的目标混合物。
[0561] 培养基:970ml去离子水;20mg Na2.EDTA;12mg FeSO4.7H2O;200mg MgSO4.7H2O;75mg CaCl2.2H2O;1g NaCl;1g(NH4)2SO4;1mg硫胺素HCl;15μg生物素;1ml微量元素溶液。微量元素溶液:250mL去离子水;700mg H3BO3;398mg MnSO4.H2O;188mg Na2MoO4.2H2O;60mg ZnSO4.7H2O;10mg Cu(NO3)2。在高压灭菌之前将pH调节至7.2。高压灭菌后,加入30ml无菌溶液以及1.2g KH2PO4和1.8g K2HPO4。将pH重新调节回pH=7.2。
[0562] 接种物:由在光照下异养生长的荚膜红假单胞菌培养物提供的10%接种物,以250rpm搅拌。以下文献中给出RCVB培养基:Wall,J.D.、Johansson,B.C.、Gest,H.,1977。荚膜红假单胞菌的多效突变体在氮代谢中存在
缺陷(Apleiotropic mutant
ofRhodopseudomonascapsulata defective in nitrogen metabolism)《微生物学档案(Arch.Microbiol.)》115:259-263;所述RCVB培养基用于深绿色的接种物的光异养生长。这种光合异养生长的接种物进而由从储存在-80℃下的菌株的甘油原液开始。
[0563] 操作:10%接种物导致起始OD为0.15。在气体上生长8天后,OD达到4.5。使用贝克曼库尔特DU720 UV/Vis分光光度计在650nm处测量OD。化能自养生长的培养物的颜色是深红色。使用带有Axioskop研究
显微镜(德国蔡司(Zeiss))的相差光学器件观察培养物的湿片。使用用于成像和数据存储的PictureFrame(加利福尼亚州戈利塔Optronics)
软件用MacroFIRE装置(加利福尼亚州戈利塔Optronics)生成显微照片。图13示出了荚膜红假单胞菌的显微照片。在化能自养生长后,在4℃下将培养物以10,000G离心15分钟。然后倒出上清液,将生物质颗粒暂时保存在-20℃下,并且然后冷冻干燥。图14示出了离心后回收的荚膜红假单胞菌生物质颗粒的照片。以这种方式,从由作为氢、电子和碳的唯一来源的H2和CO2产生的荚膜红假单胞菌的单个1升瓶中回收总共2.59克湿生物质。使用上述方法通过GC/MS提取并分析脂质,并且发现其含有长度主要为16或18个碳的脂肪酸。
[0564] 实例12
[0565] 在作为用于生长的唯一的能源和碳源的H2和CO2和O2气体的混合物上在1升气密瓶中生长嗜热氢杆菌菌株DSM 6534。从德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)收到在气体顶空下的血清瓶中的嗜热氢杆菌DSM 6534的活培养物。已知嗜热氢杆菌DSM 6534含有rTCA CO2固定循环。在H2:CO2:O2大气压为8:1:1的情况下,使用此活培养物向含有MSM培养基的160ml血清瓶提供10%接种物,所述培养基在以下文献中给出:《嗜热细菌》,Jacob K.Kristjansson,第5章,第III节,CRC出版社,1992,第86-88页。接种后600nm处的初始OD为
0.03。通过将血清瓶浸入加热的水浴中将血清瓶的温度维持在70℃。不应用搅拌。观察到培养基变浑浊,并且65小时后测量到OD为0.354——增加十倍以上。然后将此血清瓶作为10%接种物传代培养到1升气密瓶中,所述气密瓶含有120mL MSM培养基和8:1:1大气压的H2:
CO2:O2。使用水浴将培养瓶维持在70℃并且不搅拌。在64小时的过程中,更新一次气体顶空,并且OD增加到0.25。在接下来的24小时内,OD增加到0.42。再次更新顶空气体,并且两天后测量到OD为0.56。取1mL培养液进行DNA提取和测序。确定16S rRNA序列,并且将顶部BLAST序列鉴定为嗜热氢杆菌TK-6菌株。然后从1升瓶中取出培养液,并在4℃下以10,000g离心15分钟。离心后产生的湿生物质颗粒重212mg。如上文实例中所述进行湿生物质的己烷提取。
从湿生物质中回收15.2mg己烷可溶性脂质,或者7.2%湿生物质重量包含己烷可溶性脂质。
使用上述方法通过GC/MS提取并分析脂质,并且发现其具有相对高比例的20个碳链长度的脂肪酸。
[0566] 实例13
[0567] 在作为用于生长的唯一的能源和碳源的H2、CO2和O2气体的混合物上将自养黄色杆菌菌株DSM 432生长至14克/升干细胞密度。遵循以下针对在搅拌釜生物反应器中使用含有H2、CO2和O2的气体混合物进行实验的方案。
[0568] 设备:使用图15中示意性展示的2升玻璃发酵罐和图16中示意性展示的顶板探针,分批培养培养物。使用pH和温度探针以及商业控制器控制和监测温度和pH。通过自动添加2N NaOH调节pH。生物反应器中的端口可用于提供营养补充剂和消沫剂;接种物递送;基底;
更新培养基;和无菌取样。通过涡轮机提供搅拌并且通过玻璃熔块喷射气体。图17示意性地展示了反应器系统。所述系统包括压力计;气体流量计;安全和止回阀;0.2微米过滤器;生物反应器容器、传感器、致动器和控制器;冷凝器和泡沫收集器;以及出风口。气体供应来自压缩的H2、压缩的CO2和室内空气,每个气体都调节到20psi。图18示出了气体递送系统的示意图。将H2和CO2递送到流量配比器(Matheson G2-4D151-E401/E401,20psi),所述流量配比器设定气体的相对分数。流量配比器中的设置是c.l.H2=35;c.l CO2=10;以及c.l空气=
