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草甘膦抗性植物和相关方法

阅读：2发布：2020-10-31

专利汇可以提供草甘膦抗性植物和相关方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及草甘膦抗性 植物 和相关方法。具体地，本发明涉及一些从原核 生物 DGT酶衍生的多肽，和可用于编码它们的核酸。，下面是草甘膦抗性植物和相关方法专利的具体信息内容。

1.一种转基因植物细胞，其包含与启动子可操作连接的多核苷酸，其中该多核苷酸包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列，且编码SEQ ID NO:1的草甘膦抗性5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)；
其中该转基因植物细胞不可再生而产生植物，且
其中与相同物种的野生型植物细胞相比，该植物细胞对草甘膦耐受。
2.权利要求1的转基因植物细胞，其中与启动子可操作连接的多核苷酸被稳定整合到该植物细胞的基因组中。
3.权利要求1的转基因细胞，其中所述植物细胞来自选自下组的植物：小麦、玉米、大豆、烟草、水稻、黍、大麦、番茄、苹果、梨、草莓、橘子、苜蓿、棉花、胡萝卜、马铃薯、甜菜、山药、莴苣、菠菜、矮牵牛、玫瑰、菊花、草坪草、松树、冷杉、云杉、重金属积累植物、向日葵、红花、油菜、或选自下列属的植物物种：拟南芥属(Arabidopsis)、天门冬属(Asparagus)、燕麦属(Avena)、臂形草属(Brachiaria)、芸苔属(Brassica)、柑橘属(Citrus)、西瓜属(Citrullus)、辣椒属(Capsicum)、南瓜属(Cucurbita)、胡萝卜属(Daucus)、飞蓬属(Erigeron)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、大麦属(Hordeum)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、黑麦草属(Lolium)、番茄属(Lycopersicon)、苹果属(Malus)、木薯属(Manihot)、烟草属(Nicotiana)、诸葛菜属(Orychophragmus)、稻属(Oryza)、鳄梨属(Persea)、菜豆属(Phaseolus)、豌豆属(Pisum)、梨属(Pyrus)、李属(Prunus)、萝卜属(Raphanus)、黑麦属(Secale)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、小麦属(Triticum)、葡萄属(Vitis)、豇豆属(Vigna)和玉米属(Zea)。
4.权利要求3的转基因植物细胞，其中所述植物细胞为大豆植物细胞。
5.权利要求3的转基因植物细胞，其中所述植物细胞为玉米植物细胞。
6.一种产生抗草甘膦的植物细胞的方法，该方法包括：
用核酸分子转化植物细胞，所述核酸分子包含与启动子可操作连接的多核苷酸，其中该多核苷酸包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列，且编码SEQ ID NO:1的草甘膦抗性5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)，从而产生转基因植物细胞，
其中该转基因植物细胞对草甘膦是抗性的。
7.根据权利要求6的方法，其中所述植物细胞包含在植物部分、植物器官、植物组织或植物细胞培养物中。
8.根据权利要求7的方法，其中该方法进一步包括再生包含所述多核苷酸的转基因草甘膦抗性植物。
9.根据权利要求6的方法，其中所述植物细胞包含在完整植物中。
10.根据权利要求6的方法，其中所述转基因植物细胞包含第二多核苷酸，该第二多核苷酸编码能够在该植物中表达的异源多肽。
11.根据权利要求10的方法，其中所述异源多肽为AAD-1或AAD-12。
12.一种用于在含有转基因抗草甘膦植物的耕种区内控制杂草的方法，该方法包括：
在耕种区内种植转基因植物或植物种子，其中该转基因植物或植物种子包含与启动子可操作连接的多核苷酸，其中该多核苷酸包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列，且编码SEQ ID NO:1的草甘膦抗性5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)；和向耕种区施用足以控制该耕种区中的杂草、而不显著影响该转基因植物或植物种子的量的草甘膦。
13.根据权利要求12的方法，其中所述转基因植物或植物种子包含编码异源多肽的第二多核苷酸。
14.根据权利要求13的方法，其中该第二多核苷酸为aad-1或aad-12。

说明书全文

草甘膦抗性植物和相关方法

[0001] 本申请是2013年2月1日提交的申请号为201380017835.1(国际申请号PCT/US2013/024410)、发明名称为“草甘膦抗性植物和相关方法”的发明专利申请的分案申请。
[0002] 优先权声明
[0003] 本申请要求获得于2012年2月1日提交的美国临时专利申请系列号61/593,555的利益，还要求获得于2012年4月17日提交的美国临时专利申请系列号61/625,222的利益。
[0004] 根据37 C.F.R.§1.821(c)或(e)-作为ASCII文本文件提交的序列表的陈述
[0005] 根据37 C.F.R.§1.821(c)或(e)，含有ASCII文本格式的序列列表的文件已经和本专利申请一起提交。

技术领域

[0006] 本公开涉及植物生物技术。特定的实施方案涉及参与N-(膦酰基甲基)甘氨酸代谢的新多肽，和编码这些多肽的核酸。特定的实施方案涉及包含前述多肽和/或核酸的植物、植物部分、和植物细胞。
[0007] 背景
[0008] 各种杂草很长时间以来都是耕地面临的难题。尽管杂草控制可能是劳动力密集型的操作，但是高效的杀杂草化学除草剂的获得已经使它变得更加容易。除草剂的广泛使用，加上作物品种和肥料的改良，对农业的“绿色革命”做出了显著贡献。特别有用的除草剂是具有广谱除草活性的除草剂。不幸的是，广谱除草剂通常会对暴露于该除草剂的作物植株
造成有害影响。克服这个问题的一个方法是产生能够耐受广谱除草剂的作物。
[0009] 广谱除草剂的一个实例是N-膦酰甲基甘氨酸，也称为草甘膦。草甘膦已经被全世界的农民广泛应用于在作物种植之前，例如在免耕种植(no-till farming)中，控制杂草。
此外，草甘膦是一种用于在生长周期之间或作物轮作中控制杂草和自生植物(volunteer 
plant)的高效手段。草甘膦在使用后不会在土壤中遗留(carry-over)，因此被认为是可用
于农业的环境安全性最高的、广泛有效的化学除草剂之一。
[0010] 草甘膦通过抑制莽草酸途径杀死植物。这个途径导向芳族化合物(包括氨基酸、维生素和植物激素)的生物合成。草甘膦通过结合并抑制5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成
酶(通常被称作“EPSP合成酶”和“EPSPS”)的活性，阻断磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)与3-磷代莽草酸缩合形成5-烯醇式丙酮酰-3-磷代莽草酸。
[0011] 不幸的是，已知没有作物可以天然耐受草甘膦，因此，这种除草剂在栽培作物中控制杂草的用途受到了限制。一种产生耐草甘膦作物的方法是，使用基因工程技术将编码异源草甘膦耐受形式的EPSPS的基因导入到作物中。利用化学诱变，已经在细菌中产生了草甘膦耐受形式的EPSPS，并将该异源基因导入到了植物体内，产生了草甘膦耐受性植物。参见，例如Comai et al.(1983)Science 221:370-71。可在作物中过表达异源EPSPS基因以获得
期望的耐受水平。
[0012] 前述关于相关技术及其相关局限性的实例只是说明性的，而不是排它性的。通过阅读本说明书，本领域的技术人员容易想到相关技术的其它局限性。
[0013] 发明公开
[0014] 本文描述了与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的分离多肽，和编码与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的多肽的核酸(例如SEQ ID NOs:2-4)。还描述了含有与SEQ ID 
NO:1具有至少90％同一性的异源多肽的植物、植物部分、植物器官、植物种子和植物细胞。
[0015] 一些实施方案包括植物、植物部分、植物器官、植物种子和/或植物细胞，其包含编码与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的多肽异源核酸。在特定的实例中，该异源核酸包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少80％的序列同一性的核苷酸序列。一些实施方案包括植物、植物部分、植物器官、植物种子和/或植物细胞，其包含在高严格条件下与具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的另一核酸杂交的异源核酸。在特定的实例中，包含在高严格条件
下与具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的另一核酸杂交的异源核酸的植物、植物部分、植物
器官、植物种子和/或植物细胞包含由该异源核酸编码的多肽，该多肽赋予该植物、植物部分、植物器官、植物种子和/或植物细胞草甘膦耐受性(或者增加草甘膦耐受性)。
[0016] 在进一步的实施方案中，本公开涉及用于产生抗草甘膦的植物、植物部分、植物器官、植物种子和/或植物细胞的的方法，包括：用编码与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的多肽的核酸转化植物、植物部分、植物器官、植物种子和/或植物细胞；和表达该核酸，从而产生与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的多肽。
[0017] 其他实施方案包括这样的载体，其包含编码与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的多肽的核酸。特定的实例包括这样的载体，其包括编码与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的多肽的核酸。例如，载体可包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的
核酸序列。
[0018] 特定的实施方案包括草甘膦耐受性植物和植物细胞，其表达与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的异源多肽。
[0019] 其他实施方案包括用于在含有抗除草剂植物的田地或耕种区内控制杂草的方法，其中该方法可以包括：在田地或耕种区内种植含有编码与SEQ ID NO:1具有至少90％同一
性的异源多肽的核酸的植物或植物种子；和向该田地或耕种区施用足以控制田中的杂草、
而不会显著影响该植物的量的草甘膦。
[0020] 在一些实施方案中，本公开涉及可再生的细胞，用于抗草甘膦植物的组织培养。这种组织培养物可以能够再生出具有前述的抗草甘膦植物的生理学和形态学特征的植物，还能够再生出与抗草甘膦植物具有基本上相同的基因型的植物。这样组织培养物中的可再生
细胞可以是，例如，胚、原生质体、分生组织细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、花、种子、荚果、和茎。特定的实施方案涉及从根据前述的组织培养物再生的植物。
[0021] 在一些实施方案中，本公开涉及不能再生产生植物的细胞，例如用于产生耐受草甘膦的植物细胞系。在其它实施方案中，本公开涉及部分地包含这些细胞的植物。
[0022] 在某些实施方案中，本公开涉及向耕种区域内种植的作物施用多种除草剂。在多种除草剂的基础上附加过顶施用(over the top application)草甘膦，可以对除草剂的不
同性质加以利用，从而提供将更好的灵活性与经济性相结合的杂草控制。例如，各种除草剂可能在耕种区域内具有不同的耐久性；即某些除草剂在施用到该区域后可能持续存在并在
相对长的时间内有效，而其它除草剂可能会被快速降解成其它的和/或无活性的化合物。根据特定的实施方案，改良的除草剂施用系统允许使用草甘膦和多种除草剂，从而种植者能
够根据具体的使用情况调整具体除草剂的选择。
[0023] 在其他实施方案中，本公开涉及用于制作和使用耐受多于一种除草剂或除草剂类型或亚型的植物的方法和组合物，如下文所述。在特定的实施方案中，提供了同时耐受草甘膦和至少一种其它除草剂(或除草剂类型或亚型)或化学品(或化学类型或亚型)(例如杀真
菌剂、杀虫剂、植物生长调节剂等)的植物。这类植物可以用于，例如，包括用多种除草剂处理作物的方法。因此，本公开提供了除草剂抗性植物，其耐受用除草剂或除草剂组合(包括各自通过不同的除草活性模式发挥作用的除草剂的组合)的处理，或者耐受用至少一种除
草剂和至少一种其它化学品的组合的处理。通过这种方式，本公开描述了用于种植作物的
改良方法，其中选择性地控制杂草。
[0024] 根据一些实施方案的除草剂抗性植物可以包括编码可赋予草甘膦耐受性的异源多肽的核酸分子，和编码赋予2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)耐受性的多肽的核酸分子。根据前面的段落，提供至少包括第三核酸分子的植物，该第三核酸分子编码赋予植物从下组选出
的一种性状的多肽：除草剂耐受性性状；昆虫抗性性状；农艺学性状；疾病抗性性状；修饰的脂肪酸性状；和植酸降低的性状。
[0025] 在一些实例中，除草剂抗性的植物包含编码赋予草甘膦耐受性的多肽的异源核酸分子，和编码赋予草胺膦耐受性的多肽的核酸分子。一些实例包括这样的除草剂抗性植物，它们包含编码赋予植物选自下组的性状的多肽的核酸分子：除草剂耐受性性状；昆虫抗性
性状；农艺性状；抗病性性状；修饰的脂肪酸性状；和植酸降低的性状。
[0026] 在特定的实例中，除草剂抗性植物包括编码赋予草甘膦耐受性的多肽的异源核酸分子，和编码赋予对抑制乙酰乳酸合酶(ALS)((Lee et al.(1988)EMBOJ.7:1241)，也称乙
酰羟酸合成酶(AHAS)(Miki et al.(1990)Theor.Appl.Genet.80:449))的除草剂的耐受性
的多肽的核酸分子。一些实例包括这样的除草剂抗性植物，它们包含编码赋予植物选自下
组的性状的多肽的核酸分子：除草剂耐受性性状；昆虫抗性性状；农艺性状；抗病性性状；修饰的脂肪酸性状；和植酸降低的性状。
[0027] 在一些实施方案中，一种核酸可以在植物中与任何其他的核酸分子组合(或“叠加”)，以便，例如但不限于，提供额外的对草甘膦或其它除草剂的抗性或耐受性，提供对选定的昆虫或疾病的抗性，或提供营养强化，提供改良的农艺学性状，和提供可用于饲料、食品、工业用途、医药用途、和/或其它用途的蛋白或其它有用产品。实例包括在植物基因组内叠加两种或更多种感兴趣的核酸。这种“基因叠加”可以通过使用两个或多个事件的常规植物育种、用含有感兴趣的序列的构建体转化植物、转基因植物的再转化、或通过同源重组介导的靶向整合添加新的性状来加以实现。这种叠加的具体实例包括如下的任意组合：dgt-
28核酸；Cry34Ab1核酸；Cry35Ab1核酸；Cry1F核酸；Cry1Ac核酸；aad-12核酸；aad-1核酸；
pat核酸；和DSM-2核酸。
[0028] 具体地，本公开提供以下各项：
[0029] 1.一种分离的核酸分子，其选自下组：
[0030] 包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列有至少80％序列同一性的核苷酸序列的核酸分子；
[0031] 编码与SEQ ID NO:1的氨基酸序列有至少90％序列同一性的多肽的核酸分子；和
[0032] 包含在高严格度条件下与具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列的另一核酸杂交的核苷酸序列的异源核酸。
[0033] 2.项1的核酸分子，其中该核酸包含已被设计用于在植物中表达的人造序列。
[0034] 3.一种载体，其包含项1的核酸分子。
[0035] 4.项3的载体，还包含编码异源多肽的核酸。
[0036] 5.项3的载体，其中所述核酸与启动子可操作连接。
[0037] 6.一种宿主细胞，其含有项1的核酸分子作为与启动子可操作连接的异源核酸。
[0038] 7.项5的载体，其中所述该启动子是AtUbi10启动子。
[0039] 8.项6的宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物细胞。
[0040] 9.一种转基因植物、植物部分、植物器官、植物种子或植物细胞，其包含项1的核酸。
[0041] 10.项9的转基因植物、植物部分、植物器官、植物种子或植物细胞，其中与相同物种的野生型植物相比，该植物、植物部分、植物器官、植物种子和/或植物细胞对草甘膦耐受。
[0042] 11.项9的转基因植物、植物部分、植物器官、植物种子或植物细胞，其中该核酸不编码LGNAAT(SEQ ID NO:141)，并且不编码ALLMXAPLT，其中X选自丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸(SEQ ID NO:142)。
[0043] 12.项9的转基因植物、植物部分、植物器官、植物种子和/或植物细胞，其中该核酸编码与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的多肽，当将该多肽与SEQ ID NO:1对齐时，该多肽在对应于SEQ ID NO:1的84位的位置处包含丙氨酸，和/或在对应于SEQ ID NO:1的172位的位置处包含苏氨酸。
[0044] 13.从项9的转基因植物、植物部分、植物器官、植物种子和/或植物细胞产生的可再生细胞的组织培养物。
[0045] 14.从项9的转基因植物、植物部分、植物器官、植物种子或植物细胞产生的原生质体。
[0046] 15.项13的组织培养物，其中所述可再生细胞是从选自下组的组织类型产生的：叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生细胞、根、根尖、花药、花、茎和荚。
[0047] 16.一种从项13的组织培养物再生的植物，其中该植物对草甘膦是抗性的。
[0048] 17.项9的转基因植物、植物部分、植物器官、植物种子或植物细胞，其中基因组包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性的核酸分子。
[0049] 18.一种产生抗草甘膦的植物、植物部分、植物器官、植物种子或植物细胞的方法，该方法包括：
[0050] 用项1的核酸分子转化植物、植物部分、植物器官、植物种子或植物细胞；和
[0051] 表达与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的多肽。
[0052] 19.根据项18的方法，其中被转化的植物、植物部分、植物器官、植物种子或植物细胞对草甘膦是抗性的。
[0053] 20.根据项18的方法，其中该多肽不包含LGNAAT(SEQ ID NO:141)，和/或不包含ALLMXAPLT，其中X选自丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸(SEQ ID NO:142)。
[0054] 21.根据项18的方法，其中当将该多肽与SEQ ID NO:1对齐时，该多肽在对应于SEQ ID NO:1的84位的位置处包含丙氨酸，和/或在对应于SEQ ID NO:1的172位的位置处包含苏氨酸。
[0055] 22.根据项18的方法，其中所述核酸分子与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性。
[0056] 23.根据项18的方法，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。
[0057] 24.一种用于在含有抗除草剂植物的耕种区内控制杂草的方法，该方法包括：
[0058] 在耕种区内种植包含项1的核酸分子的植物或植物种子；和
[0059] 向耕种区施用足以控制该耕种区中的杂草、而不显著影响该植物或植物种子的量的除草剂。
[0060] 25.根据项24的方法，其中所述除草剂是草甘膦。
[0061] 26.根据项24的方法，其中所述包含项1的核酸分子的植物或植物种子包含编码异源多肽的第二核酸。
[0062] 27.根据项24的方法，其中该第二核酸包含aad-1或aad-12。
[0063] 28.一种在植物中赋予对除草剂的抗性的方法，该方法包括：
[0064] 用DNA构建体转化植物，所述构建体包含与项1的核酸分子可操作连接的启动子；
[0065] 再生转化的植物；和
[0066] 表达所述核酸分子从而产生与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的多肽。
[0067] 29.根据项28的方法，其中所述除草剂是草甘膦。
[0068] 30.根据项28的方法，其中所述DNA构建体包含编码在所述植物中能够表达的异源多肽的第二核酸分子。
[0069] 31.根据项30的方法，其中所述异源多肽包括aad-1或aad-12。
[0070] 32.一种植物，其基因组中稳定整合了项1的核酸作为异源核酸，其中该核酸与启动子可操作连接。
[0071] 33.项32的植物，其中该植物是大豆植物。
[0072] 34.项32的植物，其中该植物是玉米植物。
[0073] 35.项32的植物，其中该植物选自下组：小麦、玉米、大豆、烟草、臂形草、水稻、黍、大麦、番茄、苹果、梨、草莓、橘子、苜蓿、棉花、胡萝卜、马铃薯、甜菜、山药、莴苣、菠菜、矮牵牛、玫瑰、菊花、草坪草、松树、冷杉、云杉、重金属积累植物、向日葵、红花、油菜和拟南芥属(Arabidopsis)。
[0074] 36.项32的植物，其中该植物是选自下列属中的种：天门冬属(Asparagus)、燕麦属(Avena)、臂形草属(Brachiaria)、芸苔属(Brassica)、柑橘属(Citrus)、西瓜属(Citrullus)、辣椒属(Capsicum)、南瓜属(Cucurbita)、胡萝卜属(Daucus)、飞蓬属
(Erigeron)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、大麦属(Hordeum)、向日葵属
(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、黑麦草属(Lolium)、番茄属(Lycopersicon)、苹果属
(Malus)、木薯属(Manihot)、烟草属(Nicotiana)、诸葛菜属(Orychophragmus)、稻属
(Oryza)、鳄梨属(Persea)、菜豆属(Phaseolus)、豌豆属(Pisum)、梨属(Pyrus)、李属
(Prunus)、萝卜属(Raphanus)、黑麦属(Secale)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、小麦属(Triticum)、葡萄属(Vitis)、豇豆属(Vigna)和玉米属(Zea)。
[0075] 37.项8的宿主细胞，其中该植物细胞不可再生而产生植物。
[0076] 38.项9的植物细胞，其中该植物细胞不可再生而产生植物。
[0077] 39.项18的方法，其中不可再生而产生植物的植物细胞被转化。
[0078] 除了上述示例性方面和实施方案之外，进一步的方面和实施方案通过研究下面的描述将易于想到。
[0079] 附图简述
[0080] 图1包括示例EPSP合酶(即，DGT-28、DGT-32、DGT-33及其它)的部分序列比对。这3种示例DGT酶都在aroA EPSP合酶氨基酸位置96处具有一个保守的丙氨酸。该氨基酸的位置用星号指示，且该氨基酸被下划线标出。
[0081] 图2包括示例DGT酶(即，DGT-1、DGT-3和DGT-7)的比对结果。第一个星号指示了从甘氨酸变成丙氨酸的突变氨基酸残基的位置。第二个星号指示了从苏氨酸变成异亮氨酸的
第二个突变氨基酸残基的位置。第三个星号指示了从脯氨酸变成丝氨酸的第三个突变氨基
酸残基的位置。
[0082] 图3-30包括各种示例质粒的图谱：pDAB107527(图3)；pDAB105530(图4)；pDAB105531(图5)；pDAB105532(图6)；pDAB105533(图7)；pDAB105534(图8)；pDAB4104(图
9)；pDAB102715(图10)；pDAB107532(图11)；pDAB107534(图12)；pDAB102785(图13)；
pDAB100445(图14)；pDAB102946(图15)；pDAB100469(图16)；pDAB102028(图17)；
pDAB102029(图18)；pDAB102032(图19)；pDAB102034(图20)；pDAB100429(图21)；
pDAB100442(图22)；pDAB100430(图23)；pDAB102036(图24)；pDAB102038(图25)；
pDAB102040(图26)；pDAB102042(图27)；pDAB107712(图28)；pDAB107713(图29)；和
pDAB107714(图30)。
[0083] 图31包括在DGT-1(A)和DGT-7(B)中导入不同突变后用1mM PEP获得的IC50值。对于图31(A)和图31(B)的IC50曲线，实心三角形代表野生型，实心圆形代表GA突变体，空心方形代表GAPS突变体，实心方形代表TIPS突变体。
[0084] 图32-46包括各种示例质粒的图谱：pDAB102719(图32)；pDAB102718(图33)；pDAB107663(图34)；pDAB107664(图35)；pDAB107665(图36)；pDAB107666(图37)；
pDAB109812(图38)；pDAB101556(图39)；pDAB107698(图40)；pDAB108384(图41)；
pDAB108385(图42)；pDAB108386(图43)；pDAB108387(图44)；pDAB102716(图45)；
pDAB102717(图46)。
[0085] 图47-54包括各种示例质粒的图谱：pDAB110828(图47)；pDAB110827(图48)；pDAB107545(图49)；pDAB107548(图50)；pDAB107553(图51)；pDAB102792(图52)；
pDAB107602(图53)；和pDAB107533(图54)。
[0086] 实施本发明的模式
[0087] I.概览
[0088] 本文公开了参与N-(膦酰基甲基)甘氨酸代谢的新多肽，和编码这些多肽的核酸。在一些实例中，在异源表达这些多肽的植物细胞中这些多肽赋予(或提高)对草甘膦的耐受
性，而例如不会对EPSP合酶与其天然底物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的结合造成不良影响。
[0089] II.术语
[0090] 为了进一步阐明本公开的范围，提供了下列具体的定义、术语和缩写。
[0091] 除非特别定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员所普遍理解的相同的含义。除非它出现的上下文中另有明确指示，否则单数术语应当包括
复数形式，复数术语应当理解为包括单数形式。因此，不定冠词“一个/种”和“该”当在要素或组分的前面使用时对该元件或组分的实例(即出现)数目没有限定作用。当在本文中提供
数值的范围时(例如，“小于大约X”，“小于X”和“例如，X1...和X2”)，该范围应当理解为包括所提供范围内包含的所有数值和数值范围，就如同这些所包含的数值和范围被明确地列举
一样。
[0092] 如本文中所使用的，术语“包括”，“包含”，“具有”和“含有”及其变化形式，是开放式的(即，非排他的)。例如，包含一系列要素的组合物或方法，不必仅限于那些要素。这样的组合物或方法可以(或者可以不)包括其他未明确列出的或该组合物或方法固有的要素。此外，除非明确相反地说明，否则“或”的使用表示包含的(不是排他的)意义。例如，条件“A或B”可由下列的任一种满足：A真(或存在)且B假(或不存在)；-A假(或不存在)且B真(或存
在)；-A和B都真(或存在)。
[0093] 植物：如本文所使用的，术语“植物”包括整个植物及植物的任何后代、细胞、组织、或部分。术语“植物部分”包括植物的任何部分，包括，例如但不限于：种子(包括成熟种子和未成熟种子)；植物插条；植物细胞；植物细胞培养物；植物器官(如花粉、胚、花、果实、芽(shoot)、叶、根、茎、和外植体)。植物组织或植物器官可以是种子、原生质体、愈伤组织、或者任何其他被组织成一定结构或功能单元的植物细胞群。植物细胞或组织培养物可能能够再生出具有该细胞或组织所来源的植物的生理学和形态学特征的植物，并且可能能够再生
出与该植物具有基本上相同的基因型的植物。与之相反，一些植物细胞不能够再生产生植
物。植物细胞或组织培养物中的可再生细胞可以是胚、原生质体、分生组织细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、须、花、果仁、穗、穗轴、壳、或茎。
[0094] 植物部分包括可收获的部分和可用于繁殖后代植物的部分。可用于繁殖的植物部分包括，例如但不限于：种子；果实；插条；苗；块茎；和根砧木。植物的可收获部分可以是植物的任何有用部分，包括，例如但不限于：花；花粉；苗；块茎；叶；茎；果实；种子；和根。
[0095] 植物细胞是植物的结构和生理的单位，包括原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单细胞或细胞聚集体的形式(例如，松散型(friable)愈伤组织和培养细胞)，并且可以是更高级有组织单元的一部分(例如，植物组织、植物器官、和植物)。因此，植物细胞可以是原生质体、配子产生细胞、或可以再生成完整植物的细胞或细胞集合。因此，包括多个植物细胞并能够再生为完整植物的种子，在本文的实施方案中被认为是一个“植物细胞”。
[0096] 除草剂抗性/耐受性：当指称抗草甘膦或耐受草甘膦的植物时，它意味着对该植物施用一定量的草甘膦不会显著影响或杀死植物，而相同物种的野生型植物将由于该一定量
的草甘膦的施用而受到显著影响和/或被杀死。植物可能天然耐受特定的除草剂，或者植物可能作为遗传工程的结果而被赋予除草剂耐受性，所述遗传工程例如选择性育种、遗传转
化、和/或在植物基因组中导入转基因。“草甘膦抗性植物”是指含有如下多肽或核酸分子的植物，其中当将该多肽或核酸分子提供给表达它的异源植物或其他生物时，它赋予除草剂
耐受性(即，使植物或其它生物对除草剂耐受)。
[0097] 对草甘膦抗性或耐受性植物施用草甘膦，植物可能会显示受到施用的某些微小的影响。例如，植物的正常生长和发育可能会发生改变，其中植物可会显示与胁迫或疾病相关的征象或症状。对草甘膦抗性或耐受性植物施用草甘膦造成的这种微小影响，与对草甘膦
敏感植物施用草甘膦造成的有害影响形成对照。本领域技术人员可以区分出草甘膦抗性植
物和草甘膦敏感植物之间的差异。对含有赋予草甘膦耐受性的核酸的植物施用草甘膦造成
的影响显著小于对不含赋予草甘膦耐受性的核酸分子的相同物种植物施用相同量的草甘
膦。
[0098] 耐受除草剂或其它化学品的植物比合适的对照植物显示更好的耐受性。除草剂或其它化学品处理所造成的损害可以通过评估植物生长或良好生存状态的任何参数进行评
价。这些参数是本领域技术人员已知的，它们的选择可由本领域技术人员自由裁量。植物损害可以通过对植物个体或植物群的一个或多个合适的植物生长或良好生存状态参数进行
目测检查和/或统计分析进行评价。因此，可以通过评估包括例如但不限于下列的参数来评价损害：植株高度；植株重量；叶色；叶长；开花；育性；抽须(silking)；产量；和种子产生。还可以通过评估到特定发育阶段(例如抽须、开花和花粉脱落)为止所经过的时间，或者到植
物从特定化学品和/或除草剂处理恢复为止所经过的时间来评价损害。
[0099] 在进行损害评价时，可以给特定的损害程度赋值，以便进行统计学分析或定量比较。使用值的范围描述特定程度的损害是本领域已知的，并且可以使用任何合适的范围或
量表。例如，可以指配除草剂损伤得分(也称作耐受性得分)。相应地，如果在该量表中其他级别处，合适的对照植物(或对照植物群)响应于除草剂处理显示的得分统计学上显著地低
于主题群，则除草剂耐受性也可以用该量表中的其它级别表示。
[0100] 由除草剂或其它化学品导致的损害可以在用除草剂处理植物之后不同时间进行评估。很多时候，损害评价大约在对照植物表现出最大损伤时进行。有时，待没有用除草剂或其它化学品处理的对照植物经过一段时间，与给予处理之时的大小和发育阶段相比已经
发生了可测量的生长和/或发育之后，再评估损害。损害评估可以在任何合适的时间进行，合适的时间有许多，例如在用除草剂处理主题植物后12小时；1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，
12，13，和/或14天；3和/或4周；或者更长的时间。任何评估时间，只要容许检测测试植物与对照植物对处理的响应差异，就是合适的。
[0101] 当除草剂对植物无影响，当除草剂对植物有一些影响但植物随后从影响恢复，或者当除草剂对植物产生一些有害的影响但是有害的影响被抵消，例如被该特定的除草剂对
杂草的影响所抵消时，则除草剂对植物没有“显著影响”。因此，例如，如果植物与合适的对照植物(例如相同物种的未被处理的植物)相比，至少一个可以指示植物健康和/或生产力
的合适参数显示的降低小于约25％，小于约20％，小于约15％，小于约10％以下，大于约
9％，小于约8％，少于约7％，少于约6％，小于约5％，小于约4％，少于约3％，小于约2％，或小于约1％，则作物可能不被除草剂或其它处理“显著影响”。在特定的实施方案中，如果植物与合适的对照植物相比，其显示的损害相比于对照植物所显示的损害低至少40％，45％，
50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，90％，100％，150％，200％，250％，300％，400％，
500％，600％，700％，800％，900％，或1000％或者更多，则该植物对除草剂或其它化学品耐受。不被除草剂或其它处理显著影响的作物可以在至少一个参数上显示降低，但是该降低
在性质上是暂时的，并且植物在例如约1周，约2周，约3周，约4周或约6周内完全恢复。在特定的实施方案中，耐受除草剂或其它化学品的植物可以有这样的特征：即该植物不被该除
草剂或其它化学品的施用所显著影响。
[0102] 可指示植物健康和/或生产力的合适参数包括，例如但不限于：植物高度；植株重量；叶长；到特定发育阶段为止所经过的时间；开花；产量；和种子产生。参数评估可以通过目视检查和/或通过对参数的统计学分析来实施。当对主题植物和对照植物进行评价时，可以进行比较以确定主题植物是否被除草剂或其它化学品显著影响。
[0103] 可用于确定对除草剂(或其它化学品)耐受性的合适对照植物包括属于相同物种但不含有推定的异源除草剂耐受性核酸和/或多肽的植物，和确实含有推定的异源除草剂
耐受性核酸和/或多肽但没有用除草剂处理过的植物。
[0104] 除草剂：“除草剂”是可以对植物造成暂时或永久损伤的化学品。本文其它地方更详细地列出并论述了除草剂的非限制性实例。除草剂可以被纳入到植物或其细胞内，或者它可以在不被纳入的条件下对植物或细胞发挥作用。“活性成分”是除草剂制剂中负责该制剂的植物毒性的化学物质。商业除草剂制剂中的活性成分通常在产品标签上被标识为活性
成分。产品标签信息可以从美国环境保护局获取，并在oaspub.epa.gov/pestlabl/
ppls.own上有在线更新。产品标签信息还可以在www.cdms.net上在线获取。
[0105] 当关于除草剂使用时，术语“酸当量”是指以除草活性母体酸计的比例或量。
[0106] 分离的：“分离的”生物组分(例如，核酸或多肽)已经与该组分天然存在的生物细胞中的其它生物组分(即，其它染色体或染色体外DNA和RNA，和蛋白)实质上分离、与之分别产生、或从之纯化出来，在分离、产生和纯化的同时实现了该组分的化学或功能变化(例如核酸可以通过断裂连接该核酸与染色体中其余DNA的化学键而从染色体分离)。已经“分离的”核酸分子和蛋白包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白。该术语还包括通过在
宿主细胞内重组表达制备的核酸分子和蛋白，以及化学合成的核酸分子、蛋白和肽。
[0107] 核酸：术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中可以互换使用，并包括单个核酸、多个核酸、核酸片段、变体或其衍生物、和核酸构建体(例如信使RNA(mRNA)和质粒DNA(pDNA))。多核苷酸或核酸可以含有全长cDNA序列、或其片段的核苷酸序列，包括非翻译的5’和/或3’序列和编码序列。多核苷酸或核酸可以由任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸构成，其可以包括未修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或修饰的核糖核苷酸或脱
氧核糖核苷酸。例如，多核苷酸或核酸可以包括单链、双链DNA；单链区和双链区混合物DNA；
单链和双链RNA；单链区和双链区混合物RNA。包含DNA和RNA的杂交分子可以是单、双链、或单链区和双链区的混合物。前述术语还包括化学、酶学和代谢修饰形式的多核苷酸或核酸。
[0108] 应当理解，具体的DNA还指其互补物，其序列根据脱氧核糖核苷酸碱基配对的规则确定。
[0109] 如本文所使用的，术语“基因”是指编码功能产物(RNA或多肽/蛋白)的核酸。基因可以包含位于编码功能产物的序列之前(5’非编码序列)和/或之后(3’非编码序列)的调节序列。
[0110] 如本文所使用的，术语“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的核酸序列。“调节序列”是指位于编码序列上游(例如，5’非编码序列)、内部或下游(例如，3’非编码序列)的核苷酸序列，其影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调节序列包括，例如但不限于：启动子；翻译前导序列；内含子；多腺苷酸化识别序列；RNA加工位点；效应物结合位点；和茎环结构。
[0111] 如本文所使用的，术语“密码子简并性”是指遗传密码的冗余性，其允许特定核苷酸序列发生变异但不会影响所编码多肽的氨基酸序列。因为每个密码子由3个核苷酸构成，并且构成DNA的核苷酸被限制于4种特定的碱基，所以有64种可能的核苷酸组合，其中61种编码氨基酸(其余3个密码子编码终止翻译信号)。结果，许多氨基酸被多于一种密码子指
定。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由4种三联体编码，丝氨酸和精氨酸由6种三联体编码，而色氨酸和甲硫氨酸只有1种三联体编码。显示哪些密码子编码哪些氨基酸的“遗传密码”是本领域公知的。其中的简并性允许DNA碱基在一个宽广的范围内变化，而不会影响由该DNA
编码的蛋白质的氨基酸序列。
[0112] 在本文的一些实施方案中，当设计密码子序列用于在宿主细胞内获得改良的表达时，设计基因使其中的密码子使用频率接近宿主细胞的优选密码子利用的频率。因此，术语“密码子优化的”是指用于转化各种宿主的基因和核酸编码序列，其中该基因或编码序列的密码子已被改变，以反映宿主生物的典型密码子利用率，但不改变由该核酸编码的多肽。在实例中，这种优化包括用生物基因中更频繁使用的一个或多个密码子代替该基因或编码序
列中的至少一个、超过1个、显著数量的、和/或全部的密码子。
[0113] 许多生物显示偏好使用特定的密码子来编码伸长肽链中的特定氨基酸插入物。密码子优先性或密码子偏好性(在生物之间密码子利用率的差异)是由遗传密码的简并性提
供的，并且在许多生物中有大量证据证明。密码子偏好性经常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而该翻译效率则被认为依赖于(但不仅仅依赖于)接受翻译的密码子的性质和特定的
转运RNA(tRNA)分子的可得性。细胞内选定的tRNA的优势一般反映了最频繁用于肽合成的
密码子。因此，可以根据密码子优化对基因进行裁量或设计，以便在给定生物内实现最佳的基因表达。
[0114] 由于有多种多样的动物、植物和微生物物种的大量的基因序列可用，所以有可能计算密码子利用率的相对频率。密码子利用率表可以容易地获得，例如在互联网
kazusa.or.jp/codon/上可访问的“Codon Usage Database”中，并且这些表可以通过不同的方式调整适用。见Nakamura et al.(2000)Nucl.Acids Res.28:292。利用密码子利用率
表，本领域技术人员能够将相应于给定物种的频率应用于任何给定多肽序列，来设计和产
生密码子优化的编码区的人造核酸片段，该编码区编码该多肽，但是使用对该物种而言最
优的密码子。
[0115] 密码子偏好在蛋白编码区的平均碱基组成上有反映。例如，基因组中G+C含量相对较低的生物使用更多在同义密码子第三位中具有A或T的密码子，而G+C含量较高的生物则
使用更多在第三位是G或C的密码子。此外，人们认为在mRNA中存在的“稀有”密码子可能会降低该mRNA的绝对翻译速度，特别是当相应于该稀有密码子的负载tRNA的相对丰度较低
时。这个推理的一个推论是，对于多个稀有密码子而言，单个稀有密码子对翻译速度的减少可能至少是叠加性的。因此，具有高相对含量的稀有密码子的mRNA的翻译速度会相应降低。
该速度可能反映在所编码蛋白相对低水平上。
[0116] 密码子偏好可以作为单个密码子相对于所有氨基酸密码子的相对使用频率来计算。或者，密码子偏好可以作为用于编码特定氨基酸的单个密码子相对于该氨基酸的所有
其它密码子(同义密码子)的相对使用频率来加以计算。
[0117] 术语“百分比同一性”(或“％同一性”)是指两个或多个多肽序列(或多核苷酸序列)通过序列比较确定的相互关系。百分比同一性可以表示多肽(或多核苷酸)序列之间序
列相关性的程度，并可以通过这些序列的串之间的匹配加以确定。一般而言，同一性分别是指两个多核苷酸或多肽序列的精确核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸一致性。两个序列，无
论是核酸还是氨基酸序列，的百分比同一性是两个对齐的序列之间精确匹配的数目除以较
短序列的长度，再乘以100。见Russell and Barton(1994)J.Mol.Biol.244:33250。
[0118] 用于比对核酸和氨基酸序列并确定同一性的技术是本领域已知的，包括例如但不限于，在下列文献中提供的：Computational Molecular Biology(1988)(Lesk,A.M.,Ed.)
