【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、多糖類高生産性細胞の製造方法および多糖類生産用細胞に関する。 さらに詳しくは、本発明は、細胞外に多糖類を分泌する植物細胞のカルスを継代培養して多糖類生産性細胞を製造する方法の改良、そしてその改良方法により得られる多糖類生産用細胞に関する。

【０００２】

【従来の技術】多糖類を生産する植物としては多くの種類のものが知られている。 そのような植物から多糖類を取得するには、従来では、天然の、又は栽培した植物の種子、果実、茎、幹、葉、根、塊茎、あるいは塊根等からの抽出またはタッピング等による方法が利用されていた。 しかし、それらの天然の植物または栽培植物は、自然環境や天候の影響を受け易く、従って生産量や価格が安定しないという欠点がある。 このため、それらの植物の細胞または組織を液体培地にて培養することによって、細胞や組織を増殖させ、同時に多糖類を生産させて、培地中に排出させる方法が提案されている。

【０００３】上記の細胞の組織培養による多糖類の製造方法は、自然環境や天候の影響を受けないため、安定に生産することができ、有利な方法ということができるが、これまでに知られている方法では、培養細胞から生産される多糖類の収量が低いという大きな問題がある。
このため、培養条件を変えることによって多糖類の生産量を向上させることを目的とした研究が行なわれている。

【０００４】たとえば、特開平５−２０７８８８号公報に記載の発明では、ポリアンテス属のチューベロースから誘導されるカルスなどの植物細胞を液体培地にて培養する際に、その液体培地に一定範囲の量の金属塩を存在させることによって、液体培地の粘度の上昇を抑制し、
これにより多糖類の生産量の向上を図っている。 すなわち、多糖類生産用細胞は一般に、対象の植物からカルスを誘導した後、このカルスを継代培養することにより増殖させて多数の細胞として取得し、この増殖した多糖類生産用細胞を大量の液体培地にて培養して多糖類を生産させ、細胞外に分泌させ、最後に、この細胞外に分泌された多糖類を細胞から分離して、目的の多糖類を取得する方法に利用されるが、この公報に記載の発明では、多糖類の生産培地に金属塩を存在させて、液体培地の粘度の上昇を抑制する方法が利用されている。 そして、このようにして多糖類生産性細胞の多糖類生産のための液体培地の粘度の上昇が抑制される結果、培養液の拡散、混合が良好になり、多糖類の生産性が向上する他、カルスや細胞と目的物を含有する上澄液との分離も容易となり生産性が向上するとされている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、細胞外に多糖類を分泌する植物細胞のカルスを継代培養して多糖類生産性細胞を製造する公知の方法を改良することにより、更に多糖類を高生産性で生産する多糖類生産用細胞を得る方法を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、細胞外に多糖類を分泌する植物細胞のカルスを継代培養して多糖類生産性細胞を製造する方法において、該継代培養を３０〜
２００ｍＭの範囲内の濃度の金属塩を含有する液体培地にて行なうことを特徴とする多糖類高生産性細胞の製造方法にある。 上記の液体培地における金属塩濃度は４０
ｍＭ以上、１５０ｍＭ以下の範囲内の濃度であることが好ましく、更に、５０ｍＭ以上、１２０ｍＭ以下であることが特に好ましい。 金属塩は塩化カリウムであることが好ましい。 また、上記のカルスがポリアンテス属植物（特に、ポリアンテス属のチューベロース植物）の細胞から誘導されたものであることが好ましい。

【０００７】本発明はまた、カルスの状態で３０〜２０
０ｍＭの範囲内の濃度の金属塩を含有する液体培地にて継代培養されて多糖類生産性が向上した細胞外に多糖類を分泌する多糖類生産用細胞にもある。 なお、このような通常の液体培地に金属塩を追加添加して調製した液体培地での継代培養によって多糖類生産性にされた本発明の多糖類生産用細胞は、ストレス耐性が向上し、その後の培養を金属塩濃度の高い液体培地で行なわなくとも、
高い多糖類生産能を示すように変化（馴化）する。