55.这导致如通过GC测量的(岛津GC-8A、TCD检测器和奥泰CTR I柱)64%H2、11%CO2、5.4%O2的气体混合物被递送到反应器中。
[0569] 培养基:以下文献中描述了用于此实验的MSM培养基《:嗜热细菌》,CRC出版社,布卡拉顿,佛罗里达州,编辑:Jacob K.Kristjansson,1992,第87页,表4。
[0570] 接种物:从在-80℃下储存的单一甘油原液瓶开始自养黄杆菌菌株DSM 432接种物,将其转移到1升气密瓶中的200mL MSM中。H2/CO2/O2顶空的气压为10psig。在30℃下以150rpm搅拌培养瓶。
[0571] 发酵罐操作:在接种之前,将1.3升MSM转移到生物反应器容器中。使用NaOH将pH调节到6.8。将温度设定在30℃并以500RPM搅拌。每天取样两次,以通过无菌取样组合件进行OD和脂质分析。所有OD测量均使用贝克曼库尔特DU720 UV/Vis分光光度计进行。每天一次在显微镜下每天检查一次样品以检查细胞形态。将所有培养液样品以12,000g离心。储存1mL上清液用于在-20℃下进行NH4+分析。将湿生物质颗粒暂时储存在-80℃下,并且然后冷冻干燥。
[0572] 图19示出了OD600与CDW(mg/ml)之间的相关性。所述相关性的线性拟合是CDW=0.9944*(OD600)+0.4101,其中R2=0.957。图20示出了根据此方案在H2/CO2/O2气体底物上生长的氢氧混合气微生物自养黄色杆菌的生长曲线。在600nm处测量的最终OD为14.8,并且来自H2/CO2/O2气体底物上的生长的最终CDW为13.8克/升。在运行开始处短暂的对数生长期后,生物量以大致线性的速率积累,直到第六天运行终止。使用上述方法通过GC/MS提取并分析脂质,并且发现其具有相对高比例的长度为18个碳链的脂肪酸。
[0573] 实例14
[0574] 化能自养菌株筛选
[0575] 首先使用Almore公司的Vacu-Quick罐系统筛选菌株以在平板上进行化能自养。然后在液体培养物中测试有希望的菌株。
[0576] 如上所述制备基础盐培养基(MSM)并将其合并并无菌加入琼脂糖(1.5%)平板中。测试了来自以下属的162个候选菌株:贪铜菌属;黄色杆菌属;迪茨氏菌属(Dietzia);戈登氏菌属;分枝杆菌属;诺卡氏菌属;类诺卡氏菌属(Pseudonocardia);节杆菌属;食碱菌属(Alcanivorax);红球菌属;链霉菌属;红假单胞菌属;红杆菌属;和不动杆菌属;将每个菌株划线到基础盐培养基(MSM)+琼脂糖(1.5%)平板上。然后将所有相应的板置于Almore公司的Vacu-Quick罐系统中。在每个腔室的底部放置用无菌水浸泡的无菌纸巾,以保持腔室中的湿度并防止板在孵育期间干燥。然后将填充有板的气密室抽空;然后供应H2:CO2:空气(70/10/20)气体混合物。这些气体是生长的唯一能源和碳源。将气室在30℃下培养7-10天,每天清洗新鲜的气体混合物。对于表现出化能自养生长/菌落的平板,挑取菌落并然后将其划线到新鲜的基础盐培养基(MSM)+琼脂糖(1.5%)平板上,然后在提供有H2和CO2和空气(70/10/20)的Almore公司的Vacu-Quick罐系统中进行第二次孵育。然后在液体矿物盐培养基(MSM)中对第二次孵育中表现出强菌落生长的菌株进行化能自养试验。在工作体积为5mL的(Chemglass CLS-4209-10,厌氧,18×150mm)亨盖特(Hungate)管中进行实验,所述亨盖特管用固体氯丁橡胶塞(Wheaton Science Products,编号:224100331)盖住并具有铝
雷管。使用被设计用于高通量筛选的气体歧管用H2:CO2:空气(70/10/20)的气体混合物吹扫管。每天用新鲜的气体混合物吹扫管。在600rpm和30℃下将管在多功能触控HT
振荡器培养箱中以45°角孵育96小时。每24小时通过分光光度计(Genesys 10S,UV-Vis分光光度计,赛默科技公司(Thermo Scientific))测量600nm处的光密度。以下细菌菌株被鉴定为在氢氧混合气混合物上是化能自养的:嗜甲基节杆菌DSM 14008;混浊红球菌DSM 44304;混浊红球菌DSM 44311;自养黄色杆菌DSM 431;混浊红球菌DSM 44236;赤红球菌DSM 43338;混浊红球菌DSM 44315;耐金属贪铜菌DSM 2839;食醚红球菌DSM 44752;脱硫弧戈登氏菌DSM
44462;polyisoprenivorans戈登氏菌DSM 44266;polyisoprenivorans戈登氏菌DSM
44439;rubripertincta戈登氏菌DSM 46039;渗滤红球菌DSM 44240;混浊红球菌DSM
43206;恐水戈登氏菌DSM 44015;佐氏红球菌DSM 44189;维斯戈登氏菌DSM 44215;自养黄色杆菌DSM 1618;自养黄色杆菌DSM 2267;自养黄色杆菌DSM 3874;天蓝黄链霉菌DSM
41471;灰色链霉菌DSM 40236;链霉菌属DSM 40434;黄质产色链霉菌DSM 40111;热羧基链霉菌DSM 44293;类球红细菌DSM 158。
[0577] 对在液体MSM培养基中生长的氢氧混合气菌株进行完全邻近分析,所述培养基具有作为唯一的碳源和能源的氢氧混合气混合物。发现杀虫贪铜菌DSM 531和DSM 541在算术生长期采集的样品积累超过70wt%且超过80wt%的总蛋白质。还发现杀虫贪铜菌DSM 531和DSM 541合成维生素,所述维生素包含维生素B1、维生素B2和维生素B12。
[0578] 实例15