Oxford University,NY；Biocomputing:Informatics and Genome Projects(1993)
(Smith,D.W.,Ed.)Academic,NY；Computer Analysis of Sequence Data,Part I(1994)
(Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,编辑)Humania,NJ；Sequence Analysis in Molecular Biology(1987)(von Heinje,G.,Ed.)Academic,NY；和Sequence Analysis Primer(1991)
(Gribskov,M.and Devereux,J.,Eds.)Stockton,NY。用于确定两个序列之间百分比同一性
的技术可包括提供mRNA或基因的核苷酸序列和/或提供或推断由其编码的氨基酸序列，和
将该序列与第二个核苷酸和/或氨基酸序列进行比较。基因组序列也可以按照这种方式加
以确定和比较。
[0119] 此外，用于比对核酸和氨基酸序列和确定同一性的方法纳入在各种公众可得的计算机软件程序中。序列比对和百分比同一性计算可以使用，例如，如下程序实施：Vector
软件包的AlignXTM程序(Invitrogen,Carlsbad,CA)或LASERGENETM生物信息学计算软
件包的MegAlignTM程序(DNASTARTMInc.,Madison,WI)。序列的多重比对可以用ClustalTM方法实施，其包括多种比对算法版本，包括ClustalTMV和ClustalTMW(Higgins and Sharp
(1989)。CABIOS 5:151 3；Higgins et al.(1992)Comput.Appl.Biosci.8:18991)。对于
ClustalTMV中的多重比对，可使用的默认值包括空位罚分＝10和空位长度罚分＝10。
ClustalTMW中多重比对的默认参数包括(空位罚分＝10，空位长度罚分＝0.2，延迟发散序列(Delay Divergen Seqs)(％)＝30,DNA转换权重(DNA Transition Weight)＝0.5、蛋白质
权重矩阵(Protein Weight Matrix)＝Gonnet系列、DNA权重矩阵(DNA Weight Matrix)＝
IUB)。可以在ClustalTM方法中使用的用于在蛋白序列之间进行逐对比对和百分比同一性计算的默认参数是：KTUPLE＝1、空位罚分＝3、窗口(WINDOW)＝5和DIAGONALS SAVED＝5。对于核酸，这些默认参数为KTUPLE＝2，空位罚分＝5，窗口＝4和DIAGONALS SAVED＝4。在用
ClustalTM程序进行序列比对后，有可能通过观察相同程序中的“序列距离”(sequence 
distances)表来获得“百分比同一性”。
[0120] 在一些实施方案中，核酸编码如下的多肽，该多肽(当与参考多肽比较时，例如DGT多肽)具有例如但不限于：至少大约55％；至少大约60％；至少大约65％；至少大约70％；至少大约75％；至少大约80％；至少大约85％；至少大约90％；和至少大约95％的同一性，具有与参考多肽相同或相似的功能。因此，在本文中可以使用从例如55％至100％同一性的任何整数百分比描述特定的核酸，例如但不限于：55％,56％,57％,58％,59％,60％,61％,62％,63％,64％,65％,66％,67％,68％,69％,70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,
77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,
92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,和99％。某些核酸片段不仅具有前述的序列同一
性，而且可以编码如下的多肽，该多肽具有，例如但不限于：至少50个氨基酸；至少100个氨基酸；至少150个氨基酸；至少200个氨基酸；和至少250个氨基酸。特定的实施方案包括与SEQ ID NO:1具有至少大约90％同一性的核酸(例如，至少89％同一性；至少大约90％同一
性；至少大约91％同一性；至少大约92％同一性；至少大约93％同一性；至少大约94％同一性；至少大约95％同一性；至少大约96％同一性；至少大约97％同一性；至少大约98％同一性；至少大约99％同一性；和至少大约99.5％同一性)。
[0121] 术语“序列分析软件”是指一种计算机算法或软件程序，其可用于分析核苷酸或氨基酸序列。“序列分析软件”可以商业获得或独立开发。序列分析软件的非限制性实例包括：GCG程序软件包(Wisconsin Package Version 9.0，Genetics ComputerGroup(GCG)，
Madison，WI)；BLASTPTM,BLASTNTM,和BLASTXTM(Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:
403-10)；DNASTARTM(DNASTARTM,Inc.Madison,WI)；SequencherTM(Gene Codes 
TM
Corporation,Ann Arbor,MI)；和整合了Smith Waterman算法的FASTA 程序(Pearson
(1994)Comput. Methods Genome Res.[Proc.Int.Symp.],Meeting Date 1992(Suhai and 
Sandor,编辑),Plenum:New York,NY,pp.111-20)。在本文中使用序列分析软件分析核苷酸
或氨基酸序列时，除非另外指明，否则所显示的分析结果是使用所参考程序的默认值产生
的。如本文所使用的，术语“默认值”是指在首次初始化软件时，序列分析软件最初加载的一系列值或参数。
[0122] 杂交：包含全部或部分核苷酸序列的核酸可以用作探针，与克隆的基因组DNA片段或cDNA片段(例如，来自所选生物的基因组或cDNA文库)群体中存在的、与探针序列具有显
著量的序列同一性的核苷酸序列选择性“杂交”。杂交探针可以是基因组DNA片段、质粒DNA片段、cDNA片段、RNA片段、PCR扩增的DNA片段、寡核苷酸、或其他多聚核苷酸，并且探针可以用可检测的基团(例如32P)或任何其他可检测的标记标记。因此，例如但不限于，用于杂交的探针可以通过标记可特异性杂交本文中的核酸(例如与SEQ ID NO:1具有至少大约90％同
一性的核酸)的人造寡核苷酸加以制备。用于制备杂交探针和用于构建cDNA和基因组文库
的方法是本领域已知的。Sambrook等人.(1989)Molecular Cloning: A Laboratory 
Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,
NY。关于核酸杂交的详尽指导可以参见Sambrook等人(1989)，同上；和Ausubel等人(1997)Short Protocols in Molecular Biology,Third Edition，Wiley，NY，New York，pp.2-40。
[0123] 在一些实施方案中，核酸杂交(例如，对扩增的DNA的杂交)可用于鉴定样品中转基因事件的存在。核酸分子或其片段能够在某些条件下与另一个核酸分子“特异性杂交”。在一些实例中，核酸在严格的条件下与靶核酸特异性杂交。如本文所使用的，如果两个核酸分子能够在严格(例如高严格度)条件下形成反平行双链核酸结构，则称这两个核酸分子能够
彼此特异性杂交。
[0124] 如果一个核酸分子与另一个核酸分子显示完全的序列互补性，则称这两个核酸分子“互补”。如本文所使用的，当一个分子的每一个核苷酸都与另一个的核苷酸互补时，则说核酸显示“完全互补性”。显示完全互补性的分子一般可以彼此杂交，并具有足够的稳定性，从而允许它们在常规的“高严格度”条件下仍保持彼此退火。常规的高严格条件如上文
Sambrook等人(1989)所述。
[0125] 如果两个分子彼此杂交，并具有足够的稳定性，从而允许它们至少在常规的“低严格度”条件下仍保持彼此退火，则称它们显示“最小互补性”。常规的低严格条件如上文Sambrook等人(1989)所述。核酸分子要用作引物或探针，仅需要显示能够在所采用的特定
溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构的最小的序列互补性即可。
[0126] 影响杂交严格度的因素是本领域技术人员众所周知的，包括例如：温度；pH；离子强度；和有机溶剂(例如甲酰胺和二甲基亚砜)的浓度。如本领域技术人员已知的，杂交严格度随着温度升高、离子强度降低、和溶剂浓度降低而增加。严格条件还可以通过添加去稳定剂例如甲酰胺来实现。
[0127] 术语“严格条件”或“严格度条件”是考虑一个核酸与另一个靶核酸(即，与包含感兴趣的特定核苷酸序列的核酸分子)根据Sambrook等人(1989)，同上(在9.52-9.55)中讨论的具体杂交程序的杂交而定义的。另见Sambrook等人(1989)-9.47-9.52和9.56-9.58。
[0128] 在许多应用中，特异性与杂交后洗涤条件有关，其中因素包括洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交，熔点温度(Tm)可以近似地用如下的公式计算：
[0129] Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％甲)-500/L,   (1)
[0130] 其中M是单价阳离子的摩尔数，％GC是DNA中鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比，％甲是杂交溶液中甲酰胺的百分比，L是碱基对的杂交长度。Meinkoth and Wahl(1984)
Anal.Biochem.138:267-84。
[0131] Tm是这样的温度(在特定的离子强度和pH下)：在此温度，50％的互补靶序列与完美匹配的探针杂交。每有1％的错配，Tm下降大约1℃。因此，可以调整Tm、杂交、和/或洗涤条件，以便让具有期望的同一性的序列杂交。例如，如果寻找有90％同一性的杂交序列，则可以将Tm降低10℃(在特定的离子强度和pH下)。例如，严格条件可以选择比具体序列与其互
补物在特定离子强度和pH下的热熔点(Tm)低大约5℃的温度。然而，极严格条件可以在比Tm低1、2、3或4℃的温度下进行杂交和/或洗涤；中等严格条件可以使用比Tm低6、7、8、9或10℃的温度进行杂交和/或洗涤；低严格条件可以使用比Tm低11-20℃的温度进行杂交和/或洗
涤。
[0132] 在一些实例中，严格条件是如下的条件，其中盐浓度小于大约1.5M Na+(例如大约0.01-1.0M Na+)，pH 7.0-8.3,温度为短核苷酸(例如长度为10-50个核苷酸)至少大约30℃
和长探针(例如长度大于50个核苷酸)至少大约60℃。低严格条件的实例包括在37℃的30-
35％甲酰胺缓冲液、1.0M NaCl、0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)中杂交，在50-55℃的1X-2X 
SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。中严格条件的实例包括在37℃的40-
45％甲酰胺、1.0M NaCl、0.1％SDS中杂交，在55-60℃的0.5X-1X SSC中洗涤。高严格条件的实例包括在37℃的大约50％甲酰胺、大约1.0M钠盐、大约0.1％SDS中杂交，在约60-65℃的约0.1X SSC中洗涤。
[0133] 如本文所使用的，术语“多肽”包括单个多肽、多个多肽、和其片段。该术语是指由通过酰胺键(也称作肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指两个或多个氨基酸构成的任何链，且不指示产物的具体长度和大小。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、蛋白质、氨基酸链、和任何其它用于指示有两个或多个氨基酸的链的术语均包含在“多肽”的定义之内，并且前述术语在本文中可以和“多肽”互换使用。多肽可以是从天然生物源分离的或者通过重组技术产生的，但是具体的多肽不一定是从特定的核酸翻译产生的。多肽可以用任何合适的方式产生，包括例如但不限于，通过化学合成。
[0134] 内源的和异源的：如本文所使用的，术语“天然的”是指在自然界中发现的、并与其自身的调节序列(如果存在的话)在一起的多核苷酸、基因或多肽形式。术语“内源的”是指处于生物或生物基因组中的天然位置处的多核苷酸、基因或多肽的天然形式。
[0135] 相反，术语“异源的”是指在参考(宿主)生物的位置处通常不会发现的多核苷酸、基因或多肽。例如，异源核酸可以是通常在参考生物的不同基因组位置处被发现的核酸。作为进一步的实例，异源核酸可以是通常不会在参考生物中被发现的核酸。含有异源多核苷酸、基因或多肽的宿主生物可以通过将异源多核苷酸、基因或多肽导入到宿主生物内而产
生。在特定的实例中，异源多核苷酸包括以不同于相应的天然多核苷酸的形式被重新导入
到来源生物内的天然编码序列、或其部分。在特定的实例中，异源基因包括以不同于相应的天然基因的形式被重新导入到来源生物内的天然编码序列或其部分。例如，异源基因可以
包括天然编码序列，该天然编码序列是含有非天然调节区的嵌合基因的一部分，该嵌合基
因被重新导入到天然宿主内。在特定的实例中，异源多肽是以不同于相应的天然多肽的形
式被重新导入到来源生物内的天然多肽。
[0136] 异源基因或多肽可以是这样的基因或多肽，其包含功能性多肽或编码功能性多肽的核酸序列，该功能性多肽或编码功能性多肽的核酸序列与其它基因或多肽融合从而产生
嵌合或融合的多肽或编码它的基因。基因和蛋白的特定实施方案包括具体例举的全长序列
和部分、区段、片段(包括与全长分子相比具有内部和/或末端缺失的连续片段)、变体、突变体、嵌合体、以及这些序列的融合。
[0137] 修饰：如本文所使用的，术语“修饰”可以指特定参考多核苷酸内的改变，其导致由该参考多核苷酸编码的多肽的活性降低、基本上消失、或消失。修饰还指参考多肽中的改变，其导致参考多肽的活性减低、基本上消失、或消失。或者，术语“修饰”可以指参考多核苷酸中的改变，其导致该参考多核苷酸编码的多肽的活性增加或提高，以及参考多肽中的改
变，其导致参考多肽的活性增加或提高。诸如前述的改变可以通过任何本领域众所周知的
方法实现，这样的方法有若干种，包括，例如但不限于：缺失参考分子的一部分；突变参考分子(例如通过自发诱变；通过随机诱变；通过增变基因导致的诱变；和通过转座子诱变)；取代参考分子的一部分；在参考分子内插入元件；下调参考分子的表达；改变参考分子的细胞定位；改变参考分子的状态(例如通过参考多核苷酸的甲基化，和通过参考多肽的磷酸化或泛素化)；除去参考分子的辅助因子；导入靶向参考分子的反义RNA/DNA；导入靶向参考分子的干扰RNA/DNA；参考分子的化学修饰；参考分子的共价修饰；用UV辐射或X射线辐照参考分子；改变参考分子的同源重组；改变参考分子的有丝分裂重组；代替参考分子的启动子；和/或前述的任意组合。
[0138] 可以通过比较参考多核苷酸或多肽的序列与同源(例如同源酵母或细菌)多核苷酸或多肽的序列，并使高度同源区(保守区)或共有序列中的修饰数目最大化，来找到确定
在具体实例中哪些核苷酸或氨基酸残基可以被修饰的指引。
[0139] 衍生物和变体：如本文所使用的，术语“衍生物”是指本文示例序列的修饰物。这些修饰包括本文中的编码序列中的一个或多个碱基的取代、插入、和/或缺失，这些修饰可保留、略微改变、或增加该编码序列在作物物种中的功能。这些衍生物可以由本领域技术人员容易地确定，例如但不限于，通过使用用于预测和优化序列结构的计算机建模技术来确定。因此，术语“衍生物”也包括这样的异源核酸，它们包含与本文中的示例序列具有相当大的序列同一性的序列，从而使它们可具有相同、略微改变、或增加的用于在作物植物中表达
DGT-28的功能性。
[0140] 如本文所使用的，术语“变体”是指这样的多肽，其由于氨基酸的插入、缺失、突变、和/或取代而与本文的示例多肽有差异，插入、缺失、突变、和/或取代可以使用，例如但不限于，重组DNA技术加以导入。关于确定参考氨基酸序列中的哪些氨基酸残基可以取代、添加或缺失的指引，可以通过比较特定参考多肽的序列与同源多肽的序列，并使高度同源区(保守区)中被改变的氨基酸序列数目最小化，或通过用共有序列代替这些氨基酸来找到。变体多肽可以具有被取代的氨基酸，但同时仍保留参照多肽的功能活性。“变体”基因包括编码与参考基因相同的多肽，或者与参考多肽具有等价或相似活性的等价多肽的核苷酸序列。
[0141] 在一些实施方案中，变体基因可用于产生变体蛋白，并且重组宿主可用于产生变体蛋白。例如，可以构建成含有任何本文例证序列的连续残基(氨基酸或核苷酸)的变体基
因和蛋白。变体基因或蛋白可以具有，例如但不限于：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、
41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、
66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、
91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、
112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、
131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、
150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、
169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、
188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、
207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、
226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、
245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、
264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、
283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、和293个连续残基(氨基酸或核苷酸)，其相应于示例序列中的一个(相同大小的)区段。类似大小的区段，特别是保守区的区段，也可用作探针和/或引物。
[0142] 本领域的技术人员应当理解，许多水平的序列同一性均可用于鉴定与参考多肽具有相同或相似功能或活性的多肽(例如，来自其它物种)。在一些实施方案中，具有例如，但不限于：至少大约55％；至少大约60％；至少大约65％；至少大约70％；至少大约75％；至少大约80％；至少大约85％；至少大约90％；和至少大约95％序列同一性(与参考多肽，例如DGT 28多肽相比)的变体多肽具有与参考多肽相同或相似的功能。
[0143] 可以通过获取并检查感兴趣蛋白的结构(例如，从晶体结构和/或分子模型获得原子3-D(三维)坐标)，来确定包含特定分子的连续残基的变体基因和蛋白的设计和构建策
略。在一些实例中，策略可以指向蛋白质中对于修饰而言理想的某些区段，例如表面暴露的区段，而不是涉及蛋白质折叠和至关重要的3-D结构完整性的内部区段。例如，美国专利
No.5,605,793涉及通过在随机或聚焦(focused)断裂之后利用DNA再装配来生成额外的分
子多样性的方法。这可以称作基因“改组(shuffling)”，其通常包括混合两种或多种不同DNA分子的(期望大小的)片段，然后进行重复多轮复性。这种处理可以改进由主题基因编码的蛋白质的活性。结果可能是一种嵌合蛋白质，其具有改进的活性、改变的底物特异性、增加的酶稳定性、改变的立体特异性(stereospecificity)、或其他特征。
[0144] 氨基酸“取代”可以是用另一个具有相似结构和/或化学性质的氨基酸代替参考序列中的一个氨基酸(即，保守的氨基酸取代)，或者可用一个具有不同结构和/或化学性质的氨基酸代替参考序列中的一个氨基酸(即，非保守的氨基酸取代)。氨基酸可以分成如下的
结构和/或化学类别：非极性、不带电荷的极性、碱性、和酸性。相应地，可以根据所涉及的残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、或两亲性质上的相似性进行“保守”氨基酸取代。
例如，非极性(疏水)氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；不带电荷的(中性)极性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。或者，可以通过选择这些氨基酸中的任何种类
在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、或两亲性质上的差异性来进行“非保守”氨基酸取代。“插入”或“缺失”可以在重组蛋白质在结构或功能上可以耐受的变化范围内。
[0145] 在一些实施方案中，变体蛋白质相对于参考全长蛋白质是“截短的”。在一些实例中，截短的蛋白质保留参考蛋白质的功能活性。“截短的”蛋白质意思是指蛋白质的一部分可以被例如切掉，而剩下的截短的蛋白质在切割后仍保留并显示期望的活性。切割可以用任何蛋白质酶实现，这样的蛋白酶有很多种。此外，有效切割的蛋白质可以用分子生物学技术产生，其中通过限制性内切核酸酶消化或者通过本领域技术人员可用的其它技术，从编
码序列中去除编码蛋白质的一部分的DNA碱基。截短的蛋白质可以在异源系统中表达，例
如，大肠杆菌、杆状病毒、基于植物的病毒系统和酵母。赋予除草剂耐受性的截短蛋白质可以通过使用异源系统在除草剂耐受性生物测定体系中表达蛋白质来加以确认，例如本文中
所述。本领域公知，可成功地产生截短蛋白质，并使它们保留全长参考蛋白质的功能活性。
例如，Bt蛋白质可以以一种截短的(核心蛋白质)形式使用。参见，例如，Hofte and 
Whiteley(1989)Microbiol.Rev.53(2):242 55；和Adang et al.(1985)Gene 36:289 300。
[0146] 在一些情况下，特别是用于在植物中表达的情况下，使用表达截短蛋白质的截短基因可能是有利的。截短基因可以编码由例如全长蛋白质的40、41、42、43、44、45、46、47、
48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、
73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、
98、或99％构成的多肽。
[0147] 本领域的技术人员可确定保留作为其设计来源的参考序列的功能的变体基因和蛋白质，例如通过测定重组变体的活性加以确定。如果这种活性测定是已知的并且已经被
表征，那么功能变体的确定仅需要常规的实验。
[0148] 可以对酶“活性位点”进行特异性改变，以影响其在活性或立体结构特异性方面的固有功能性。参见Muller et.al.(2006)Protein Sci.15(6):1356 68。例如，已知的tauD结构已被用作一种模式双加氧酶，用来在与其固有底物牛磺酸结合的情况下确定活性位点残基。参见Elkins et al.(2002)Biochemistry 41(16):5185 92。关于酶活性位点的序列优
化和可设计性的信息可以参见Chakrabarti et al.(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102
(34):12035 40。
[0149] 可以改变蛋白质的各种结构性质和三维结构特征，而不对蛋白质的活性/功能性造成不良影响。可以进行不会对分子活性和/或三维构象造成不良影响的保守氨基酸取代
(“耐受性(tolerated)”取代)。还可以设计与参考蛋白质在序列水平上不同、但保留相同或相似的总体关键三维结构、表面电荷分布等的变体蛋白质。参见例如美国专利7,058,515；
Larson et  al.(2002)Protein  Sci.11:2804 13；Crameri  et al.(1997)
Nat.Biotechnol.15:436 8；Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747 51；
Stemmer(1994)Nature 370:389 91；Stemmer(1995)Bio/Technology 13:549 53；Crameri et al.(1996)Nat.Med.2:1003；和Crameri et al.(1996)Nat.Biotechnol.14:3159。
[0150] 对适合于在表达构建体(例如，DGT-28表达构建体)中使用的5'或3'UTR(例如，人造发夹)也可以实施计算机设计，这样的计算机设计可用于设计本文一些实施方案的核酸
内的元件。用于预测/评估5'或3'UTR衍生物的计算机建模和UTR和计算机建模技术包括，例TM
如但不限于：MFoLd 3.1版(可以从Genetics Corporation Group,Madison,WI获得；见
Zucker et al.“Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure 
Prediction:A Practical Guide,”录自RNA Biochemistry and Biotechnology,1143,
J.Barciszewski&B.F.C.Clark编辑,NATO ASI Series,Kluwer Academic Publishers,
Dordrecht,NL,1999；Zucker et al.(1999)J.Mol.Biol.288:91140；Zucker et al.“RNA Secondary Structure Prediction,”录自Current Protocols in Nucleic Acid 
Chemistry,S.Beaucage,D.E.Bergstrom,G.D.Glick,and R.A.Jones编辑,John Wiley&
Sons,New York,11.2.111.2.10,2000)；和COVETM(使用协方差模型分析RNA结构(随机上下
文无关文法方法(stochastic context free grammar methods)))v.2.4.2(Eddy and 
Durbin(1994)Nucl.Acids Res.22:2079 88),其以源代码免费发布，并可以通过登录网址
genetics.wustl.edu/eddy/software/下载；和FOLDALIGNTM(见Gorodkin et al.(1997)
Nucleic Acids Res.25(18):372432和Gorodkin et al.(1997)Proceedings 
International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology ISMB 
International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology 5:120 
123),其也是免费发布的，并可以在网址foldalign.ku.dk/software/index.html上下载。
[0151] 启动子：术语“启动子”指一种能够控制核酸编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。在实例中，受控制的编码序列位于启动子序列的3'。可以从天然基因中整体获得启动
子，启动子可以包括来自天然出现的不同启动子的不同元件，或者启动子甚至可以包括人
造的DNA片段。本领域的技术人员理解，不同的启动子可以指导基因在不同组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境或生理条件表达。所有上述启动子的实例都是已知的，并且在本领域中用于控制异源核酸的表达。指导基因在大多数细胞类型中在
大部分时间里表达的启动子通常称为“组成型启动子”。此外，虽然本领域技术人员已经尝试界定调节序列的确切边界(在许多情况下未成功)，但是已经认识到，长度不同的DNA片段可能具有相同的启动子活性。特定核酸的启动子活性可以使用本领域熟知的技术进行测
定。
[0152] 可操作连接：术语“可操作连接”是指单一核酸上的多个核酸序列的关联，其中一个核酸序列的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时(例如，编码序列在启动子的转录控制之下)，启动子与编码序列就是可操作连接的。编码序列可以沿着有义和反义方向与调节序列可操作连接。
[0153] 表达：如本文所使用的，术语“表达”可以指衍生自DNA的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达还指mRNA翻译成多肽。如本文所使用的，术语“过表达”是指高于相同基因或相关基因的内源表达的表达。因此，如果异源基因的表达高于可比较的内源基因的表达，则该异源基因被“过表达”。
[0154] 转化：如本文所使用的，术语“转化”是指核酸或其片段被转移并整合到宿主生物内，导致基因上稳定的遗传。含有转化核酸的宿主生物被称作“转基因”、“重组”或“转化”生物。已知的转化方法包括，例如但不限于：根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根土壤杆菌(A.rhizogenes)介导的转化；磷酸钙转化；聚凝胺转化；原生质体融合；电穿孔；超声波方法(例如，超声波穿孔(sonoporation))；脂质体转化；显微注射；用裸DNA转化；用质粒载体转化；用病毒载体转化；基因枪转化(微粒轰击)；碳化硅WHISKERS(晶须)介导的转化；气溶胶射线转化(aerosol-beaming)；和PEG介导的转化。
[0155] 导入：如本文所使用的，术语“导入”(在将核酸导入细胞的上下文中)包括细胞的转化，以及包含核酸的植物与第二种植物的杂交，从而使第二种植物含有该核酸，这可以用常规植物育种技术实施。这些育种技术是本领域已知的。关于植物育种技术的讨论，见Poehlman(1995)Breeding Field Crops,第4版,AVI Publication Co.,Westport CT。
[0156] 回交方法可用于将核酸导入植物。这种技术用于将性状导入植物已有几十年的历史。回交(以及其它的植物育种方法学)的描述实例可以参见，例如，Poelman(1995)，同上；
和Jensen(1988)Plant Breeding Methodology,Wiley,New York,NY。在一个示例性回交方
案中，将感兴趣的原始植物(以下简称“轮回亲本”)与携带要导入的核酸的第二个植物(“非轮回亲本”)杂交。然后，将此杂交产生的子代再次与轮回亲本杂交，并重复该过程直到获得转化植物，其中除了来自非轮回亲本的核酸之外，转化植物还复原了轮回亲本的几乎全部
的期望形态和生理特征。
[0157] 质粒/载体：如本文所使用的，术语“质粒”和“载体”是指一种染色体外元件，其可携带一个或多个非细胞核心代谢部分的基因。质粒和载体通常是环状双链DNA分子。然而，质粒和载体可以是线性或环状核酸，呈单链或双链DNA或RNA，并可以衍生自任何来源，其中若干核苷酸序列被连接或重组成一个独特的构建体，其能够将启动子片段和编码DNA序列与任何合适的3’非翻译区一起导入到细胞内。在实例中，质粒和载体可以包括自主复制序列、基因组整合序列、和/或噬菌体或核苷酸序列。
[0158] III.DGT-28和DGT-28编码序列
[0159] 本文的一些实施方案提供了分离的多肽，其与SEQ ID NO:1具有至少大约90％同一性(例如89％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,
至少97％,至少98％,和至少99％同一性)。这种多肽在本文被称作DGT-28多肽。本文的一些实施方案提供了编码与SEQ ID NO:1具有至少大约90％同一性的多肽的核酸。这类核酸的
特定实例在本文被称作“dgt-28”核酸。在多种多样的应用中期望修饰植物细胞中的草甘膦代谢(例如，导入草甘膦抗性)，Dgt-28核酸可用于任何这样的应用。
[0160] 为举例目的提供的Dgt-28核酸的特定实例是SEQ ID NOs:2和3。因此，一些实施方案提供了包含如下核苷酸序列的核酸，其与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少大约80％
序列同一性(例如79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％的，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少
94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，和至少99％同一性)；其中该核酸编码与SEQ ID NO:1具有至少大约90％同一性的多肽。Dgt-28核酸的特定实例包括在严格(例如高
严格)条件下与具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核酸特异性杂交的核酸。
[0161] 在一些实施方案中，提供了密码子优化的Dgt-28核酸。例如，为了在植物中获得异源基因的高表达，可能期望设计基因并对基因进行重新工程化，从而使它在植物细胞内更高效地表达。在期望在植物细胞内表达细菌基因的场合，这个策略是特别可取的。
[0162] 因此，本文的一些实例提供了编码DGT-28蛋白质的植物优化基因，和设计它的方法，用来产生能够在双子叶或单子叶植物中最优表达的DNA序列，并且其中序列修饰不会干扰翻译或转录。对于以在单子叶和双子叶植物中表达相同的DGT-28蛋白质为目的的优化
Dgt-28基因设计，在本文中用该优化表达基因的蛋白质编码区的再工程化进行了示例。本
文中植物优化的Dgt-28核酸的实例包括SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
[0163] 在对编码用于在双子叶植物或单子叶植物(例如，棉花、加拿大油菜、烟草、玉米、大豆、小麦和水稻)中表达的DGT-28蛋白质的基因进行工程化时，可以确定预期的宿主植物的密码子偏好，例如通过使用可公开获得的DNA序列数据库找到关于植物基因组或各种植物基因蛋白质编码区的密码子分布信息来加以确定。
[0164] 在设计用于植物表达的核酸中的编码区时，当存在多种选择时，应当确定植物优选的主要(“第一选择”)密码子，以及优选密码子的第二、第三、第四选项等。然后，可以设计编码相同肽(例如，DGT-28蛋白质)的氨基酸序列的新DNA序列，但是新DNA序列与原始DNA序列的区别在于用植物(第一优选的、第二优选的、第三优选的、或第四优选的，等等)密码子进行了取代，以规定氨基酸序列中每个位置处的氨基酸。
[0165] 然后可以对新序列进行分析，寻找可能由这些修饰产生的限制酶位点。对于鉴定出的位点，可以进一步通过用第一、第二、第三或第四选择的优选密码子替换这些密码子来进行修饰。序列中其他可能影响感兴趣的基因转录或翻译的位点是茎-环结构、外显子:内
含子接点(5'或3')、多聚腺苷酸添加信号、和RNA聚合酶终止信号；这些位点可通过用植物密码子取代予以去除。可以对序列进行进一步的分析和修饰，以减少TA或CG双联体
(doublet)的频率。除了双联体之外，具有超过大约6个相同残基的G或C双联体序列区块
(block)会影响序列的转录或翻译。因此，可以通过将密码子的第一或第二选择替换为下一级优选的密码子等方式来对这些区块进行修饰。
[0166] SEQ ID NO:2(Dgt-28(v5))是针对双子叶植物中的表达优化的。SEQ ID NO:3(Dgt-28(v6))是针对单子叶植物中的表达优化的。这些人造序列中的密码子利用率是基于
优选的密码子利用率而选择的；即每一个的表达产物都是由具有单子叶或双子叶植物利用
率偏好的密码子编码的，并且除去了有害的序列和多余的限制性位点，以增加DGT-28多肽
的转录/翻译效率且便于进行DNA操作步骤。
[0167] 类似地，对SEQ ID NO:4的核酸分子(Dgt-28(v1))进行了优化，以提高在大肠杆菌中的表达。SEQ ID NO:4中的密码子利用率是根据大肠杆菌优选的密码子利用率而选择的；
所表达的蛋白质由具有大肠杆菌利用率偏好的密码子所编码。在重新设计过程中，除去了
有害的序列和多余的限制性位点，以增加DGT-28编码序列的转录/翻译效率并便于进行DNA
操作步骤。因此，在大肠杆菌中从包含SEQ ID NO:4的核酸表达DGT-28可导致强健的蛋白质表达，例如，用于DGT-28的酶学表征。
[0168] 一旦在纸上或计算机上设计出了优化的(例如，植物优化的)DNA序列，便可以在实验室里人造出在序列上与设计的序列精确对应的实际DNA分子。可以对这些人造的核酸分
子进行克隆和进行其他操作，完全如同它们来自自然或天然的来源一样。
[0169] 本文中的核酸可以被克隆到载体中，用于转化到原核或真核细胞中进行复制和/或表达。载体可以是原核载体；例如，质粒、或穿梭载体、昆虫载体、或真核载体。本文的核酸也可以被克隆到表达载体中，例如，用于施用到植物细胞中。在某些应用中，可能优选的是具有在大肠杆菌中发挥功能的载体(例如，生产用于产生抗体的蛋白质，DNA序列分析，插入物构建，获得大量核酸)。
[0170] 为了在细胞内表达DGT-28蛋白质，通常将编码蛋白质的核酸亚克隆到含有指导转录的启动子的表达载体中。合适的细菌和真核启动子是本领域公知的，例如在Sambrook等,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第2版1989；第3版，2001年)；Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)；和Current Protocols in 
Molecular Biology(Ausubel et al.,同上)中所述。本文中用于表达核酸的细菌表达系统
可以在，例如，大肠杆菌、芽孢杆菌属和沙门氏菌属中获得(Palva et al.,Gene 22:229 
235(1983))。用于这些表达系统的试剂盒可以商购。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统是本领域技术人员公知的，并且也可以商购。
[0171] 考虑DGT-28蛋白质的预期用途(例如，在植物、动物、细菌、真菌和原生动物中表达)来选择用于将遗传信息转运到细胞内的具体表达载体。通用的细菌和动物表达载体是
本领域已知的，并在例如，美国专利公开20050064474A1和国际专利公开WO 05/084190，
WO05/014791和WO03/080809中有详细说明。可以用通用的转染方法产生表达大量蛋白质的
细菌细胞系，随后可以使用通用技术加以纯化。
[0172] 用于指导本文核酸表达的启动子的选择取决于特定的应用。在本文的实施方案中可以使用多种在植物中指导基因表达的启动子。这些启动子可以从组成型、化学调节型、诱导型、组织特异型、和种子优选型启动子中选择。例如，适合于宿主细胞的强组成型启动子可用于表达和纯化DGT-28蛋白质。植物启动子的非限制性实例包括来自如下来源的启动子
序列：拟南芥泛素-10(ubi 10)(Callis,et al.,1990,J.Biol.Chem.,265:12486 12493)；
根癌土壤杆菌甘露碱合酶(Δmas)(Petolino et al.,U.S.Patent No.6,730,824)；和/或
木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)(Verdaguer et al.,1996,Plant Molecular Biology 31:1129 
1139)。
[0173] 组成型启动子包括，例如，核心花椰菜花叶病毒35S启动子(Odell et al.(1985)Nature 313:810 812)；水稻肌动蛋白质启动子(McElroy et al.(1990)Plant Cell 2:163 
171)；玉米泛素启动子(美国专利号5,510,474；Christensen et al.(1989)Plant 
Mol.Biol.12:619 632和Christensen et al.(1992)Plant Mol.Biol.18:675 689)；pEMU
启动子(Last et al.(1991)Theor.Appl.Genet.81:581 588)；ALS启动子(美国专利号5,
659,026)；玉米组蛋白启动子(Chabouté et al.Plant Molecular Biology,8:179 191
(1987))；等。
[0174] 可用的植物兼容性启动子的范围包括组织特异性和诱导型启动子。诱导型调控元件是能够响应诱导剂而直接或间接激活一种或多种DNA序列或基因的转录的调控元件。在
没有诱导物时，上述DNA序列或基因将不被转录。通常，特异性结合诱导型调控元件从而激活转录的蛋白质因子以无活性的形式存在，随后会被诱导剂直接或间接地转化为活性形
式。诱导物可以是化学剂，例如蛋白质、代谢物、生长调节剂、除草剂或酚类化合物，或由热、冷、盐、或有毒元素所直接施用的生理胁迫，或通过病原体或致病剂如病毒而间接施用的生理胁迫。典型地，特异性结合诱导型调控元件从而激活转录的蛋白质因子以无活性的形式
存在，随后会被诱导剂直接或间接地转化为活性形式。可以通过从外部将诱导物施用给细
胞或植物，例如通过喷雾、浇水、加热或类似的方法，而将含有诱导型调控元件的植物细胞暴露于诱导物。
[0175] 在本文的实施方案中可以使用任何诱导型启动子。见Ward et al.Plant Mol.Biol.22:361 366(1993)。诱导型启动子包括，例如但不限于：蜕皮激素受体启动子(美国专利号6,504,082)；来自ACE1系统的响应铜的启动子(Mett et al.PNAS 90:4567 4571
(1993))；来自玉米的响应苯磺酰胺除草剂安全剂的In2-1和In2-2基因(美国专利号5,364,
780；Hershey et al.,Mol.Gen.Genetics 227:229-237(1991)和Gatz et al.,
Mol.Gen.Genetics  243:32-38(1994))；来自Tn10的Tet阻遏物(Gatz  et al.,
Mol.Gen.Genet.227:229-237(1991)；来自类固醇激素基因的启动子，其转录活性受到糖皮质激素的诱导(Schena et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:10421(1991)和McNellis 
et al.,(1998)Plant J.14(2):247-257)；玉米GST启动子，其被用作预应急除草剂的疏水
亲电子化合物激活(参见美国专利No.5,965,387和国际专利申请公开No.WO 93/001294)；
和烟草PR-1a启动子，其被水杨酸激活(见Ono S,Kusama M,Ogura R,Hiratsuka K.,
“Evaluation of the Use of the Tobacco PR-1a Promoter to Monitor Defense Gene 
Expression by the Luciferase Bioluminescence Reporter System,”Biosci 
Biotechnol Biochem.2011 Sep 23；75(9):1796-800)。其他受化学调控的感兴趣的启动子包括四环素诱导型和四环素抑制型的启动子(参见，例如，Gatz et al.,(1991)
Mol.Gen.Genet.227:229-237,和美国专利号5,814,618和5,789,156)。
[0176] 其它可调节的感兴趣启动子包括冷应答调控元件或热激调控元件，其转录分别受到冷或热暴露的影响(Takahashi et al.,Plant Physiol.99:383-390,1992)；可被厌氧条
件诱导的醇脱氢酶基因的启动子(Gerlach et al.,PNAS USA 79:2981-2985(1982)；
Walker et al.,PNAS 84(19):6624-6628(1987))，来自豌豆rbcS基因或豌豆psaDb基因的
光诱导型启动子(Yamamoto et al.(1997)Plant J.12(2):255-265)；光诱导型调节元件
(Feinbaum et al.,Mol.Gen.Genet.226:449,1991；Lam and Chua,Science 248:471,
1990；Matsuoka et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20):9586-9590；Orozco et 
al.(1993)Plant Mol.Bio.23(6):1129-1138)；植物激素诱导型调节元件(Yamaguchi 
Shinozaki et al.,Plant Mol.Biol.15:905,1990；Kares et al.,Plant Mol.Biol.15:
225,1990)，等等。诱导型调控元件还可以是玉米In2-1或In2-2基因，它们响应苯磺酰胺除草剂安全剂(Hershey et al.,Mol.Gen.Gene.227:229-237,1991；Gatz et al.,
Mol.Gen.Genet.243:32-38,1994)，和转座子Tn10的四环素阻遏物(Gatz et al.,
Mol.Gen.Genet.227:229-237,1991)。
[0177] 胁迫诱导型启动子包括盐/水胁迫诱导型启动子，如P5CS(Zang et al.(1997)Plant Sciences 129:81-89)；冷诱导型启动子，如cor15a(Hajela et al.(1990)Plant 
Physiol.93:1246-1252),cor15b(Wilhelm et al.(1993)Plant Mol Biol 23:1073-
1077),wsc120(Ouellet et al.(1998)FEBS Lett.423 324-328),ci7(Kirch et al.