【０００８】すなわち、本発明の発明者の研究により、
細胞外に多糖類を分泌する植物細胞のカルスを継代培養して多糖類生産性細胞を得る際に、その継代培養を通常の液体培地に金属塩を追加添加して、一定範囲の濃度の金属塩を含有するように調整した液体培地にて行なった場合に、多糖類生産性が顕著に向上した多糖類生産性細胞が得られること、そしてそのようにして得られた多糖類生産性細胞はストレス耐性が向上するように馴化されており、その後に通常の液体培地にて培養した場合でも高い多糖類生産性を示すことが判明した。 本発明は、本発明者によるこのような新規な知見に基づいて完成されたものである。

【０００９】本発明の多糖類高生産性細胞の製造方法において使用される植物の細胞については、それが多糖類を生産する種類のものである限り特に制限はなく、例えば、アオイ科植物のオクラ、セリ科植物のニンジン、シソ科植物のハッカなど各種の植物を用いることができる。 ただし、本発明では、特に、細胞としてポリアンテス属（Ｐｏｌｉａｎｔｈｅｓ Ｌ．）の植物の細胞、特にポリアンテス属のチューベロース（Ｐｏｌｉａｎｔｈ
ｅｓ ｔｕｂｅｒｏｓａ Ｌ． ）植物より誘導されたカルスを利用する場合において有利に利用できるため、以下の記載では、このポリアンテス属のチューベロース植物の細胞のカルスを例にとって本発明を説明する。

【００１０】ポリアンテス属のチューベロース植物から得られるカルスは、アラビノース、マンノース、ガラクトース、キシロースおよびグルクロン酸を構成成分とする酸性ヘテロ多糖を生産することで知られている。 そして、その継代培養は、公知の基本培地、例えば、ムラシゲ・スクーグ（Ｍｕｒａｓｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ）の培地、リンスマイヤー・スクーグ（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ−
Ｓｋｏｏｇ）の培地、ガンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）の培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）の培地、ニッチ・ニッチ（Ｎｉｔａｃｈ−Ｎｉｔａｃｈ）の培地、ツレッケ（Ｔ
ｕｌｅｃｋｅ）の培地などを利用して行なわれる。 なかでも、ムラシゲ・スクーグの培地やリンスマイヤー・スクーグの培地の使用が好ましい。 これらの液体培地に通常低濃度の金属塩が含まれている。

【００１１】これらの継代培養用の培地には更に植物ホルモンや炭素源等の公知の各種の添加剤が添加されていてもよい。 添加する植物ホルモンの種類や濃度は多糖類の生産性に影響を及ぼす。 例えば２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、α−ナフタレン酢酸（ＮＡ
Ａ）、インドール酢酸（ＩＡＡ）、インドール酪酸（Ｉ
ＢＡ）などのオーキシン類；カイネチン、ベンジルアデニン（ＢＡ）、ジメチルアミノプリン（２ＩＰ）などのサイトカイニン類；ジベレリンＡ ₃ （ＧＡ ₃ ）などのジベレリン類などを使用することができる。 このなかで、
２，４−ＤまたはＮＡＡを単独で、あるいはＮＡＡとＢ
Ａまたはカイネチンとを組合せて用いることが好ましい。 それらの場合の濃度は２，４−ＤまたはＮＡＡを単独で用いる場合には、５×１０ ^-4 Ｍから１×１０ ^-7 Ｍの範囲の濃度、特に５×１０ ^-5 Ｍから５×１０ ^-6 Ｍの範囲の濃度が、ＮＡＡとＢＡまたはＮＡＡとカイネチンとを組合せて用いる場合には、ＮＡＡの濃度は１×１０ ^-4 Ｍ
から１×１０ ^-7 Ｍの範囲の濃度、特に１×１０ ^-4 Ｍから５×１０ ^-6 Ｍの範囲の濃度、そしてＢＡ又はカイネチンの濃度は５×１０ ^-5 Ｍから１×１０ ^-9 Ｍ、特に１×１０
^-6 Ｍから１×１０ ^-7 Ｍの範囲の濃度が好ましい。

【００１２】炭素源としては、グルコース、フラクトース、マンノース、キシロース、サッカロース、ラムノース、フコース、デンプンなどが用いられる。 多糖類の生産量は、添加する炭素源の種類にはあまり大きく影響されるものではなく、通常はサッカロースが炭素源として用いられる。 炭素源の量も多糖類の生産量にあまり影響を与えるものではないが、一般に１〜６重量％の範囲の濃度で用いられる。