[0579] 杀虫贪铜菌DSM 531裂解物制备
[0580] 在作为用于生长的能源和碳源的无菌MSMG培养基(基础盐培养基+40g/L D-葡萄糖)上生长杀虫贪铜菌菌株DSM 531并使细胞裂解。
[0581] 遵循以下针对杀虫贪铜菌菌株DSM 531的生物质产生和裂解物制备的方案。
[0582] 实验菌株生物质产生:使用取自菌株甘油原液的1体积%进行72小时接种,然后使用10体积%进行120小时培养以产生菌株生物质。
[0583] 在250rpm、30℃、72小时下,将杀虫贪铜菌菌株的初始生长从1.5mL甘油原液接种到振荡培养箱(New Brunswick Scientific,Series 25振荡培养箱,落地式)中的500mL锥形瓶(VWR#10536-926)中的160mL MSMG培养基中。通过营养肉汤(NB)琼脂平板、SpectraMax M5分光光度计上在600nm处的光密度,以及在1000倍镜头放大率下显微镜Labomed iVu3100上的形态学检查来检查菌株。
[0584] 将20mL接种原液转移到含有200mL MSMG培养基的2L锥形瓶(VWR#10545-844)中,从160mL接种原液中得到总共8个2L烧瓶。在30℃、250rpm下将2L烧瓶在振荡培养箱中孵育120小时。通过在营养肉汤(NB)琼脂平板上划线、分光光度计上在600nm处的光密度、pH测量以及收获时在1000倍镜头放大率下显微镜上的形态检查来监测菌株。
[0585] 将培养液转移到皮重无菌的250mL离心瓶(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)#05 564 1)中,并在4℃下以8000rpm在离心机(Sorvall Evolution RC)中离心20分钟。轻轻倒出培养液,并将颗粒转移到皮重无菌的50mL隼管(VWR#89039-656)中。将颗粒储存在-80℃下。
[0586] 在收获时还进行了杀虫贪铜菌DSM 531菌株的细胞干重测量。在收获2L烧瓶之前,将来自每个烧瓶的10mL培养液转移到皮重无菌的50mL隼管中。在12000rpm、4℃下将管置于离心机(Eppendorf)上5分钟。轻轻倒出培养液,并将湿的颗粒在-80℃下冷冻2小时。将冷冻的颗粒放在
冷冻干燥机(Virtis Benchtop,-62.6℃,56mTorr)上18小时。
[0587] 在将甘油原液接种到160mL MSMG培养基中75小时后,在0.792,pH=7.34下测量OD600。培养液具有乳白色外观。未接种的MSMG培养基也在NB琼脂平板上划线,作为阴性对照。
[0588] 在从每瓶200mL MSMG培养基中的20mL接种原液传代培养物到2L烧瓶中113小时后。将来自每个2L烧瓶的细胞在NB琼脂平板上划线,并在1000倍大小的显微镜下观察。目测菌株纯度约为99.9%。
[0589] 通过在8000rpm、4℃下在具有密封帽的无菌250mL离心瓶中离心20分钟来收获2L烧瓶中的杀虫贪铜菌培养物。轻轻倒出培养液,并将湿的颗粒合并并储存在-80℃下。收获时,平均OD600=19.9并且pH=6.2-6.3。测量培养液中湿颗粒的重量和浓度。
[0590] 在收获之前,将来自每个2L烧瓶的10mL培养液转移到皮重的隼管中以进行细胞干重测量。
[0591] 裂解细胞提取物制备
[0592] 将30g湿细胞颗粒在室温下解冻15分钟。加入30g无菌MilliQ水。将管剧烈涡旋直至产生均匀溶液。将细胞溶液分成各自含有10g的6-50ml隼管,并使用具有1/8英寸锥形微尖探针(#101-148-070)的Branson Sonifier 250在冰水浴中进行超声处理。将探针降低至距离管底部1cm以内。将电力缓慢拨至40-60%输出,其中总超声时间为1分钟。使微尖端和细胞溶液冷却约10分钟。再进行两次超声处理,每次1分钟,其间冷却时间为10分钟。
[0593] 裂解细胞提取物的蛋白质测量
[0594] 使用布拉德福德测定法(Bradford assay)确定整个裂解细胞提取物、透明裂解物和通过分子量截止(MWCO)滤膜的渗透物中的蛋白质浓度。
[0595] 将5uL样品和BSA标准品(BIO-RAD#5000201)加入透明的96孔平
底板中。BSA浓度范围为150ug/mL到600ug/mL。随后,将250uL 1倍染料试剂(考马斯亮兰(Comassie Blue)G250,BIO-RAD#5000201)加入到板的每个孔中。在室温、300rpm下将板置于平板振荡器上30分钟,然后在SpectraMax M5分光光度计上在595nm处读取吸光度。
[0596] 水解产物制备
[0597] 根据此方案产生的细胞裂解物经历本领域熟知的化学水解和酶促水解方法。
[0598] 实例16
[0599] 蛋白酶示范实验
[0600] 在有氧浸没条件下在合适的培养基中生长的微生物(例如,真菌马昆德拟青霉)合成蛋白酶(例如角蛋白酶)。
[0601] 将细胞外液体浓缩并部分纯化以产生酶粉末。确定酶粉末的平均活性。
[0602] 对于角蛋白酶,将蹄和角底物研磨并筛分,作为阳性对照,然后通过在50℃和pH8.0下以0.75g/L到3.00g/L的浓度处理角蛋白酶(酶/底物比例为1:67比1:17)来进行角蛋白粉末的水解。这用作角蛋白酶活性的阳性对照。
[0603] 对于此实验,通过在50℃和pH8.0下以0.75g/L到3.00g/L的浓度处理角蛋白酶(酶/底物比例为1:67比1:17),将来自杀虫贪铜菌或在H2/CO2上生长的另一种微生物的冷冻干燥的微生物生物质粉末水解。