(1997)Plant Mol Biol.33:897-909),和ci21A(Schneider et al.(1997)Plant 
Physiol.113:335-45)；干旱诱导型启动子，如Trg-31(Chaudhary et al.(1996)Plant 
Mol.Biol.30:1247-57)和rd29(Kasuga et al.(1999)Nature Biotechnology 18:287-
291)。渗透压诱导型启动子，如Rab17(Vilardell et al.(1991)Plant Mol.Biol.17:985-
93)和渗压素(osmotin)(Raghothama et al.(1993)Plant Mol Biol 23:1117-28)。热诱导
型启动子，如热激蛋白(Barros et al.(1992)Plant Mol.19:665-75；Marrs et al.(1993)Dev.Genet.14:27-41)、smHSP(Waters et al.(1996)J.Experimental Botany 47:325-
338)；和来自欧芹泛素启动子的热激诱导型元件(WO 03/102198)。其它胁迫诱导型启动子
包括rip2(美国专利号5,332,808和美国公开号No.2003/0217393)和rd29a(Yamaguchi 
Shinozaki et al.(1993)Mol.Gen.Genetics 236:331-340)。某些启动子可以被创伤诱导，包括土壤杆菌属的pMAS启动子(Guevara Garcia et al.(1993)Plant J.4(3):495-505)和
土壤杆菌ORF13启动子(Hansen et al.,(1997)Mol.Gen.Genet.254(3):337-343)。
[0178] 组织优选的启动子可用于在特定植物组织内靶向增强转录和/或表达。这些类型启动子的实例包括种子优先(seed-preferred)的表达，例如由菜豆蛋白(phaseolin)启动
子(Bustos et al.1989.The Plant Cell Vol.1,839-853)，和玉米球蛋白-1基因
(Belanger,et al.1991 Genetics 129:863-972)提供的种子优先表达。对于双子叶植物，
种子优先的启动子包括，但不限于，菜豆的β-菜豆蛋白(β-phaseolin)、油菜籽蛋白
(napin)、β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)、大豆凝集素(soybeanlectin)、十字花科蛋白(cruciferin)，等等。对于单子叶植物，种子优先的启动子包括但不限于：玉米的15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、γ-玉米醇溶蛋白、糯质蛋白质
(waxy)、超甜素(shrunken)1和超甜素2，球蛋白1，等等。种子优先的启动子还包括那些指导基因主要在种子内的特定组织中表达的启动子，例如，γ-玉米醇溶蛋白的胚乳优先的启动子，来自烟草的隐藏(cryptic)启动子(Fobert et al.1994.T DNA tagging of a seed 
coat specific cryptic promoter in tobacco.Plant J.4:567-577)，来自玉米的P-基因
启动子(Chopra et al.1996.Alleles of the maize P-gene with distinct tissue 
specificities  encode  Myb-homologous  proteins  with  C-terminal 
replacements.Plant Cell 7:1149-1158,Erratum in Plant Cell.1997,1:109)，来自玉
米的球蛋白-1启动子(Belenger and Kriz.1991.Molecular basis for Allelic 
Polymorphism of the maize Globulin-1 gene.Genetics 129:863-972)，和指导在玉米
粒的种皮或果壳上表达的启动子，例如果皮特异性谷氨酰胺合成酶启动子(Muhitch et 
al.,2002.Isolation of a Promoter Sequence From the Glutamine Synthetase1-2 
Gene Capable of Conferring Tissue Specific Gene Expression in Transgenic 
Maize.Plant Science 163:865-872)。
[0179] 除了启动子之外，表达载体通常还含有转录单元或表达盒，其含有用于在宿主细胞(无论是原核还是真核)内表达核酸所需的全部其它元件。因此，典型的表达盒含有，例
如，与编码蛋白质的核酸序列可操作连接的启动子，和信号，例如高效进行转录本多聚腺苷酸化、转录终止、核糖体结合位点、或翻译终止的信号。表达盒的其它元件包括，例如，增强子和异源剪接信号。
[0180] 可以包含其它的载体组分，其也取决于基因的预期用途。实例包括选择标记、靶向序列或调控序列，转运肽序列如优化的转运肽序列(见美国专利号5,510,471)，稳定化序列如RB7 MAR(见Thompson and Myatt,(1997)Plant Mol.Biol.,34:687 692和WO9727207)，或前导序列、内含子等。植物表达载体和报告基因的一般描述和实例可以参见Gruber等,
“Vectors for Plant Transformation”，录自Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick等编辑；CRC Press，第89-119页(1993)。
[0181] 合适的表达载体的选择将取决于宿主和将表达载体导入宿主内的方法。表达盒可以包括在植物中发挥功能的转录和翻译终止区，其位于感兴趣的异源核苷酸序列3’端。终止区可以是感兴趣的DNA序列天然具有的，或者可以来自其他的来源。易用的终止区可以从根癌土壤杆菌的Ti质粒获得，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶(nos)终止区(Depicker et 
al.,Mol.and Appl.Genet.1:561-573(1982)和Shaw et al.(1984)Nucleic Acids 
Research  vol.12,No.20  pp7831-7846(nos))，另见Guerineau  et 
al.Mol.Gen.Genet.262:141-144(1991)；Proudfoot,Cell 64:671-674(1991)；Sanfacon 
et al.Genes Dev.5:141 149(1991)；Mogen et al.Plant Cell 2:1261-1272(1990)；
Munroe et al.Gene 91:151-158(1990)；Ballas et al.Nucleic Acids Res.17:7891-
7903(1989)；Joshi et al.Nucleic Acid Res.15:9627-9639(1987)。
[0182] 表达盒可以含有5’前导序列。这些前导序列可以发挥增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的，并包括例如小核糖核酸病毒(Picornavirus)的前导序列、EMCV前导
序列(脑心肌炎5'非编码区)，Elroy-Stein et al.Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86:6126-6130
(1989)；马铃薯Y病毒前导序列，例如，TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)Carrington and Freed Journal of Virology,64:1590-1597(1990)，MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)，Allison 
et al.,Virology 154:9-20(1986)；人免疫球蛋白质重链结合蛋白质(BiP)，Macejak et 
al.Nature 353:90-94(1991)；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的未翻译前导序列(AMV 
RNA 4)，Jobling et al.Nature 325:622-625(1987)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)，
Gallie et al.(1989)Molecular Biology of RNA,237-256页；和玉米褪绿斑驳病毒前导
序列(MCMV)Lommel et al.Virology 81:382-385(1991)。另见Della Cioppa et al.Plant Physiology 84:965-968(1987)。
[0183] 构建体还包含可增强翻译和/或mRNA稳定性的序列，例如内含子。这种内含子的一个实例是拟南芥组蛋白H3.III变体的基因II的第一内含子。Chaubet et al.Journal of 
Molecular Biology,225:569-574(1992)。
[0184] 在期望将异源核酸序列的表达产物引导到特定的细胞器，特别是质体、造粉体，或到内质网，或者分泌在细胞表面或细胞外的场合，表达盒可以进一步包括转运肽编码序列。这些转运肽是本领域公知的，并且包括但不限于：酰基载体蛋白、RUBISCO的小亚基、植物EPSP合酶和向日葵的转运肽(见Lebrun等人的美国专利5,510,417)，玉米Brittle 1叶绿体
转运肽(Nelson et al.Plant Physiol 117(4):1235-1252(1998)；Sullivan et al.Plant Cell 3(12):1337-48；Sullivan et al.,Planta(1995)196(3):477-84；Sullivan et al.,J.Biol.Chem.(1992)267(26):18999-9004)等。此外，嵌合的叶绿体转运肽是本领域已知
的，例如优化的转运肽(参见美国专利号5,510,471)。其它的如叶绿体转运肽先前已经在美国专利号Nos.5,717,084；5,728,925中有描述。本领域的技术人员将很容易意识到，有许多种选项可用于将产物表达到特定的细胞器中。例如，大麦α淀粉酶序列常被用于指导向内质网的表达。Rogers,J.Biol.Chem.260:3731 3738(1985)。
[0185] 本领域的技术人员会意识到，使用重组DNA技术能够提高被转染核酸分子的表达控制，例如通过操纵宿主细胞内核酸分子的拷贝数、核酸分子转录的效率、所得的转录本翻译的效率、和翻译后修饰的效率。此外，可以对启动子序列进行基因工程改造，使其与天然启动子相比表达水平提高。可用于控制核酸分子表达的重组技术包括，但不限于，将核酸分子稳定整合到一个或多个宿主细胞染色体中，向质粒添加载体稳定性序列，替换或修饰转
录控制信号(例如启动子、操纵基因、增强子)，替换或修饰翻译控制信号(例如，核糖体结合位点、Shine-Dalgarno或Kozak序列)，修饰核酸分子使其与宿主细胞的密码子利用率对应、和删除导致转录本不稳定的序列。
[0186] 转化载体中可以包含用于筛选被转化的细胞或组织或植物部分或植物的报告基因或标记基因。选择标记的实例包括那些赋予针对抗代谢物(例如除草剂或抗生素)的耐受
性的标记，例如：二氢叶酸还原酶，其赋予对氨甲喋呤的抗性(Reiss,Plant Physiol.(Life Sci.Adv.)13:143-149,1994；另见Herrera Estrella et al.,Nature 303:209-213,1983；
Meijer et al.,Plant Mol.Biol.16:807-820,1991)；新霉素磷酸转移酶，其赋予对氨基糖苷类新霉素、卡那霉素和巴龙霉素的抗性(Herrera Estrella,EMBO J.2:987-995,1983 
and Fraley et al.Proc.Natl.Acad.Sci USA 80:4803(1983))；潮霉素磷酸转移酶，其赋
予潮霉素抗性(Marsh,Gene 32:481 485,1984；另见Waldron et al.,Plant Mol.Biol.5:
103-108,1985；Zhijian et al.,Plant Science 108:219-227,1995)；trpB，其允许细胞利用吲哚代替色氨酸；hisD，其允许细胞利用组氨醇代替组氨酸(Hartman,
Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 85:8047,1988)；甘露糖6-磷酸异构酶，允许细胞利用甘露糖
(WO 94/20627)；鸟氨酸脱羧酶，其赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸的抗性(DFMO；McConlogue,1987,录自:Current Communications in Molecular Biology,
Cold Spring Harbor Laboratory ed.)；和来自土曲霉的脱氨酶，其赋予对稻瘟菌素S的抗性(Tamura,Biosci.Biotechnol.Biochem.59:2336-2338,1995)。
[0187] 其它的选择标记包括，例如，突变体乙酰乳酸合酶，其赋予咪唑啉酮或磺酰脲抗性(Lee et al.,EMBO J.7:1241-1248,1988)，突变体psbA，其赋予阿特拉津(atrazine)抗性(Smeda et al.,Plant Physiol.103:911-917,1993)，或突变体原卟啉原氧化酶(见美国专
利No.5,767,373)，其它赋予对除草剂(例如草胺膦)抗性的标记。合适的选择标记基因的实例包括，但不限于，编码氯霉素抗性(Herrera Estrella et al.,EMBO J.2:987-992,
1983)；链霉素抗性(Jones et al.,Mol.Gen.Genet.210:86-91,1987)；壮观霉素抗性
(Bretagne-Sagnard et al.,Transgenic Res.5:131-137,1996)；博来霉素抗性(Hille et al.,Plant Mol.Biol.7:171-176,1990)；磺酰胺抗性(Guerineau et al.,Plant 
Mol.Biol.15:127-136,1990)；溴苯腈抗性(Stalker et al.,Science 242:419-423,
1988)；草甘膦抗性(Shaw  et  al.,Science  233:478-481,1986)；草铵膦
(phosphinothricin)抗性(DeBlock et al.,EMBO J.6:2513-2518,1987)，等的基因。
[0188] 供选择基因使用的一个选项是编码草胺膦抗性的DNA，并且在一个实施方案中，可以是处于木薯叶脉花叶病病毒启动子控制之下的草铵膦乙酰转移酶(pat)、玉米优化的pat
基因或bar基因。这些基因赋予对双丙氨膦(bioalaphos)的抗性。见Wohlleben et al.,
(1988)Gene 70:25-37)；Gordon Kamm et al.,Plant Cell 2:603；1990；Uchimiya et 
al.,BioTechnology 11:835,1993；White et al.,Nucl.Acids Res.18:1062,1990；
Spencer et al.,Theor.Appl.Genet.79:625-631,1990；和Anzai et al.,
Mol.Gen.Gen.219:492,1989。pat基因的一个版本是玉米优化的pat基因，其在美国专利
No.6,096,947中有描述。
[0189] 此外，可以使用这样的标记，其有助于鉴定含有编码该标记的多核苷酸的植物细胞。当序列的存在产生可测量的产物，并且能够产生产物而不会破坏植物细胞时，可以使用可评分的(scorable)或可筛选的(screenable)标记。实例包括β-葡糖醛酸酶或uidA基因
(GUS)，其编码一种酶，该酶有多种发色底物是已知的(例如，美国专利5,268,463和5,599,
670)；氯霉素乙酰转移酶(Jefferson et al.The EMBO Journal vol.6 No.13pp.3901-
3907)；和碱性磷酸酶。在一个优选的实施方案中，所用的标记是β-胡萝卜素或维生素原A(Ye et al.,Science 287:303-305(2000))。该基因已被用于提高稻米的营养，但在这里是使用它作为可筛选标记，利用所提供的金黄色来检测与感兴趣基因连锁的该基因的存在。
与使用该基因为植物贡献营养的情况不同的是，更小量的蛋白质足以实现该目的。其它可
筛选标记包括一般的花青素/类黄酮的基因(见Taylor and Briggs,The Plant Cell
(1990)2:115-127中所讨论的)，包括例如，R-座位基因，其编码的产物可以调节植物组织中花青素色素(红色)的产生(Dellaporta et al.,录自Chromosome Structure and 
Function,Kluwer Academic Publishers,Appels and Gustafson eds.,pp.263-282
(1988))；控制类黄酮色素生物合成的基因，如玉米C1基因(Kao et al.,Plant Cell(1996)
8:1171 1179；Scheffler et al.,Mol.Gen.Genet.(1994)242:40-48)和玉米C2基因
(Wienand et al.,Mol.Gen.Genet.(1986)203:202 207)；B基因(Chandler et al.,Plant 
Cell(1989)1:1175-1183)，p1基因(Grotewold et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA(1991)
88:4587-4591；Grotewold et al.,Cell(1994)76:543-553；Sidorenko et al.,Plant 
Mol.Biol.(1999)39:11-19)；青铜色(bronze)座位基因(Ralston et al.,Genetics(1988)
119:185-197；Nash et al.,Plant Cell(1990)2(11):1039-1049)，等等。
[0190] 合适标记的其他实例包括青色荧光蛋白质(CYP)基因(Bolte et al.(2004)J.Cell Science 117:943-54和Kato et al.(2002)Plant Physiol 129:913-42)，黄色荧
光蛋白质基因(来自Evrogen公司的PHIYFPTM；见Bolte et al.(2004)J.Cell Science 117:
943-54)；lux基因，其编码一种荧光素酶，该荧光素酶的存在可以通过使用，例如，X射线胶片、闪烁计数、荧光光度法、低光度摄像机、光子计数摄像机或多孔发光法等进行检测
(Teeri et al.(1989)EMBO J.8:343)；绿色荧光蛋白质(GFP)基因(Sheen et al.,Plant 
J.(1995)8(5):777-84)；和DsRed2，用该标记基因转化的植物细胞呈红色，因此可以通过目测选择(Dietrich et al.(2002)Biotechniques 2(2):286 293)。其它的实例包括β-内酰
胺酶基因(Sutcliffe,Proc.Nat'l.Acad.Sci.U.S.A.(1978)75:3737)，其编码各种发色底
物已知的酶(例如PADAC，一种发色头孢菌素)；xylE基因(Zukowsky et al.,Proc.Nat'
l.Acad.Sci.U.S.A.(1983)80:1101)，其编码邻苯二酚双加氧酶，该酶能够转化发色儿茶
酚；α-淀粉酶基因(Ikuta et al.,Biotech.(1990)8:241)；和酪氨酸酶基因(Katz et al.,J.Gen.Microbiol.(1983)129:2703)，其编码的酶能够将酪氨酸氧化成DOPA和多巴醌，后者进一步缩合形成容易检测的化合物黑色素。显然，许多这样的标记是本领域技术人员可用
并且知晓的。
[0191] IV.包含DGT-28的细胞和生物
[0192] 在一些实施方案中，提供了细胞和/或生物(例如植物细胞或植物)，其包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的异源多肽。在特定的实施方案中，提供了细胞和/或生物，其包含编码与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的异源多肽的异源核酸；例如dgt-28核酸。一些实施方案包括这样细胞和/或生物，其包含在高严格度条件下与另一个具有SEQ ID NO:2
或SEQ ID NO:3的核酸杂交的异源核酸。
[0193] 植物细胞、植物部分、和/或植物可以通过本领域已知的多种导入异源核酸的方法中的任何方法进行遗传修饰，从而包含异源多肽(例如，DGT-28蛋白)和/或异源核酸(例如，dgt-28-核酸)。在本文的特定实施方案中，通过选自例如但不限于转化和选择育种(例如回交育种)的方法向植物细胞、植物部分和/或植物中引入异源分子。
[0194] 任何植物物种或植物细胞均可被遗传修饰从而包含本文的异源多肽和/或核酸。在一些实施方案中，这样遗传修饰的植物细胞不能够再生而产生植株。在一些实施方案中，根据本公开遗传修饰的植物(例如植物宿主细胞)包括，但不限于，高等植物、双子叶植物、单子叶植物、可消费植物(consumable-plant)、作物植物、和油料植物(例如含油种子植
物)。这样的植物包括，例如但不限于：苜蓿；大豆；棉花；油菜籽(加拿大油菜)；亚麻籽；玉米；水稻；臂形草属(brachiaria)；小麦；红花；高粱；甜菜；向日葵；烟草；和草(例如，草坪草)。在特定的实例中，本文中经过遗传修饰的植物细胞或植物包括，例如但不限于：欧洲油菜(Brassica napus)；印度芥菜(Brassica juncea)；埃塞俄比亚芥菜(Brassica 
carinata)；萝卜(Brassica rapa)；甘蓝(Brassica oleracea)；大豆(Glycine max)；亚麻(Linum usitatissimum)；玉米(Zea mays)；红花(Carthamus tinctorius)；向日葵
(Helianthus annuus)；烟草(Nicotiana tabacum)；拟南芥(Arabidopsis thaliana)，巴西坚果(Betholettia excelsa)；蓖麻子(Ricinus communis)；椰子(Cocus nucifera)；香菜(Coriandrum sativum)；棉花属(Gossypium spp.)；花生(Arachis hypogaea)；希蒙得木
(Simmondsia chinensis)；油棕(Elaeis guineeis)；橄榄(Olea eurpaea)；水稻；笋瓜
(Cucurbita maxima)；大麦(Hordeum vulgare)；甘蔗(Saccharum officinarum)；小麦属
(包括硬粒小麦(Triticum durum)和普通小麦(Triticum aestivum))；和浮萍(Lemnaceae 
sp.)。在某些实施方案中，植物可以具有特定的遗传背景，如优良栽培种、野生型栽培种，和商业上可区分的品种。
[0195] 可以利用引入到植物细胞内的核酸向几乎任何植物赋予期望的性状。利用编码DGT多肽的核酸和各种转化方法，可以对多种植物或植物细胞系统进行工程化，以获得本文所述的期望的生理学和农艺学特征。本文的实施方案可以使用本领域众多转化植物(以及
产生遗传修饰的植物)的方法中的任何方法。已经开发出了大量用于植物转化的方法，包括用于双子叶植物以及单子叶植物的生物和物理转化方案(见，例如，Goto Fumiyuki et al.(1999)Nat.Biotechnol.17:282-6；Miki et al.(1993)Methods in Plant Molecular 
Biology and Biotechnology(Glick,B.R.and Thompson,J.E.,Eds.),CRC Press,Inc.,
Boca Raton,FL,pp.67-88)。此外，在例如Gruber et al.(1993),同上,第89-119页记载了
用于植物细胞和组织转化和再生的载体和体外培养方法。
[0196] 可用于将核酸导入植物宿主细胞的植物转化技术包括，例如但不限于：用根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌的卸甲T-DNA作为转化剂转化；磷酸钙转染；聚凝胺转化；原生质体融合；电穿孔(D'Halluin et al.(1992)Plant Cell 4:1495-505)；超声波方法(例如，超声穿孔(sonoporation))；脂质体转化；显微注射；与裸DNA接触；与质粒载体接触；与病毒载体接触；基因枪法(例如，DNA粒子轰击(见，例如Klein et al.(1987)Nature 327:703)和微粒轰击(Sanford et al.(1987)Part.Sci.Technol.5:27；Sanford(1988)Trends Biotech.6:
299,Sanford(1990)Physiol.Plant 79:206；and Klein et al.(1992)Biotechnology 10:
268)；碳化硅晶须介导的转化(Kaeppler et al.(1990)Plant Cell Rep.9:415-8)；纳米颗粒转化(见，例如，美国专利公开号No.US2009/0104700A1)；气溶胶射线转化；和聚乙二醇(PEG)介导的摄取。在具体的实例中，可直接将异源核酸引入到植物细胞的基因组DNA中。
[0197] 一种广泛使用的将表达载体引入到植物中的方法是基于土壤杆菌的自然转化系统。Horsch et al.(1985)Science 227:1229。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌是已知可用于遗传转化植物细胞的植物致病性土壤细菌。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌各自的Ti和Ri质
粒携带有负责对植物遗传转化的基因。Kado(1991)Crit.Rev.Plant.Sci.10:1。关于土壤杆菌载体系统和用于土壤杆菌介导的基因转移的方法的详细说明也可以在例如下列文献中
获得：Gruber et al.,同上,Miki et al.,同上,Moloney et al.(1989)Plant Cell 
Reports 8:238,和美国专利Nos.4,940,838和5,464,763。
[0198] 如果使用土壤杆菌进行转化，那么通常将待插入的DNA克隆入特殊的质粒中，或者是插入中间载体或者是插入二元载体。中间载体不能在土壤杆菌中自我复制。中间载体可
以通过利用辅助质粒转移到根癌土壤杆菌内(接合(conjugation))。日本烟草超二元系统
是这种系统的一个实例(综述参见，Komari et al.(2006)Methods in Molecular Biology
(K.Wang,编辑)No.343；Agrobacterium Protocols,第2版，第1卷,Humana Press Inc.,
Totowa,NJ,pp.15-41；和Komori et al.(2007)Plant Physiol.145:1155-60)。二元载体能够在大肠杆菌和土壤杆菌中自我复制。二元载体包含选择标记基因和由T DNA的左右边界
区框定的接头或多接头。它们能够被直接转化到土壤杆菌中(Holsters,1978)。土壤杆菌含有携带vir区域的质粒。Ti或Ri质粒也包含转移T DNA必需的vir区。vir区是将T-DNA转移到植物细胞中必需的。可以包含额外的T-DNA。
[0199] 当使用二元T-DNA载体(Bevan(1984)Nuc.Acid Res.12:8711 21)或共培养程序(Horsch et al.(1985)Science 227:1229 31)让细菌感染细胞时，根癌土壤杆菌宿主的毒
力功能将会令含有构建体和近邻的标记的T-链插入到植物细胞DNA中。一般地，土壤杆菌转化系统用于对双子叶植物进行工程化。Bevan et al.(1982)Ann.Rev.Genet 16:357-84；
Rogers et al.(1986)Methods Enzymol.118:627-41。土壤杆菌转化系统也可用于将核酸
转化和转移到单子叶植物和植物细胞中。参见，美国专利No.5,591,616；Hernalsteen et al.(1984)EMBO J 3:3039-41；Hooykass Van Slogteren et al.(1984)Nature 311:763-
4；Grimsley et al.(1987)Nature  325:1677-9；Boulton et al.(1989)Plant 
Mol.Biol.12:31 40；和Gould et al.(1991)Plant Physiol.95:426-34。
[0200] 本文中重组宿主的遗传操作可以使用通用的遗传技术和筛选来进行，并且可以在任何适于遗传操作的宿主细胞中实施。在一些实施方案中，重组宿主细胞可以是任何适合
于基因修饰和/或重组基因表达的生物或微生物宿主。在一些实施方案中，重组宿主可以是植物。本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且在下列文献中有描述，例如，但不限于：Sambrook等(1989)，同上；Silhavy等(1984)Experiments with Gene 
Fusions，Cold Spring Habor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；和Ausubel等
(1987)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.and 
Wiley Interscience,New York,NY。
[0201] 在将核酸导入到植物细胞中之后，可以使植物细胞生长，且当分化的组织(例如芽和根)出现时，能够产生成熟的植物。在一些实施方案中，可以产生多个植物。用于再生植株的方法是本领域普通技术人员已知的，并可以在如下的文献中找到：Plant Cell and 
Tissue Culture,1994,Vasil and Thorpe Ed.Kluwer Academic Publishers，和Plant 
Cell Culture Protocols(Methods in Molecular Biology 111,1999 Hall Ed.，Humana 
Press)。本文所述的遗传修饰植物可以在在发酵培养基中培养，或者在合适的培养基例如
土壤中生长。在一些实施方案中，用于高等植物的合适生长培养基可以是任何植物生长培
养基，包括但不限于，土壤、砂、任何其它可支持根生长的颗粒介质(例如蛭石、珍珠岩等)或水培养基，以及合适的光、水和促进高等植物生长的营养补充剂。
[0202] 对于通过上述任何一种转化技术产生的转化植物细胞，可以进行培养以再生具有转化基因型、因而具有期望表型的完整植物。这种再生技术依赖于对组织培养生长培养基
中某些植物激素的操纵，典型地依赖于已经与期望的核苷酸序列一起被引入的杀生物剂
和/或除草剂标记。从培养的原生质体再生植株在下列文献中有描述：Evans,et al.,"
Protoplasts Isolation and Culture"in Handbook of Plant Cell Culture,124-176
页,Macmillian Publishing Company,New York,1983；和Binding,Regeneration of 
Plants,Plant Protoplasts,21-73页,CRC Press,Boca Raton,1985。再生也可以从植物愈
伤组织、外植体、器官、花粉、胚或其部分获得。这样的再生技术在Klee et al.(1987)
Ann.Rev.of Plant Phys.38:467 486中有一般性的描述。
[0203] 在其它实施方案中，被转化的植物细胞不能够再生产生植物。这些细胞可用于，例如，开发具有相关表型(例如除草剂抗性)的植物细胞系。
[0204] 可以通过对工程化的植物材料进行选择或筛选，利用转化DNA上存在的标记基因所编码的性状来鉴定和分离转化的植物细胞、愈伤组织、组织、或植物。例如，可以通过在含有抑制量的抗生素或除草剂(转化基因构建体提供对该抗生素或除草剂的耐受性)的培养
基上培育工程化的植物材料来实施选择。此外，还可以通过筛选重组核酸构建体上存在的
任何可见的标记基因(例如β-葡糖苷酸酶、荧光素酶或gfp基因)的活性，来鉴定转化的植物和植物细胞。这些选择和筛选方法是本领域技术人员公知的。
[0205] 含有本文的异源分子的转基因植物可以通过选择性育种来产生，例如，通过含有该分子的第一亲本植物与第二亲本植物有性杂交，由此产生多个第一子代植物。然后选择
可以抵抗选择标记(例如草甘膦，本文的异源分子可以赋予子代植物对它的抗性)的第一子
代植物。然后可以使第一子代植物自交，从而产生多个第二子代植物。然后，可以选择可抵抗选择标记的第二子代植物。这些步骤可以进一步包括使第一子代植物或第二子代植物与
第二亲本植物或第三亲本植物回交。
[0206] 还应当理解，两种不同的转基因植物也可以交配以产生含有两个独立分离的、叠加的外源基因的后代。适当后代的自交能够产生对两个叠加外源基因而言均为纯合子的植
物。还构想了与亲本植物的回交和与非转化植物的异交(out-crossing)，以及无性繁殖。通常用于不同性状和作物的其他育种方法是本领域已知的。回交育种已经被用于将简单遗传
的(simply herited)、高度可遗传的(highly inheritable)性状的基因转移到合意的纯合
栽培种或近交系(即为轮回亲本)中。所得的植物预期具有轮回亲本(例如栽培种)的属性以
及从供体亲本转移来的期望性状。初始杂交后，选择具有供体亲本表型的个体，并与轮回亲本反复杂交(回交)。所得亲本预期将具有轮回亲本(例如栽培种)的属性和从供体亲本转移
来的期望性状。
[0207] 核酸也可以通过同源重组被引入到植物基因组的预定区域内。通过同源重组将多核苷酸序列稳定整合到植物细胞的特定染色体位点中的方法在本领域中已有描述。例如，
在美国专利申请公开号No.2009/0111188 A1中描述的位点特异性整合涉及使用重组酶或
整合酶来介导将供体多核苷酸序列引入到染色体靶中。另外，国际专利申请号No.WO 2008/
021207描述了锌指介导的同源重组，用来一个或多个供体多核苷酸序列稳定地整合到基因
组的特定位置内。使用重组酶，例如美国专利No.6,720,475中描述的FLP/FRT，或美国专利No.5,658,772中描述的CRE/LOX，可用于将多核苷酸序列稳定整合到特定的染色体位点。最后，在Puchta et al.,PNAS USA 93(1996)pp.5055-5060)中描述了使用大范围核酸酶
(meganuclease)将供体多核苷酸导向到特定的染色体位置。
[0208] 用于在植物细胞内位点特异性整合的其它不同方法是公知的，并且可以适用(Kumar et al.,Trends in Plant Sci.6(4)(2001)pp.155-159)。此外，在多种原核生物和低等真核生物中业已鉴定的位点特异性重组系统可以在植物中应用。这类系统的实例包
括，但不限于：来自鲁氏接合酵母pSR1质粒的R/RS重组酶系统(Araki et al.(1985)
J.Mol.Biol.182:191-203)，和噬菌体Mu的Gin/gix系统(Maeser and Kahlmann(1991)
Mol.Gen.Genet.230:170-176)。
[0209] 在一些实施方案中，编码与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的多肽的异源核酸可以在宿主细胞和/或生物内任选地与另一种核酸组合。例如，在某些实施方案中，编码与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的多肽的异源核酸可以和另一种核酸组合或“叠加”，其中另一种核酸可以提供针对草甘膦或其它除草剂的额外的耐受性或抗性，和/或提供对选
定的昆虫或疾病的抗性，和/或提供营养强化，和/或提供改良的农艺特征，和/或提供额外的可用于饲料、食物、工业、药物或其它用途的蛋白质或其它产物。植物基因组中两个或多个感兴趣的核酸序列的“叠加”可以通过例如下列手段来实现：使用两个或更多个事件的常规植物育种、用含有核酸的构建体转化植物、转基因植物的再转化、或通过借助同源重组的导向整合来添加新的性状。
[0210] 可以和编码与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的多肽的异源核酸“叠加”的核酸包括，例如但不限于：
[0211] 赋予害虫或疾病抗性的基因或编码序列(例如iRNA)
[0212] (A)植物疾病抗性基因。植物防御经常通过植物中疾病抗性基因(R)的产物与病原体中相应的无毒性(Avr)基因的产物的特异相互作用而被激活。可以用克隆的抗性基因转
化植物品种，从而工程构建对特定病原体株有抗性的植物。这些基因的实例包括：提供黄枝孢霉(Cladosporium fulvum)抗性的番茄Cf-9基因(Jones et al.,1994 Science 266:
789)；，提供丁香假单胞杆菌番茄致病变种抗性的番茄Pto基因，其编码一种蛋白激酶
(Martin et al.,1993 Science 262:1432)，和提供丁香假单胞菌抗性的拟南芥RSSP2基因
(Mindrinos et al.,1994 Cell 78:1089)。
[0213] (B)苏云金芽孢杆菌蛋白质、其衍生物或以其为模本的人造多肽，例如Btδ-内毒素基因的多核苷酸序列(Geiser et al.,1986 Gene 48:109)和植物杀虫(VIP)基因(见，例如，Estruch et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93:5389-94)。此外，编码δ-内毒素基因的DNA分子可以从美国典型培养物保藏中心(Rockville,Md.)购得，ATCC登录号为40098，