【００１３】本発明のカルスの継代培養で用いる液体培地は、上記のような通常の継代培養に使用する液体培地に、例えば１０〜１８０ｍＭ（好ましく２０〜１００ｍ
Ｍ）の範囲内の濃度の金属塩を添加することにより容易に調製することができる。 この継代培養時の液体培地への金属塩の追加添加により、カルス（細胞）の多糖類生産性が顕著に向上する。

【００１４】金属塩としては、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム、バリウムなどのアルカリ土類金属、そして鉄、亜鉛、アルミニウムなど金属のような一〜三価の金属の塩化物、硫酸塩、炭酸塩、リン酸塩、硝酸塩が用いられる。 具体的な金属塩の例としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、
塩化カルシウム、塩化バリウム、塩化マグネシウム、塩化鉄、塩化亜鉛、塩化アルミニウム、硫酸ナトリウム、
硫酸カリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸バリウム、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸アルミニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸バリウム、炭酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、リン酸バリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸カルシウム、硝酸マグネシウム、硝酸バリウムなどを挙げることができる。

【００１５】本発明のカルスの継代培養は、通常２０〜
３０℃の範囲で１５〜３０日間程度の培養（振盪培養が好ましい）を数回（回数に特に限定はないが、通常は、
３回以上）実施することにより行なわれる。 なお、継代培養時の金属塩の添加は、必ずしも毎回の継代培養用液体培地に行なう必要はないが、多糖類生産能の顕著な向上のためには、多くの回の継代培養用液体培地に金属塩を存在させることが好ましい。 また、それぞれの回の継代培養用培地中の金属塩濃度を変動させることも多糖類生産能の顕著な向上のためには有効である。

【００１６】本発明のカルス（細胞）の継代培養方法において用いられる培養装置、培養槽などについては特に制限はない。 培養槽としては縦型ドラム、横型ドラム、
回転ドラムなど各種のタイプのものを用いることができる。 ただし、振盪可能な培養槽の使用が好ましい。 培養装置には通常は撹拌装置が付設され使用されるが、液体培地が培養槽の内部で循環移動するようにしてあれば、
撹拌装置の設置と使用は必ずしも必要ではない。

【００１７】本発明の継代培養により得られる多糖類生産能の向上した細胞はそのまま多糖類生産用細胞として、公知の培養条件にて培養し、工業的あるいは実験室的な多糖類の生産に利用できる。 その際の液体培地としては、上記の継代培養に利用した液体培地と同様な組成、あるいは特に多糖類の生産に適した液体培地（特に同様に金属塩を含む液体培地）を利用することが好ましい。

【００１８】

【実施例】

［実施例１］ （１）カルスの誘導：開花２〜７日前のチューベロースのつぼみを切り取り、７０％エタノール溶液で１分間滅菌し、更に１％次亜塩酸ナトリウム溶液で１０分間滅菌した後、滅菌水で洗浄した。 滅菌処理された外植片を適当な大きさに切り、カルス誘導用培地に接種した。 カルス誘導用培地には、基本培地として０．８％の寒天を含むリンスマイヤー・スクーグの培地（Ｌ−Ｓ培地：硝酸カリウムおよびその他の金属塩を合計で約２５ｍＭ含有）を用いた。 植物ホルモンとしては、オーキシンとして１０ ^-5 ＭのＮＡＡとサイトカイニンとして１０ ^-6 ＭのＢＡを添加した。 炭素源としては３％サッカロースを添加した。 この培地を０．１Ｎ−ＫＯＨでｐＨ５．７に調整したのち、オートクレーブを用いて１２０℃、１．２
気圧で１５分間滅菌した。 培養は電照下２５±１℃で行なった。 ３０〜６０日間の培養の後、それぞれの外植片からはカルスが誘導されていることが確認された。

【００１９】（２）カルスの継代培養第一期：上記の工程で誘導されたカルスを誘導培地と同一の培地を用いて同一条件下で３０日間培養する継代培養単位工程を２０
回（各回毎にカルスは新しい培地に移される；２０代の継代培養）を行なった。