[0604] 水解反应进行至多6小时。在孵育期间,测量角蛋白或蛋白质降解并将其表示为溶解的氮的分数。此外,记录了可溶性蛋白质的量的增加和液相中总游离氨基酸的增加。还测定了水解产物的游离氨基酸组成。将通过凯氏定氮法(Kjeldahl method)测量的溶液中的氮含量表示为干粉(角蛋白或微生物)中总氮含量的百分比。确定了溶解的原始生物质中的N-含量部分。测定了与空白样品(不含酶)相比蛋白质溶解的增强。测定了不同浓度的蛋白酶对蛋白质溶解的影响。测量作为时间函数的可溶性蛋白质增加并确定酶促反应的时间过程。
[0605] 测量先前发现对植物具有积极作用的氨基酸。将得到的水解产物的氨基酸含量(以总量的%计)的对照与文献中所描述的蛋白质水解产物的组成进行比较。
[0606] 作为阳性对照,将马昆德拟青霉的角蛋白酶应用于粉末状蹄和角底物预计将在5小时内获得4g/L到5g/L的可溶性蛋白质(这取决于酶浓度),以及超过4,000mg/L的水解产物中的氨基酸浓度。
[0607] 在后续实验中,测试了通过蒸汽然后通过酶促水解对富含蛋白质的生物质进行的处理。比较经蒸汽预处理和未经蒸汽预处理的氮的溶解。比较蒸汽预处理的富含蛋白质的生物质与非蒸汽处理的材料的蛋白酶水解的时间过程。在蒸汽处理和未处理的情况之间比较从底物释放到溶液中的蛋白质、肽和氨基酸的量。在将马昆德拟青霉的角蛋白酶应用于已经蒸汽处理的粉末状蹄和角底物的阳性对照中,预期角蛋白氮的溶解度为98%。
[0608] 进行类似实验,测试来自本文所述菌株(包含但不限于链霉菌属)的蛋白酶,其在包含但不限于C1碳源的底物上生长。
[0609] 实例17
[0610] 酶促PH过程
[0611] 图21示出了本文所述方法的一个实施例的框图,其中呈水性细胞悬浮液形式的培养液经历碱处理,然后进行物理处理和酶促水解以直接获得有机酶提取物。在一些情况下,进行浓缩和/或分离和/或干燥的另外的步骤,从而提供各种有机酶提取物产物。在此方法的实验测试中,测定通过本发明方法获得的提取物的肽谱。
[0612] 根据图21中所示的框图进行实验。用10-11%w/w和w/v的目标测定500ml培养液中干物质的百分比。还测定了培养液中细胞的化学组成(例如%C、H、O、N、P、K、S)。在开放式玻璃反应器中处理培养液,加入28%NH3使pH为9.6,同时搅拌(60-80rpm)。
[0613] 在碱处理之后,使混合物在高压釜中经受115kPa的压力和120℃的温度20分钟。用氢氧化钾10M将因此获得的溶液调节至pH9.2。将此pH为9.2的溶液在恒温浴中维持在55℃,同时搅拌(60-80rpm)并加入0.3%v/v的枯草杆菌蛋白酶(来自每个偶氮酪蛋白测定法的蛋白酶储备溶液的70,000单位活性)。用28%氨维持pH。将这些水解条件维持24小时。在24小时处收集所得的水解产物,并测定化学组成(例如%C、H、O、N、P、K、S)。测定水解的氮和有机物产率。
[0614] 测量一个体积的水解产物,然后在旋转蒸发器中用70℃的恒温浴将水解产物浓缩5倍,从而获得浓缩的水解产物。在浓缩后测量干物质的重量百分比,其中目标干物质的重量为50-55%。此实验测试所述浓缩的水解产物是否采取稳定的糖浆形式。
[0615] 测量另一体积的水解产物并在4000G下将其离心30分钟。获得被称为可溶水解产物部分的上清液的体积,以及被称为不可溶水解产物部分的颗粒的重量。确定各自的干物质含量以及两个部分中干物质的化学组成(例如%C、H、O、N、P、K、S)。确定每个部分的有机物产率。还建立了每个部分的氨基酸组成及其肽谱。大小低于300Da的肽涉及游离氨基酸和小肽。测定这些游离氨基酸和小肽的含量。
[0616] 测定可溶水解产物的浓度,并测量体积和有机物w/w%。观察可溶水解产物稠度(例如,是否像糖浆一样)。在90℃下干燥不可溶水解产物部分,并测量最终重量和水分含量。
[0617] 实例18
[0618] 蛋白质提取物与还原的核酸
[0619] 将高压均质化应用于根据本发明生长的细胞。测试条件以鉴定在破坏大多数细胞同时保持内源核酸酶活性方面的最佳值;保存待收获的蛋白质,并且不产生任何异味。测试以下均质化参数:压力为5,000psig到15,000psig;温度为32℉到122℉且pH值为4.5到6.5;l到5次通过均质器。可以将破碎的细胞(匀浆)稀释、加热或冷却,并根据需要调节pH以增强过程和核酸酶和蛋白质可提取性。将匀浆调节至高于5.5的pH,并且特别测试8到11的pH范围;持续5到60分钟且温度为40℉到140℉。目的是提取核酸酶、蛋白质和其它碱溶性物质。
通过离心和/或过滤将匀浆分离成不可溶细胞壁残余物和被称为碱性提取物的可溶提取物。影响内源核酸酶的提取和利用的因素是:核酸酶含量、pH、加工温度、反应时间、底物浓度、活化剂和抑制剂。这些因素可以相互作用以影响蛋白质组成和产率,并且优化这些因素以使蛋白质产率最大化和/或使核酸污染最小化。进行从细胞壁残留物开发聚糖产物的尝试,所述聚糖产物类似于1972年11月29日提交的题为酵母聚糖及其制备方法(Yeast Glycan and Process of Making Same)的专利申请序列号310,452中所描述的酵母聚糖产物。贝克酵母聚糖是经
粉碎、洗涤、巴氏杀菌和干燥的酵母(酿酒酵母)细胞壁。其主要由长链碳水化合物组成,以干固体计不低于85%。碳水化合物由聚糖和甘露聚糖单元构成,比例约为2:1。其可以用作沙拉酱、冷冻甜点类似物、酸奶油类似物、奶酪味和酸奶油味小吃蘸料中的乳化剂和乳化剂盐和稳定剂和
增稠剂和调质剂。