67136，31995和31998。
[0214] (C)植物凝集素，例如，多种君子兰(Clivia miniata)甘露糖结合性植物凝集素基因的核苷酸序列(Van Damme et al.,1994 Plant Molec.Biol.24:825)。
[0215] (D)维生素结合蛋白质，例如亲和素及亲和素同源物，其可用作针对昆虫类害虫的杀幼虫剂。见美国专利No.5,659,026。
[0216] (E)酶抑制剂，例如蛋白酶抑制剂或淀粉酶抑制剂。这些基因的实例包括水稻半胱氨酸蛋白质酶抑制剂(Abe et al.,1987 J.Biol.Chem.262:16793)，烟草蛋白酶抑制剂I
(Huub et al.,1993 Plant Molec.Biol.21:985)，和α-淀粉酶抑制剂(Sumitani et al.,
1993 Biosci.Biotech.Biochem.57:1243)。
[0217] (F)昆虫特异性激素或信息素，例如蜕皮激素和保幼激素或其变体、基于它们的模拟物，或其拮抗剂或激动剂，例如杆状病毒表达的克隆保幼激素酯酶，保幼激素的失活子
(Hammock et al.,1990 Nature 344:458)。
[0218] (G)昆虫特异性肽或神经肽，其在表达时会扰乱受影响的害虫的生理机能(J.Biol.Chem.269:9)。这些基因的实例包括昆虫利尿激素受体(Regan,1994)，在太平洋折翅蠊(Diploptera punctata)中鉴定的咽侧体抑制素(allostatin)(Pratt,1989)，和昆虫
特异性麻痹神经毒素(美国专利No.5,266,361)。
[0219] (H)在自然界中由蛇、马蜂等产生的昆虫特异性毒液，例如蝎子昆虫毒性肽(Pang,1992 Gene 116:165)。
[0220] (I)负责超富集单萜、倍半萜、甾体、异羟肟酸、苯丙烷衍生物或其它具有杀虫活性的非蛋白质分子的酶。
[0221] (J)参与生物活性分子修饰(包括翻译后修饰)的酶；例如糖酵解酶、蛋白质水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶，无论是天然的还是人造的。这些基因的实例包括马蹄莲
(callas)基因(PCT公开的申请WO 93/02197)，几丁质酶编码序列(其可以从例如ATCC以登
录号3999637和67152获得)，烟草钩虫几丁质酶(Kramer et al.,1993 Insect 
Molec.Biol.23:691)，和欧芹ubi4-2多聚泛素基因(Kawalleck et al.,1993 Plant 
Molec.Biol.21:673)。
[0222] (K)刺激信号转导的分子。这些分子的实例包括绿豆钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列(Botella et al.,1994 Plant Molec.Biol.24:757)，和玉米钙调蛋白cDNA克隆的核
苷酸序列(Griess et al.,1994 Plant Physiol.104:1467)。
[0223] (L)疏水矩肽(hydrophobic moment peptide)。见例如美国专利Nos.5,659,026和5,607,914，后者教导了赋予疾病抗性的人造抗微生物肽。
[0224] (M)膜透性酶，通道形成剂或通道阻断剂，例如杀菌肽-β裂解肽类似物(Jaynes et al.,1993 Plant Sci.89:43)，其使转基因烟草植物对青枯病有抗性。
[0225] (N)病毒侵袭性蛋白质或由其衍生的复杂毒素。例如，在经转化的植物细胞中，病毒衣壳蛋白的积累可赋予针对该衣壳蛋白所来源的病毒以及相关病毒所致的病毒感染和/
或疾病发展的抗性。已经给转化植物赋予了衣壳蛋白介导的，针对苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草条纹病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒的抗性。参见，例如，Beachy et al.(1990)Ann.Rev.Phytopathol.28:451。
[0226] (O)昆虫特异性抗体或由其衍生的免疫毒素。因此，靶向昆虫肠道关键代谢功能的抗体可以使受影响的酶失活，杀死昆虫。例如，Taylor等人(1994)，在第七届国际分子植物-微生物相互作用研讨会(Seventh Int'l.Symposium on Molecular Plant Microbe 
Interactions)上的第497号摘要显示了转基因烟草中通过产生单链抗体片段的酶失活。
[0227] (P)病毒特异性抗体。见例如Tavladoraki et al.(1993)Nature 266:469，其显示了表达重组抗体基因的转基因植物被保护免于病毒攻击。
[0228] (Q)由病原体或寄生物自然产生的发育阻滞(developmental-arrestive)蛋白质。因此，真菌内切α-1,4-D多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁的均聚-α-1,4-D-半乳糖醛酸而促进真菌定殖和植物营养素释放(Lamb et al.,1992)Bio/Technology 10:1436。
Toubart等(1992 Plant J.2:367)描述了豆类内切多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的编码基因
的克隆和表征。
[0229] (R)由植物自然产生的发育阻滞(developmental-arrestive)蛋白质，例如大麦核糖体失活基因，其提供了增加的针对真菌疾病的抗性(Longemann et al.,1992).Bio/
Technology 10:3305。
[0230] (S)RNA干扰，其中用RNA分子抑制靶基因的表达。一个实施例中的RNA分子是部分或完全双链的，其触发沉默响应，导致dsRNA被切割成小的干扰RNA，它们随后被纳入到靶向复合体中，靶向复合体破坏同源的mRNA。见例如Fire等人，美国专利6,506,559；Graham等人，6,573,099。
[0231] 赋予除草剂抗性的基因
[0232] (A)编码针对抑制生长点或分生组织的除草剂，例如咪唑啉酮类(imidazalinone)、磺酰苯胺类(sulfonanilide)或磺酰脲类除草剂的抗性或耐受性的基
因。这类基因的实例编码一种突变的ALS酶(Lee et al.,1988 EMBOJ.7:1241)，其也被称作AHAL酶(Miki et al.,1990 Theor.Appl.Genet.80:449)。
[0233] (B)一种或多种额外的编码针对草甘膦抗性或耐受性的基因，所述抗性或耐受性是由突变体EPSP合酶和aroA基因赋予的，或者是通过一些基因如GAT(草甘膦乙酰转移酶)
或GOX(草甘膦氧化酶)和其它膦酰基化合物，如草胺膦(pat和bar基因；DSM-2)，和芳氧基苯氧基丙酸和环己二酮(ACC酶抑制剂编码基因)所致的代谢失活而获得的。见例如美国专利
No.4,940,835，其公开了可赋予草甘膦抗性的EPSP形式的核苷酸序列。编码突变体aroA基
因的DNA分子能够以ATCC登录号39256获得，突变体基因的核苷酸序列在美国专利No.4,
769,061中公开。欧洲专利申请No.0 333 033和美国专利No.4,975,374公开了可赋予除草
剂如L-草铵膦抗性的谷氨酰胺合酶基因的核苷酸序列。欧洲专利申请No.0 242 246提供了
草铵膦乙酰转移酶基因的核苷酸序列。De Greef et al.(1989)Bio/Technology 7:61中描
述了表达编码草铵膦乙酰转移酶活性的嵌合bar基因的转基因植物的产生。赋予针对芳氧
基苯氧基丙酸和环己二酮如稀禾定和甲禾灵(haloxyfop)的抗性的示例性基因是Accl-S1,
Accl-S2和Accl-S3基因，如Marshall et al.(1992)Theor.Appl.Genet.83:435所述。
[0234] (C)编码针对可抑制光合作用的除草剂例如三嗪(psbA和gs+基因)和苄腈(腈水解酶基因)的抗性的基因。Przibilla et al.(1991)Plant Cell 3:169描述了使用编码突变
体psbA基因的质粒转化衣藻。在美国专利No.4,810,648中公开了腈水解酶基因的核苷酸序
列，含有这些基因的DNA分子可以通过ATCC登录号53435、67441和67442获得。Hayes et al.(1992)Biochem.J.285:173中描述了编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达。
[0235] (D)编码针对可结合羟基苯基丙酮酸二加氧酶(HPPD)的除草剂的抗性基因，HPPD是催化对-羟基苯基丙酮酸(HPP)转化形成尿黑酸的反应的酶。这包括例如异噁唑
(EP418175,EP470856,EP487352,EP527036,EP560482,EP682659,美国专利No.5,424,276)，
特别是异噁唑草酮，其是玉米的选择性除草剂，二酮腈(diketonitrile)(EP496630,
EP496631)，特别是2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3苯基)丙烷-1,3-二酮和2-氰基-
3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2苯基)丙烷-1,3-二酮，三酮类(EP625505，EP625508，美国专利No.5,506,195)，特别是磺草酮、和pyrazolinate等除草剂。在植物中产生过量HPPD的基因能够提供针对这些除草剂的耐受性或抗性，包括例如美国专利Nos.6,268,549和6,
245,968和美国专利申请公开No.20030066102中描述的基因。
[0236] (E)编码针对苯氧基生长素除草剂，如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性或耐受性的基因，其也可以赋予针对芳氧基苯氧基丙酸类(AOPP)除草剂的抗性或耐受性。这些基
因的实例包括α-酮戊二酸依赖性的双加氧酶(aad-1)基因，如美国专利No.7,838,733所述。
[0237] (F)编码针对苯氧基生长素除草剂如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性或耐受性的基因，其也可以赋予针对吡啶基氧基生长素除草剂，如氟草烟或绿草定的抗性或耐受
性。这些基因的实例包括α-酮戊二酸依赖性的双加氧酶(aad-12)基因，如WO2007/053482-A2所述。
[0238] (G)编码针对麦草畏的抗性或耐受性的基因(见例如美国专利公开No.20030135879)。
[0239] (H)编码针对抑制原卟啉原氧化酶(PPO)的除草剂的抗性或耐受性的基因(见美国专利No.5,767,373)。
[0240] (I)提供针对可结合光系统II反应中心(PS II)核心蛋白质的三嗪除草剂(例如莠去津)和尿素衍生物(如敌草隆)除草剂的抗性或耐受性的基因。见Brussian et al.,
(1989)EMBO J.1989,8(4):1237-1245。
[0241] 可赋予或贡献数量叠加性状(Value Added Trait)的基因
[0242] (A)修饰的脂肪酸代谢，例如通过用反义基因或硬脂酰-ACP去饱和酶转化玉米或芸苔属植物从而增加植物的硬脂酸含量(Knultzon et al.,1992)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 
89:2624。
[0243] (B)降低的植酸含量
[0244] (1)引入植酸酶编码基因，如黑曲霉植酸酶基因(Van Hartingsveldt et al.,1993 Gene 127:87)，提高植酸降解，向被转化植物添加更多游离磷酸盐。
[0245] (2)可引入降低植酸含量的基因。在玉米中，这可以通过，例如，克隆然后重新导入如下所述的单个等位基因的相关DNA来实现：该单个等位基因导致以植酸水平低为特征的玉米突变体的原因(Raboy et al.,1990 Maydica 35:383)。
[0246] (C)改良的碳水化合物组成，例如通过用编码改变淀粉的分支模式的酶的基因转化植物而实现。这些酶的实例包括，粘液链球菌(Streptococcus mucus)果糖基转移酶基因(Shiroza et al.,1988)J.Bacteriol.170:810，枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因
(Steinmetz et al.,1985 Mol.Gen.Genel.200:220)，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(Pen et 
al.,1992 Bio/Technology 10:292)，番茄转化酶基因(Elliot et al.,1993),大麦淀粉酶
基因(Sogaard et al.,1993 J.Biol.Chem.268:22480)，和玉米胚乳淀粉分支酶II(Fisher et al.,1993 Plant Physiol.102:10450)。
[0247] 各种测定方法可以和本公开的某些实施方案中的核酸分子联合使用。下面的技术在多种情况下有用，并且在一个实施方案中，可用于检测植物细胞中核酸分子和/或编码多肽的存在。例如，分子的存在可以通过多种方法加以确定，包括使用序列的引物或探针、
ELISA测定检测编码的蛋白质、Western印迹检测蛋白质、或Northern或Southern印迹检测
RNA或DNA。可以采用用于检测酶DGT-28的酶学测定。另外，可以使用本领域中确立的程序产生能够检测DGT-28蛋白质存在的抗体。其它技术，例如原位杂交、酶染色和免疫染色，也可以用于检测特定植物器官或组织中重组构建体的存在或表达。转基因可以在植物的一些组
织或一定的发育阶段中选择性表达，或者转基因可以在基本上所有植物组织中、基本上在
其整个生命循环中表达。然而，任何组合表达模式也可以使用。
[0248] Southern分析是一种常用的检测方法，其中DNA用限制性内切核酸酶切割，并在琼脂糖凝胶上分级，以通过分子量分离DNA，然后转移到尼龙膜上。然后，用32P(或其它探针标记)放射性标记的探针片段杂交，并在SDS溶液中洗涤。
[0249] 类似地，Northern分析采用类似的方案，其中RNA用限制性内切核酸酶切割，并在琼脂糖凝胶上分级，通过分子量分离RNA，然后转移到尼龙膜上。然后，用32P(或其它探针标签)放射性标记的探针片段杂交，并在SDS溶液中洗涤。对从感兴趣的组织分离的RNA(例如，mRNA)的分析能够指示相对表达水平。典型地，如果mRNA存在或mRNA的量增加，则可以假设相应的转基因被表达。Northern分析，或其他mRNA分析方案，可以用于确定被引入的转基因或天然基因的表达水平。
[0250] 在Western分析中，不是分离DNA/RNA，而是提取感兴趣的蛋白质并置于丙烯酰胺凝胶上。随后把蛋白质印迹到膜上并与标记底物接触。参见，例如Hood等“, Commercial Production of Avidin from Transgenic Maize；Characterization of Transformants,
Production,Processing,Extraction and Purification”Molecular Breeding 3:291 
306(1997)；Towbin等(1979)“Electrophoretic transfer of proteins from 
polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets:procedure and some applications”
Proc Natl Acad Sci USA 76(9):4350-4354；Renart等“. Transfer of proteins from 
gels to diazobenzyloxymethyl paper and detection with antisera:a method for 
studying antibody specificity and antigen structure”Proc Natl Acad Sci USA 76
(7):3116-3120。
[0251] 本文的核酸或其片段可用于设计用于PCR扩增的引物。在进行PCR扩增时，引物与模板之间可以忍受一定程度的错配。可以通过本领域普通技术人员已知的方法在给定的引
物中产生突变、插入和缺失。
[0252] 检测方法的另一个实例是焦磷酸测序技术，如Winge(Innov.Pharma.Tech.00:18 24,2000)所述。在该方法中，设计一个与相邻的基因组DNA和插入物DNA接点重叠的寡核苷
酸。将该寡核苷酸与来自感兴趣的区域的单链PCR产物杂交(一个引物在插入序列内，一个
引物在侧翼基因组序列内)，并在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、腺苷5'磷酰硫酸和荧光素的存在进行温育。各别地添加各种dNTP，掺入产生光信号，测量该光信号。由于成功的扩增、杂交和单碱基或多碱基延伸，该光信号指示转基因插入物/侧翼序列的存在。
[0253] 分子信标已被描述用于序列检测。简要地说，设计与侧翼基因组和插入物DNA接点重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针的独特结构导致它含有一种使荧光部分和淬灭部分保
持非常靠近的二级结构。对FRET探针和PCR引物(一个引物在插入DNA序列内，一个引物在侧翼基因组序列内)在热稳定聚合酶和dNTP的存在下进行循环。在成功的PCR扩增之后，FRET
探针与靶序列的杂交导致探针的二级结构被除去，并且荧光部分和淬灭部分空间分离。由
于成功的扩增和杂交，荧光信号指示侧翼基因组/转基因插入序列的存在。
[0254] 水解探针测定，或者也称作 (Life Technologies,Foster City,Calif.)，是一种检测和定量DNA序列之存在的方法。简要地说，设计FRET寡核苷酸探针，其具有一段在转基因内的寡聚体，一段在侧翼基因组序列内的寡聚体，用于事件特异性检测。
将FRET探针和PCR引物(一个引物在插入DNA序列内，一个引物在侧翼基因组序列内)在热稳
定聚合酶和dNTP的存在下进行循环。FRET探针的杂交导致荧光部分从FRET探针上的淬灭部
分被切断并释放。由于成功的扩增和杂交，荧光信号指示侧翼/转基因插入序列的存在。
[0255] ELISA或酶联免疫法自1971年以来已为人所知。一般地，将溶解在缓冲液中的抗原包被在塑料表面上。当添加血清时，抗体可以附着在固相上的抗原上。当这些抗体与酶缀合时，抗体的存在与否可以得到展示。加入适当的底物可以检测结合的缀合物的量，后者可以被定量。一种常见的ELISA测定法是使用生物素化的抗-(蛋白质)多克隆抗体和碱性磷酸酶
缀合物的方法。例如，用于定量测定漆酶水平的EILSA可以是一种抗体夹心测定法，其采用商购的多克隆兔抗体。该抗体与碱性磷酸酶缀合以便于检测。另一个实例中是用于检测胰
蛋白酶或胰蛋白酶原的ELISA测定法，其使用生物素化的抗胰蛋白酶或抗胰蛋白酶原多克
隆抗体、以及链霉亲和素-碱性磷酸酶缀合物。
[0256] 某些实施方案涉及使用本公开的一个实施方案的植物作为至少一个亲本来进行杂交的过程。例如，特定的实施方案涉及F1杂交植物，它的一个亲本是、或两个亲本都是任何本文所举例的植物。其它实施方案涉及这种F1杂交体产生的种子。还有其它的实施方案
涉及通过用不同的(例如自交亲本)植物与示例的植物杂交，并收获所得的杂交体种子，来
产生F1杂交体种子的方法。其它实施方案涉及作为母本或父本的示例植物。通过仔细斟酌
亲本植物，可以改善所得植物的特征。
[0257] V.-由DGT-28介导的草甘膦抗性
[0258] 与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的多肽可以具有EPSPS酶活性。因此，在一些实施方案中可以使用与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的多肽，编码与SEQ ID NO:1
具有至少90％同一性的多肽的核酸(例如,SEQ ID NOs:2-4)，和在高严格度条件下与具有
SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核酸杂交的核酸，来赋予细胞或生物(例如植物细胞或植物)
草甘膦耐受性。，提供对草甘膦除草制剂有抗性的植物或植物细胞在很多应用中是有用的，在这些应用中，具有该耐受性的植物细胞能够耐受足以控制栽培区域内的至少一些杂草的
量的草甘膦。
[0259] 草甘膦是一种含有N-(膦酰基甲基)甘氨酸的组合物，是一种广泛应用的除草剂组分。草甘膦通常配制成含水液态浓缩物中的盐、固体浓缩物、乳液或微乳液。从发芽开始在植物发育的各个阶段，草甘膦可以对植物过顶(over-the-top)施用。
[0260] 在美国和全世界，草甘膦耐受性植物品种与草甘膦除草制剂的组合使用已经成为作物生产中杂草管理的标准程序。种植者使用草甘膦耐受性状的首要优势是，它允许简单
而方便地施用草甘膦——一种广谱、萌发后使用的除草剂——以控制不想要的植物和草
(即“杂草”)，并具有优秀的作物安全性，且对种植前(pre-plant)除草剂施用的依赖性较小。其它的好处包括与免耕和少耕系统更好地配合。耐草甘膦作物扩展了杂草管理的选项，使杂草控制工作更容易、更便宜、更灵活。已经有种植者报道，施用除草剂所需的田间行程减少，并使栽培行程也减少，从而节省燃料并减少土壤侵蚀。因此，耐草甘膦的作物降低了除草剂导致的环境风险，同时增加了必要的化学剂控制杂草的效力。
[0261] 因此，本文的一些实施方案可用于在包含植物的栽培区域内对杂草的选择性控制，其中该植物含有与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的多肽，编码与SEQ ID NO:1具有
至少90％同一性的多肽的核酸，和/或在高严格度条件下与具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:
3的核酸杂交的核酸，其中该植物与相同物种的不含该多肽和/或核酸的植物相比，具有增
加的草甘膦耐受性。在一些实施例中，本文提供的方法包括向作物叶和杂草施用足够量的
除草剂草甘膦，以控制杂草的生长。
[0262] 本文特定的实施方案提供了一种用于在含有作物的栽培区域内杀死或控制杂草或不想要的植被的方法，其中该作物例如是含有与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的多
肽、编码与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的多肽的核酸、和/或可以在高严格度条件下
与具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核酸杂交的核酸的植物。在一些实例中，该方法包括
向作物和/或栽培区域施用草甘膦；例如向作物叶施用一定量的草甘膦，同时向紧邻这些植物的杂草施用草甘膦，其中该量足以导致对杂草或不想要的植被的控制，而同时基本上不
伤害作物。
[0263] 可以用足以获得期望的生物结果(例如控制杂草生长同时不会显著影响草甘膦耐受作物)的施用比率向植物施用草甘膦组合物。这些施用比率通常用每单位处理面积上草
甘膦的量表示，例如克每公顷(g/ha)。什么构成“显著效果”取决于研究、开发、销售和使用组合物的人员的标准和实践，选择令组合物显著有效的施用比率属于本领域技术人员的技
艺。
[0264] 在某些实例中，用每单位面积上施用的、导致某种杂草受到85％控制(以生长降低或死亡率为度量)的草甘膦组合物的量来定义施用比率。选择足以控制栽培区域内的杂草
的若干草甘膦除草剂施用比率属于普通农业科技工作者的技艺。本领域的技术人员会类似
地认识到，个体植物的状况、天气和生长条件、以及组合物中具体的活性成分及其重量比，会在具体施用中影响除草剂的有效性程度。
[0265] 在一些实施方案中，可以向植物叶组织施用含水草甘膦组合物以杀死或控制多种多样的不期望植物(包括一年生和多年生草及阔叶杂草)的生长，通过向叶片组织施用含水
草甘膦组合物。在构想的除草剂组合物(例如，粒状固体浓缩物、液态浓缩物、即用型组合物和桶混(tank-mix)组合物)中存在的草甘膦的活性量可以随着许多因素而改变，包括例如，待控制的杂草物种和施用方法。然而，一般而言，草甘膦的浓度、以及任选地，用于除草剂组合物中的表面活性剂和/或某些其他的佐剂或添加剂(如本文其它地方所述)，足以控制栽
培区域内的杂草。
[0266] 除草剂喷雾组合物可以作为含水溶液或分散液施用，无论该组合物是生产成即用型，还是通过液体草甘膦浓缩物的进一步稀释或者向颗粒状固体草甘膦浓缩物中添加水而
产生的。然而，如本文所使用的，术语“含水”包括这样的组合物，其中含有若干量的非水溶剂，只要存在的主要溶剂是水即可。除草剂喷雾组合物可以通过本领域技术人员公知的任
何合适的方法施用到待处理植物的叶片，包括飞行施用和地面施用技术(例如，地面喷杆
(ground boom)、手动喷雾器、芯吸(rope-wick))。
[0267] 在一些实施例中，液态浓缩组合物配制成含有如下浓度的草甘膦：每升至少大约50克,至少大约75克，或至少大约100,125,150,175,200,225,250,275,300,310,320,330,
340,350,360,370,380,390,400,410,420,430,440,450,460,470,480,490,500,510,520,
530,540,550,560,570,580,590,600,610,620,630,640,650,660,670,680,690或700克(酸
当量或称a.e.)，或者更多。草甘膦浓度范围可以是，例如，约50至约680克(a.e.)每升
(gpl)，约100至约600gpl，约250至约600gpl，和约360至约540gpl。
[0268] 当用基于草甘膦浓缩物总重的重量百分比表示时，液态浓缩物可以含有，例如，至少约10wt.％草甘膦(a.e.),至少约15wt.％,和至少约20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,
55,56,57,58,59,60,62,63,64,65,66,67,或68wt.％，或者更多。草甘膦浓度范围可以是，例如，约10wt.％至约70wt.％a.e.，约20wt.％至约68wt.％，或者约25wt.％至约45wt.％。
[0269] 如果草甘膦作为即用型组合物施用，那么草甘膦浓度可以是，例如，约1wt.％至约3wt.％a.e.，和约1wt.％至约2wt.％。
[0270] 喷洒组合物可以被配制成以，例如，至少约1加仑喷洒组合物每英亩，至少约2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,或20加仑每英亩和更多来施用。喷洒组合
物喷洒体积可以是，例如，对于空中施用，约1加仑至约100加仑每英亩，约2加仑至约40加仑每英亩，和约2加仑至约5加仑每英亩，对于地面施用，约5加仑至约20加仑每英亩。
[0271] 在一些实例中，可以使用这样的液态浓缩物制剂，其具有水相，其中草甘膦主要以盐的形式存在；和非水相，其可任选地含有相对水不溶性的第二除草活性成分。这些制剂可以包括，例如，乳剂(包括粗乳液和微乳液、油包水、水包油和水包油包水型)、悬浮液和悬乳剂。在某些情况下，非水相可以包括微囊组分(例如，微胶囊化的除草剂)。在具有非水相的制剂中，组合物中草甘膦a.e.的整体浓度可能仍然是本文中就水相浓缩物制剂所列举的特定示例范围。
[0272] 可以根据任何制剂使用的草甘膦的合适盐形式包括，例如，碱金属盐，例如钠盐和钾盐，铵盐，二铵盐如二甲基铵，烷基胺盐例如二甲基胺和异丙基胺盐，烷醇胺盐例如乙醇胺盐，烷基锍盐例如三甲基锍盐，氧化锍盐，以及它们的混合物或它们的组合。草甘膦的商TM TM TM TM业制剂示例包括，但没有限制：GLYPHOMAX ,GLYPHOMAX XRT,GLYPHOMAX PLUS,DURANGO ,
ROUNDUPTMULTRA,ROUNDUPTMULTRAMAK,ROUNDUPTMCT,ROUNDUPTMEXTRA,ROUNDUPTMBIOACTIVE,ROUNDUPTMBIOFORCE,RODEOTM,POLARISTM,SPARKTM,ACCORDTMSP,ACCORDTMXRT,和ACCORDTM浓缩物，所有这些都包含草甘膦的异丙铵盐(IPA)；ROUNDUPTMDRY和RIVALTM，其含有草甘膦的铵TM TM
盐；ROUNDUP GEOFORCE，一种草甘膦钠盐制剂；TOUCHDOWN ，一种草甘膦三甲基硫盐制剂；
TOUCHDOWNTMIQ，一种草甘膦二铵盐制剂，TOUCHDOWNTMTOTAL IQ，一种草甘膦钾盐制剂，和ROUNDUPTMWEATHERMAX，一种草甘膦钾盐制剂。草甘膦制剂可包括安全剂(safening agent)、表面活性剂、和/或佐剂。
[0273] 如果期望，在制备供施用的制剂时，使用者可以将一种或多种佐剂与草甘膦组合物和稀释水混合。这些佐剂可以包括额外的表面活性剂和/或无机盐(例如硫酸铵)，目的是进一步提高除草剂效力。
[0274] 如果期望，使用者还可以在草甘膦制剂中使用合适的安全剂，以进一步保护植物和/或增加对更多种除草剂的交叉抗性。安全剂是可以通过生理或分子机制降低除草剂对
作物的植物毒性的化学剂，而不会降低杂草控制效力。安全剂通常用于通过激活或表达
cP450增加植物的免疫系统。示例性安全剂包括，例如但不限于：解草嗪、解毒喹、解草胺腈、二氯丙烯胺、1-二氯乙酰基-六氢-3,3,8a-三甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-6(2H)-酮
(dicyclonon)、O,O-二乙基二硫代磷酸酯(dietholate)、解草唑、解草啶、解草胺、氟草肟、解草恶唑、双苯恶唑酸、吡咯二酸(mefenpyr)、4-氯苯基甲基氨基甲酸酯(mephenate)、萘二甲酸酐、和解草腈。
[0275] 安全剂可用于保护大种子的禾本科作物，例如但不限于，玉米、高粱和湿播种水稻，免于种植前掺入的(preplant-incorporated)或萌发前施用(preemergence-applied)
的硫代氨基甲酸盐和氯代乙酰苯胺家族除草剂的损伤。还已开发安全剂用来保护冬季谷类
作物，例如小麦，免于萌发后施用芳氧基苯氧基丙酸和磺酰脲除草剂的损伤。安全剂保护玉米和水稻免于磺酰脲、咪唑啉酮、环己二酮、异噁唑、和三酮除草剂的损伤的应用也已经得到了确立。
[0276] 植物激活剂(一类可以通过激活植物防御机制而保护植物的新型化合物)也可以用于本文的实施方案中。植物激活剂的实例包括阿拉酸式苯(acibenzolar)和噻菌灵
(probenazole)。
[0277] 本发明的实施方案在下面的实施例中进一步限定。但应当理解，这些实施例仅作为举例说明给出。从上面的讨论和这些实施例，本领域的技术人员能够确定本发明的必要
特征，并且在不背离本发明精神和范围的前提下，可以对本发明的实施方案进行各种改变
和修改，以使其适应各种用途和条件。因此，本领域技术人员根据前面的描述，容易想到除本文显示并描述的实施方案之外的本发明实施方案的各种修改。这些修改也应落入所附的
权利要求书的范围内。以下是作为举例说明提供的，而非意在限制本发明的范围。
实施例
[0278] 实施例1：材料和方法
[0279] 本公开的实施方案将在下面的实施例中进行进一步的描述，这些实施例是作为举例提供的，并不以任何方式意图限制本发明。
[0280] 大肠杆菌5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP合酶)中的一个单氨基酸突变(G96A)会导致草甘膦不敏感性(Padgette et al.,(1991)；Eschenburg et al.,(2002)；
Priestman et al.,(2005)；Haghani et al.,(2008))。尽管该突变会赋予对草甘膦的耐受性，但是已知它也会不利地影响EPSP合酶与其天然底物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的结合。结果造成的底物结合效率的改变会导致突变酶不适合于在植物内提供对草甘膦的耐受性。
[0281] 在计算机上从NCBI GenBank数据库筛选这样的EPSP合酶蛋白质和多核苷酸序列：在该EPSP合酶中与大肠杆菌EPSP合酶中引入的G96A突变类似的位置上，该EPSP合酶天然地
含有丙氨酸(Padgette et al.,(1991)；Eschenburg et al.,(2002)；Priestman et al.,
(2005)；Haghani et al.,(2008))。
[0282] 被鉴定出在该位置含有天然丙氨酸的一种酶是来自斯维链霉菌(Streptomyces sviceus)ATCC29083的DGT-28(GENBANK登录号NO:ZP_06917240.1)。进一步的计算机数据挖
掘显示了另外3个独特的链霉菌酶，它们与DGT-28具有更大的同源性：DGT-31(GENBANK ACC NO:YP_004922608.1)；DGT-32(GENBANK ACC NO:ZP_04696613)；和DGT-33(GENBANK ACC 
NO:NC_010572)。这些酶都在EPSP合酶中与大肠杆菌版本的EPSP合酶中引入的G96A突变类
似的位置上含有天然的丙氨酸。图1。
[0283] 因为来自不同生物的EPSP合酶蛋白质具有不同的长度，所以对大肠杆菌版本的EPSP合酶的突变编号不一定与来自其它生物的EPSP合酶的突变编号相对应。这些鉴定的
EPSP合酶的草甘膦耐受性或PEP底物亲和力先前并未得到过表征。而且，这些EPSP合酶代表了一类新的EPSP合酶，其不含有任何已经用于表征先前描述的I类(植物来源序列，在美国
专利No.RE39247中进一步描述)、II类(细菌来源序列，在美国专利No.RE39247中进一步描
述)、和III类(细菌来源序列，在国际专利申请WO 2006/110586中进一步描述)EPSP合酶的
序列基序。
[0284] 对新型DGT-28、DGT-31、DGT-32和DGT-33酶的草甘膦耐受性和PEP底物亲和性进行了表征，并与I类EPSP合酶进行了比较。使用如下的I类酶进行比较：来自大豆的DGT-1，来自欧洲油菜的DGT-3(GENBANK登录号NO:P17688)，来自小麦的DGT-7(GENBANK登录号NO:
EU977181)。人造并评估了I类EPSP合酶及其突变体。这些植物EPSP合酶中导入的一个突变
是在与大肠杆菌版本EPSP合酶的G96A突变类似的位置处引入的甘氨酸到丙氨酸的突变。此
外，在这些I类EPSP合酶中与Funke et al.,(2009)所述的大肠杆菌EPSP合酶的氨基酸97(T
变为I)和氨基酸101(P变为S)类似的位置处，引入了苏氨酸到异亮氨酸和脯氨酸到丝氨酸
的突变。
[0285] 图1描绘了DGT-28、DGT-31、DGT-32、和DGT-33与其它EPSP合酶的部分序列比对结果。所有4种DGT酶均在aroA-EPSP合酶的氨基酸位置96处有一个保守的丙氨酸。该氨基酸的位置用星号指示，并且该氨基酸残基用下划线标示。
[0286] 图2显示了DGT-1、DGT-3和DGT-7酶的比对结果。第一个星号指示了从甘氨酸变成丙氨酸的突变氨基酸残基的位置。第二个星号指示了从苏氨酸变成异亮氨酸的突变氨基酸
残基的位置。第三个星号指示了从脯氨酸变成丝氨酸的第三个突变氨基酸残基的位置。这
些突变被引入到DGT-1、DGT-3和DGT-7的不同版本。含有突变的这些基因的不同版本(v1,-
v2,-v3…-vN)将下文有更详细的描述。
[0287] 实施例2:用于植物和细菌表达的序列优化
[0288] 植物优化.计算单一密码子相对于所有氨基酸的密码子的使用频率，来作为双子叶植物和单子叶植物(玉米)的密码子偏好。表1。或者，可以计算编码特定氨基酸的单个密码子相对于该氨基酸的所有其它密码子(同义密码子)的使用频率，来作为密码子偏好。在
设计用于植物表达的密码子区时，当存在多种选择时，应当确定所述植物优选的主要(“第一选择”)密码子、以及优选密码子的第二、第三、第四等选择。
[0289] 对来自斯维链霉菌DGT-28编码区序列的分析显示存在多个被认为不利于最优植物表达的序列基序，以及对于双子叶和单子叶植物中表达而言非最优的密码子组成。
[0290] 表1.-在D、E、I和J列中显示来自单子叶(玉米％)和双子叶(双子叶植物％)植物基因编码区的同义密码子出现率(representation)。用于植物优化人造基因设计的平衡化-
偏好(balanced-biased)密码子出现率组的值见C和H列
[0291]
[0292]
[0293] *DNU＝不使用
[0294] 为了工程构建编码DGT-28蛋白质的植物优化基因，利用冗余遗传密码设计了编码氨基酸序列的DNA序列，而冗余遗传密码是利用根据特定宿主植物的蛋白质编码序列汇编
的密码子偏好表确立的。在表1中，D列和I列提供了在单子叶植物(玉米)编码区中发现的每种氨基酸的同义密码子的分布(以该氨基酸的所有密码子利用率的％计)。E列和J列提供了
在双子叶植物编码区中发现的每种氨基酸的同义密码子的分布(以该氨基酸的所有密码子
利用率的％计)。某些氨基酸的某些同义密码子在植物基因中很少发现(例如CGG)。通常，如果在任一植物类型的基因中，密码子编码相关氨基酸的几率为约10％或更低，则可以认为
该密码子是稀有的(如表1中C和H列的DNU所示)。为了平衡某一氨基酸的其余密码子选择的
分布，使用如下的公式为每个密码子计算加权平均出现率(Weighted  Average 
representation)：
[0295] C1的加权平均值％＝1/(％C1+％C2+％C3+等等)x％C1 x 100,   (1)
[0296] 其中C1是所考虑的密码子，％C2、％C3等代表其余的同义密码子在双子叶植物中的平均％值(相关密码子的平均％值取自表1的C和H列)。
[0297] 每个密码子的加权平均％值在表1的C和H列给出。
[0298] 使用前述的程序，使用在双子叶植物基因中发现的频繁使用的密码子的平衡化密码子分布，设计了用于在双子叶植物中最优表达的、基本上编码DGT-28蛋白质的氨基酸序
列的新DNA序列。使用在单子叶植物基因中发现的频繁使用的密码子的平衡化密码子分布，设计了用于在单子叶植物中最优表达的、基本上编码DGT-28蛋白质的氨基酸序列的第二个
DNA序列。这两个新DNA序列与编码dgt-28的原始DNA序列的区别在于，改用植物(第一优选、第二优选、第三优选或第四优选的)密码子来指定蛋白质氨基酸序列中每个位置上的合适
氨基酸。
[0299] 植物优化DNA序列的设计从DGT-28蛋白质序列(Genbank登录号No:-ZP_06917240.1)的蛋白质序列的逆翻译开始。使用从表1的E和J列构建的双子叶植物密码子偏