【００２０】（３）カルスの継代培養第二期：２リットル容の三角フラスコに、培地（Ｌ−Ｓ培地：硝酸カリウムおよびその他の金属塩を合計で約２５ｍＭ含有）に、
５ w/v％スクロース、１０ ^-5 ＭのＮＡＡ、１０ ^-6 ＭのＢ
Ａ、及び５０ｍＭの塩化カリウムを添加したもの）を１
０００ｍＬを仕込み、この培地にカルスを接種量５ w/v
％（新鮮重量、以下も同じ）で接種して、２６℃、９０
ｒｐｍで３０日間振とう培養した。 この継代培養単位工程ごとに細胞を分離し、その一部を同組成の培地に移植して継代培養を５代継続して本発明の細胞を得た。 なお、対照として塩化カリウムを添加しなかった以外は同一の培地を利用し、同様に継代培養して対照用の細胞を得た。

【００２１】（４）継代培養後の細胞の多糖類生産能の測定Ｉ（金属塩無添加培地での培養） ５００ｍＬ容の三角フラスコに仕込んだ培地（上記と同じＬ−Ｓ培地に４ w/v％スクロース及び１０ ^-5 Ｍの２，
４−Ｄを添加したもの）２００ｍＬに本発明の細胞と比較用の細胞を別々に移植し、２６℃、９０ｒｐｍで２週間振とう培養した。 そして、この培養単位工程ごとに細胞を分離し、その分離細胞の同一組成の培地に添加する方法による半連続培養を繰り返し、実施した。 また、細胞分離後の培地について分析し、その培地中の多糖類生産量を測定した。 その結果を図１に示す。

【００２２】（５）継代培養後の細胞の多糖類生産能の測定II（金属塩添加培地での培養） ５００ｍＬ容の三角フラスコに仕込んだ培地（上記と同じＬ−Ｓ培地に４ w/v％スクロース、１０ ^-5 Ｍの２，４
−Ｄ及び５０ｍＭの塩化カリウムを添加したもの）２０
０ｍＬに本発明の細胞と比較用の細胞を別々に移植し、
２６℃、９０ｒｐｍで２週間振とう培養した。 そして、
この培養単位工程ごとに細胞を分離し、その分離細胞の同一組成の培地に添加する方法による半連続培養を繰り返し、実施した。 また、細胞分離後の培地についても分析し、その培地中の多糖類生産量を測定した。 その結果を図２に示す。

【００２３】（６）測定結果 図１と図２の結果から、いずれの培地であっても、本発明に従って高濃度の金属塩を含む培地で継代培養した細胞が、従来の低濃度の金属塩を含む培地で継代培養した細胞に比較して、明らかに高い多糖類生産能を示すように変化（馴化）していることがわかる。

【００２４】［実施例２］実施例１の（５）の継代培養後の細胞の多糖類生産能の測定II（金属塩添加培地での培養）を、培養単位工程の振とう時間を１週間とした以外は、同様の方法で、本発明の細胞と比較用の細胞について今度は長期間の培養を行ない、同様にして多糖類生産能の変化を調べた。 その結果を図３に示す。 図３の結果から、本発明に従って高濃度の金属塩を含む培地で継代培養した細胞が、従来の低濃度の金属塩を含む培地で継代培養した細胞に比較して、特に長期培養において顕著に高い多糖類生産能を維持することがわかる。

【００２５】

【発明の効果】本発明に従って高い濃度で金属塩を含む培地で継代培養した細胞は、従来の低濃度の金属塩を含む培地で継代培養した細胞に比較して明らかに高い多糖類生産能を示し、その高い多糖類生産性は長期培養においても充分に維持される。 従って、本発明の製造方法を利用して製造した多糖類生産性細胞は、工業的に多糖類を生産する場合に特に有利に使用できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に従って高濃度の金属塩を含む培地で継代培養した細胞と従来の培地で継代培養した細胞との多糖類生産性の推移の例を示すグラフである。

【図２】本発明に従って高濃度の金属塩を含む培地で継代培養した細胞と従来の液体培地で継代培養した細胞との、多糖類生産用の高濃度の金属塩を含有する培地での多糖類生産性の推移の例を示すグラフである。

【図３】本発明に従って高濃度の金属塩を含む培地で継代培養した細胞と従来の培地で継代培養した細胞との長期間培養における多糖類生産能の推移の例を示すグラフである。

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