[0620] 分离细胞壁残余物后,孵育可溶剩余物,使内源核酸酶分解核酸聚合物。测试的孵育条件范围为40℃到60℃,pH为5到8,且时间为15到120分钟。通过离心分离蛋白质。在核酸酶反应阶段结束时,以各种方式处理系统以试图提高蛋白质污泥的离心速率。测试0.1wt%到1.0wt%的CaCl2固体以加速蛋白质的回收。测试的离心条件的pH范围为4到7,且温度范围为4℃到90℃。测试在内源性核酸酶反应完成后和离心前加入氯化钙是否显著提高了离心速率或通量。图22提供了一个可能的实施例的框图。
[0621] 通过离心将核酸酶反应混合物分离成低RNA-蛋白质污泥部分和可溶细胞质成分部分。测试可溶细胞质成分部分的组成。预计含有核酸片段、一些蛋白质和蛋白质片段、糖原和许多包含维生素的代谢中间体。预计可溶细胞质成分构成总微生物部分的有价值部分,并且预计可溶细胞质成分具有与酵母提取物或酸乳清类似的应用。
[0622] 测试不可溶蛋白质部分的水洗对风味的影响。测试另外的真空脱水步骤,然后干燥成粉末。测试的真空条件范围为20到28英寸Hg,在T=120°F到200°F下,持续10到60分钟。在5%到25%固体的范围内测试进入最终干燥步骤的固体内容物。测试的干燥方法包括:喷雾干燥、滚筒干燥、冷冻干燥等。
[0623] 测试粉末的组成。确认无细胞组成以及不存在活细胞。进行近似分析以建立基于以下干固体的重量组成:蛋白质;核酸(目标小于约3%);脂质;灰分;碳水化合物;纤维;其它生物质。还测定了维生素和矿物质含量。
[0624] 实例19
[0625] 由杀虫贪铜菌制备蛋白质
[0626] 对根据本发明的方法在H2和CO2上生长的生物质进行三次水洗,并且如果需要的话,通过离心将所述生物质增稠至11wt%固体。
[0627] 将50加仑含有45磅杀虫贪铜菌固体的悬浮液冷却至45℉并在8,000PSIG的压力下进行均质化并立即冷却至45℉。重复均质化总共三次。用水将匀浆稀释至150加仑的体积,并加入食品级碱性试剂氢氧化钠直至达到pH9.5。将材料搅拌15分钟,并且然后离心材料。移除不可溶残余物(细胞壁碎片)。称量匀浆固体的初始量,以及在对碱提取物可溶生物质和不可溶生物质进行均质化、提取和分离后的回收。通过加入一种普通盐酸将碱提取物调节至pH 6.0,并加热至122℉。将提取物在pH 6.0下温和搅拌1小时,以使内源核酸酶消化核酸。
[0628] 用于比较的并行运行涉及在以下条件下用外源核酸酶处理碱性提取物:pH7;50℃;持续2小时。从麦芽芽中提取外源核酸酶,并以9lbs麦芽芽提取物固体/18lbs杀虫贪铜菌提取物固体的速率使用外源核酸酶。
[0629] 用于比较的其它并行运行包括:1)使用低温高碱过程来减少RNA。在此方法中,用NaOH将来自匀浆的碱提取物调节至pH 12并在60℃下加热2小时。在将系统调节至pH 4.5后分离蛋白质。2)使用高温低碱过程来减少RNA。在此方法中,将来自匀浆的碱提取物调节至pH 10.5并在80℃下加热4小时。在将系统调节至pH 4.5后分离蛋白质。
[0630] 在孵育结束时,加入37.5克氯化钙。将蛋白质悬浮液温热至175℉并离心得到蛋白质污泥和酸乳清。测量每个相应部分中干燥固体的重量。通过用两个体积的水稀释并再次离心来洗涤蛋白质污泥,同时将温度保持处于175℉并将pH维持在6.0。在干固体基础上,测量洗涤的蛋白质污泥的量以及洗涤固体的量。在175℉、pH6下将经洗涤的蛋白质污泥真空浓缩(28英寸Hg)至20%固体,并将其喷雾干燥。测定喷雾干燥产物的组成,包含:%水分、%粗蛋白(N×6.25)、%核酸、%脂质、%灰分、%碳水化合物(按差异)。
[0631] 比较未分馏的杀虫贪铜菌蛋白质和分离的杀虫贪铜菌蛋白质的营养质量,其中已通过上述各种方法降低了核酸含量。将未分馏的生物质用水洗涤三次并喷雾干燥。
[0632] 测定所有样品的必需氨基酸含量。将内容物与粮农组织蛋白质需求委员会(1957b)(FAO Committee on Protein Requirements(1957b))“粮农组织营养研究第16号(FAO Nutritional Studies No.16)”引用的内容物进行比较,并进行分析以确定所述内容物如何达到或超过用于生长试验鼠的氨基酸需求。
[0633] 相对于酪蛋白基线(PER=2.5)测定蛋白质功效比值或PER。使用饮食中10%校正蛋白质的水平对大鼠进行喂养测试。遵循以下文献中公开的测试程序《:公职分析化学家协会官方分析方法(Official Methods of Analysis of the A.O.A.C.)》第800页,第11版(1970)。使用未分馏的杀虫贪铜菌生物质进行一些测试,所述测试不尝试减少RNA。
[0634] 比较未分馏生物质与蛋白质分离物的PER和RNA含量。还比较了仅使用内源核酸酶制备的分离物与使用外源核酸酶制备的分离物,以及使用更强的碱过程制备的分离物。
[0635] 实例20
[0636] PH中生物刺激素效应的测试
[0637] 通过逆转录聚合酶链反应分析PH对编码在三羧酸循环中起作用的酶的基因的转录模式的影响。对编码所研究的酶的基因的转录积累进行研究以确定转录积累是否被PH处理上调。还测试了酶活性。使用相同的方法验证对照PH产物(如源自
鞣制残余物水解的PH产物)的生物刺激素作用。
[0638] 实例21
[0639] 生物刺激素的产生和测试
[0640] 通过膜过滤分离由如本文所述的C1原料产生的细菌细胞乳膏。测量细胞乳膏的总固体含量和总氮含量。目标量分别为约8wt%和0.8wt%。还测量了粘度。将硫酸加入约300ml细胞乳膏中,以将细胞乳膏的pH调节至3.5。通过将经pH调节的细胞乳膏装入500ml Erlenmeyer烧瓶中用箔覆盖并在16lbs压力下在128℃下置于高压釜中24小时来进行水解。