好表对SEQ ID NO:1进行逆翻译。使用从表1的D和I列构建的单子叶植物偏好表对SEQ ID 
NO:1实施另一个逆翻译。
[0300] 然后，通过补偿密码子变化(同时保留整体加权平均密码子出现率)以除去或添加限制酶识别位点，除去高稳定的链内二级结构，和除去其它可能对克隆操作或工程化基因
在植物内的表达有害的序列，对最初的逆翻译序列进行修饰。然后，对DNA序列再次进行分析，寻找可能通过这些修饰产生的限制酶识别位点。对于鉴定出的位点进一步进行修饰，用优选密码子的第一、第二、第三或第四选择代替相关的密码子。序列中其它可能影响感兴趣的基因转录或翻译的位点包括外显子:内含子接点(5’或3’)，多聚A添加信号，和RNA聚合酶终止信号。对经过修饰的序列进行进一步的分析和进一步的修饰，以降低TA或CG双联体的
频率，以及增加TG或CT双联体的频率。除了这些双联体外，具有超过约6个连续[G+C]或[A+T]残基的序列区块也会影响序列的转录或翻译。因此，也要修饰这些序列区块，将第一或第二选择的密码子替换为优选密码子的其它选择。基因设计中不包含显著量的稀有密码子，
只有在必要时，为了满足除密码子组成本身之外的不同设计标准(例如添加或删除限制酶
识别位点)方才使用。
[0301] 这种新设计的、双子叶植物优化的dgt-28v5多核苷酸序列在SEQ ID NO:2中列出。新设计的、单子叶植物优化的dgt-28v6多核苷酸序列在SEQ ID NO:3中列出；该序列进行了微小的修饰，在第二个氨基酸位置处包含一个丙氨酸，以便引入限制酶位点。所得的DNA序列具有更高程度的密码子多样性，理想的碱基组成，含有策略性设置的限制酶识别位点，并且缺少可能干扰基因转录或产物mRNA翻译的序列。
[0302] 由商业供应商(DNA2.0,Menlo Park,CA)合成了含有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，且含有额外的序列的DNA片段，额外的序列例如6-框终止子(添加在编码序列的3’端的、位于全部6个阅读框中的终止密码子)，和用于克隆的5’限制位点。然后，如下面实施例所述地，将合成的核酸分子克隆到表达载体中，并转化到植物或细菌中。
[0303] 使用相似的密码子优化策略设计dgt-1、dgt-3 v2(G173A)、dgt-3 v3(G173A；P178S)、dgt-3 v4(T174I；P178S)、dgt-7 v4(T168I；P172S)、dgt-32 v3、dgt-33 v3、和dgt-
33 v3。这些基因的密码子优化版本分别如SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ 
ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,和SEQ ID NO:144所列。
[0304] 细菌优化设计了用于在大肠杆菌细胞中最优表达的、编码SEQ ID NO:1DGT-28蛋白质的新DNA序列。大肠杆菌优化的DNA序列的设计最初是使用来自GeneArt的专有密码子
优化规程(Regensburg,Germany)对SEQ ID NO:1的蛋白质序列进行逆翻译。通过补偿密码
子变化(同时保留整体加权平均密码子出现率)以除去或添加限制酶识别位点，除去高稳定
的链内二级结构，和除去其它可能对克隆操作或工程化基因在植物内的表达有害的序列，
对最初的逆翻译序列进行修饰。此类在编码区中应避免的有害序列的一个实例是16S核糖
体RNA结合序列(“Shine-Dalgarno序列”)，例如AGGAGG，其可能编码例如两个连续的精氨酸，但是也可能用作基因内的(因此是不期望的)翻译起始信号。SEQ ID NO:4给出了编码
SEQ ID NO:1蛋白质的大肠杆菌偏好的dgt-28-DNA序列(dgt-28v1)。
[0305] 为了方便克隆和确保高效的翻译起始，在ATG翻译起始密码子的上游设置了一个5'端NdeI限制酶识别序列。同样为了克隆和确保恰当的翻译终止，在编码区3'端包含编码
两个TAA翻译终止密码子的碱基和一个XhoI限制酶识别位点的碱基。包含SEQ ID NO:4的
DNA片段的合成由供应商GeneArtTM实施。
[0306] 使用相似的大肠杆菌密码子优化策略设计dgt-1 v5,dgt-1 v6(G112A),dgt-1 v7(G112A；P117S),dgt-1 v8(T113I；P117S),dgt-3 v6(G105A),dgt-3 v7(G105A；P112S),
dgt-3 v8(T106I；P112S),dgt-7 v5,dgt-7 v6(G113A),dgt-7 v7(G113A；P117S),dgt-7 v8(T114I；P117S),dgt-32 v5,和dgt-33 v5。对于dgt-1、dgt-3和dgt-7序列版本，通过除去叶绿体导向序列而加以修饰。这些基因的大肠杆菌优化的版本分别如SEQ ID NO:12,SEQ ID 
NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID 
NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,和SEQ ID NO:24所列。
[0307] 实施例3:用于细菌表达草甘膦耐受基因的载体
[0308] 大肠杆菌表达用的pET表达载体dgt-28的构建为了体外测试，由GeneArtTM公司合成并克隆了dgt-28 v1大肠杆菌优化的基因序列(SEQ ID NO:4)，用于合成和克隆。利用添
加的Nde I和Xho I限制位点将合成的dgt-28 v1基因序列克隆到pET28表达载体中。所得的
构建体引入了N端6X His标签，并标记为pDAB100445。图14。
[0309] dgt-28 v1的定点突变对dgt-28 v1进行定点诱变，以评估位置84处的丙氨酸对提供针草甘膦耐受性的作用。将该天然丙氨酸突变成甘氨酸，以确定该变化是否会降低酶对
草甘膦的耐受性或对PEP的亲和力。选择该氨基酸残基是因为它与先前所述引入到大肠杆
菌EPSP合酶中的G96A突变相对应。
[0310] 使用StratageneTM的Quick Change IITM试剂盒(Santa Clara,CA)进行诱变。根据TM
QuickChange 的方案设置PCR反应，使用pDAB100445(dgt-28v1)作为模板DNA。含有突变的
dgt-28v2基因序列的构建体命名为pDAB102946(图15)，并通过DNA测序加以确认。设计了如下的引物来制造氨基酸转变：
[0311] DGT28 MutF(SEQ ID NO:25；5’gATgTTTATTgCCgTgATggTggAACCACCgCACgTTTTC)
[0312] DGT28 MutR(SEQ ID NO:26；5’gAAAACgTgCggTggTTCCACCATCACggCAATAAACATC)
[0313] 对dgt-28 v2进行第二轮诱变，尝试进一步降低其对草甘膦的耐受性。在已经被诱变的dgt-28 v2中引入第二个突变T172A。Haghani et al.,(2008)中已描述了在这个位点
将EPSP合酶相反地从丙氨酸变为苏氨酸，导致对草甘膦不敏感。最终的结果是产生了A84G、T172A双突变体，其命名为dgt-28 v3。根据QuickChangeTM的方案设置PCR反应，并使用
pDAB102946(dgt-28v2)作为模板DNA。含有突变的dgt-28 v3基因序列的构建体命名为
pDAB100469(图16)。设计了如下的引物以产生T172A突变：
[0314] DGT28 Mut2F(SEQ ID NO:27；5’gggTCCgCTggCACgTCAgggTCTgCgTATTCg)
[0315] DGT28 Mut2R(SEQ ID NO:28；5’CgAATACgCAgACCCTgACgTgCCAgCggACCCAgCAgC)
[0316] 额外的大肠杆菌表达用构建体,pET表达载体为了体外测试，合成并克隆TM
(GeneArt )了dgt-1 v5,dgt-1 v6,dgt-1 v7,dgt-1 v8,dgt-3 v6,dgt-3 v7,dgt-3 v8,
dgt-7 v5,dgt-7 v6,dgt-7 v7,dgt-7 v8,dgt-32 v5,和dgt-33 v5基因序列。将合成的基
因克隆到pET28表达载体中。所得构建体标记为：pDAB102028(图17)，其含有dgt-1 v5；
pDAB102029(图18)，其含有dgt-1 v6；pDAB102032(图19)，其含有dgt-1 v7；pDAB102034(图
20)，其含有dgt-1 v8；pDAB100429(图21)，其含有dgt-3 v6；pDAB100442(图22)，其含有dgt-3 v7；pDAB100430(图23)，其含有dgt-3 v8；pDAB102036(图24)，其含有dgt-7 v5；
pDAB102038(图25)，其含有dgt-7 v6；pDAB102040(图26)，其含有dgt-7 v7；和pDAB102042(图27)，其含有dgt-7 v8。
[0317] DGT-32和DGT-33的克隆为了体外测试，分别从二元载体pDAB107532(图11)和pDAB107534(图12)中扩增出如下的植物优化基因：dgt-32v3和dgt-33 v3。使用如下的引物组：
[0318] pMALDGT32F(SEQ ID NO:29；CATATGACCGTTATTGAAATTCCGGG)和
[0319] pMALDGT32R(SEQ ID NO:30；GATATCCTATTATTAACGACCTTCCAG)；用于dgt-32,和pMALDGT33F(SEQ ID NO:31；CATATGGGTGCAGTTACCGTTATTGA),
[0320] pMALDGT33R(SEQ ID NO:32；GATATCCTATTATTATGCCTGCGGAC)；用于dgt-33。
[0321] 然后，将扩增的序列亚克隆到pMAL c5X中，从而使每一个基因与malE编码序列框内融合。最终的表达构建体为：含有dgt-32v3的pDAB107713(图29)，和含有dgt-33v3的
pDAB107714(图30)。
[0322] 实施例4:体外生物化学酶动力学测定
[0323] 重组DGT酶的过表达和纯化在Rosetta2TM(DE3)细胞(NovagenTM,Madison,WI)中从上述的构建体过表达重组DGT蛋白质。使用单集落接种在37℃过夜培养过的含有氯霉素(25
μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)的50mL LB起始培养物。使用过夜培养物接种含有氯霉素(25μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)的1L LB。使培养物在37℃生长至O.D.600＝0.6，然后置于冰水浴中10分钟。通过添加终浓度为500μM的IPTG实现目标蛋白质的表达。
[0324] 在20℃诱导过夜，随后通过8,000rpm离心20分钟进行收集。将细胞沉淀物贮存在-80℃，直到需要进行纯化。所有纯化步骤均在4℃下实施。将来自1升培养物的细胞沉淀重悬在20-30mL缓冲液A(50mM HEPES pH7.5，150mM KCl，2mM DTT，1mM EDTA，20mM咪唑，和5％甘油)中。然后添加COMPLETETM蛋白酶抑制剂混合物(1片/50ml，Roche,Indianapolis,IN)和溶菌酶(1mg/mL,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)，将悬浮液搅拌20分钟。用
TM TM
Branson Sonifier 250进行细胞裂解(3 x 60秒冲击)，随后通过16,000rpm离心45分钟除
去细胞碎片。
[0325] 通过固定化金属亲和色谱(IMAC)，使用5mL HisTrap FF预装柱(crude column)将DGT酶一步纯化为均质。用缓冲液A平衡该柱，并在相同缓冲液中加载样品。然后，用10倍柱体积的缓冲液A洗涤柱，随后用0-100％缓冲液B(50mM HEPES pH 7.5,200mM KCl,2mM DTT,
1mM EDTA,500mM咪唑,和5％甘油)线性梯度进行洗脱25个柱体积。将通过SDS PAGE分析判
断为含有目标蛋白质的级分用装备有10kDa分子量截留(MWCO)的Millipore超离心设备浓
缩成2.5mL。将纯化的DGT酶用PD-10柱(GE Healthcare)交换缓冲液到50mM HEPES pH 7.5,
150mM KCl,2mM  DTT,和5％甘油中，并随后浓缩到～1mL。样品通常1:50稀释，并在
Cary50TMBio UV-可见光分光光度计上记录240-700nm的UV-可见光光谱。然后，使用理论消化系数根据280nm的吸光度(ExPASy,Geneva,Switzerland)计算蛋白质浓度。
[0326] 重组DGT-32和DGT-33融合物的表达和纯化DGT-32和DGT-33酶被构建成在酶的氨基端含有一个麦芽糖融合标签。分离并确认用pDAB107712(图28),pDAB107713和
pDAB107714转化的大肠杆菌细胞。使用每个细菌菌株的单菌落接种含有100μg/μL羧苄青霉素和25μg/μL氯霉素的50mL LB培养基。将起始培养物在37℃过夜生长，随后用于接种补充有0.2％葡萄糖、100μg/μL羧苄青霉素和25μg/μL氯霉素的600mL LB培养基。培养物在37℃生长至O.D.600＝0.4，此时添加IPTG至终浓度为50μM IPTG。培养物在18℃诱导15小时。第二天，通过8,000rpm离心20分钟沉淀细胞来收集培养物。将细胞糊保存在-80℃，直至需要用于纯化。
[0327] 将冷冻的离心沉淀物重悬浮在20-30mL缓冲液A(50mM HEPES pH 7.5,100mM KCl,1mM EDTA,5％甘油,和1mM DTT)和1片蛋白酶抑制剂(Roche Complete)中。一旦离心沉淀物
完全重溶，便添加1mg/mL溶菌酶，并将样品在4℃混合15-20分钟。用溶菌酶温育后，将样品转移到50mL离心管中，并置于冰上。然后，将样品以1分钟间隔随后4分钟冷却进行超声破
碎。该步骤再重复2次，总共3次超声波循环。通过16,500rpm离心45分钟除去细胞碎片，并将上清液加载到50mL注射环(injection loop)中。将粗裂解液施用到直链淀粉柱上，用7倍柱体积的缓冲液A洗涤，并用100％缓冲液B(缓冲液A和10mM麦芽糖)洗脱。将目标蛋白质汇集
并用30kDa MWCO的Centricon浓缩至2.5mL。将纯化的蛋白质用PD-10凝胶过滤柱进行交换
缓冲液为50mM HEPES pH 7.5，100mM KCl和5％甘油。通过Bradford测定使用BSA作为标准
确定蛋白质浓度。将纯蛋白质在液氮中冷冻并贮存于-80℃。
[0328] 植物和细菌DGT酶的体外动力学表征按照Lanzetta  et  al.(1979)Anal.Bioch.100:95 7所述的改良程序，通过测量无机磷(Pi)的产生来测量野生型(WT)和
突变DGT的酶活性。测定按96孔板格式实施，在Spectra Max 190酶标仪(Molecular 
Devices,Sunnyvale,CA)上以总体积50μL进行。典型的测定体系含有50mM HEPES pH 7.5,
150mM KCl,2mM DTT,和1mM S3P。PEP和草甘膦浓度按照指示改变。草甘膦作为游离酸从
Sigma获得，并重悬在ddH2O中。通过添加KOH溶解草甘膦，直至混合物的pH在中性。通过添加
0.01-1μM浓度的DGT酶来起始测定。通过添加235μL孔雀石绿:钼酸铵溶液的3:1混合物终止反应。完全显色(～1分钟)之后，记录660nm的吸光度，并从标准曲线计算形成的Pi量。使用缺少酶的对照反应校正背景吸光度。使用本检测方法，高浓度的PEP(>2mM)和草甘膦(>
30mM)会贡献显著量的背景吸光度。用数据拟合米氏方程，其允许确定Km和Vmax(公式3)，而TM
IC50从公式4确定，其中y是相对活性，s是Hill系数。使用GraFit version 5软件
(Erithacus Software Limited,Horley,U.K.)对数据进行分析。
[0329]
[0330]
[0331] 竞争性抑制剂的IC50值会随着底物浓度的变化而改变，因此表2的IC50值是在1mM PEP和60μM PEP(植物中细胞内PEP浓度的估计值)下获得的。应该仅比较在相同浓度PEP下
测得的IC50值(DGT-32和DGT-33的Km在100μM PEP下确定)。此外，高耐受性酶的IC50值不能用Lanzetta的方法精确地确定，因此是根据相对活性估测的。
[0332] 植物DGT的动力学首先测试两个具有非突变天然序列的酶，DGT-1 v5和DGT-7 v5，以建立草甘膦敏感性的基准参数。两种蛋白质均显示对PEP的低Km值(～70μM)，并且对草甘膦敏感，1mM PEP下的IC50值为～20μM(表2)。如对DGT-1 v6,DGT-3 v6,和DGT-7 v6所观察到的，G到A的单个点突变导致对草甘膦的耐受性显著提高(IC50值为8-21mM)，但是也令对PEP的Km值增加了～8倍。对于所有植物来源的DGT(DGT-1 v7,DGT-3 v7,和DGT-7 v7)，双突变
也提高了草甘膦耐受性，但是同样导致PEP Km相当大的提高。表2。TIPS突变体(DGT-1 v8,DGT-3 v8,和DGT-7 v8)对中等浓度的草甘膦(3-6mM)耐受，但与GA和GAPS突变体形成对照
的是，Km水平保持接近野生型蛋白质，在60-200μM之间。图31展示了引入载明的突变导致DGT-1(A)和DGT-7(B)的草甘膦耐受性偏移。对于产生图31所示数据的实验，将PEP浓度保持在1mM，其很可能导致DGT-7 v8的IC50提高(>80mM)。实施进一步的程序，以确定低水平的PEP是否改变对草甘膦的相对耐受性。PEP的生理相关水平在5-60μM范围。使用60μM PEP，IC50值显著降低(3.6mM)，提示初始确定受到过量PEP的影响，这一点从米氏动力学可以预期，并在表2中示明。
[0333] 图31显示了在DGT-1(A)和DGT-7(B)中引入各种突变之后，用1mM PEP获得的IC50值。对于A和B IC50曲线，实心三角形代表野生型，实心圆形代表GA突变体，空心方形代表GAPS突变体，实心方形代表TIPS突变体。
[0334] 表2.DGT酶的稳态动力学参数。由于所用方法的限制，大于50的IC50值是估计值。*草甘膦的IC50是在100μM PEP下确定的。
[0335]
[0336] 细菌DGT的动力学在细菌酶中，DGT-28v1具有最有利的整体动力学参数(升高的IC50和kcat/Km值)。该酶对>80mM浓度的草甘膦耐受，并显示1.32 x 105M 1s 1的催化效率。
DGT-28v2中的A→G突变将IC50降低到2.17mM(在60μM PEP下)，并导致对PEP的Km有略微提高(161μM)。这种突变酶保留DGT-28v1所见的高催化效率。即使具有降低的IC50，在某些应用中，该突变酶仍然适合于在植物内(in planta)提供对草甘膦的耐受性。数据提示，这种新类型的EPSP合酶，丙氨酸不是草甘膦耐受性的唯一决定因素。为了探索其他可能的决定因
素，构建了额外的变体DGT-28v3(A84G-T172A双突变体)。该酶显示对草甘膦降低的耐受性，IC50值为5.15mM(在60μM PEP下)。DGT-28 v3 IC50的降低伴随着催化效率降低200倍，提示第二个突变导致了非预期的效果(表2)。具有更高同一性的DGT-28 v1同源物(～75％氨基
酸同一性)DGT-32和DGT-33具有对PEP的低Km(～114-139μM)，但是催化效率比DGT-28v1低
100倍。这种催化效率的降低很可能是由于麦芽糖结合蛋白(MBP)融合。该酶也对草甘膦不
敏感，显示的IC50值大于50mM。这些体外测定表明各种DGT酶可提供对草甘膦的耐受性，于是将DGT酶在植物内进行测试。
[0337] 实施例5:植物转化载体的克隆
[0338] 植物二元载体构建使用通用克隆方法构建入门载体，其含有与dgt-28框内融合的叶绿体转运肽多核苷酸序列。对于含有与dgt-28融合的转运肽(TraP)的入门载体，用IN-
FUSIONTMAdvantage Technology(Clontech,Mountain View,CA)进行组装。作为融合的结
果，从dgt 28中除去了第一个氨基酸——甲硫氨酸。通过DNA2.0(Menlo Park,CA)分别合成转运肽TraP4 v2(SEQ ID NO:33),TraP5 v2(SEQ ID NO:34),TraP8 v2(SEQ ID NO:35),
TraP9 v2(SEQ ID NO:36),TraP12 v2(SEQ ID NO:37),和TraP13 v2(SEQ ID NO:38)，并融
合于dgt-28的5’端片段(到唯一的AccI限制性核酸内切酶识别位点为止并包含该位点)。
[0339] 含有各种TraP和dgt-28表达盒的二元质粒由拟南芥泛素10启动子(AtUbi10-v2；Callis,et al.,(1990)J.Biol.Chem.,265:12486 12493)驱动，并且侧翼是根癌土壤杆菌
开放阅读框23的3’非翻译区(AtuORF23 3′UTR v1；U.S.Pat.No.5,428,147)。
[0340] 组装好的TraP和dgt-28表达盒使用 技术(Invitrogen,Carlsbad,CA)改造后，通过土壤杆菌介导的植物转化转化进植物中。限制性核酸内切酶从New 
England BioLabs(NEB；Ipswich,MA)获得，DNA连接使用T4 DNA连接酶(Invitrogen)进行。
使用 LR 酶混合物(Invitrogen)实施Gateway反应，将一个入门
载体组装到单一的目标载体中，该目标载体含有一个选择标记盒：木薯叶脉花叶病毒启动
子(CsVMV v2；Verdaguer et al.,(1996)Plant Mol.Biol.,31:1129 1139)—DSM-2(美国
专利申请No.2007/086813)-根癌土壤杆菌开放阅读框1的3’非翻译区(AtuORF1 3′UTR v6；
Huang et al.,(1990)J.Bacteriol.172:1814 1822)。使用 质粒试剂盒
(Macherey Nagel Inc.,Bethlehem,PA)或质粒Midi试剂盒(Qiagen)按照供应商的指导进
行质粒制备。琼脂糖Tris乙酸凝胶电泳后，使用QIAquickTM凝胶提取试剂盒(Qiagen)分离
DNA片段。
[0341] 通过小量制备(miniprep)DNA的限制性消化初步筛选所有装配的质粒的集落。对选定克隆的质粒DNA，由商业测序公司(EurofinsTMMWG Operon,Huntsville,AL)进行测序。
使用SEQUENCHERTM软件(Gene Codes Corp.,Ann Arbor,MI)对序列数据进行组装和分析。
[0342] 下列二元构建体表达各种TraP:dgt-28融合基因序列：pDAB107527(图3)，含有TraP4 v2:dgt-28v5(SEQ ID NO:79)；pDAB105530(图4)，含有TraP5 v2:dgt-28 v5(SEQ ID NO:80)；pDAB105531(图5)，含有TraP8 v2:dgt-28 v5(SEQ ID NO:81)；PDAB105532(图6)，含有TraP9 v2:dgt-28 v5(SEQ ID NO:82)；pDAB105533(图7)，含有TraP12 v2:dgt-28 v5
(SEQ ID NO:83)；和pDAB105534(图8)，含有TraP13 v2:dgt-28v5(SEQ ID NO:84)。
pDAB105534的dgt-28v5序列被修饰，其中第一个密码子(GCA)变成(GCT)。
[0343] 其它植物二元载体构建使用与上述相似的克隆策略构建含有dgt-31,dgt-32,dgt-33,dgt-1,dgt-3,和dgt-7的二元质粒。
[0344] 如前所述地，将微生物来源的基因；dgt-31,dgt-32,和dgt-33，与不同的叶绿体转运肽融合。使用如下的叶绿体转运肽：TraP14 v2(SEQ ID NO:39),TraP23 v2(SEQ ID NO:40),TraP24 v2(SEQ ID NO:41)。pDAB107532(图11)含有与TraP14 v2(SEQ ID NO:42)融合
的dgt-32 v3，pDAB107534(图12)含有与TraP24 v2(SEQ ID NO:43)融合的dgt-33 v3，
pDAB1017533(图54)含有与TraP23 v2(SEQ ID NO:143)融合的dgt-33 v1。dgt表达盒由拟
南芥泛素10启动子(AtUbi10启动子v2)驱动，并且侧翼是根癌土壤杆菌开放阅读框23的3’
非翻译区(AtuORF23 3′UTR v1)。在二元载体中还存在一个DSM-2选择标记盒，其含有木薯叶脉花叶病毒启动子(CsVMV v2)—DSM-2—根癌土壤杆菌开放阅读框1的3’非翻译区
(AtuORF1 3′UTR v6)。
[0345] 构建了其他的二元载体，其中dgt-31v3,dgt-32v3,和dgt-33v3与前述的叶绿体转运肽序列融合。例如，TraP8 v2序列与dgt-31v3,dgt-32v3,和dgt-33v3融合，并被如上所述地克隆到二元载体中。
[0346] 构建了含有I类基因(dgt-1,dgt-3,和dgt-7)的二元载体。构建了如下的二元载体，并转化进植物中：pDAB4104(图9)，其含有如美国专利申请公开No.2011/0124503所述的dgt-1v4序列，该序列的侧翼是如美国专利申请公开No.2009/0064376中所述的烟草
Osmotin序列；pDAB102715(图10)；pDAB102716(图45)；pDAB102717(图4611)；和pDAB102785(图13)。没有将与dgt-28,dgt-31,dgt-32,和dgt-33融合的各种TraP叶绿体转运肽添加到I
类基因中，因为这些植物来源的序列具有天然的植物叶绿体转运肽。这些载体在表3中有更详细的描述。
[0347] 表3.含有I类EPSP合酶基因(即dgt-1,dgt-3,或dgt-7)的二元载体描述
[0348]
[0349] 实施例6:转化到拟南芥中并筛选
[0350] 拟南芥转化用Clough和Bent(1998)所述的花序浸渍法(floral dip)转化拟南芥。使用含有上述二元质粒其中之一的选定土壤杆菌菌落接种一个或多个100mL含有壮观霉素
(100mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的YEP肉汤预培养物。将培养物在28℃、225rpm恒定搅拌下
温育过夜。在室温下通过大约5000x g 10分钟沉淀细胞，并弃去所得上清液。将细胞沉淀物轻轻重悬在含有5％(w/v)蔗糖、10μg/L 6-苄氨基嘌呤和0.04％SilwetTML-77的400mL浸渍培养基(dunking media)中。将大约1个月大的植物浸渍在培养基中5-10分钟，并轻轻搅拌。
将植物侧向放倒，用透明或不透明的塑料袋覆盖2-3小时，然后直立放置。使植物在22℃，16小时光照/8小时黑暗的光周期中生长。浸渍后大约4周，采收种子。
[0351] 转化植物的选择新鲜采收的T1种子(含有dgt和DSM-2表达盒)在室温干燥7天。将T1种子播种在26.5x 51-cm发芽托盘(germination tray)中，每个盘放入200mg等份的层积
(stratified)T1种子(～10,000个种子)，这些种子先前已经悬浮于40mL 0.1％琼脂糖溶液
中，并在4℃保存2天，以完成休眠要求并确保种子同步萌发。
[0352] 将Sunshine Mix LP5用细蛭石覆盖，并用Hoagland溶液从地下灌溉至湿润，然后通过重力排水。用移液器将每个40mL等份的层积种子均匀播种在蛭石上，并用保湿盖
(humidity dome)覆盖4-5天。除去保湿盖1天后，利用草胺膦萌发后喷雾进行初始转化体筛选(筛选共转化的DSM-2基因)。
[0353] 在种植后7天(DAP)和11DAP，使用DeVilbiss压缩空气喷嘴用0.2％Liberty除草剂溶液(200g ai/L草胺膦,Bayer Crop Sciences,Kansas City,MO)喷洒T1植物(分别为子叶
期和2-4叶期)，喷洒体积为10mL/盘(703L/ha)，每次施用提供280g ai/ha有效比率的草铵
膦。在最后一次喷洒4-7天后鉴定存活者(活跃生长的植物)，并移植到备有盆栽培养基
(Metro Mix 360)的3英寸盆(pot)中。将移植的植物在温室中培养(22±5℃,50±30％RH,
14h光照:10黑暗,最低500μE/m2s1自然光+补充光)。对存活的T1植株进行分子确认分析，以确认草甘膦耐受性基因已经稳定整合到植物的基因组中。
[0354] 分子确认确认了用pDAB107527,pDAB105530,pDAB105531,pDAB105532,pDAB105533,或pDAB105534转化的拟南芥植株的基因组中存在dgt-28和DSM-2转基因。这些
多核苷酸序列的存在通过水解探针测定、基因表达盒PCR(也称作植物转录单元PCR—PTU 
PCR)、Southern印迹分析和定量反转录PCR分析得到了确认。
[0355] 首先通过一种与TAQMANTM类似的水解探针测定对T1拟南芥植物进行筛选，确认DSM-2和dgt-28转基因的存在。通过基因表达盒PCR对事件进行筛选，以确定dgt表达盒是否完全整合到植物基因组中而没有重排。使用从这些研究所得的数据确定转基因拷贝数，并
甄别选定的拟南芥事件，用于自花授粉和产生T2代。对T2代拟南芥植物，也通过水解探针测定进行筛选，以确认植物染色体内DSM-2和dgt基因的存在并估计拷贝数。最后，使用
Southern印迹分析对T1拟南芥植物中的一个子集确认估算的拷贝数。
[0356] 使用类似的测定法确认用pDAB4101转化的植物中dgt-1转基因的存在，用pDAB107532转化的植物中dgt-32转基因的存在，用pDAB107534转化的植物中dgt-33转基因
的存在，用pDAB102715转化的植物中dgt-3转基因的存在，用pDAB102716转化的植物中dgt-
3转基因的存在，用pDAB102717转化的植物中dgt-3转基因的存在，和用pDAB102785转化的
植物中dgt-7转基因的存在。
[0357] 水解探针测定使用下文所述的水解探针测定确定T1和T2拟南芥植物中的拷贝数。鉴定了具有不同数目的转基因的植物，并进行随后的草甘膦耐受性研究。
[0358] 将组织样品收集到96孔平板中，并冻干2天。用KLECOTM组织粉碎机和钨珠(tungsten bead)(Environ Metal INC.,Sweet Home,Oregon)进行组织浸解(tissue 
maceration)。组织浸解后，使用BiosprintTM96孔板试剂盒(QiagenTM,Germantown,MD)根据制造商建议的方案以高通量格式分离基因组DNA。借助QUANT-ITTMPICO GREEN DNA测定试剂盒(Molecular Probes,Invitrogen,Carlsbad,CA)对基因组DNA进行定量。将经过定量的基
因组DNA用BIOROBOT3000TM自动液体操作仪(Qiagen,Germantown,MD)调整到大约2ng/μL，用于水解探针测定。通过水解探针测定法确定转基因拷贝数的过程应用实时定量PCR来实现，实时定量PCR使用 480系统(Roche Applied Science,Indianapolis,
IN)。为DSM-2,dgt-28和内参基因TAFII15(Genbank ID:NC 003075；Duarte et al.,(201)
BMC Evol.Biol.,10:61)设计了测定法。
[0359] 为了扩增，准备1X终浓度的 480 Probe Master Mix(Roche Applied Science)，其在10μL体积的多重反应体系中含有每种DSM-2和dgt-28引物各0.1μM、每种TAFII15引物各0.4μM、和0.2μM每种探针。表4。实施两步扩增反应，60℃延伸40秒，同时进行荧光捕获。运行所有样品，并且对每个样品的分析使用平均循环阈值(Ct)值。使用
LightCyclerTM软件1.5发布版进行实时定量PCR数据的分析，该分析使用相对定量模块
(relative quant module)，并且基于ΔΔCt方法。为此，每个运行中包含一个来自单拷贝校准品(calibrator)和已知的2拷贝检验标准(check)的基因组DNA样品。确定了T1和T2转基因拟南芥植物的水解探针筛选的拷贝数结果。
[0360] 表4.DSM-2,dgt-28和内参基因(TAFII15)水解探针测定的引物和探针信息
[0361]
[0362]
[0363] 通过Southern印迹分析确认dgt-28的整合使用Southern印迹分析证实了插入的T-链DNA片段的整合模式，并鉴定了含有dgt-28的事件。得到了展示拟南芥基因组中转基因插入物的整合和完整性的数据。使用Southern印迹数据鉴定了T-链DNA的一个完整拷贝的
简单整合。使用一个PCR扩增的、特异针对dgt-28基因表达盒的探针进行了详细的Southern印迹分析。该探针与用特定限制性内切酶消化过的基因组DNA的杂交鉴定了具有特定分子
量的基因组DNA片段，利用这些片段的模式鉴定全长、单插入的T1转基因事件，以便用于产生下一代。
[0364] 将组织样本收集于2mL锥形管中(EppendorfTM)并冷冻干燥2天。用KLECKOTM组织粉碎机和钨珠进行组织浸解。组织浸解后，用CTAB分离程序分离基因组DNA。基因组DNA进一步用QiagenTMGenomic Tips试剂盒进行纯化。通过Quant-ITTMPico Green DNA测定试剂盒
(Molecular Probes,Invitrogen,Carlsbad,CA)对基因组DNA进行定量。将经过定量的基因
组DNA调整到4μg以达到浓度一致。
[0365] 对于每个样品，用限制酶SwaI(New England Biolabs,Beverley,MA)完全消化4μg基因组DNA，并在25℃温育过夜，然后向反应中添加NsiI，并在37℃温育6小时。用Quick 
Precipitation SolutionTM(Edge Biosystems,Gaithersburg,MD)根据制造商建议的规程，通过沉淀来浓缩经过消化的DNA。然后于65℃下将基因组DNA重悬于25μL水中1小时。将重悬的样品加载到在1X TAE中制备的0.8％琼脂糖凝胶上，并在1X TAE缓冲液中以1.1V/cm电泳
过夜。将凝胶依次进行变性(0.2M NaOH/0.6M NaCl)30分钟，和中和(0.5M Tris-HCl(pH 
7.5)/1.5M NaCl)30分钟。
[0366] 使用色谱纸捻(wick)和纸巾将20X SSC缓冲液通过凝胶过夜被动吸取(wicking)到经过处理的IMMOBILONTMNY+转移膜(Millipore,Billerica,MA)，以将DNA片段转移到尼龙膜上。转移后，将膜用2X SSC短暂地清洗，与STRATALINKERTM1800(Stratagene,LaJolla,CA)交联，并在80℃真空烘烤3小时。
[0367] 使用Model 400杂交培养箱(Robbins Scientific,Sunnyvale,CA)，在玻璃滚瓶中将印迹与预杂交液(Perfect Hyb plus,Sigma,St.Louis,MO)一起65℃温育1小时。从含有
完整编码序列的PCR片段制备探针。使用QIAEXTMII凝胶提取试剂盒纯化PCR扩增子，并借助Random RT Prime ITTM标记试剂盒(Stratagene,La Jolla,CA)用α32P-dCTP对PCR扩增子进行标记。将变性探针直接添加到预杂交液中至大约200万计数/印迹/mL，与印迹一起在65℃杂交过夜。杂交后，在65℃用0.1XSSC/0.1％SDS继续清洗印迹40分钟。最后，将印迹暴露于储磷成像屏，并利用Molecular Dynamics Storm 860TM成像系统成像。
[0368] 使用在本研究中完成的Southern印迹分析确定拷贝数，并确认含有dgt-28转基因的选定事件位于拟南芥的基因组中。
[0369] 通过PCR分析确认dgt-28基因表达盒通过端点(end point)PCR反应检测在T1植物事件中所含的dgt-28基因表达盒的存在。使用特异针对dgt-28基因表达盒的AtUbi10启动
子v2和AtuORF23 3′UTR v1区的引物(表5)进行检测。
[0370] 表5.用于dgt-28基因表达盒确认的寡核苷酸引物
[0371]引物名称 序列
正向寡聚物(SEQ ID NO:52) 5’CTGCAGGTCAACGGATCAGGATAT 3’
反向寡聚物(SEQ ID NO:53) 5’TGGGCTGAATTGAAGACATGCTCC 3’
[0372] PCR反应需要一个标准的3步PCR循环规程来扩增基因表达盒。所有PCR反应均使用下述的PCR条件完成：94℃ 3分钟，接着35个循环的94℃30秒，60℃ 30秒，和72℃ 3分钟。该TM
反应用EX-TAQ PCR试剂盒(TaKaRa Biotechnology Inc.Otsu,Shiga,Japan)按照制造商的
说明完成。最后一个循环之后，将反应在72℃温育10分钟。使用TAE琼脂糖凝胶电泳确定PCR扩增子的大小。具有预期大小的PCR扩增子的存在，表明在转基因拟南芥事件的基因组中全长基因表达盒的存在。
[0373] 通过定量反转录PCR分析确认dgt-28相对转录将dgt-28转基因植物的组织样品收集在96孔平板中，并冷冻于-80℃。用KLECOTM组织粉碎机和钨珠(Environ Metal INC.,
Sweet Home,Oregon)进行组织浸解。组织浸解后，使用QiagenTMRneasy 96试剂盒
(QiagenTM,Germantown,MD)根据制造商建议的方案以高通量格式分离总RNA，该方案包括任选的柱上DNA酶I处理。随后对洗脱的总RNA进行额外的DNA酶I(AmbionTM,Austin,TX)处理。
使用总RNA作为模板并用High Capacity cDNA Reverse TranscriptionTM试剂盒(Applied 
Biosystems,Austin,TX)按照制造商建议的方案，同时添加寡核苷酸TVN，进行cDNA合成。表达的定量用水解探针测定来实施，且使用 480系统(Roche Applied 
Science,Indianapolis,IN)通过实时定量PCR来进行。使用 探针设计
软件2.0，为dgt-28和内参基因“未知蛋白”(GenBank登录号：AT4G24610)设计了测定法。为了扩增，以1X终浓度准备 480 Probe Master Mix(Roche Applied 
Science)，其在10μL体积的多重反应体系中含有每种引物各0.4μM和每种探针各0.2μM。表
6。
[0374] 表6.用于dgt-28定量反转录PCR分析的PCR引物.
[0375] 引物名称 序列AT26410LP(SEQ ID NO:54) 5’CGTCCACAAAGCTGAATGTG 3’
AT26410RP(SEQ ID NO:55) 5’CGAAGTCATGGAAGCCACTT3’
UPL146 Cat#04694325001(Roche,Indianapolis,IN)
DGT28F(SEQ ID NO:56) 5’CTTCAAGGAGATTTGGGATTTGT3’
DGT28R(SEQ ID NO:57) 5’GAGGGTCGGCATCGTAT 3’
UPL154探针 Cat#04694406001(Roche,Indianapolis,IN)
[0376] 实施两步扩增反应，60℃延伸40秒，并进行荧光捕获。所有样品运行3个重复，使用平均循环阈值(Ct)值分析每个样品。每个样品运行负逆转录反应(minus  reverse transcription)，以确保不存在gDNA污染。基于ΔΔCt方法分析实时定量PCR数据分析。利用该测定确定了dgt-28在转基因拟南芥事件(确定为半合和纯合)中的相对表达。dgt-28 
mRNA的相对转录水平比内部对照高2.5-207.5倍。这些数据表明，dgt-28转基因植物含有功能性dgt-28基因表达盒，并且植物能够转录dgt-28转基因。
[0377] Western印迹分析在从转基因拟南芥植物获得的叶片样品中检测DGT-28。将来自dgt-28转基因植物的植物提取物和DGT-28蛋白标准品用含有DTT的 LDS样品缓
冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA)在90℃温育10分钟，并在丙烯酰胺预制胶中电泳分离。然
后，使用制造商的方案将蛋白质电转移到硝酸纤维素膜上。用 封闭
混合物(Invitrogen)封闭后，先后用抗-DGT-28抗血清和山羊抗兔磷酸酶检测DGT-28蛋白。
通过化学发光底物BCIP/NBT Western分析试剂(KPL,Gaithersburg,MD)将被检测的蛋白可
视化。Western印迹产生完整DGT-28蛋白，表明接受测定的dgt-28转基因植物表达了DGT-28蛋白。
[0378] 实施例7:草甘膦耐受性
[0379] 用不同比率的草甘膦喷洒含有dgt-28转基因的转基因T1拟南芥植物。在本研究中采用增大的比率，以确定相对抗性水平(105,420,1,680或3,360g ae/ha)。一个典型的草甘膦1X使用比率，它将会控制非转化的拟南芥，是420g ae/ha。用校准为187L/ha的履带式喷雾器将加硫酸铵的草甘膦制剂施用给T1植物。本研究中使用的T1拟南芥植物具有不同的
dgt-28转基因拷贝数。将低拷贝dgt-28T1拟南芥植物自花授粉，并用于产生T2植物。表7显示了具有草甘膦除草剂抗性基因的dgt-28转基因植物、dgt-1、和野生型对照的比较。表8显示了具有草甘膦除草剂抗性基因的dgt-32和dgt-33与dgt-1和野生型对照的比较。表9显示了
新型细菌EPSP合酶与I类EPSP合酶及对照在1,680g ae/ha的草甘膦比率下的比较。
[0380] 转化的dgt-28拟南芥植物的草甘膦选择结果首先使用草甘膦筛选方案，以非转化种子为背景选择拟南芥T1转化体。对每个T1构建体分析3个浅箱或30,000个种子。对上面选出的T1植物进行分子表征，随后将具有可变(variable)拷贝数的代表性植物移植到单独的
盆中，并以如前所述的不同比率喷洒商业草甘膦。这些植物的响应用处理2周后(WAT)的％
可见损伤表示。表中提供的数据显示，展示很少或没有损伤(<20％)、中等损伤
或严重损伤(>40％)的个体植株。为每个用于拟南芥转化的构建体提供了算术平均值和标
准差。还在最后一列中指示了针对每个比率和转化的个体响应的范围。野生型，非转化的拟南芥(哥伦比亚栽培种)，用作草甘膦敏感性对照。
[0381] 植物的响应水平不同。该差异可以归因于以下的事实，即每株植物代表一个独立的转化事件，因此感兴趣的基因的拷贝数在每个植物之间都有改变。我们注意到，一些含有转基因的植物对草甘膦不耐受；对于这些植物是否表达转基因，尚未进行彻底的分析。很可能是由于T1拟南芥植物中存在的高拷贝数转基因会导致转基因沉默或者表观遗传效应，导
致虽然存在dgt-28转基因仍然对草甘膦敏感。
[0382] 表9中提供了针对1,680g ae/ha比率的草甘膦的按比率区分的总体群体损伤平均值(overall population injury average by rate)，证明用dgt-3,dgt-7,dgt-28,dgt-32
和dgt-33转化的植物与dgt-1和野生型对照相比有显著差异。
[0383] 由新的细菌EPSP合成酶提供的耐受性因具体的酶而不同。DGT-28,DGT-32和DGT-33出人意料地提供了对草甘膦显著的耐受性。对于测试的所有转运肽，dgt基因均赋予T1拟南芥植物个体除草剂抗性。由此可见，使用额外的叶绿体转运肽(即TraP8—dgt-32或
TraP8—dgt-33)将会提供对草甘膦的保护，在给定的处理中损伤水平与报道的相似。
[0384] 表7.dgt-28转化的T1拟南芥对萌发后施用的、比率在一定范围内的草甘膦的响应，与dgt-1(T4)纯合子抗性群体和非转化对照比较。施用后14天的目测％损伤
[0385]
[0386]
[0387]
[0388] 表8.dgt-32和dgt-33转化的T1拟南芥对萌发后施用的一定范围的比率的草甘膦的响应，与dgt-1(T4)纯合子抗性群体和非转化对照比较。施用后14天的目测％损伤
[0389]
[0390] 表9.dgt-28,dgt-32,dgt-33,dgt-3,和dgt-7转化的T1拟南芥对萌发后施用的1,680g ae/ha的草甘膦的响应，与dgt-1(T4)纯合子抗性群体和非转化对照比较。施用后14天的目测％损伤
[0391]
[0392] dgt-28作为选择标记使用如上所述的拟南芥转化植物，测试dgt-28作为草甘膦筛选剂的选择标记。将大约50个T4代拟南芥种子(对dgt-28是纯合的)掺入(spiked into)大
约5,000个野生型(对草甘膦敏感)种子中。令种子萌发，并用选择剂量的草甘膦喷洒幼苗。
比较了数次草甘膦处理；对于每一盘(tray)植物，按照下列处理方案之一，接受一个或两个施用期的草甘膦：7DAP(种植后天数),11DAP,或7DAP和11DAP。因为所有植物还在同一个转
化载体内含有草胺膦抗性基因，可以将用草甘膦选出的含dgt-28的植物与用草铵膦选出的
含DSM-2或pat的植物直接进行比较。
[0393] 如前所述地用DeVilbissTM喷头施用草甘膦处理。在17DAP，将含有dgt-28的转基因植物鉴别为“抗性”或“敏感性”。种植后7和11天(DAP)施用26.25-1680g ae/ha草甘膦处理，显示可以有效选择含有dgt-28的转基因拟南芥植物。对敏感性和抗性植物计数，发现草甘膦抗性植物的数目与所种植的含有dgt-28转基因的转基因种子的原始数目相关。这些结果
表明，dgt-28可以有效地用作经转化的拟南芥群体的替代选择标记。
[0394] 可遗传性将已确认的T1转基因拟南芥事件自花授粉，产生T2种子。通过向100颗随机的T2同胞施用含有草铵膦(200g ae/ha)的IgniteTM除草剂，对这些种子进行后代测试
(progeny test)。在喷洒施用(用履带式喷雾器,以187L/ha比率施用)之前，将每个单独的
T2植物移植到7.5-cm方盆中。对于显性遗传的单个座位，T1家族(T2植物)以预期的3抗性:1敏感性的模式发生了分离，孟德尔遗传性通过卡方分析确定(P>0.05)。表10示出了以预期
的孟德尔遗传分离的T1家族的百分比，证明dgt-28性状是通过孟德尔遗传传递给T2代的。从
5-15个T2个体收集种子(T3种子)。如前所述地对来自3-4个随机选择的T2家族中每一个的25个T3同胞进行后代测试。数据显示没有分离，因此证明dgt-28和dgt-3被稳定整合在染色体内，并以孟德尔方式遗传至少3代。
[0395] 表10.100株植物后代测试中以单孟德尔遗传分离的T1家族(T2植物)的百分比
[0396] 感兴趣的基因 在1座位分离的受测T1家族(％)dgt-3 v2 64％
dgt-3 v3 60％
dgt-3 v4 80％
dgt-7 v4 63％
TraP5 v2–dgt-28 v5 100％
TraP8 v2–dgt-28 v5 100％
TraP9 v2–dgt-28 v5 100％
TraP12 v2–dgt-28 v5 50％
TraP13 v2–dgt-28 v5 75％
Yfp转基因对照植物 100％
[0397] T2拟南芥数据对含有低拷贝数dgt-28转基因的选定T1拟南芥事件的第二代植物(T2)进行进一步的草甘膦耐受性表征。如前所述施用草甘膦。植物响应用处理2周后(WAT)
的％可见损伤表示。用很少或没有损伤(<20％)、中等损伤(20-40％)或严重损伤(>40％)的个体数的柱状图表示数据。给出了每个用于拟南芥转化的构建体的算术平均值和标准差。
还在最后一列中指示了每个比率和每种转化的个体响应的范围。野生型、非转化的拟南芥
(哥伦比亚栽培种)用作草甘膦敏感性对照。在T2代中，可以获得用于测试每个事件的半合
子和纯合子植物，因此将它们包括在内测试的每个草甘膦比率。半合子植物在一个座位上
含有两个不同的等位基因，相比之下，纯合子植物在一个座位上含有两个相同的等位基因。
由于半合子和纯合子植物相比在基因剂量(gene dosage)上的差异，预期在T2代中存在对
草甘膦响应的差异性。对草甘膦响应的差异性反映在标准差和响应范围上。
[0398] 在T2代中，对单拷贝和多拷贝dgt-28事件均表征了草甘膦耐受性。在一个事件中，各单拷贝植物显示相似的草甘膦耐受性。表11提供了一个单拷贝T2事件的特征数据。含有与TraP5 v2连锁的dgt-28的事件与含有其它TraP转运肽的dgt-28构建体相比，没有提供强
健的草甘膦耐受性。然而，与非转化的哥伦比亚对照相比，dgt-28TraP5构建体确实提供了低水平的草甘膦耐受性。有些情况下，显示含有2个或更多个拷贝的dgt-28的事件对高比率的草甘膦更加敏感(数据未显示)。这种对草甘膦敏感性的增加与先前对同样含有高拷贝数
的dgt-28转基因的T1植物描述的数据相似。这可能是由于拟南芥植物中存在的高拷贝数转
基因会导致转基因沉默或者表观遗传效应，结果虽然存在dgt-28转基因，仍然对草甘膦敏
感。
[0399] 这些事件含有与TraP5 v2(pDAB105530),TraP12 v2(pDAB105533)和TraP13 v2(pDAB105534)连锁的dgt-28。
[0400] 除了dgt-28之外，表12还提供了用dgt-3转化的T2拟南芥事件。如表11中关于dgt-28事件所述的，该数据表含有一个代表性事件，它反映了每个构建体对草甘膦的响应特征。
为了表征dgt-3，将含有受AtUbi10启动子驱动的dgt-3基因的单个PTU(植物转录单元)的构
建体(pDAB102716，图45和pDAB102715，图10)，与含有该相同基因的2个PTU的构建体
(pDAB102719，图32；pDAB102718，图33)进行比较。含有2个PTU的构建体利用AtUbi10启动子来驱动基因的一个拷贝，而利用CsVMV启动子驱动另一个拷贝。采用两个PTU是为了比较
dgt-3转基因植物与含有两个转基因拷贝的dgt-28转基因植物。数据证明，仅含有一个单
PTU的单拷贝T2 dgt-3事件比所测试的单拷贝dgt-28事件对草甘膦更敏感，但是比非转化
对照更耐受。含有dgt-3基因的2个PTU的T1家族比含1个PTU的构建体提供了更高水平的目
测草甘膦耐受性。在两种情况下，T1家族均与dgt-1和野生型对照进行比较。T2数据证明，dgt-28作为单拷贝事件提供了强健的耐受性。
[0401] 表11.选定的含有dgt-28的个体T2拟南芥事件对萌发后以不同比率施用的草甘膦的响应，与dgt-1(T4)纯合子抗性群体和非转化对照比较。施用后14天的目测％损伤
[0402]
[0403]
[0404]
[0405] 表12.用dgt-3转化的选定T2拟南芥事件对萌发后以不同比率施用的草甘膦的响应。施用后14天的目测％损伤
[0406]
[0407] T3拟南芥数据对含有低拷贝数dgt-28转基因的选定T2拟南芥事件的第三代植物(T3)进行进一步的草甘膦耐受性表征。如前所述地用草铵膦从每个品系选出25株植物，并
且来自每个测试构建体的品系对于选择标记基因均没有分离。如前所述施用草甘膦。植物
响应用处理2周后(WAT)的％可见损伤表示。用显示很少或没有损伤(<20％)、中等损伤(20-
40％)或严重损伤(>40％)的个体数的柱状图来表示数据。提供了每个用于拟南芥转化的构
建体的算术平均值和标准差。在最后一列中，还针对每个比率和每种转化指示了个体响应
的范围。将野生型、非转化的拟南芥(哥伦比亚栽培种)用作草甘膦敏感性对照。
[0408] 表13.含有dgt-28的各个选定T3拟南芥事件对萌发后以不同比率施用的草甘膦的响应，与dgt-1(T4)纯合子抗性群体和非转化对照比较。施用后14天的目测％损伤
[0409]
[0410]
[0411]
[0412] 转化植物的筛选将新鲜采收的T1种子[dgt-31,dgt-32,和dgt-33v1基因]在室温下干燥，并运输到印第安纳波利斯进行测试。将T1种子播种在26.5x 51-cm发芽托盘
(T.O.Plastics Inc.,Clearwater,MN)中，每盘放入200mg等份的层积T1种子(～10,000个
种子)，其先前已经被混悬于40mL 0.1％琼脂糖溶液中，并在4℃保存2天，以完成休眠要求并确保种子同步萌发。
[0413] 将Sunshine Mix LP5(Sun Gro Horticulture Inc.,Bellevue,WA)用细蛭石覆盖，并用Hoagland溶液从地下灌溉至湿润，然后通过重力排水。用移液器将每个40mL等份的层积种子均匀播种在蛭石上，并用保湿盖(KORDTMProducts,Bramalea,Ontario,Canada)覆
盖4-5天。一旦植物萌发，除去保湿盖，然后用草铵膦萌发后喷洒剂进行初始转化体选择(选择共转化的dsm-2基因)。
[0414] 在种植后6天(DAP)和10DAP，使用DeVilbiss压缩空气喷嘴用0.1％IGNITETM除草剂溶液(280g ai/L草铵膦,Bayer Crop Sciences,Kansas City,MO)喷洒T1植物(分别为子叶
期和2-4叶期)，喷洒体积为10mL/盘(703L/ha)，每次施用提供200g ae/ha有效比率的草铵
膦。在最终喷洒4-7天后鉴定存活者(活跃生长的植物)。将存活的植物单独移植到备有盆栽培养基(Metro Mix 360TM)的3英寸盆(pot)中。在组织采样用于拷贝数分析之前，植物在温室中培养至少1天。
[0415] 对T1植物采样，并完成对dgt-31,dgt-32,和dgt-33v1基因的拷贝数分析。然后，对T1植物分配不同比率的草甘膦，使得每个比率均包括一定范围的拷贝。对于拟南芥，26.25g ae/ha草甘膦是用于区分敏感性植物与具备有意义水平抗性的植物的有效剂量。施用更高的比率，用于确定相对抗性水平(105,420,1680,或3360g ae/ha)。表15显示了针对dgt-1的比较。
[0416] 所有草甘膦除草剂施用均用履带式喷雾器以187L/ha的喷雾体积完成。所使用的草甘膦是商业Durango二甲胺盐制剂(480g ae/L,Dow AgroSciences,LLC)。对于显示草铵
膦或草甘膦耐受性的低拷贝T1植物，进一步在T2代中进行评估。
[0417] 第一个拟南芥转化用dgt-31,dgt-32,和dgt-33v1实施。首先用草铵膦筛选方案将T1转化体从未转化种子的背景中选择出来。对于每种T1构建体，分析了3个浅箱(flat)或30,
000个种子。计算了转化频率，表14列出了T1dgt-31,dgt-32,和dgt-33构建体的结果。
[0418] 表14.用筛选选择标记基因DSM-2的草铵膦选出的T1 dgt-31,dgt-32,和dgt-33拟南芥构建体的转化频率
[0419]构建体 盒 转化频率(％)
pDAB107532 AtUbi10/TraP14 dgt-32 v1 0.47
pDAB107533 AtUbi10/TraP23 dgt-31 v1 0.36
pDAB107534 AtUbi10/TraP24 dgt-33 v1 0.68
[0420] 将上面选出的T1植物随后移植到单独的盆中，并用不同比率的商业草甘膦喷洒。表15比较了dgt-31,dgt-32,和dgt-33v1和对照基因赋予拟南芥T1转化体草甘膦抗性的响
应。植物响应用2WAT的％可见损伤表示。用展示很少或没有损伤(<20％)、中等损伤(20-
40％)或严重损伤(>40％)的个体数的柱状图表示数据。提供了每一处理的算术平均值和标
准差。还在最后一列中指示了每个比率和每种转化的个体响应的范围。野生型非转化的拟
南芥(哥伦比亚栽培种)用作草甘膦敏感性对照。与阴性对照相比，具有转运肽TraP23的
DGT-31(v1)基因对各个T1拟南芥植物赋予了微弱的除草剂耐受性，但是具有转运肽TraP8
的基因展示了更好的耐受性。在用TraP8测试的比率、以及用DGT-32和DGT-33各自不同的叶绿体转运肽(分别为TraP14和TraP24)测试的比率下，DGT-32和DGT-33都展示了强健的草甘
膦耐受性。在给定的处理中，植物的响应水平变化很大，该差异可能是由于以下的事实，即每株植物代表一个独立的转化事件，因此感兴趣的基因的拷贝数在每个植物之间有不同。
重要的是，在所测试的每个草甘膦比率下，均有一些个体比其它个体更加耐受。表15提供的按比率区分的总群体损伤平均值表明，用dgt-31、dgt-32和dgt-33v1转化的植物与dgt-1v1或者野生型对照相比存在显著差异。
[0421] 表15.dgt-31、dgt-32和dgt-33v1转化的T1拟南芥对萌发后以一定范围的比率施用的草甘膦的响应，与dgt-1(T4)纯合子抗性群体和非转化对照比较。
[0422] 施用后2周后的目测％损伤
[0423]
[0424]
[0425] 实施例8:dgt-32和dgt-33作为选择标记
[0426] 使用dgt-32和dgt-33v1作为选择标记，以草甘膦为选择剂。用转化的拟南芥分析这些标记的性能。将大约50粒T4代拟南芥种子(对dgt-32和dgt-33v1是纯合的)掺杂到大约
5,000粒野生型(敏感型)种子中。比较了数个处理，对于每一盘(tray)植物,按照下列处理
方案之一，接受一个或两个施用期的草甘膦：7DAP,11DAP,或7DAP然后11DAP。因为所有的个体还在同一转化载体中含有dsm-2基因，因此用草甘膦筛选的dgt-32和dgt-33能够直接与
用草铵膦筛选的dsm-2进行比较。
[0427] 用DeVilbissTM喷头施用处理。在17DAP，将植物鉴定为耐受或敏感。在筛选频率方面，在种植后7天和11天(DAP)施用的26.25-280g ae/ha 2,4-D处理同样有效。这些结果表明，dgt-32和dgt-33v1能够有效地用作选择标记。
[0428] 可遗传性将多种T1事件自花授粉，以产生T2种子。通过向100个随机T2同胞施用IGNITETM(200g ae/ha)对这些种子进行后代测试。将每个单株T2植物移植到7.5-cm方盆中，然后进行喷洒施用(用履带式喷雾器以187L/ha施用比率施用)。通过卡方分析(P>0.05)确
定了按照孟德尔遗传以预期对于显性遗传单座位的3耐受性:1敏感性模式分离的T1家族(T2
植物)。
[0429] 从5-15个T2单株收集种子(T3种子)。对来自3个随机选择T2家族的每一个的25个T3同胞进行后代测试。数据没有显示分离，表明dgt-32和dgt-33 v1均被稳定整合，并以孟德尔方式遗传至少3代。
[0430] T3 DGT品系的其它除草剂耐受性表征将T3代拟南芥种子层积，并播种在选择托盘内。以相似的方式种植含有dgt-1的转化对照品系和非转化对照。将幼苗转移到单独的3-英寸盆内，置于温室中。用履带式喷雾器以187L/ha喷洒所有植物。用420-3360g ae/ha范围的草甘膦(DURANGOTMDMA,Dow AgroSciences)喷洒植物。所有的施用物均在水中配制。每个处理重复4次，并在处理后7和14天对植物进行评估。
[0431] 实施例9:其它作物物种的转化
[0432] 利用本领域技术人员已知的方法，例如与先前PCT国际专利公开No.WO 2007/053482中的实施例11或实施例13所述的基本上相同的技术，用dgt-28,dgt-31,dgt-32,和/
或dgt-33(具有或没有叶绿体转运肽)转化大豆，以提供对除草剂草甘膦的高水平耐受性。
[0433] 利用本领域技术人员已知的方法，例如与先前美国专利7,838,733的实施例14或PCT国际专利公开No.WO 2007/053482的实施例12所述的基本上相同的技术，用dgt-28,
dgt-31,dgt-32,和/或dgt-33(具有或没有叶绿体转运肽)转化棉花，以提供对除草剂草甘
膦的高水平耐受性。
[0434] 利用本领域技术人员已知的方法，例如与先前美国专利7,838,733的实施例26或PCT国际专利公开No.WO 2007/053482的实施例22所述的基本上相同的技术，用dgt-28,
dgt-31,dgt-32,和/或dgt-33(具有或没有叶绿体转运肽)转化加拿大油菜，以提供对除草
剂草甘膦的高水平耐受性。
[0435] 实施例10:玉米转化
[0436] 用于玉米转化的DNA构建体使用如上所述的标准克隆方法构建用于根癌土壤杆菌介导的玉米转化的二元载体。表16列出了构建用于玉米转化的载体。在包含dgt-28载体中
使用如下的基因元件；使用玉米泛素1启动子(ZmUbi1；美国专利No.5,510,474)驱动dgt-28编码序列，该编码序列侧翼是玉米脂肪酶3’非翻译区(ZmLip  3′UTR；美国专利
No.7179902)，选择标记盒的组成为：玉米泛素1启动子，其被用于驱动aad-1编码序列(美国专利No.7,838,733)，该编码序列侧翼是玉米脂肪酶3’非翻译区。aad-1编码序列赋予苯氧基生长素除草剂例如2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，以及对芳基氧基苯氧基丙酸(AOPP)类除
草剂的耐受性。
[0437] dgt-28构建体被构建成标准二元载体和土壤杆菌超二元系统载体(Japan Tobacco,Tokyo,JP)。标准二元载体包括：pDAB107663,pDAB107664,pDAB107665,和
pDAB107665。土壤杆菌超二元系统载体包括pDAB108384,pDAB108385,pDAB108386,和
pDAB108387。
[0438] 还构建了含有黄色荧光蛋白(yfp；美国专利申请2007/0298412)报告基因的构建体。pDAB109812含有一个yfp报告基因盒，其由玉米泛素1启动子驱动，且侧翼为玉米per 5 
3′非翻译区(Zm per5 3′UTR；美国专利No.7179902)，选择标记盒的组成为：甘蔗杆状病毒启动子(SCBV；美国专利No.5,994,123)，其被用于驱动aad-1表达，且其侧翼是玉米脂肪酶
3’非翻译区。pDAB101556含有一个yfp盒，其由玉米泛素1启动子驱动，侧翼为玉米per 5 3′非翻译区，选择标记盒的组成为：玉米泛素1启动子，其被用于驱动aad-1表达，且其侧翼是玉米脂肪酶3’非翻译区。pDAB107698含有一个dgt-28盒，其由玉米泛素1启动子驱动，且其侧翼为玉米脂肪酶3′非翻译区；一个yfp盒，且由玉米泛素1启动子驱动并且侧翼为玉米per 
5 3′非翻译区，选择标记盒的组成为：甘蔗杆状病毒启动子，其被用于驱动aad-1表达，且其侧翼是玉米脂肪酶3’非翻译区。所有这三个构建体均是标准的二元载体。
[0439] 表16.玉米转化载体
[0440]
[0441] 穗灭菌和胚分离为了获得玉米的未成熟胚，在温室中种植玉米近交系B104的植株，并自花授粉或同胞授粉(sib-pollinated)产生穗。在授粉后大约9-12天采集穗。在实验当天，对穗进行表面灭菌：在20％次氯酸钠(5％)溶液中浸泡穗，并震荡20-30分钟，随后在无菌水中漂洗3次。灭菌后，从每个穗无菌解剖出未成熟的合子胚(1.5-2.4mm)，并随机分配到含有液体感染培养基(LS基础培养基,4.43gm/L；N6维生素溶液[1000X],1.00mL/L；L-脯
氨酸,700.0mg/L；蔗糖,68.5gm/L；D(+)葡萄糖,36.0gm/L；10mg/ml 2,4-D,150μL/L)的微离心管中。对于一套给定的实验，每次转化使用从3个穗汇集的胚。
[0442] 土壤杆菌起始培养物：
[0443] 将含有上述二元转化载体的土壤杆菌甘油保存物在含有合适抗生素的AB基本培养基平板上划线，并在20℃生长3-4天。挑取单菌落并在含有相同抗生素的YEP平板上划线，并在28℃温育1-2天。
[0444] 土壤杆菌培养和共培养从YEP平板获取土壤杆菌克隆，悬浮在置于50mL一次性管中的10mL感染培养基中，使用分光光度计将细胞密度调整到OD600nm为0.2-0.4。将土壤杆菌培养物置于旋转摇床上，室温125rpm振荡，同时进行胚解剖。从无菌玉米谷粒分离大小为
1.5-2.4mm的未成熟合子胚，置于1mL感染培养基中，用相同培养基清洗1次。每个管中加入土壤杆菌悬液(2mL)，将管置于振荡平台上10-15分钟。将胚转移到共培养培养基(MS盐，
4.33gm/L，L-脯氨酸，700.0mg/L；肌醇，100.0mg/L，酪蛋白酶促水解物100.0mg/L，30mM麦草畏-KOH，3.3mg/L；蔗糖，30.0gm/L；GelzanTM,3.00gm/L；改良的MS-维生素[1000X]，1.00ml/L；8.5mg/ml AgNO3，15.0mg/L；DMSO，100μM)，调整方向使胚盘朝上，并在25℃、24小时光照，
50μmole m-2sec-1光强条件下温育3天。
[0445] 愈伤组织筛选和假定事件(putative envents)的再生共培养期后，将胚转移到没有选择剂的恢复培养基(resting media)(MS盐，4.33gm/L；L-脯氨酸，700.0mg/L；1,2,3,5/
4,6-六羟基环己烷，100mg/L；MES[(2-(n-吗啉代)-乙磺酸),游离酸]0.500gm/L；酪蛋白酶水解物100.0mg/L；30mM的麦草畏-KOH，3.3mg/L；蔗糖，30.0gm/L；Gelzan 2.30gm/L；改良的MS-维生素[1000X]，1.00ml/L；8.5mg/ml AgNO3，15.0mg/L；羧苄青霉素，250.0mg/L)，并在
25℃、24小时光照，50μmole m-2sec-1光强条件下温育3天。
[0446] 生长抑制剂量响应实验提示，0.25mM和更高的草甘膦浓度足以抑制非转化B104玉米品系的细胞生长。将胚转移到含有0.5mM草甘膦的选择1培养基(MS盐，4.33gm/L；L-脯氨酸，700.0mg/L；肌醇，100.0mg/L；MES[(2-(n-吗啉代)-乙磺酸)，游离酸]0.500gm/L；酪蛋白酶水解物100.0mg/L；30mM的麦草畏-KOH，3.3mg/L；蔗糖，30.0gm/L；GelzanTM2.30gm/L；改良的MS-维生素[1000X]，1.00ml/L；8.5mg/ml AgNO3，15.0mg/L；羧苄青霉素，250.0mg/L)，并在28℃，黑暗和/或24小时光照，50μmole m-2sec-1光强条件下温育7-14天。
[0447] 将增殖中的胚性愈伤组织转移到含有1.0mM草甘膦的选择2培养基(MS盐，4.33gm/L；1,2,3,5/4,6-六羟基环己烷，100mg/L；L-脯氨酸，700.0mg/L；MES[(2-(n-吗啉代)-乙磺酸)，游离酸]0.500gm/L；酪蛋白酶水解物100.0mg/L；30mM的麦草畏-KOH，3.3mg/L；蔗糖，
30.0gm/L；GelzanTM2.30gm/L；改良的MS-维生素[1000X]，1.00ml/L；8.5mg/ml AgNO3，
15.0mg/L；羧苄青霉素，250.0mg/L；R-吡氟氯禾灵酸(R-Haloxyfop acid))，并在28℃、黑暗和/或24小时光照，50μmole m-2sec-1光强条件下温育14天。这一选择步骤允许转基因愈伤组织进一步增殖和分化。愈伤组织选择期持续3-4周。
[0448] 将增殖中的胚性愈伤组织转移到含有0.5mM草甘膦的PreReg培养基(MS盐，4.33gm/L；1,2,3,5/4,6-六羟基环己烷，100mg/L；L-脯氨酸，350.0mg/L；MES[(2-(n-吗啉代)-乙磺酸)，游离酸]0.250gm/L；酪蛋白酶水解物50.0mg/L；NAA-NaOH 0.500mg/L；ABA-EtOH 2.50mg/L；BA 1.00mg/L；蔗糖，45.0gm/L；GelzanTM2.50gm/L；改良的MS-维生素
[1000X]，1.00ml/L；8.5mg/ml AgNO3，1.00mg/L；羧苄青霉素，250.0mg/L)，并在28℃，24小时光照，50μmole m-2sec-1光强条件下温育7天。
[0449] 将具有抽芽状芽(shoot-like bud)的胚性愈伤组织转移到含有0.5mM草甘膦的再生培养基(MS盐，4.33gm/L；1,2,3,5/4,6-六羟基环己烷，100mg/L；蔗糖，60.0gm/L；GellanTM
胶G434 3.00gm/L；改良的MS-维生素[1000X]，1.00ml/L；羧苄青霉素，125.0mg/L)，并在24小时光照，50μmole m-2sec-1光强条件下培养7天。
[0450] 将具有初生根的小芽(small shoot)转移到含有生根培养基(MS盐，4.33gm/L；改良的MS-维生素[1000X]，1.00ml/L；1,2,3,5/4,6-六羟基环己烷，100mg/L；蔗糖，60.0gm/L；
Gellan胶G434TM3.00gm/L；羧苄青霉素，250.0mg/L)的植物托盘(phytotray)中，并在27℃、
16/8小时光照/黑暗、140-190μmole m-2sec-1光强条件下温育7天。使用上述方案分析假定的转基因小植物的转基因拷贝数并将其转移到土壤中。
[0451] 玉米植物中dgt-28和aad-1转基因存在的分子确认通过水解探针测定确认dgt-28和aad-1多核苷酸序列的存在。通过一种类似于TAQMANTM的水解探针测定法对分离的T0玉米植株进行了初始筛选，以确认dgt-28和aad-1转基因的存在。这些研究产生的数据被用来确定转基因拷贝数，并用于选择转基因玉米事件用于回交和进行到T1代。
[0452] 将组织样品收集在96孔板中，用KLECOTM组织粉碎机和不锈钢珠(Hoover Precision Products,Cumming,GA)在QiagenTMRLT缓冲液进行组织浸解。组织浸解后，使用BiosprintTM96孔板试剂盒(QiagenTM,Germantown,MD)，根据制造商建议的方案以高通量格TM
式分离基因组DNA。用Quant-IT Pico Green DNA测定试剂盒(Molecular Probes,
Invitrogen,Carlsbad,CA)对基因组DNA进行定量。用BIOROBOT3000TM自动移液器(Qiagen,
Germantown,MD)将定量过的基因组DNA调整到大约2ng/μL，用于水解探针测定。利用一种类似于 测定的水解探针测定法来确定转基因拷贝数，该测定通过使用
480系统(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)进行实时定量
PCR来实施。使用 探针设计软件2.0，为aad-1、dgt-28和内参基因转换
酶(Genbank登录号No:U16123.1)设计了测定法。为了扩增，在10μL体积的含有aad-1和dgt-
28引物各0.4μM、和每种探针各0.2μM(表17)的多重反应体系中制备1X终浓度的
480 Probe Master Mix(Roche Applied Science)。
[0453] 实施两步扩增反应，在60℃延伸40秒并获取荧光。运行所有样品，并使用平均循环阈值(Ct)值分析每个样品。使用LightCyclerTM软件1.5发布版进行实时定量PCR数据的分析，其使用相对定量模块，并基于ΔΔCt方法。每次运行中包含单拷贝校准物(calibrator)和已知的二拷贝检验标准(check)，对照包括来自该校准物和检验标准的基因组DNA样品。
表18列出了水解探针测定的结果。
[0454] 表17.用于aad-1,dgt-28和内参(转化酶)水解探针测定的引物和探针
[0455] 寡核苷酸名称 检测基因 SEQ ID NO: 寡核苷酸序列GAAD1F aad-1正向引物 58 TGTTCGGTTCCCTCTACCAA
GAAD1P aad-1探针 59 CACAGAACCGTCGCTTCAGCAACA
GAAD1R aad-1反向引物 60 CAACATCCATCACCTTGACTGA
IV-Probe 转化酶探针 61 CGAGCAGACCGCCGTGTACTTCTACC
IVF-Taq 转化酶正向引物 62 TGGCGGACGACGACTTGT
IVR-Taq 转化酶反向引物 63 AAAGTTTGGAGGCTGCCGT
zmDGT28 F dgt-28正向引物 64 TTCAGCACCCGTCAGAAT
zmDGT28 FAM dgt-28探针 65 TGCCGAGAACTTGAGGAGGT
zmDGT28 R dgt-28反向引物 66 TGGTCGCCATAGCTTGT
[0456] 表18.dgt-28事件的T0拷贝量结果。低拷贝事件由1-2个转基因拷贝组成，括号中列出了单拷贝数。高拷贝事件包含3个或更多个转基因拷贝。
[0457] 用于转化的质粒 低拷贝事件数(单拷贝) 高拷贝事件数pDAB107663 43(31) 10
pDAB107664 30(24) 5
pDAB107665 40(27) 10
pDAB107666 24(12) 12
pDAB109812 2(1) 0
pDAB101556 25(15) 10
pDAB107698 3(1) 2
[0458] 实施例11:dgt-28转化玉米的除草剂耐受性
[0459] 使玉米dgt-28转化事件(T0)在温室中驯化，并生长至植物从组织培养转向温室生长条件(即，从轮生体(whorl)生出2-3片新的看上去正常的叶片)。植物在27℃，16小时光
照:8小时黑暗条件的温室中生长。然后，用DURANGO DMATM商业制剂(含有除草剂草甘膦)并添加2％w/v硫酸铵对植物进行处理。除草剂施用用履带式喷雾器实施，喷雾体积为187L/
ha，喷雾高度50cm。用280-4480g ae/ha草甘膦的范围对T0植物喷洒草甘膦，该范围的草甘膦能够对非转化玉米品系造成显著损伤。致死剂量的定义为导致B104近交系>95％损伤的
比率。
[0460] T0 dgt-28玉米植物的结果表明对比率最高达4480g ae/ha的草甘膦实现了耐受性。在T0代中使用了一种特殊的培养基。与非转化对照相比，转化植物的生长停滞
(stunting)极小且整体植物生长，这表明当与TraP5、TraP8和TraP23叶绿体转运肽连锁时，dgt-28提供了强健的草甘膦耐受性。
[0461] 将选定的T0植物自交和回交，以便进一步在下一代中进行表征。用140-1120g ae/ha草铵膦或105-1680g ae/ha草甘膦喷洒100个含有T1植物的选定dgt-28品系。选择标记和
草甘膦抗性基因二者被构建在相同质粒中。因此，如果通过喷洒除草剂选择某一个除草剂
抗性基因，则认为这两个基因同时存在。在14DAT，对抗性和敏感植物进行计数，用于确定如下品系的百分比：通过卡方分析确定，这些品系作为单座位、显性孟德尔性状(3R:1S)分离。
这些数据证明，dgt-28作为一种强健的草甘膦抗性基因在单子叶物种中是可遗传的。向T1
或F1存活者施用更高比率的草甘膦，以进一步表征由dgt-28基因提供的耐受性和保护。
[0462] dgt-28转化的T0玉米中的萌发后除草剂抗性通过土壤杆菌转化产生与TraP4,TraP5,TraP8和TraP23连锁的dgt-28的T0事件，并在受控的生长室条件下驯化，直至从轮生体(whorl)生出2-4片新的看上去正常的叶片。给植物指定个体鉴定编号，并对植物采样用
于进行dgt-28和aad-1拷贝数分析。根据拷贝数分析，选出植物用于蛋白表达分析。将植物移植到含有新生长培养基的较大的盆中，在27℃，16小时光照:8小时黑暗的温室条件下生
长。然后用添加2％w/v硫酸铵的DURANGO DMATM商业制剂(草甘膦)对没有采样用于蛋白表达的剩余植物进行处理。处理的分布使得每组植物含有具有不同拷贝数的T0事件。除草剂的
施用使用履带式喷雾器，以187L/ha喷雾体积、50-cm喷雾高度来进行。用280-4480g ae/ha草甘膦的草甘膦范围对T0植物进行喷洒，该范围能够对非转化玉米品系造成显著损伤。致
死剂量的定义为导致B104近交系>95％损伤的比率。B104是转化体的遗传背景。
[0463] T0 dgt-28玉米植物的结果表明，对最高达4480g ae/ha比率的草甘膦实现了耐受性。表19。与非转化对照相比，转化植物的生长停滞极小且整体植物生长，这表明当与
TraP5,TraP8,和TraP23连锁时，dgt-28提供了强健的的针对草甘膦的保护作用。
[0464] 表19.具有不同拷贝数的T0 dgt-28事件在处理后14天对280-4480g ae/ha不同比率草甘膦+2.0％w/v硫酸铵的响应
[0465]
[0466]
[0467] 通过标准ELISA进行的蛋白表达分析证明，测试的所有构建体的平均DGT-28蛋白范围是12.6-22.5ng/cm2。
[0468] 确认F1代在温室条件下的草甘膦耐受性将没有喷药的单拷贝T0植物与非转化背景B104回交，以便在下一代中进行进一步的表征。在T1代中，评估了草甘膦耐受性，以确认
dgt-28基因的遗传。对于T1植物，在V1生长期施用除草剂ASSURE IITM(35g ae/ha喹禾灵-甲酯(quizalofop-methyl))，以选择AAD-1蛋白。将选择标记和草甘膦抗性基因构建在同一质粒上。因此，如果一个基因被选择，则认为两个基因同时存在。7DAT后，对抗性和敏感性植物进行计数，并从群体中除去空植物。这些数据证明，dgt-28(v1)作为一种强健的草甘膦抗性基因在单子叶物种中是可遗传的。对植物采样，通过标准ELISA和RNA转录本水平表征DGT-
28蛋白。如前所述地用560-4480g ae/ha草甘膦喷洒抗性植物。数据表明，与叶绿体转运肽TraP4,TraP5,TraP8和TraP23关联的dgt-28对高达4480g ae/ha草甘膦具有强健的耐受性。
表20。
[0469] 表20.F1单拷贝dgt-28事件在处理后14天对560-4480g ae/ha比率范围的草甘膦+2.0％w/v硫酸铵的响应