水解后,再次测量细胞乳膏(水解产物)的粘度。预计所述粘度大大减少,可溶物和不溶物明显分离。冷却后,通过20微米纸过滤器将水解产物过滤,并收集可溶部分用于进一步分析。
测量可溶部分的总固体含量和总氮。通过测量与对照处理相比枝条密度随时间的变化,测试可溶部分在草坪草中引发植物激素反应的能力。在70天试验期间,每两周用水、硫酸铵或可溶部分对温室中的
地块草坪进行叶面处理。硫酸铵和可溶部分均以0.05lbs氮气/1,000平方英尺的量施用。在第0天、第44天和第70天测量草坪枝条密度。与对照处理相比,测试到用可溶部分处理的草坪草的枝条密度从第0天到第70天统计学显著地(p<0.05)增加。
[0641] 实例22
[0642] 工业微生物细胞质量和水解产物对萝卜生长的影响
[0643] 试验旨在测量不同肥料处理对冠军品种的红萝卜(Raphanussalivus)的生长和产率的影响。将种子在雾化床中发芽,并以20:5:5的比率将种子分别移植到含有泥炭藓、珍珠岩和蛭石的6英寸直径的盆中。每周三天用200ml水浇灌盆。在发芽期间不提供肥料。在移植的同一天施用处理肥料。处理包含不使用肥料的阴性对照、阳性对照、一个含有硫酸铵的对照、另一个含有商业9-3-6肥料的对照、以及由蛋白酶和木瓜蛋白酶水解产生的水解产物。以高数量和低数量(例如110kg N/公顷和28kg N/公顷)施用水解产物。以匹配的高数量(例如110kg N/公顷)应用阳性对照。预计高碳率(例如110kg/ha)可以满足萝卜生产的要求。预计低氮率(例如28kg/ha)低于N的要求。在完全随机区组设计中重复四次应用每种处理。
[0644] 从根据本发明的C1原料产生的SCP培养液(约10%总固体)中获得水解产物。在分别加入木瓜蛋白酶( T-100,Enzyme Development Corporation,纽约,纽约州)和细菌蛋白酶( 碱性蛋白酶L660,Enzyme Development Corporation,纽约,纽约州)之前,通过用30%氢氧化钾将pH调节至7或9来使蛋白质培养液水解。在水浴中将细胞乳膏水解总共24小时,其中通过搅拌器提供恒定搅拌,并将温度维持在60℃。通过在120℃下对水解产物进行5分钟高压灭菌使酶变性。
[0645] 将所有肥料处理的萝卜重量与不施肥的萝卜重量进行比较。硫酸铵与对照9-3-6的比较测试是否存在对磷或钾的任何未满足的要求。差异的缺乏证明,P和K的水平是足够的。将用蛋白酶和木瓜蛋白酶水解产物进行的低N处理与高N处理进行比较。对低N案例进行测试,以确定在氮含量较低的情况下是否可以获得高产率,以及用于萝卜生产的氮的使用效率是否在统计学上更高。提高的效率反映了生物刺激素作用并证明,水解的细胞乳膏有可能在低氮输入的情况下增加根作物产量。
[0646] 实例23
[0647] 水培系统中的水解产物测试
[0648] 此实验的目的是确定使用微生物来源的PH是否可以增强筏漂浮水培系统中生长的莴苣的生长和N摄取。
[0649] 漂浮筏或DWC(深水培养)适合于大规模生产某些类型的蔬菜,具体地说,莴苣。将莴苣幼苗放在漂浮的筏上,所述筏通常由大的聚苯乙烯片制成,其中切出许多孔以容纳植物的根。
[0650] 清洁的含氧水是必不可少的。植物根部被高度氧化。根部本身一直沉浸在水中。需要消除污垢颗粒,因为污垢会粘附在植物的白色根部,并阻止植物根部吸收能够使植物成熟和生长的重要的氧气和矿物质。
[0651] 浮动筏系统使用多个规则间隔的砂滤多孔石来对植物根部进行大量氧化。进入此区域的水现在应该不含大多数固体。植物的根部应该是干净的并看起来是白色。这里的莴苣应该迅速生长,并且很容易进行收获。
[0652] 使用完全的和降低的水培
营养液浓度,测试每周叶面施用PH对新鲜生物质、SPAD指数和N摄取的影响。还测试了将PH引入水中。
[0653] 使用测量在两个
波长下通过叶子的光透射的仪器来测定SPAD指数,以确定叶子的绿度和厚度。红外线范围内的透射提供与叶片厚度相关的测量,并且使用红光范围内的波长来测定绿度。两种波长的
透射比提供被称为CCI的叶绿素含量指数,或可替代地作为SPAD指数。CCI是线性标度,并且SPAD是对数标度。已经显示,这些仪器和标度与叶绿素含量的叶绿素化学测试相关,除了非常高的叶绿素含量水平。叶绿素含量计通常用于包含氮应激和硫应激的营养植物应激测量。
[0654] 实例24
[0655] 蘑菇生长强化剂配制
[0656] 根据上文所公开的方法,通过如本文所述的高蛋白质细胞(如但不限于杀虫贪铜菌)产生蘑菇生长强化剂。生长和收获后,将细胞团脱水并干燥,使其水含量不超过13wt%水分。
[0657] 使用本领域普通技术人员已知的方法标准化干燥的生物质颗粒。在优化的平均粒径下,得到了颗粒粒径的集中分布。确定最佳的平均粒径以便通过蘑菇堆肥和营养素可用性提供足够的分布,同时不使营养素过多,这可以实现通过如细菌或外来霉菌等竞争微生物快速利用颗粒。在
制造过程中的这个阶段,分析干燥颗粒产品以确认产品主要含有不大于或小于—l0+30美国标准筛网(正负5%)的颗粒。还测试了产品是否存在任何活性污染生物。
[0658] 实验性地测试了产品的碳水化合物含量。由于碳水化合物通常是不希望的外来微生物的关键生长刺激物,因此目标是低碳水化合物产品。因此,低碳水化合物限制了这些生物的繁殖。在某些非限制性实施例中,移除碳水化合物,以便进一步增加蛋白质含量和每单位重量是产品的最终效力。
[0659] 如果产品符合上述标准,则将其转移到混合器单元(Forberg Model C200-SS-2D或等同物)。在混合器单元中,将产品与防腐剂混合。优选的防腐剂包含含铜化合物、氨基甲酸酯类化合物、酚类化合物和抗生素化合物,其具体实例如下:
[0660] 1.含铜材料——单独的硫酸铜或与石灰混合。
[0661] 2.氨基甲酸酯材料——1-(丁基氨基甲酰基)-2-苯并咪唑并氨基甲酸甲酯;亚乙基双二硫代氨基甲酸锌。
[0662] 3.酚醛材料——邻苯基
苯酚;邻苯二甲酰氯-苯酚及其盐。
[0664] 以有效量添加所选择的试剂,以使产品在堆肥过程中不受外来微生物的影响,但不能防止蘑菇菌丝体对其的利用。
[0665] 优选地,以连续模式执行剩余的过程步骤。下一个步骤涉及对产品进行巴氏杀菌。为了完成巴氏杀菌,将产品在干燥器装置(Nara桨式干燥器型号1.6W或等同物)中加热。操作干燥器以在约5分钟内将产品的温度从环境水平升至220℉。这将通过使用Nara桨式干燥器型号1.6W在约325℉注入95psi蒸汽来实现。巴氏杀菌旨在实现以下目标:(1)减少营养细菌和霉菌板数的至少三个对数;(2)使嗜温细菌孢子灭活;以及(3)使脂氧合酶失活。然而,旨在使上述热量不足以使产品基本上变性。巴氏杀菌旨在减少在菌种运行期间由外来微生物产生早期和不期望的热量的可能性。测定活微生物的巴氏杀菌前水平和巴氏杀菌后水平。
[0666] 完成巴氏杀菌后,将产品转移到由振动流化床递送机(Jeffrey Dresser Industries,型号IXIO TMV或等同物)组成的冷却器/蒸发器单元中。冷却器/蒸发器单元使用2500CFM的环境过滤空气,以在约一到两分钟内将产品温度从220℉降低到100℉。以这种方式冷却后,测量产品的水分含量。此阶段的目标水分含量约为7.5%。在上述过程期间测量和
跟踪产品的水分含量并且在巴氏杀菌/冷却阶段期间测量和跟踪产品的温度曲线。
[0667] 从如上所述的产品中蒸发水旨在防止在巴氏杀菌过程中未被杀死的微生物(包含细菌孢子)的腐败。在1-2分钟内快速冷却至100℉旨在防止蛋白质变性——蛋白质的变性与产品在高温下保持的时间成正比。
[0668] 所得的最终蘑菇生长强化剂产品旨在包含基本上未变性的蛋白质材料。变性涉及蛋白质的三级或四级结构的修饰,从而改变蛋白质的物理和生物学特性。通过称为“PDI”或“蛋白质分散性指数”的指数来反映本文所使用的术语“基本上未变性”。采用PDI测量涉及用水提取细胞产物以及使用凯氏定氮分析法(Kjeldahl analysis)分析提取的部分。在进行凯氏定氮分析时,用浓缩的H2SO4消化产物,其将产物中的氮转化为硫酸铵。然后用碱性物质处理所得溶液,从而导致氨的释放。通过用标准酸滴定来确定释放的氨的量。然后可以使用滴定结果计算产物中的氮含量。为了计算PDI,使用AOCS方法Ba 10-65中提供的公式。在本申请中,“基本上未变性”的蛋白质的特征在于具有不低于50的PDI。对产物进行PDI分析,并与使用甲醛变性大豆材料的市售产品进行比较;据报道,所述市售产品的PDI约为11.4。进行蘑菇生长强化剂的近似分析,所述分析包含蛋白质、水分、脂肪、灰分、粗纤维、碳水化合物的含量。还确定了卡路里含量。
[0669] 蘑菇生长强化剂在制备后立即使用,或装袋并储存在干燥凉爽的位置以备后用。在使用中,优选地在蘑菇栽培的催生阶段将产品与堆肥均匀混合。在14天的菌种运行期间,将组合的堆肥/生长强化剂产品保持处于75℉-85℉的温度范围内。超出此范围的温度(特别是高于90℉的温度)可能导致产率和质量的显著损失。通过测试确定添加到堆肥中以获得最佳结果的蘑菇生长强化剂的重量百分比。目标是最佳生长强化剂重量为堆肥的3.5%干重,或更广泛地,堆肥的2到5%(干重)的范围内。
[0670] 实例25
[0671] 蘑菇生长强化剂测试
[0672] 试验中使用的堆肥是由小麦秸秆(46,700lb.)与鸡粪(20,000lb.)、棉籽壳(15,000lb.)、
硫酸钾(700lb.)、尿素(300lb.)、大豆分裂物(3,500lb.)和棉籽粕(7,000lb.)配制而成。将完成的堆肥放入8英寸深的托盘中,每个托盘加入4磅棉籽植物油并进行巴氏杀菌。巴氏杀菌后,将每个托盘的4.2磅双孢蘑菇菌种与补充材料一起加入到堆肥中,所述补充材料如上所述由在C1底物上生长的蛋白质细胞团制备,添加剂的范围为2-6重量%。阳性对照是基于商业大豆蛋白的配制品。阴性对照未将补充剂添加到堆肥。补充百分比基于
6.5lb堆肥干物质/平方英尺。使用标准目数测试到,所有补充剂具有相似的颗粒粒径。
[0673] 在添加补充剂之后,然后将水添加到托盘中以将内容物的水分含量提高至约70%。接下来,将托盘放置在
相对湿度为90-95%的受控环境室中。堆肥温度保持处于78℉-
82℉之间。在菌种生长13天后,在堆肥表面铺上一层1.75英寸厚的松软土壤,并充分浇水。
然后将托盘保持处于受控环境室(65℉-73℉;10,000ppm CO2)中13天,然后突然将空气温度和CO2转变为60℉和800ppm CO2;以引起蘑菇结果。然后将托盘放入生产室并且收获托盘后每周冲洗四次。所涉及的时间长度如下:(a)第I阶段堆肥——56天;(b)第II阶段堆肥——6天;(c)菌种运行——13天;(d)条件保持——13天;以及(e)收获——32天。确定实验和对照中蘑菇的平均总产率(kg/m2)。
[0674] 实例26
[0676] 如上所述产生的具有降低的核酸含量的高蛋白质产物(HPP)用作食品配料。
[0677] 制备:
[0678] 1.称取所需量的HPP并将其置于霍巴特(Hobart)混合碗中。
[0679] 2.测量水与HPP的比例大约是3:2,并以大约1:60的比例向水中添加焦糖色素。将混合器设置为速度I。
[0680] 3.打开霍巴特混合器,并在混合时非常缓慢地向霍巴特混合碗中的HPP添加焦糖色是水。充分混合材料。