[0470]
[0471]
[0472] 蛋白表达数据证明，在测试的所有T1事件和构建体中均值DGT-28蛋白的范围是42.2-88.2ng/cm2，这证明了T1代中的蛋白表达。
[0473] 田地条件下的dgt-28玉米的表征将单拷贝T1事件送至田间地点用于产生杂交半合和近交纯合种子，以供进一步的表征。杂交种子的产生是通过将玉米转化系B104的T1事
件与近交系4XP811杂交，产生该事件以1:1(半合子:空)分离的杂交群体。将所得的种子运
送到2个不同的地点。按照完全随机区组设计(randomized complete block design)，每个构建体在每个地点种植总共5个单拷贝事件，设置3个重复。设计田地，使得草甘膦的施用在V4生长期发生，且一组单独的植物在V8生长期被施用。用4XP811/B104常规杂交体作为阴性对照。
[0474] 实验行(experimental rows)用184g ae/ha ASSURE IITM(106g ai/L喹禾灵-甲酯(quizalofop-methyl))处理，以消除空分离体。所有实验入选者相对于ASSURE IITM施用均以1:1(敏感:抗性)发生了分离(p＝0.05)。对于选定的抗性植物，从每个事件采样，通过标准ELISA定量DGT-28蛋白。
[0475] 对于喹禾灵-甲酯抗性植物，在V4或V8生长期用商业除草剂DURANGO DMATM(480g ae/L glyphosate)加2.5％w/v硫酸铵进行处理。使用喷管式喷雾器进行除草剂施用，喷雾
器校准到输送187L/ha的体积、50-cm喷雾高度。用1120-4480g ae/ha草甘膦的范围对植物
喷洒草甘膦，该范围而能够对非转化玉米品系造成显著损伤。致死剂量定义为导致4XP811
近交系>95％损伤的比率。对下列各项进行可见损伤评估：7、14和21DAT(处理后天数)时的目测失绿百分比、坏死百分比、生长抑制百分比和总可见损伤。将评估结果与每个品系的未处理检验标准和阴性对照进行比较。
[0476] 所有评估期的可见损伤数据证明，在两个地点和两个施用期，对高达4480g ae/ha DURANGO DMATM具有强健的耐受性。提供了来自一个地点的针对V4施用的代表性事件，并且这些事件与其它事件、施用期和地点一致。
[0477] 表21。一个事件来自含有与TraP23连锁的dgt-28的构建体(pDAB107665)，该事件TM
对ASSURE II 所致的AAD-1蛋白选择有耐受性，但是对施用的所有比率的草甘膦敏感。
[0478] 表21.dgt-28事件对V4生长期施用的1120-4480g ae/ha范围的草甘膦+2.5％w/v硫酸铵的响应
[0479]
[0480] 在生殖生长期对4480g ae/ha草甘膦比率进行了额外评估。对于所有构建体、施用期和地点，抽穗、授粉期和穗充满的目测评估均与每个品系的未处理检验标准(check)相
似。DGT-28蛋白的定量结果证明，均值蛋白表达的范围是186.4-303.0ng/cm2。数据证明，在田间条件下在整个生殖生长期内，dgt-28转化玉米对高达4480g ae/ha的草甘膦都具有强
健的耐受性。基于喷洒耐受性结果，数据还证明了DGT-28蛋白的检出和功能。
[0481] 确认dgt-28玉米在纯合状态下的可遗传性和耐受性将来自T1S2的种子如前所述地在温室条件下种植。对已在田间条件下表征过的5个单拷贝品系，在同质状态下再次进行表征。植物生长至V3生长期，分配到3个草甘膦比率，范围是1120-4480g ae/ha草甘膦
(DURANGO DMATM)，每个处理4个重复。如前所述地用履带式喷雾器实施施用，在2.0％w/v硫酸铵中进行配制。施用硫酸铵作为每个品系的未处理检验标准。如前所述地在处理后7和14天进行目测评估。数据证明，所有测试事件对高达4480g ae/ha草甘膦均具有强健的耐受
性。表22。
[0482] 表22.纯合子dgt-28事件对施用1120-4480g ae/ha范围的草甘膦+2.0％w/v硫酸铵的响应
[0483]
[0484]
[0485] 来自在田间条件下不耐受的pDAB107665的品系被证明对草甘膦无耐受性，因此与田间观察结果一致(数据未显示)。除了先前提到的一个品系之外，其它品系的所有用草甘
膦处理的重复均对草甘膦不敏感。因此，数据证明了dgt-28玉米能够以孟德尔方式遗传到
同质群体。通过标准ELISA确定的DGT-28蛋白的表达情况证明，在对草甘膦耐受的单拷贝事件中，均值蛋白表达范围是27.5-65.8ng/cm2。数据证明了DGT-28蛋白在所有世代都是有功能的蛋白，并且稳定。
[0486] 实施例12：使用草甘膦作为选择标记的萌发后除草剂耐受性
[0487] 如前所述，从组织培养物中除去T0转化植物，并在温室内驯化。所测试的事件含有与TraP5,TraP8,和TraP23叶绿体转运肽连锁的dgt-28。已经证明，这些T0植物提供了对最高达4480g ae/ha草甘膦的强健耐受性，并且非转化植物被低至280g ae/ha的草甘膦浓度
所控制。这些数据证明，在使用范围为280-4480g ae/ha的草甘膦浓度的情况下，dgt-28能够用作选择标记。
[0488] 将若干来自含有dgt-28转基因的玉米固定品系的种子掺杂到(spiked into)若干非转化玉米种子中。种植种子并使之生长至V1-V3发育期，此时用280-4480g ae/ha范围的
选择性剂量的草甘膦喷洒小植株。7-10天后，对敏感性和耐受性植株进行计数，草甘膦耐受植株的量与所种植的含有dgt-28转基因的转基因种子的原始量相关。
[0489] 实施例13:dgt-28玉米的叠加
[0490] 出于研究目的，使用AAD-1蛋白作为dgt-28转化玉米中的选择标记。aad-1也可以在玉米中用作除草剂耐受性性状，为作物提供强健的2,4-D耐受性，直至V8施用。对来自构建体pDAB107663(TraP4::dgt-28),pDAB107664(TraP8::dgt-28)和pDAB107666(TraP5::
dgt-28)的4个事件，表征了它们对草甘膦和2,4-D桶混合施用的耐受性。表征研究用F1种子在温室条件下完成。施用如前所述地用履带式喷雾器实施，使用如下的比率：1120-2240g ae/ha草甘膦(对dgt-28基因选择性),1120-2240g ae/ha 2,4-D(对aad-1基因选择性)，或
这两种除草剂处于所述比率的桶混合物。在7和14DAT对植物进行评级。表23显示了以2240g ae/ha施用除草剂的喷洒结果。
[0491] 表23.F1 aad-1和dgt-28玉米在处理后14天对喷洒2240g ae/ha 2,4-D、草甘膦、和两种除草剂的桶混合物组合的响应
[0492]
[0493] 结果确认，dgt-28能够成功地与aad-1叠加，从而增加可用于感兴趣的作物的除草剂谱(草甘膦+苯氧乙酸类，分别用于dgt-28和aad-1)。在难以控制阔叶杂草或存在抗性杂
草生物型的作物生产中，该叠加可用作杂草控制和保护感兴趣的作物的手段。在玉米和其
它植物中，额外的输入或输出性状也可以和dgt-28基因叠加。
[0494] 实施例14:其它作物的转化
[0495] 使用已知的技术对其它作物进行了转化。对于土壤杆菌介导的黑麦转化，见例如Popelka JC,Xu J,Altpeter F.,“Generation of rye with low transgene copy number after biolistic gene transfer and production of(Secale cereale L.)plants 
instantly marker-free transgenic rye,”Transgenic Res.2003Oct；12(5):587-96.)。
对于土壤杆菌介导的高粱转化，见例如Zhao et al.,“Agrobacterium-mediated sorghum transformation,”Plant Mol Biol.2000 Dec；44(6):789-98。对于土壤杆菌介导的大麦转化，见例如Tingay  et al.,“Agrobacterium tumefaciens-mediated  barley 
transformation,”The Plant Journal,(1997)11:1369–1376。对于土壤杆菌介导的小麦转化，见例如Cheng et al.,“Genetic Transformation of  Wheat Mediated  by 
Agrobacterium tumefaciens,”Plant Physiol.1997Nov；115(3):971-980。对于土壤杆菌介导的水稻转化，见例如Hiei et al.,“Transformation of rice mediated by 
Agrobacterium tumefaciens,”Plant Mol.Biol.1997Sep；35(1-2):205-18。
[0496] 其它(非土壤杆菌)转化技术用于将dgt-28、dgt-32、或dgt-33转化进入，例如，玉米(Zea mays)、小麦(Triticum spp.)、水稻(Oryza spp.和Zizania spp.)、大麦(Hordeum spp.)、棉花(Abroma augusta和Gossypium spp.)、大豆(Glycine max)、糖用和菜用甜菜(Beta spp.)、甘蔗(Arenga pinnata)、番茄(Lycopersicon esculentum)和其它种、粘果酸浆(Physalis ixocarpa)、黄水茄(Solanum incanum)和其它种、和树番茄(Cyphomandra 
betacea)、马铃薯(Solanum tuberosum)、甘薯(Ipomoea batatas)、黑麦(Secale spp.)、辣椒(Capsicum annuum、chinense、和frutescens)、莴苣(Lactuca sativa、perennis、和
pulchella)、卷心菜(Brassica spp.)、芹菜(Apium graveolens)、茄子(Solanum 
melongena)、花生(Arachis hypogea)、高粱(Sorghum spp.)、苜蓿(Medicago sativa)、胡萝卜(Daucus carota)、豆类(Phaseolus spp.和其它属)、燕麦(Avena sativa和
strigosa)、豌豆(Pisum、Vigna、和Tetragonolobus spp.)、向日葵(Helianthus annuus)、南瓜(Cucurbita spp.)、黄瓜(Cucumis sativa).烟草(Nicotiana spp.)、拟南芥
(Arabidopsis thaliana)、草坪草(Lolium、Agrostis、Poa、Cynodon、和其它属)、三叶草(Trifolium)、野豌豆(Vicia)。
[0497] 由dgt-28、dgt-32和dgt-33赋予的草甘膦耐受性可提高草甘膦除草剂在许多落叶和常青木材种植系统中用于当季使用(in-season use)的应用能力。草甘膦除草剂耐受性
木材物种增加了这些除草剂过顶施用而无需担忧损伤的适应性。因此，dgt-28,dgt-32,和/或dgt-33被转化进入木材物种中：桤树(Alnus spp.),白蜡树(Fraxinus spp.),白杨和杨
属树种(Populus spp.),山毛榉(Fagus spp.),桦树(Betula spp.),樱桃树(Prunus 
spp.),桉树(Eucalyptus spp.),山核桃(Carya spp.),枫树(Acer spp.),橡树(Quercus 
spp.),和松树(Pinus spp.)。
[0498] 草甘膦除草剂耐受性可提高草甘膦除草剂在观赏和荷果物种中选择性控制杂草的应用能力。因此，dgt-28、dgt-32和/或dgt-33被转化进入观赏和荷果物种中：玫瑰(Rosa spp.)、火焰卫矛(burning bush)(Euonymus spp.)、矮牵牛(Petunia spp.)、秋海棠
(Begonia spp.)、杜鹃(Rhododendron spp.)、海棠或苹果(Malus spp.)、梨(Pyrus spp.)、桃(Prunus spp.)、和金盏花(Tagetes spp.)。
[0499] 实施例15:与其它性状叠加
[0500] 含有昆虫抗性(IR)性状的转基因作物在整个北美的玉米、大豆和棉花植物中普遍存在，并且对这些性状的利用正扩大到全球。许多种子公司已经开发出了将昆虫抗性和除
草剂耐受性(HT)性状相结合的商业转基因作物。这些包括苏云金芽孢杆菌性状(例如，在网站lifesci.sussex.ac.uk，2006列出的Bt毒素)，非Bt昆虫抗性性状，以及任何或全部上述的HT性状。通过IR性状控制多个虫害问题的能力是一个有价值的商业产品概念。然而，如果杂草控制和昆虫控制是彼此相互独立的，那么这种产品概念的便利性将受到限制。
[0501] 将Dgt-28、dgt-31、dgt-32或dgt-33以单独的或与一种或多种额外的HT性状叠加的形式与一种或多种额外的输入性状(例如昆虫抗性、真菌抗性、或胁迫耐受性等，见
www.isb.vt.edu)叠加，叠加或是通过常规育种，或是联合作为一个新的转化事件。IR性状与dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33叠加。一旦获得IR性状的编码序列，即添加表达元件
(例如启动子、内含子、3'UTR等)并通过重组DNA方法将IR性状与dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33分子叠加。
[0502] IR性状包括：Cry1F(美国专利Nos.5,126,133；5,188,960；5,691,308；6,096,708；6,573,240；和6,737,273)；Cry1A(c)(美国专利Nos.6,114,138；5,710,020；6,251,656；和
6,229,004)；Cry1F和Cry1A(c)与dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33作为三重叠加；Cry34Ab(1)(美国专利Nos.7,323,556；7,897,342；7,888,495；7,875,430；7,932,033；7,956,246；
6,340,593),Cry35 Ab(1)(美国专利No.6,340,593；7,323,556；7,897,342；7,888,495；7,
875,430；7,932,033；7,956,246)；和/或Cry35Ab(1)和Cry 34Ab(1)与dgt-28,dgt-31,dgt-
32,或dgt-33作为三重叠加。
[0503] 益处包括：由dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33提供改良的杂草控制，并且在先前实施例中所述，与管理虫害和/或其他农艺胁迫的能力联合。含有这些与dgt-28,dgt-31,
dgt-32,或dgt-33叠加的性状的植物可提供一套完整的改良的作物品质的农艺包，其具有
灵活且成本高效地控制任何数量的农艺问题的能力。IR和HT性状的组合在大多数农艺和园
艺/观赏作物和林业中具有应用潜力。
[0504] dgt-28,dgt-31,dgt-32或dgt-33与相称的除草剂抗性和昆虫耐受性的组合，这些除草剂抗性和昆虫耐受性由任何Bt或非Bt IR基因(此类基因有多种)提供，可以用于本文
列出的作物物种。通过常规育种或遗传工程用dgt-28,dgt-31,dgt-32或dgt-33转化并与相
应的HT性状或IR性状叠加，使得本文列出的各种商业除草剂均有可能在这类作物中应用。
这些化学的代表性除草剂的具体使用比率，由汇编于CPR(Crop Protection Reference)一
书中或类似结集中的除草剂标签、或在线汇编的标签(例如cdms.net/manuf/manuf.asp)、
或任何商业或学术的作物保护指南如美国农业联盟(Agriliance)的作物保护指南(2005)
来规定。
[0505] 实施例16:在任何作物中DGT性状与AAD性状叠加
[0506] 通过叠加dgt性状和aad性状(例如,美国专利7,838,733中描述的aad-1；或PCT国际专利公开No.WO 2007/053482A2中描述的aad-12)，无论是通过常规育种还是联合作为一
种新转化事件，可以提高杂草控制效率、改善灵活性、和提高管理杂草迁移和除草剂耐受性发生的能力。
[0507] aad-1转化作物允许种植者在单子叶作物中选择性施用芳氧基链烷酸酯(aryloxyalkanoate)除草剂。这些单子叶作物可以具有更高的苯氧基生长素安全边界。此
外，可以对用aad-1转化的双子叶作物选择性施用苯氧基生长素。用aad-12转化作物允许种植者在双子叶作物中选择性施用吡啶氧基生长素和氧基链烷酸酯除草剂，以控制杂草物
种。通过将dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33与aad-1或aad-12性状叠加，可以给种植人提
供更宽的用于管理杂草的除草剂谱。而且，使用除草剂组合可以更灵活地管理杂草物种内
的除草剂耐受性。
[0508] 为植物提供了下面的杂草控制选项，其中dgt性状与aad性状在任何单子叶或双子叶作物物种中叠加：
[0509] A.以标准萌发后施用比率(420-2160g ae/ha,例如560-1120g ae/ha)施用草甘膦，以控制大多数禾本科杂草(grass)和阔叶杂草物种。在这些草甘膦施用比率下，dgt性状可提供耐受性。为了控制草甘膦耐受性阔叶杂草如飞蓬(Conyza canadensis)或本来就难
以用草甘膦控制的杂草(例如，鸭跖草属(Commelina spp))，将280-2240g ae/ha(例如,
560-1120g ae/ha)的2,4-D与草甘膦一起顺次施用、桶混合或预混合施用，以提供额外的控制。aad-1和aad-12均可提供对2,4-D的抗性。此外，aad-12还提供对吡啶氧基生长素除草
剂，如氟草烟或绿草定的耐受性。施用吡啶氧基生长素除草剂以控制草甘膦抗性阔叶杂草，如飞蓬(Conyza canadensis)和鸭跖草属(Commelina spp)。对于绿草定，施用比率范围通
常为70-1120g ae/ha，例如140-420g ae/ha。对于氟草烟，施用比率范围通常为35-560g 
ae/ha，例如70-280ae/ha。
[0510] B.以标准萌发后施用比率(420-2160g ae/ha,例如560-1120g ae/ha)施用草甘膦，用于控制大多数禾本科草和阔叶杂草物种。为了控制草甘膦耐受性草如黑麦草(Lolium rigidum)或牛筋草(Eleusine indica)，将10-200g ae/ha(例如,20-100g ae/ha)的喹禾灵
与草甘膦一起顺次施用、桶混合或预混合施用，以提供有效的控制。aad-1提供对喹禾灵的耐受性。将aad-1与dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33在作物物种中叠加，可产生耐受上述
除草剂的作物。
[0511] C.草甘膦可以高效控制除阔叶杂草物种之外的禾本科杂草物种。Aad-1与dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33的叠加性状允许施用对禾本科草有效的比率的草甘膦(105-840g 
ae/ha,例如210-420g ae/ha)。然后与草有效比率的草甘膦一起顺次、桶混合或预混合施用
2,4-D(280-2240g ae/ha,例如560-1120g ae/ha)，从而提供必要的阔叶杂草控制。使用
AOPP除草剂如10-200g ae/ha(例如,20-100g ae/ha和20-35g ae/ha)的喹禾灵，以实现更
强力的禾本科杂草控制和/或延迟草甘膦耐受性禾本科草的出现。低比率的草甘膦也对阔
叶杂草的控制提供一些好处；然而主要的控制来自于2,4-D。
[0512] D.类似地，aad-12与dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33的叠加性状允许施用对禾本科草有效的比率的草甘膦(105-840g ae/ha,例如210-420g ae/ha)。然后将2,4-D(280-
2240g ae/ha,例如560-1120g ae/ha)与对禾本科草有效比率的草甘膦一起顺次、桶混合或
预混合施用，以提供必要的阔叶杂草控制。以前述的比率使用的绿草定和氟草烟也是处理
方案中可以接受的组分。低比率的草甘膦也对阔叶杂草的控制提供一些好处；然而主要的
控制来自于2,4-D、绿草定或氟草烟。
[0513] 向作物中转化aad-12有助于单独或组合(顺次或独立)使用一种或多种市售的芳氧基生长素除草剂。类似地，aad-1有助于单独或组合(顺次或独立)使用一种或多种市售的苯氧基生长素除草剂和一种或多种商业AOPP除草剂。将这些性状中的任何一种与dgt-28、
dgt-31、dgt-32或dgt-33叠加有助于更强力地管理杂草物种。这些化学的代表性除草剂的
具体使用比率，由汇编于CPR(Crop Protection Reference)一书中或类似结集中的除草剂
标签、或在线编集的标签(例如cdms.net/manuf/manuf.asp)、或任何商业或学术的作物保
护指南如美国农业联盟(Agriliance)的作物保护指南(2005)来规定。
[0514] 实施例17:DGT性状与AHAS性状在任何作物中叠加
[0515] 编码咪唑啉酮类除草剂耐受性的性状(AHAS)目前已经在北美种植的许多作物中存在，包括，但不仅限于，玉米、水稻、向日葵和小麦。其它的咪唑啉酮耐受性作物(例如，棉花和甜菜)也已经在研发中。许多咪唑啉酮类除草剂(例如，甲氧咪草烟、咪唑乙烟酸、灭草喹和甲基咪草烟)目前在各种常规作物中选择性使用。咪唑啉酮耐受性性状如AHAS已经促
进了咪唑乙烟酸、甲氧咪草烟、和非选择性咪唑烟酸的应用。到目前为止，咪唑啉酮耐受性HTC具有非转基因的优势。这种化学类型还具有显著的土壤残留活性，因此其提供的杂草控制能够超出施用期，这不同于基于草甘膦或草铵膦的系统。然而，咪唑啉酮类除草剂控制杂草的谱不如草甘膦宽(Agriliance,2003)。此外，咪唑啉酮类除草剂的作用方式(抑制乙酰
乳酸合成酶，ALS)使得许多杂草产生了抗药性(Heap I(2004).The international survey of herbicide resistant weeds,可以在www.weedscience.com获得)。
[0516] 通过常规育种还是联合作为一个新转化事件使Dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33与咪唑啉酮耐受性性状叠加，可以改善杂草控制效率、增强灵活性、提高管理杂草迁移和除草剂耐受性发生的能力。
[0517] 为植物提供了如下的杂草控制选项，其中在任何单子叶或双子叶作物物种中叠加dgt性状和咪唑啉酮耐受性性状：
[0518] A.以标准萌发后施用比率(35-280g ae/ha,例如70-140g ae/ha)施用咪唑乙烟酸，用于控制任何禾本科草和阔叶杂草物种。
[0519] i)通过桶混合420-2160g ae/ha、例如560-1120g ae/ha的草甘膦，控制ALS-抑制剂抗性阔叶杂草，如西部苋(Amaranthus rudis)、三裂叶豚草(Ambrosia trifida)、藜
(Chenopodium album)(及其它,Heap,2004)。
[0520] ii)通过桶混合420-2160g ae/ha、例如560-1120g ae/ha的草甘膦，控制本身对咪唑啉酮类除草剂更加耐受的阔叶杂草物种，如牵牛花属(Ipomoea spp)。
[0521] iii)通过桶混合420-2160g ae/ha,例如560-1120g ae/ha的草甘膦，控制ALS-抑制剂抗性杂草，如石茅(Sorghum halepense)和黑麦草属(Lolium spp)。
[0522] iv)通过桶混合420-2160g ae/ha,例如560-1120g ae/ha的草甘膦，控制本身耐受性的禾本科杂草物种(例如偃麦草(Agropyron repens))。
[0523] 通过常规育种或基因工程化用dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33转化并与任何咪唑啉酮耐受性性状叠加，有助于各种商业咪唑啉酮类除草剂或草甘膦除草剂的任何一种的
应用，无论是单独应用还是以多种组合应用。这些化学的代表性除草剂的具体使用比率，由汇编于CPR(Crop Protection Reference)一书中或类似结集中的除草剂标签、或在线编集
的标签(例如cdms.net/manuf/manuf.asp)、或任何商业或学术的作物保护指南如美国农业
联盟(Agriliance)的作物保护指南(2005)来规定。
[0524] 实施例18:大豆转化
[0525] 通过土壤杆菌介导的大豆子叶节外植体(cotyledonary node explant)转化产生了含有稳定整合的dgt-28转基因的转基因大豆(Glycine max)。使用携带含有功能性dgt-
28的二元载体的卸甲(disarmed)土壤杆菌菌株起始转化。
[0526] 土壤杆菌介导的转化用改良的Zeng et al.(Zeng P.,Vadnais D.A.,Zhang Z.,Polacco J.C.,(2004),Plant Cell Rep.,22(7):478 482)的半子叶节程序实施。简而言
之，使大豆种子(Maverick栽培种)在基本培养基上萌发，分离子叶节，并用土壤杆菌感染。
芽启动(shoot initiation)培养基、芽伸长(shoot elongation)培养基、以及生根培养基
添加有头孢噻肟、特美汀和万古霉素，用于去除土壤杆菌。通过除草剂进行选择，以抑制非转化芽(non-transformed shoot)生长。将选出的芽(shoot)转移到生根培养基以生根，然
后转移到土壤混合物中以驯化幼苗。
[0527] 选定幼苗的顶生小叶(terminal leaflet)用除草剂局部处理(叶喷涂技术(leaf paint technique)，以筛选假定的转化体。将筛选到的幼苗转移至温室，驯化，然后用除草剂叶片喷涂以再确认耐受性。从这些假定的转化T0植物采样，并使用分子分析确认除草剂
选择标记和dgt-28转基因的存在。使T0植物在温室中自花授粉，产生T1种子。
[0528] 可以使用第二种大豆转化方法产生额外的转基因大豆植物。使用携带含有功能性dgt-28的卸甲土壤杆菌菌株起始转化。
[0529] 使用Paz et al.,(Paz M.,Martinez J.,Kalvig A.,Fonger T.,and Wang K.,(2005)Plant Cell Rep.,25:206-213)的改良半种子程序实施土壤杆菌介导的转化。简而
言之，将成熟大豆种子用氯气过夜灭菌，并用无菌H2O浸没20小时，然后进行土壤杆菌介导的植物转化。将种子沿种脐纵向对半切开，分开种子并去除种皮。切下胚轴，并从子叶节点除去任何主苗/芽(axial shoot/bud)。所得的半种子外植体用土壤杆菌感染。芽启动培养
基、芽伸长培养基、以及生根培养基添加有头孢噻肟、特美汀和万古霉素，用于去除土壤杆菌。利用除草剂选择来抑制非转化芽(non-transformed shoot)的生长。将选出的芽
(shoot)转移到生根培养基中以生根，然后转移到土壤混合物中以驯化幼苗。
[0530] 从假定的转化T0植物采样，并使用分子分析来确认除草剂选择标记和dgt-28转基因的存在。数个事件被鉴定为含有所述转基因。对这些T0植物进行进一步的分析，并允许它们在温室中自花授粉，产生T1种子。
[0531] 确认dgt-28向T1代的可遗传性对DGT-28蛋白向T1代的可遗传性，使用两种方法中的一种进行评估。第一种方法包括将T1种子种植到Metro-mix培养基中，并在第1个三小叶
(trifoliate)生长期在已萌发的植物上施用411g ae/ha的IGNITETM280SL。第二种方法是使用钢珠(ball bearing)和genogrinder研磨机对总共8个重复的种子匀浆。然后利用用于检
测PAT蛋白的ELISA条测试(ELISA strip test)来检测可遗传事件，这是因为选择标记与
dgt-28位于相同质粒上。对于任一种方法而言，如果有一个植物对草铵膦耐受或者被PAT 
ELISA条测试所检出，则该事件表现出遗传到T1代的能力。
[0532] 如前所述地用总共5个构建体进行可遗传性筛选。质粒含有与TraP4、TraP8和TraP23连锁的dgt-28。所有构建体中的事件证明，PAT::DGT-28蛋白遗传到T1代的可遗传性为68％。
[0533] dgt-28转化的T1大豆的萌发后除草剂耐受性来自通过如前所述的筛选方法被确认可遗传的T1事件的种子在温室条件下种植在Metro-mix培养基中。让植物生长至第1个三
TM
小叶(trifoliate)完全展开，如前所述地用411g ae/ha的IGNITE 280 SL处理，以选择pat
基因。给来自每个事件的抗性植株提供唯一的标识，并采样用于dgt-28基因的配型分析。利用配型数据，为每个草甘膦施用比率指定2个半合子和2个纯合子重复，从而在存在足够植
物时，为每个处理提供总共4个重复。这些植物与野生型Petite havana烟草进行比较。对所有植物用设定为187L/ha的履带式喷雾器进行喷洒。对植物喷洒560-4480g ae/ha范围的
DURANGOTM二甲胺盐(DMA)。所有施用物均用水配制，并添加2％w/v硫酸铵(AMS)。在处理后7和14天对植物进行评估。给植物指定一个关于总体目测生长停滞、失绿、和坏死的损伤分
级。T1代是有分离的，因此可以预期由于配型的不同会存在一些可变的响应。
[0534] 表24.喷洒结果证明，每个被表征的构建体至少有一个dgt-28事件在14DAT(处理后天数)对高达4480g ae/ha草甘膦具有强耐受性。构建体的代表性单拷贝事件与Maverick
阴性对照相比均提供了对高达4480g ae/ha的耐受性
[0535]
[0536] dgt-28在T2代中对高比率草甘膦的保护对每个构建体的2-5个T2品系进行45株植物后代测试。根据在前一代中完成的配型分析选择纯合品系。如前所述地种植种子。然后如前所述地用411g ae/ha的IGNITE 280SL喷洒植物，以选择pat选择标记。3DAT后，对抗性和敏感性植物进行计数。
[0537] 对于含有与dgt-28连锁的TraP4的构建体(pDAB107543和pDAB107548)，所测试的12个品系中有9个没有分离，从而确认了T2代中的同质品系。含有与dgt-28连锁的TraP8的
品系(pDAB107545)显示4个品系中有2个没有分离体，并且显示dgt-28在大豆中以孟德尔遗
传方式遗传至少2代。从抗性植物获取组织样品，并通过标准ELISA方法对DGT-28蛋白进行
定量。数据表明，DGT-28蛋白在测试的无分离T2品系中的平均值范围是32.8-107.5ng/cm2。
来自构建体pDAB107553(TraP23::dgt-28)的品系先前没有用草铵膦选择，利用草甘膦剂量
响应来测试同质性(homogenosity)和对高比率草甘膦的耐受性。来自构建体pDAB107553的
品系的重复样品对560-4480g ae/ha范围的草甘膦比率耐受，因此被确认是一个同质群体，并可以遗传至少2代。
[0538] 如前所述地向2-3个三小叶大豆施用DURANGO DMA，其比率范围是560-4480g ae/ha的草甘膦。14DAT的可见损伤数据确认了在T1中证明的耐受性结果。
[0539] 表25.数据表明dgt-28烟草与非转化对照相比，在两代内对高达3360g ae/ha草甘膦均具有强健的耐受性
[0540]
[0541]
[0542] 实施例19:用dgt-28转化水稻
[0543] 在一个示例方法中，通过土壤杆菌介导的无菌水稻种子转化，产生了含有稳定整合的dgt-28转基因的转基因水稻(Oryza sativa)。使用携带含有功能性dgt-28的二元载体
的卸甲土壤杆菌菌株来起始转化。
[0544] 将培养基用1M KOH调节到pH 5.8，并用2.5g/l植物凝胶(Phytagel)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)固化。将胚性愈伤组织培养在含有30ml半固体培养基的100x 20mm
培养皿中。让水稻幼苗在含有50ml培养基的MAGENTA盒中生长。让细胞悬浮液保持在含有
35mL液体培养基的125ml锥形瓶中，并以125rpm旋转。在25–26℃黑暗中进行胚培养物的诱导和维持，在16-h光周期的光照室内进行植物再生和全株植物培养(Zhang et al.1996)。
[0545] 胚性愈伤组织的诱导和维持在如前所述的改良NB基础培养基(Li et al.1993)中进行，其中适应性地修改该培养基使其含有500mg/L谷氨酰胺。在含有用30g/L蔗糖代替麦
芽糖的SZ液体培养基(Zhang et al.1998)中启动并保持悬浮培养。渗透性培养基(NBO)是
添加了甘露醇和山梨醇各0.256M的NB培养基。在补充了合适除草剂选择剂的NB培养基上选
择除草剂抗性愈伤组织3-4周。在培养基(PRH50)上实施预再生(pre-egeneration)1周，该
培养基的组成是：NB培养基、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、1mg/lα-萘乙酸(NAA)、5mg/l脱落酸(ABA)和选择性除草剂。在再生培养基(RNH50)上培养之后，进行幼苗再生，直至再生出假定的转基因芽(transgenic shoot)，其中再生培养基(RNH50)包含NB培养基(含2,4-D,
0.5mg/l NAA，以及选择性除草剂)。将芽(shoot)转移到生根培养基中，其具有半强度的
Murashige和Skoog基本盐和Gamborg氏B5维生素，并补充有1％蔗糖和选择性除草剂。
[0546] 对水稻粳稻品种Taipei 309的成熟干燥的种子进行灭菌，如Zhang et al.1996所述。通过在NB培养基上黑暗培养无菌成熟水稻种子来诱导胚性组织。从盾片取出直径大约
1mm的初级愈伤组织，并用于在SZ液体培养基中起始细胞悬浮。然后如Zhang 1996所述地维持悬浮液。在先前的亚培养之后3-5天，从液体培养物取出悬液衍生的胚性组织，并放置在NBO渗透性培养基中，在培养皿中形成直径大约2.5cm的圆环，培养4h后进行轰击。轰击后
16-20小时，将组织从NBO培养基转移到NBH50选择培养基上，确保被轰击的表面朝上，并在黑暗中温育14-17天。然后从原来的被轰击的外植体分离出新形成的愈伤组织，并放置在相同培养基上的附近位置。再过8-12天后，目测鉴定相对紧凑的、不透明的愈伤组织，将它们转移到PRH50预再生培养基中，在黑暗中经过7天。然后将生长中的愈伤组织，其已变得更加紧凑和不透明，亚培养到RNH50再生培养基上，在16小时光周期下经过14-21天。将再生芽
1
(regenerating shoot)转移到含有/2MSH50培养基的MAGENTA盒中。从单个外植体再生的多
个植株视为同胞，将它们作为一个独立的植物品系对待。如果植株在1/2MSH50培养基上产生厚实、白色的根并且生长旺盛，则将该植物评定为对dgt-28基因呈阳性。一旦幼苗达到
MAGENTA盒的顶部，便将它们转移到6-cm盆的土壤中，在100％湿度下保持1周，然后移到生长室中，14-h光照下30℃和黑暗下21℃，保持2-3周，然后转移到温室的13-cm盆中。采集种子，并在37℃干燥1周，随后在4℃保存。
[0547] dgt-28水稻的T0分析将通过土壤杆菌转化获得的水稻转化体移植到培养基中，并驯化适应温室条件。对所有植物进行采样用于PCR检测dgt-28，结果表明，pDAB110827
(TraP8::dgt-28)有22个PCR阳性事件，pDAB110828(TraP23::dgt-28)有最少16个PCR阳性
事件。对PCR阳性事件的dgt-28的Southern分析证明，两个构建体均为简单(1-2个拷贝)事
件。选定的T0事件的蛋白表达显示，DGT-28的蛋白表达从低于检测水平到130ng/cm2不等。如前所述地用2240g ae/ha DURANGO DMATM对从构建体pDAB110828选择的T0事件进行处理，并在处理后7和14天进行评估。数据证明对所施用比率的草甘膦具有强耐受性。让所有PCR阳
性植株产生T1种子，用于进一步的表征。
[0548] Dgt-28在水稻中的可遗传性对来自含有叶绿体转运肽TraP8的构建体pDAB110827的4个dgt-28T1品系进行100株后代测试。将种子种植于填满培养基的盆中。然后如前所述
地用560g ae/ha DURANGO DMATM喷洒所有植物，以选择dgt-28基因。7DAT后，对抗性和敏感性植株进行计数。通过卡方分析确定，在对每个构建体所测试的4个品系中，有2个株作为单座位、显性孟德尔性状(3R:1S)分离。Dgt-28在多个物种中是一种可遗传的草甘膦抗性基
因。
[0549] dgt-28转化的T1水稻的萌发后除草剂耐受性为来自后代测试中使用的每个事件的T1抗性植株指定唯一的标识，并采样用于dgt-28基因的配型分析。利用配型数据为每个
草甘膦施用比率指定2个半合子和2个纯合子重复，从而为每个处理提供总共4个重复。这些植物与野生型kitaake水稻进行比较。对所有植株用设定为187L/ha履带式喷雾器进行喷
洒。用560-2240g ae/ha范围的DURANGO DMATM喷洒植物。所有施用物用水配制，并添加2％w/v硫酸铵(AMS)。在处理后7和14天对植物进行评估。为植物指定对应于总体目测生长停滞、失绿和坏死的损伤分级。T1代是有分离的，因此可以预期由于配型的不同存在一些可变的
响应。
[0550] 喷洒结果表明，在7DAT(处理后天数)，更高比率的草甘膦仅造成的微小的植物损伤(数据未显示)。
[0551] 表26.14 DAT的目测损伤数据显示对高达2240g ae/ha草甘膦的平均目测损伤低于15％
[0552]
[0553]
[0554] 针对来自pDAB110827的所有4个T1测试品系的重复样品，进行了DGT-28蛋白检测。数据表明，对于半合子和纯合子重复样品，DGT-28均值蛋白的范围分别为20-82ng/cm2和
21-209ng/cm2。这些结果表明T1代中有稳定的蛋白表达，并且dgt-28水稻在经过施用560g ae/ha草甘膦进行选择之后，可对高达2240g ae/ha的草甘膦耐受。
[0555] 实施例20:用dgt-28转化草坪草