[0681] 4.通过绞肉机(例如,霍巴特附件)挤出混合材料,并将挤出的HPP捕获在干燥器托盘或盘中。挤出的HPP在从
挤出机中出来时可以被切成期望的长度,或者可以作为长段收集并在干燥后减小到期望的大小。
[0682] 5.将挤出的材料在
对流烘箱中干燥至10%
含水量。将干燥的有纹理的HPP再水化以进一步用于食品应用中,方法是:通过a)在室温下在水(过量)中再水化1到2小时,或者通过b)在过量的温水(100-140℉)中再水化1小时。测定水吸收与有纹理的HPP的比率。
[0683] 实例27
[0684] 测试豆豉生产的生长强化剂和具有豆渣的测试配制品
[0685] 豆渣是在豆奶/
豆腐制造后产生的基于大豆的副产品。其具有相对较高的蛋白质含量。可以通过使用豆豉起子用真菌少孢根霉菌(Rhizopus oligosporus)进行发酵将豆渣转化为豆豉,或者使用如糙米、碾碎的小麦、大豆和其它豆类与谷物制品等配料将豆渣转化为
滤饼豆豉。
[0686] 在此实验中,测试了本发明的细胞和/或其提取物和/或水解产物是否可以用作与豆渣底物组合的少孢根霉菌的生长强化剂。还测试了用生长强化剂产生的合成豆豉相比于阴性对照是否具有优良特性,如但不限于营养价值。
[0687] 此实验还测试在滤饼豆豉生产中,细胞、提取物和/或水解产物与单独的豆渣一起使用,还是与如糙米、碾碎的小麦、大豆和其它豆类与谷物制品等其它配料组合。
[0688] 实例28
[0689] 本文所描述的某些实施例利用如太阳能和风能等间歇的可再生能源来产生固碳所需的H2。CO2源是如发电厂等工业来源。电解槽通常在低电力需求和高可再生电力供应期间消耗电力。在这种低需求和高可再生能源发电期间,德克萨斯州、苏格兰和德国等地区的可再生的无CO2排放的电力供应量可高达95%。因此,实际上电解槽正在利用无CO2排放的电力来从水中产生H2,并且如果存在任何CO2密集型电力,电解槽将利用很少。在这些地区,高可再生电力供应和低电网需求的时段约占50%的时间,并且因此预计电解槽将在大约50%的时间内运行。H2和CO2的现场罐存储缓冲了来自工业来源的CO2产生和来自电解槽的H2产生之间的时间差异,从而使得这两种气体能够连续流入CO2固定生物过程。化能自养氢氧混合气微生物将CO2、H2和矿物质营养素(即,NPK)转化为高蛋白质生物质。可以将这种富含蛋白质的生物质转化为植物的生物刺激素、或蘑菇的生长补充剂、或动物饲料、或人类的直接营养(图23和图24)。来自电解槽的O2将超出微好氧的氢氧混合气生物过程的要求。这种过剩的O2可以作为纯气体副产品出售(图25),或者反馈到化石燃烧或动力装置,以提高装置的热效率并增加从装置排放的烟气流中的CO2浓度。增加的CO2浓度有利于碳捕获步骤。
[0690] 为了实现
碳中和,优选地将所述系统定位在具有高间歇可再生能源发电的区域。电解槽装置仅在电力需求低和可再生电力供应过剩期间汲取电力。这将减轻由间歇性可再生能源引起的电网应变(图25)。除了捕获CO2、生产有价值的营养素、以及在低需求期间减少可再生能源发电对电网造成的压力,所述系统还可以通过允
许可再生能源在低需求时期继续发电,更全面地利用可再生能源。电解槽技术的一个主要应用是:在高电力需求和低可再生电力供应期间,将可再生能源供应过剩期间产生的H2转化为电网电力——实际上是沿着价值链从H2回到电力。将H2和CO2转化为蛋白质,并从那里转化为植物、蘑菇、动物和人类的营养素——实际上从H2继续向上延伸价值链。
[0691] 本文已经足够详细地描述了本发明的特定优选实施例,以使本领域技术人员能够实践本发明的全部范围。然而,应当理解的是,这些实施例是说明性的,并且没有具体描述的本发明的许多可能的变化仍然落入本发明和所附权利要求的范围内。
[0692] 尽管已经出于清楚理解的目的通过说明和举例的方式对上述发明进行了一些详细描述,但是对于本领域技术人员而言显而易见的是,可以在不偏离所附权利要求书中描述的本发明的精神和范围的情况下对其进行某些改变和
修改。因此,以上说明不应该被解释为限制本发明的范围。
[0693] 本文给出的描述仅通过举例的方式添加,并不旨在以任何方式限制本发明的范围。更一般来讲,本领域的技术人员将容易认识到,本文中描述的所有参数、尺寸、材料以及配置意味着是示例性的,并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于本发明的教导内容所用于的一种或多种具体应用。在本文中陈述数值限制或范围的情况下,包含端点。此外,数值限制或范围内的所有值和子范围都被明确地包含在内,就像明确写出的一样。仅使用常规实验,所属领域的技术人员将认识到或者能够确定本文描述的本发明的具体实施例的许多等效物。可以进行许多变化、修改、添加和减少。此外,可以按顺序排列本文所描述的许多步骤,并且可以添加或删除许多步骤。因此,应理解,前述实施例是仅通过实例方式来介绍的,并且在所附权利要求和其等效物的范围内,本发明可以按与具体描述和要求不同的方式来实践。
[0694] 本发明涉及本文中描述的每个单独的特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法。此外,两个或更多个这样的特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合,如果这样的特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法并不相互矛盾,被包含在本发明的范围内。
[0695] 本文引用的所有出版物、专利和专利申请均在此通过引用整体并入,并且达到如同每个独立的出版物、专利或专利申请被专门且单独地指示通过引用并入的相同程度。