[0556] 借助从种子(Penn-A-4栽培种)生发的胚性愈伤组织，在匍匐剪股颖(Creeping Bentgrass)中实现了根癌土壤杆菌介导的dgt-28转基因遗传转化。参见“Efficiency of 
Agrobacterium tumefaciens-mediated turfgrass(Agrostis stolonifera L)
transformation”(Luo et.al.,2004)。
[0557] 用携带超二元载体的根癌土壤杆菌菌株感染愈伤组织细胞，该超二元载体含有受单子叶植物特异性启动子驱动的除草剂抗性转基因(例如dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-
33)。整体稳定转化效率的范围是18％-45％。Southern印迹和遗传分析证实了转基因被整
合在匍匐翦股颖的基因组内，并且转基因正常传递到T1代中稳定表达。所有的独立转化事
件携带转基因的1-3个拷贝，并且大多数(60–65％)只包含转基因的1个单拷贝且没有明显
的重排。
[0558] 成熟的种子用砂纸脱壳，并在10％(v/v)CloroxTM漂白剂(6％次氯酸钠)加0.2％(v/v)吐温20(Polysorbate 20)中剧烈震荡90分钟进行表面灭菌。用无菌蒸馏水漂洗5次
后，将种子置于愈伤组织诱导培养基(MS基本盐和维生素，30g/L蔗糖，500mg/l酪蛋白水解物，6.6mg/L 3,6二氯-邻-茴香酸(麦草畏)，0.5mg/l 6-苄氨基嘌呤(BAP)和2g/L植物凝胶。
培养基的pH调节至5.7，随后高压灭菌120℃ 20分钟)。
[0559] 将含有准备好的种子外植体的培养平板在室温下黑暗中保持6周。胚性愈伤组织通过目测选择，并亚培养在新鲜的愈伤组织诱导培养基内，在室温下黑暗中保持1周，随后进行共培养。
[0560] 在土壤杆菌介导感染前1天，将胚性愈伤组织分成1-2mm的薄片，并置于含有100μM乙酰丁香酮的愈伤组织诱导培养基上。然后向每片愈伤组织施用10μl等份的携带dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33转基因的土壤杆菌悬浮液(660nm的OD＝1.0)，随后在25℃黑暗中
共培养3天。然后，将愈伤组织转移到添加了125mg/l头孢噻肟和250mg/l羧苄青霉素以抑制细菌生长的愈伤组织诱导培养基上，并培养2周。
[0561] 当将愈伤组织转移到含有250mg/L头孢噻肟和除草剂的愈伤组织诱导培养基之上时，发生转基因植物的选择。愈伤组织材料在此培养基上保持8周，其中选择亚培养的间隔为3周。选择过程在室温下黑暗中进行。
[0562] 为了植物再生，首先将抗除草剂的增殖愈伤组织事件移至补充有头孢噻肟和用于选择的除草剂的再生培养基上(MS基本培养基、30g/l蔗糖、100mg/l肌醇、1mg/l BAP和2g/l植物凝胶)。这些愈伤组织在室温下黑暗中保持1周，然后移到光照下2-3周以产生芽
(shoot)。
[0563] 将产生的芽(shoot)分离并转移到没有激素但含有除草剂和头孢噻肟的再生培养基上以促进根生长，同时维持选择压力并抑制任何残余的土壤杆菌细胞。然后，将根发育良好的幼苗(3-5周)转移到土壤中，并在温室或田间生长。
[0564] 将转基因植物保持在户外的封闭苗床(containment nursery)上(3-6个月)，直到12月的冬至。然后，将春化后的植物转移到温室中，保持在25℃，16/8h光周期，周围用非转基因对照植株包围，以将转基因植物与其它花粉源物理隔离。在移回温室后3-4周，转基因植物开始开花。用来自周围对照植物的花粉对这些植物进行异交(out-cross)。使从每个单独转基因植物收集的种子在25℃的土壤中萌发，使T1植物在温室中生长，用于进一步的分
析。
[0565] 按照该描述的方案用dgt-28转化其它禾本科草类，包括早熟禾(Poaannua)，百喜草，翦股颖，狗牙根，莓系属的牧草(Bluegrass)，须芒草(bluestems)，臂形草，雀麦草
(Bromegrass)，旱地翦股颖(Browntop bent)(Agrostis capillaries)，野牛草，金丝雀草，地毯草，假俭草，紫羊茅(Festuca  rubra  commutate)，马唐，翦股颖(Agrostis 
stolonifera)，Crested hairgrass(Koeleria macrantha)，毛花雀稗，羊茅草，Festolium，硬羊茅草/羊羊茅草(Festuca ovina)，格兰马草，印度草(Indiangrass)，约翰逊草
(Johnsongrass)，画眉草(Lovegrass)，混合草(mixes)(马用草(Equine)，牧草(Pasture)
等)，原生草(Native Grasses)，鸭茅，多年生黑麦草(Lolium perenne)，小糠草(Redtop)，雀麦属植物，一年生和多年生黑麦草，纤细的匍匐紫羊茅(Festuca rubra trichophylla)，加拿大早熟禾(Poa pratensis)，St.Augustine，强匍匐型紫羊茅(Festuca rubra rubra)，苏丹草，柳枝稷，高羊茅(Festuca arundinacea)，发草(Deschampsia caespitosa)，草坪草，小麦草，和结缕草(Zoysiagrass)。
[0566] 实施例21:用DGT性状转化芸苔属植物
[0567] 用土壤杆菌介导的转化，使用可赋予对草甘膦抗性的dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33基因转化欧洲油菜(Brassica napus)NexeraTM710栽培种。
[0568] 将欧洲油菜种子用10％市售漂白剂表面灭菌10分钟，用无菌蒸馏水漂洗3次。然后，将种子置于半浓度的MS基础培养基(Murashige and Skoog,1962)上，并维持设定为25
℃、16hr光照/8hr黑暗的光周期的生长方案。
[0569] 从5-7日龄的幼苗切下下胚轴节段(3-5mm)，并置于愈伤组织诱导培养基K1D1(MS培养基加1mg/l激动素和1mg/l 2,4-D)上3天，作为预处理。然后，将节段转移到培养皿中，用含有包含dgt-28的构建体的根癌土壤杆菌菌株处理。根癌土壤杆菌在150rpm摇床上28℃
黑暗生长过夜，随后重悬在培养基中。
[0570] 用土壤杆菌处理下胚轴节段30分钟后，将这些节段放回愈伤组织诱导培养基上3天。共培养后，将节段放在K1D1TC(含有250mg/l羧苄青霉素和300mg/l特美汀的愈伤组织诱导培养基)上，使其恢复1周。或者，将节段直接置于选择培养基K1D1H1上(含有除草剂的上述培养基)。羧苄青霉素和特美汀是用于杀死土壤杆菌的抗生素。选择剂允许被转化的细胞生长。
[0571] 将来自分离的独立事件的愈伤组织样品用PCR进行测试。对于dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33的存在测试呈阳性的样品，进行确认并转移到用于再生的培养基上。然
后，将愈伤的(callused)下胚轴节段置于B3Z1H1(MS培养基,3mg/l苄氨基嘌呤,1mg/l玉米
素,0.5gm/l MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸],5mg/l硝酸银,选择性除草剂,羧苄青霉素和特美
汀)芽再生培养基上。在3周之后芽(shoot)开始再生。将下胚轴节段和芽(shoot)一起转移
到B3Z1H3培养基上(MS培养基,3mg/l苄氨基嘌呤,1mg/l玉米素,0.5gm/l MES[2-(N-吗啉
代)乙磺酸],5mg/l硝酸银,选择性除草剂,羧苄青霉素和特美汀)，再生长3周。
[0572] 从下胚轴节段切下芽(shoot)，并转移到芽伸长培养基MESH10上(MS,0.5gm/l MES,选择性除草剂,羧苄青霉素和特美汀)再生长2-4周。将细长芽(elongated shoot)在
MSI.1(含有0.1mg/l吲哚基丁酸的MS)上培养以诱导根。一旦植物建立起根系统，便将植物
移植到土壤中。植物在ConvironTM中在受控的环境条件下驯化1-2周，然后转移至温室。
[0573] 使转化的T0植物在温室中自发授粉，以获得T1种子。用一定浓度范围的草甘膦除草剂喷洒T0植物和T1后代，以确定由dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33基因提供的保护水平。
[0574] 实施例22:用dgt-28转化烟草
[0575] 用含有dgt-28转基因的根癌土壤杆菌转化烟草(Petit Havana栽培种)叶片。将含有dgt-28转基因的质粒的单个菌落接种到4mL含有壮观霉素(50μg/mL)和链霉素(125μg/
mL)的YEP培养基中，并在190rpm摇床上28℃过夜温育。随后使用4mL种子培养物接种125mL
挡板锥形瓶中的25mL相同培养基的培养物。该培养物在28℃温育，190rpm震荡，直至达到
OD600～1.2。然后，将10mL土壤杆菌悬液置于无菌60x 20mm PetriTM盘中。
[0576] 从在PhytaTraysTM(Sigma,St.Louis,MO)中含有30g/L蔗糖的MS培养基(Phytotechnology Labs,Shawnee Mission,KS)上无菌生长的植物新鲜切下叶片
(0.5cm2)，并浸泡在10mL土壤杆菌过夜培养物中数分钟，在无菌滤纸上吸干水分，然后置于添加了1mg/L吲哚乙酸和1mg/L 6-苄氨基嘌呤的相同培养基上。3天后，将与携带有dgt-28
转基因的土壤杆菌共培养过的叶片转移到含有5mg/L BastaTM和250mg/头孢噻肟的相同培
养基。
[0577] 3周后，将个体T0幼苗转移到含有10mg/L BastaTM和250mg/L头孢噻肟的MS培养基中，再经过3周后，转移到土壤中并移至温室。使选定的T0植物(使用上述的分子分析规程鉴定的)自花授粉，在荚果完全干燥后从其收集种子。对T1苗筛选配型和报告基因表达(如下
文所述)，并鉴定了含有dgt-28转基因的选定植物。
[0578] 以如下方式将植物移至温室：从根部洗掉琼脂，移植到13.75cm方盆的土壤中，将盆置于 袋(SC Johnson&Son,Inc.)中，在袋子的底部放入自来水，并在30℃温室中
置于间接光下1周。3-7天后，打开袋子；给植物施肥，让其在打开的袋子中生长，直至植物适应温室环境，此时移除袋子。让植物在普通暖温室条件下生长(白天27℃,夜晚24℃,16小时白天,最小自然光+辅助光＝1200μE/m2s1)。
[0579] 在繁殖前，从T0植物采样进行DNA分析，通过实时定量PCR确定插入的dgt-28的拷贝数。将新鲜组织置于试管中，并在4℃冻干2天。在组织完全干燥后，在试管中放置钨珠
(Valenite)，并用Kelco珠磨机对样品干磨1分钟。然后进行标准DNeasyTMDNA分离程序
(Qiagen,DNeasy 69109)。然后，用Pico Green(Molecular Probes P7589)对提取的DNA等
份进行染色，并在具有已知标准品的荧光计(BioTekTM)中读取，获得以ng/μl为单位的浓度。
TM
使用总共100ng总DNA作为模板。PCR反应在9700Geneamp 热循环仪(Applied Biosystems)
中实施，使样品经历94℃ 3分钟，35个94℃ 30秒、64℃ 30秒、和72℃ 1分45秒的循环，随后是72℃ 10分钟。通过在1％琼脂糖凝胶上电泳并用EtBr染色对PCR产物进行分析，并通过
Southern印迹进行确认。
[0580] 从3个含有不同叶绿体转运肽序列(TraP4、TraP8和TraP23)的构建体再生5-9个PCR阳性事件，每个事件具有1-3个dgt-28基因拷贝，并移至温室中。
[0581] 对所有PCR阳性植物进行采样，用于通过标准ELISA定量DGT-28蛋白。在所有PCR阳性植物中均检测到了DGT-28蛋白，并且注意到，随着dgt-28拷贝数的增加，蛋白浓度有增加趋势。
[0582] aad-12(v1)在烟草中的可遗传性对每个构建体的5个dgt-28 T1品系进行100株后代测试。构建体含有如下叶绿体转运肽序列之一：TraP4,TraP8或TraP23。将种子层积、播种并移植，与上文举例的拟南芥规程非常相似，只是在移植之前，不通过初始选择除去空植
物。随后如前所述地用280g ae/ha的IGNITE 280 SL喷洒所有植物，以选择pat选择标记。
3DAT后，对抗性和敏感性植物进行计数。
[0583] 通过卡方分析确定，在对每个构建体所测试的5个品系中，有4个作为单座位、显性孟德尔性状分离(3R:1S)。Dgt-28是一种在多个物种中可遗传的草甘膦抗性基因。
[0584] dgt-28转化的T1烟草的萌发后除草剂耐受性为来自后代测试中使用的每个事件的T1抗性植株指定唯一的标识，并采样用于dgt-28基因配型分析。利用配型数据，为每个草甘膦施用比率指定2个半合子和2个纯合子重复，从而为每个处理提供总共4个重复。将这些植物与野生型Petite havana烟草进行比较。对所有植株用设定为187L/ha履带式喷雾器进
行喷洒。用560-2240g ae/ha范围的DURANGO DMATM喷洒植物。所有施用物用水配制，并添加
2％w/v硫酸铵(AMS)。在处理后7和14天对植物进行评估。给植物指定对应于总体目测生长
停滞、失绿和坏死的损伤分级。T1代是有分离的，因此可以预期由于配型的不同会存在一些可变的响应。
[0585] 喷洒结果表明，在7DAT(处理后天数)，高比率的草甘膦造成的植物损伤极小(数据未显示)。14DAT后，可见损伤数据表明，含TraP4的构建体的单拷贝事件与来自含TraP8和
TraP23的构建体的单拷贝事件相比，损伤增加。表27。
[0586]
[0587]
[0588] 在2240g ae/ha草甘膦比率下，显示含有TraP4的事件的平均损伤为37.5％，而含有TraP8和TraP23的事件的平均损伤分别为9.3％和9.5％
[0589] 这些结果表明，dgt-28对高达4480g ae/ha的草甘膦具有耐受性，并且显示与dgt-28基因连锁的叶绿体转运肽序列提供的耐受性存在差异。
[0590] Dgt-28在T2代中对高比率草甘膦的保护对每个构建体的2-3个T2品系进行25株植物后代测试。基于在前一代中完成的配型分析选择纯合品系。如前所述地对种子进行层积、播种和移植。然后如前所述地用280g ae/ha的Ignite 280 SL喷洒所有植物，以选择pat选
择标记。3DAT后，对抗性和敏感性植物进行计数。对每个构建体测试的全部品系均没有分
离，从而确认了T2代的同质品系，并证明dgt-28在烟草中可以孟德尔遗传至少2代。
[0591] 如前所述地对2-3叶烟草施用比率范围为420-3360g ae/ha草甘膦的DURANGO DMATM。14DAT的可见损伤数据确认了在T1代中展示的耐受性结果。来自含有TraP4的构建体的2拷贝品系的叶数据表明，单拷贝的TraP8和TraP23品系具有相似的耐受性(数据未显
示)。
[0592] 表28.来自含有TraP4与dgt-28的构建体的单拷贝品系显示与来自含有TraP8和TraP23与dgt-28的构建体的品系相比损伤增加
[0593]
[0594]
[0595] 这些结果表明，与非转化对照相比，dgt-28烟草在2代内对高达3360g ae/ha的草甘膦具有强耐受性。
[0596] 在施用草甘膦之前从每个事件的选定植株采样，用于通过标准DGT-28ELISA分析DGT-28蛋白。数据表明，所有各构建体的简单(1-2个拷贝)品系的DGT-28蛋白平均表达量范围是72.8-114.5ng/cm2。数据表明，dgt-28在T2代转化烟草中表达蛋白，并且耐受性数据确认了有功能的DGT-28蛋白。
[0597] 叠加dgt-28以增加烟草(Petit Havana栽培种)除草剂谱对纯合dgt-28(pDAB107543和pDAB107545)和aad-12 v1(pDAB3278)植物(对于后者，见PCT/US2006/
042133)进行相互杂交，并收集F1种子。对来自每个基因的2次相互杂交的F1种子进行层积，并用1120g ae/ha草甘膦(对dgt-28基因具有选择性),1120g ae/ha 2,4-D(对aad-12基因
具有选择性),或所述比率的两种除草剂的桶混合物，对每个杂交的6个重复样品进行处理。
植物在14 DAT进行评级。喷洒结果如表29所示。
[0598] 表29.F1 aad-12和dgt-28的响应
[0599]
[0600] 结果确认dgt-28能够与aad-12(v1)成功叠加，从而增加可用于感兴趣的作物的除草剂谱(对于dgt-28和aad-12，分别为草甘膦+苯氧乙酸)。在难以控制阔叶杂草或者存在抗性杂草生物型的作物生产中，叠加可用作杂草控制和感兴趣的作物保护的手段。其他的输
入或输出性状也可以和dgt-28基因叠加。
[0601] 实施例23:在小麦中对草甘膦的抗性
[0602] 编码DGT-28的二元载体的产生用本领域公知的手段和技术设计并组装了含有DGT-28表达盒和PAT选择盒的二元载体。每个DGT-28表达盒包含启动子、来自玉米泛素
(Ubi)基因的5’非翻译区、和内含子(Toki et al.,Plant Physiology 1992,100 1503-
07)，随后是编码序列，该序列由4种转运肽(TraP4,TraP8,TraP23或TraP5)其中之一与人造版本的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因(DGT-28)的5’端融合而构成，其经过了
密码子优化以便在植物中表达。DGT-28表达盒以3’非翻译区(UTR)终止，该3’UTR包含来自玉米的脂肪酶基因(Vp1)的转录终止子和多聚腺苷酸化位点(Paek et al.,Mol.Cells 
1998 30；8(3)336-42)。PAT选择盒包括启动子、来自水稻肌动蛋白(Act1)基因的5’非翻译区和内含子(McElroy et al.,The Plant Cell 1990 2(2)163 171)、随后是从绿色产色链
霉菌(Streptomyces viridochromogenes)分离的草铵膦乙酰转移酶基因(PAT)的人造版
本，其经过了密码子优化以便在植物中表达。PAT基因编码一种蛋白质，其赋予对谷氨酰胺合成酶抑制剂，包括草铵膦、草铵膦和双丙氨磷的抗性(Wohlleben et al.,Gene 1988,70
(1),25-37)。该选择盒用3′UTR终止，该3′UTR包含来自花椰菜花叶病毒(CaMV)35S基因的转录终止子和多聚腺苷酸化位点(Chenault et al.,Plant Physiology 1993 101(4),1395-
1396)。
[0603] 选择盒由商业基因合成公司(GeneArt,Life Technologies)合成，并克隆到Gateway适能的(Gateway-enabled)二元载体中。将DGT-28表达盒亚克隆到pDONR221中。使
用所得的入门克隆与编码草铵膦乙酰转移酶(PAT)表达盒的Gateway适能二元载体进行LR 
Clonase II(Invitrogen,Life Technologies)反应。通过使用从New England BioLabs
(NEB；Ipswich,MA)和Promega(Promega Corporation,WI)获得的限制性核酸内切酶对纯化
DNA进行限制性消化，对所有组装质粒的菌落进行初始筛选。质粒DNA的制备用QIAprep 
Spin Miniprep试剂盒(Qiagen,Hilden)或Pure Yield Plasmid Maxiprep系统(Promega 
Corporation,WI)按照制造商的使用说明进行。选定克隆的质粒DNA用ABI Sanger测序和
Big Dye Terminator v3.1循环测序规程(Applied Biosystems,Life Technologies)进行
TM
测序。序列数据使用Sequencher 软件(Gene Codes Corporation,Ann Arbor,MI)组装和分
析。
[0604] 将所得的4个二元表达克隆：pDAS000122(TraP4-DGT28),pDAS000123(TraP8-DGT28),pDAS000124(TraP23-DGT28)和pDAS000125(TraP5-DGT28)，分别转化进入根癌土壤
杆菌菌株EHA105。
[0605] 用dgt-28表达构建体产生转基因小麦事件使用供体小麦品系Bobwhite MPB26RH，按照与Wu et al.,Transgenic Research 2008,17:425-436相似的规程进行土壤杆菌介导
的转化，产生表达4种DGT-28表达构建体其中之一的转基因小麦植物。对假定的T0转基因事件选择草铵膦(PPT)耐受性，该耐受性是由PAT选择标记赋予的表型，并转移到土壤中。将T0植物在温室封闭(containment)条件下生长，并产生T1种子。总体上，为每个DGT-28表达构建体产生了大约45个独立的T0事件。
[0606] T0小麦dgt-28小麦事件的草甘膦耐受性让T0事件在温室中驯化，生长至从轮生体生出2-4片新的、外观正常的叶片(即植物已经从组织培养转向温室生长条件)。使植物在25℃温室，12小时补光的条件下生长，直至成熟。如前所述地对在相同条件下生长的T1植物进行草甘膦耐受性的初始筛选和Taqman分析。数据允许确定可遗传T1事件以供进一步表征。
将6个低拷贝(1-2个拷贝)和2个多拷贝T1事件在温室条件下再次种植，并生长至3叶期。用
420-3360g ae/ha范围的草甘膦商业制剂(Durango DMATM)喷洒T1植物，该范围能够对非转
化小麦品系造成显著损伤。在施用物中添加了2％w/v硫酸铵。致死剂量的定义为导致Bob 
White MPB26RH非转化对照>75％损伤的比率。施用除草剂。
[0607] 在本实施例中，利用草甘膦施用来确定dgt-28基因在T1代中的分离，并且证明对递增水平的草甘膦的耐受性。用处理21天(DAT)后可见损伤的量表来表示植物响应。数据显示为展示少于25％可见损伤(4)、25-50％可见损伤(3)、50-75％可见损伤(2)和大于75％可见损伤(1)的个体数的柱状图。为每个用于小麦转化的构建体提供了算术平均值和标准差。
还在最后一列中为每个比率和每种转化指示了个体响应的评分范围。用野生型，非转化的
小麦(Bob White MPB26RH栽培种)，作为草甘膦敏感性对照。在T1代中，有半合子和纯合子植物可用于测试每个事件，因此每个测试的草甘膦比率都包含了它们。半合子植物所含的
基因量将是纯合子植物一半，因此可以预期在T1代中对草甘膦的响应存在差异。
[0608] T1 dgt-28小麦植株的结果证明，用叶绿体转运肽TraP4,TraP5,TraP8和TraP23实现了对高达3360g ae/ha的草甘膦比率的耐受性。表30是低拷贝T1事件的数据，但是代表了每个构建体的群体。
[0609] 表30.低拷贝T1 dgt-28小麦事件在处理后21天对草甘膦的响应
[0610]
[0611] 在21DAT，对抗性和敏感性植株进行计数，确定了通过卡方分析作为单一座位分离并显示显性孟德尔性状(3R:1S)的品系的百分比。表31.这些数据证明，dgt-28是一种在单
子叶物种中可以遗传的强草甘膦抗性基因。
[0612] 表31.各构建体的基于420-3360g ae/ha范围草甘膦选择证明了孟德尔方式遗传的T1 dgt-28事件的百分比
[0613]
[0614] 对T0转基因植物整合编码DGT-28的T-DNA的分子确认从所有假定T0小麦植株的冷冻干燥叶片材料提取基因组DNA。将新鲜采集的叶组织在液氮中速冻，并在Labconco 
Freezone (Labconco,Kansas City,MO)中在-40℃和133 x 10-3mBar压力下冷冻干燥
24h。使用 植物DNA微量提取试剂盒(Qiagen)按照制造商的使用说明对冻干的材
料进行DNA提取。
[0615] 对来自每个T0植物的DNA测试是否有残留的根癌土壤杆菌菌株，并确定编码DGT-28的T-DNA的整合拷贝数目。用双重 qPCR测定检测根癌土壤杆菌的存在与否，从
小麦基因组扩增内源泛素基因(正向和反向引物和探针如下)：
[0616] 5’GCGAAGATCCAGGACAAGGA 3’(SEQ ID NO:85；正向引物)
[0617] 5’CTGCTTACCGGCAAAGATGAG 3’(SEQ ID NO:86；反向引物)
[0618] 5’TTCCCCCGGACCAGCAGCGT 3’(SEQ ID NO:87；探针)
[0619] 并从pTiBo542扩增virC：
[0620] 5’CCGACGAGAAAGACCAGCAA 3’(SEQ ID NO:88；正向引物)
[0621] 5’CTTAAGTTGTCGATCGGGACTGT 3’(SEQ ID NO:89；反向引物)
[0622] 5’TGAGCCTCTCGTCGCCGATCACAT 3’(SEQ ID NO:90；探针).
[0623] 按照Livak和Schmittgen(Methods 2001 25:402-8)的方法，通过双重qPCR测定估计整合T-DNA的拷贝数。该测定扩增六倍体小麦D基因组上的内源单拷贝嘌呤吲
哚蛋白(puroindoline)-b(Pinb)基因(Gautier et al.Plant Science 2000 153,81–91)：
[0624] 5’ATTTTCCATTCACTTGGCCC 3’(SEQ ID NO:91；正向引物)
[0625] 5’TGCTATCTGGCTCAGCTGC 3’(SEQ ID NO:92；反向引物)
[0626] 5’ATGGTGGAAGGGCGGTTGTGA 3’(SEQ ID NO:93；探针)
[0627] 和存在于T-DNA上的肌动蛋白(Act1)启动子的一个区域：
[0628] 5’CTCCCGCGCACCGATCTG 3’(SEQ ID NO:94；正向引物)
[0629] 5’CCCGCCCCTCTCCTCTTTC 3’(SEQ ID NO:95；反向引物)
[0630] 5'AAGCCGCCTCTCGCCCACCCA 3’(SEQ ID NO:96；探针).
[0631] 将如下所述的植物归类为转基因：该植物没有扩增出virC产物；并且使用针对内源泛素和水稻肌动蛋白启动子的引物从该植物扩增出了正确的产物。根据Livak和
Schmittgen(Methods 2001 25:402-8)，整合T-DNA的数目从2ΔΔc(T)进行估算。总的来
说，全部T0植物的大约95％具有至少一个T-DNA的整合拷贝。表32
[0632] 表32.产生的独立T0植株数目和编码DGT-28的整合T-DNA的估计数
[0633]
[0634] 用于跟踪转基因遗传的PCR配型测定法的开发通过用8种限制性内切核酸酶消化经纯化的基因组DNA，随后连接特异针对由限制性内切核酸酶产生的突出端(overhang)的
双链衔接子，来鉴定T-DNA整合位点的侧翼序列。衔接子连接后，使用针对编码DGT-28的T-DNA的3’或5’端的生物素化引物、和针对每个衔接子的引物进行PCR。将PCR产物捕获并在Ampure固相可逆固定化(Solid Phase Reversible Immobilization,SPRI)珠子
(Agencourt Bioscience Corporation,Beckman Coulter Company)上纯化。然后进行巢式
PCR，并用 v3.1化学(Applied Biosystems)在 自动毛细管电泳平
台上对扩增产物进行Sanger测序。序列分析使用Sequencher软件(GeneCodes,Ann Arbor,
MI)实施，用于产生(如果有可能)共有序列。使用所得的共有序列和单个序列(singleton)
作为BlastN查询项，搜索小麦品种中国春(Chinese Spring)的流式分选染色体臂的组装基
因组探查序列重叠群(www.wheatgenome.org)，以确定其中发生了T-DNA整合的染色体，并
帮助设计用于开发PCR配型测定的亚基因组特异性引物。
[0635] 为每个转基因事件开发了两种PCR测定法，以便于在后代中对转基因遗传进行跟踪。第一种测定(下文称作出-出PCR(out-out PCR))被设计成扩增整个T-DNA整合位点。在
该测定中通过开关PCR(on-off PCR)实现亚基因组特异性扩增(sub-genome-specific 
amplification)，开关PCR所使用的引物被设计为将倒数第二个碱基(其含有硫代磷酸酯
键)置于如下所述的核苷酸序列变异之上：该序列变异将靶座位与该座位在小麦基因组中
他处的重复拷贝(同源物和旁系同源物)区分开来。第二种测定(下文称作入-出PCR(in-out PCR))被设计成从T-DNA到内源序列的扩增。该测定使用一个来自所述出-出PCR测定的引
物，和一个设计为针对编码DGT-28的T-DNA的3’或5’端的引物。PCR引物设计成长度为18-27个核苷酸，熔点为60-65℃，最佳为63℃。出-出PCR)和入-出PCR测定均在25μl反应体积中进行，含有0.2mM dNTP,1x Phusion PCR缓冲液(New England BioLabs),1.5mM MgCl2,0.5U
热启动Phusion DNA聚合酶(New England BioLabs),25ng纯化的基因组DNA和0.4μM每种引
物。PCR循环条件为98℃，30秒，然后(98℃，10秒，65℃20秒，72℃60秒)40个周期。转基因植物配型的指定如表33所示。
[0636] 表33.用于PCR配型测定的转基因事件和用于出-出和入-出PCR的引物序列
[0637]
[0638]
[0639] *指示硫代磷酸酯键
[0640] T1转基因植物的草甘膦耐受性表型评估为了确定具有DGT-28表达构建体的转基因事件是否显示草甘膦耐受性，在温室封闭条件下对从单个事件衍生的T1植物进行表型评
估。实施了两种表型筛选。在第一个(初步)筛选中，对转基因事件(有充足的T1种子用于两种表型筛选)的草铵膦和草甘膦耐受性进行评估，以确认DGT-28表达并确立各事件之间对
除草剂耐受性的等级次序。在第二个(详细)筛选中，对于选定的转基因事件，以不同的喷洒比率对草甘膦耐受性进行评估，以证实事件内和DGT-28表达构建体之间被赋予的除草剂耐
受性的水平。
[0641] 将每个选定事件的12粒T1种子和非转化供体小麦品系Bobwhite MPB26RH的3个重复(每个12粒种子)播种在85mm盆中，并在25℃、补充光照以提供12小时光周期、充分浇水条件下，生长至2叶期。将各盆按照随机设计放置，以便在数据分析过程中消除环境影响。所筛选的转基因事件如表34所列。在2叶期，用420g ai/ha剂量比率的草胺膦喷洒全部T1植物以及12个非转化供体小麦植物的第一个重复。4天后对植物进行目测检查，并使用具有一定范围表型响应的代表性植物建立0-6的打分表。表35
[0642] 表34.初步筛选中测试的转基因事件
[0643]
[0644]
[0645]
[0646] *根据多重 qPCR测定。低拷贝和多拷贝分别表示≤3和≥4个整合T-DNA
[0647] 表35.用于记录喷洒4天后对草胺膦的表型响应的评分量表
[0648]得分 描述
0 萌发延迟或植株建成差；不纳入后续的分析
1 >75％叶坏死；芽(shoot)失绿/枯萎/死亡
2 25-75％叶坏死；芽(shoot)/叶大部分失绿
3 10-25％叶坏死；<50％叶片失绿；中等枯萎；微小失绿芽(shoot)
4 <10％叶坏死；微小枯萎；微小失绿
5 叶尖端坏死；其余植株健康
6 健康植物
[0649] 然后，对试验中的每个植物相对于打分量表进行评分，评分者对于植物基因型是“盲目的”，以消除评分偏向性。草胺膦评分5天后，用420g ai/ha剂量比率的草甘膦喷洒全部T1植物以及非转化供体小麦植物的第一和第二重复。非转化供体小麦品系剩余的第三重
复(总共12株植物)不喷洒。在喷洒后7、14和21天，对植物进行目测检查。为每个时间点建立一个覆盖表型响应范围的评分量表，并用于给整个试验评分。在每个时间点，评分者对于植物基因型是“盲目的”。喷洒7天后的评分量表是0-7(表36)，喷洒14和21天后，评分量表是1-
4。在草甘膦喷洒14天后，还为每个植物记录植株高度、分蘖数和形态异常。萌发延迟或形态建成差的植物不纳入随后的分析。
[0650] 使用评分量表对喷洒草甘膦7天后的表型响应进行记录。
[0651] 表36.用于记录喷洒7天后对草甘膦表型响应的评分表
[0652]得分 描述
0 植物死亡
1 >75％叶坏死；芽(shoot)失绿/枯萎/死亡
2 50-75％叶坏死；严重失绿和枯萎
3 25-50％叶坏死；<50％叶片失绿；中等枯萎
4 10-25％叶坏死；<25％叶片失绿；微小枯萎
5 <10％叶坏死；微小失绿
6 叶尖端坏死；其余植株健康
7 健康植物
[0653] 表37.用于记录喷洒14和21天后对草甘膦表型响应的评分表
[0654]得分 描述
1 植物死亡
2 50-75％叶片坏死；严重失绿和枯萎；植物濒死
3 <25％叶片坏死；<25％叶片失绿；微小枯萎；生长迹象
4 健康植物
[0655] 草胺膦响应分析未能显示在被喷洒的非转化供体小麦植物与未被喷洒的非转化供体小麦植物之间有清楚的表型差异(数据未显示)。结果，无法可靠地评估转基因事件对
草胺膦的耐受性。相反，喷洒21天后的草甘膦响应分析显示出了在被喷洒和未喷洒的非转
化供体植物之间有清楚的表型差异。
[0656] 表38。因此，根据喷洒21天后收集到的响应得分对转基因事件之间的草甘膦耐受性进行分析。当转基因事件的12个T1植物中有4个或更多个具有大于或等于3的响应得分
时，则认为该事件显示出草甘膦耐受性。这个标准是基于如下的预期，即每个事件在T1代中对该转基因会以1:2:1(存在纯合子:半合子:不存在纯合子)分离，并使得具有微弱DGT28表
达的事件能够鉴定出。使用从单个耐受性植物计算出的任意定义的累积得分，对转基因事
件的观察到的草甘膦耐受性进行分级。累积得分根据14和21天的响应得分和喷洒14天后记
录的植株长度、分蘖数和形态异常来结算。
[0657] 表38.非转化供体小麦植株在喷洒后21天对除草剂处理的表型响应
[0658]  喷洒草胺膦 喷洒草甘膦 存活比率
重复1 是 是 10/12死亡/濒死
重复2 否 是 10/12死亡/濒死
重复3 否 否 12/12健康
[0659] 总的来说，被筛选的92个转基因事件中的67个显示了草甘膦耐受性的证据。表39。为每个DGT-28表达载体选出6个估计具有≤3个转基因整合拷贝的转基因事件和2个估计具
有4个或更多个整合转基因的转基因事件，用于第二次(详细)表型筛选。
[0660] 表39.转基因事件对草甘膦处理的分级后的表型响应
[0661]
[0662]
[0663]
[0664] *正得分指示较高的草甘膦耐受性。未处理的非转化供体小麦植株的标准化累计得分为12.2
[0665] 详细的表型筛选将含有每个选定事件的12粒T1种子的4个重复和非转化供体小麦品系Bobwhite MPB26RH的8个重复(每个12粒种子)播种在85mm盆内，并在25℃、补充光照以提供12小时光周期、充分浇水条件下，生长至2叶期。将各个盆按随机设计放置，以便在数据分析过程中可以消除环境影响。所筛选的转基因事件如表40所列。在2叶期，在用草甘膦喷洒前记录每个植物的植株高度和叶数。对于每个选定事件以及非转化供体小麦品系的T1植
株的第一、第二、第三和第四重复，分别用420,840,1680和3360g ai/ha的剂量比率进行喷洒。非转化供体小麦品系的第五、第六、第七和第八重复(总共48个植物)不喷洒。在喷洒后
7、14和21天，使用表37中的评分量表对植物的植株长度、叶数和对草甘膦的表型响应进行评分。还记录任何形态异常。为了评分，评分者对于植物基因型和喷洒剂量比率是“盲目
的”，以防止评分偏向性。在喷洒前评分时具有萌发延迟和形态建成差(标准：植物长度<
6cm)的植物，不纳入随后的分析。
[0666] 表40.在详细表型筛选中测试的转基因事件
[0667]
[0668]
[0669] *基于多重 qPCR测定。低拷贝和多拷贝分别表示≤3和≥4的整合T-DNA
[0670] 喷洒7、14和21天后的草甘膦响应分析显示，被喷洒和未被喷洒的非转化供体小麦植物之间有截然不同的表型差异。该区分在第21天时最大，并且在所有草甘膦剂量比率下
均可观察到。表41。为了评估转基因事件对每个喷洒剂量比率的耐受性，将空T1植物(即没有携带转基因的植物)排除出随后的分析。在喷洒21天后响应得分小于3的T1植物被认为具
有空基因型。基于耐受性表型的方差分析(ANOVA)揭示，DGT-28表达构建体、转基因事件和草甘膦喷洒剂量具有显著影响。表42。然而，由于用于记录个体植物的表型的响应得分的范围有限(即1-4，表40)，多重比较检验未能对这些差异的来源提供有意义的生物学解释。大体上，对每个DGT-28表达构建体测试的8个独立的转基因事件在每个喷洒剂量比率下显示
出相似的草甘膦耐受性，表明所有4个DGT-28转基因均赋予了显性表型，并且单拷贝足以赋予草甘膦耐受性。每个DGT-28表达构建体显示对至少3360g ai/ha的草甘膦具有有效的耐
受性。
[0671] 表41.非转化供体小麦植株对不同草甘膦处理在喷洒后21天的表型响应
[0672]
[0673] 表42.基于草甘膦耐受性植物的方差分析(ANOVA)
[0674]
[0675] 1自由度；2分别在0.001(***)和0.01(**)统计学显著
[0676] 草甘膦耐受性T1植物中T-DNA存在的分子确认使用在实施例2中开发的PCR配型测定法确认在预留用于产生T2种子的草甘膦耐受性T1植物(见实施例6)中编码DGT-28的T-
DNA的存在。总的来说，对104个T1植物进行PCR配型测试，其中89％被确认为含有转基因的至少1个拷贝。
[0677] 表43。这些结果确认，所观察到的草甘膦耐受性是被编码DGT-28的T-DNA的存在所赋予的。
[0678] 表43.在T1植物中观察到的转基因分离
[0679]
[0680]
[0681] 为草甘膦耐受性转基因事件的产生T2种子从被选择包含在详细表型筛选中的32个转基因事件中，通过表型筛选保留了大约8个草甘膦耐受性T1植物(表40)。将植物转移到
200mm盆中，并在25℃、补充光照以提供12小时光周期、充分浇水条件下生长。在开花之前，将每个植物上的穗单独包裹，以防止异交。
[0682] 虽然本发明的各方面已经在某些实施方案进行了描述，但是它们在本发明的精神和范围内可以被进一步进行修改。因此，本申请意图涵盖使用其一般原理的本发明实施方
案的任何变化、用途或修改。此外，本申请意图涵盖通过这些实施方案所涉及的领域中的已知或习惯做法可以获得、并且落在附加权利要求的范围之内的对本公开的偏离。
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