突变型atpA基因及其应用
阅读：940发布：2020-05-08
专利汇可以提供突变型atpA基因及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种突变型atpA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。突变型atpA基因具有提高 植物 抗非 生物 胁迫的功能，其可用于生产高抗性的植物，还应用于鉴定或辅助鉴定高抗性植物。，下面是突变型atpA基因及其应用专利的具体信息内容。
1.一种蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种核酸分子，其编码权利要求1所述的蛋白质。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、重组菌或转基因细胞系。
5.权利要求1所述的蛋白质、权利要求2或3所述的核酸分子、权利要求4所述的重组载体、重组菌或转基因细胞系在提高植物非生物胁迫抗性中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述非生物胁迫包括高盐或干旱。
7.一种高抗性植物的生产方法，包括将权利要求2或3所述的核酸分子导入受体植物中，从而得到高抗性植物，所述抗性是指非生物胁迫抗性，包括高盐或干旱。
8.用于检测权利要求1所述蛋白质、权利要求2或3所述核酸分子的试剂在高抗性植物鉴定或辅助鉴定中的应用，所述抗性是指非生物胁迫抗性，包括高盐或干旱。
9.一种鉴定或辅助鉴定高抗性植物的试剂盒，其包括用于检测权利要求1所述蛋白质的抗体和/或用于检测权利要求2或3所述核酸分子的试剂；所述抗性是指非生物胁迫抗性，包括高盐或干旱。
10.一种鉴定或辅助鉴定高抗性植物的方法，其包括检测植物材料中权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述核酸的表达。
突变型atpA基因及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种突变型atpA基因及其应用。
背景技术
[0002] 植物需要应对持续变化的环境，包括经常性的不利于植物生长和发育的胁迫环境。这些不良环境包括生物胁迫(如病原体感染和食草动物的啃食)和非生物胁迫(例如干旱、高温、冷害、营养匮乏、盐害以及土壤中铝、砷、镉等有毒金属毒害)。干旱、盐害以及温度胁迫是影响植物的地理分布、限制农作物产量，并威胁粮食安全的主要环境因子。极端天气越来越频繁的出现，将加剧非生物胁迫对农业生产的不利影响。因此，提高作物非生物胁迫抗性，已经成为农业发展的当务之急。
发明内容
[0003] 本申请发明人从番茄纯和材料09888-6中克隆得到atpA基因，经对比发现，本发明克隆到的atpA基因与Genbank上公布的atpA基因(序列号为：AC_000188)相比，第674位碱基由T变为C，其编码第225位氨基酸的碱基从GTA(Val V亮氨酸)变为GCA(Ala A丙氨酸)。经研究证实，本发明克隆到的atpA基因具有较强的抗非生物胁迫(例如高盐、干旱)的功能，这在以前是没有报道过的，为植物抗高盐和干旱研究提供新的思路。
[0004] 本发明所采取的技术方案是：
[0005] 一种蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0006] 一种核酸分子，其编码上述的蛋白质。
[0007] 作为优选的，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，也即突变型atpA基因。
[0008] 含有上述核酸分子的重组载体、重组菌或转基因细胞系。
[0009] 以上所述的蛋白质、核酸分子、重组载体、重组菌或转基因细胞系在提高植物非生物胁迫抗性中的应用。
[0010] 作为优选的，所述非生物胁迫包括高盐或干旱。
[0011] 一种高抗性植物的生产方法，包括将以上所述的核酸分子导入受体植物中，从而得到高抗性植物，所述抗性是指非生物胁迫抗性，包括高盐或干旱。
[0012] 进一步优选地，所述受体植物优选为茄科植物。
[0013] 用于检测上述蛋白质或核酸分子的试剂在高抗性植物辅助育种中的应用，所述抗性是指非生物胁迫抗性，包括高盐或干旱。
[0014] 所述试剂可以是蛋白质提纯及测序试剂、基因克隆及测序试剂或者是其他可用于蛋白质、核酸定性检测的试剂。
[0015] 一种高抗性植物辅助育种试剂盒，其包括用于检测上述蛋白质的抗体，或者是用于检测上述核酸分子的PCR引物，或者是其他可用于蛋白质、核酸定性检测的试剂。所述抗性是指非生物胁迫抗性，包括高盐或干旱。
[0016] 本发明的有益效果是：
[0018] 图1为atpA基因全长cDNA核苷酸序列和推理的氨基酸序列。
[0019] 图2为转基因烟草Kan抗性筛查及驯化移栽，其中：a)侵染后外植体；b)愈伤分化；c)抗性芽分化；d)抗性芽生长；e)转基因烟草生根；f)转基因烟草。
[0020] 图3为转atpA基因烟草DNA水平PCR鉴定，PCR模板分别为：Water：水，P：质粒，N-t：非转基因烟草DNA，1-23：各转基因株系DNA。
[0021] 图4为转atpA基因烟草RNA水平qRT-PCR鉴定。
[0023] 图6为转基因与对照(WT)株系在不同浓度NaCl胁迫下籽苗生长状态比较。
[0025] 图8为叶绿素荧光成像观察盆栽植株抗盐能力。
[0026] 图9为叶绿素荧光成像观察盆栽植株耐干旱能力。
具体实施方式
[0027] 为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
[0028] 本发明所用到的番茄纯和材料09888-6由东北农业大学园艺园林学院番茄研究所赠与。
[0029] 实施例1 atpA基因的克隆
[0030] 以番茄叶绿体基因组的atpA基因为模板设计特异性引物，序列如下所示：
[0031] F：5’-ATGGTAACCATTCGAGCTGACG-3’(SEQ ID NO.3)；
[0032] R：5’-TTATGCTTGTTCCTGAAGTATAAAACG-3’(SEQ ID NO.4)
[0033] 番茄纯和材料09888-6为模板，利用特异性引物，采用RT-PCR技术，从番茄总RNA中扩增得到本研究atpA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0034] 经对比发现，本发明克隆到的atpA基因与Genbank上公布的番茄atpA基因(序列号为：AC_000188相比，第674位碱基由T变为C，其编码第225位氨基酸的碱基从GTA(Val V亮氨酸)变为GCA(Ala A丙氨酸)，具体见图1。
[0035] 实施例2 atpA基因的功能认证
[0036] 1、转基因烟草株系的制备
[0037] 将切好的烟草叶盘放入制备好的具有较高侵染能力的脓杆菌菌液(含有atpA基因过量表达质粒)中，20min震荡侵染完成后，将叶盘背面向上平铺在培养基上，共培养48h后转移到含有SM及Kan抗性的愈伤和芽诱导培养基上，两周后叶盘的切口边缘长出抗性愈伤组织或芽，以后10天更换一次芽诱导培养基，芽长到5cm时，切除大块愈伤，将芽转移至生根培养基中进行生根培养。待植株根系生长繁茂，可移栽到土中驯化，洗掉植株根部的琼脂，移栽至湿润无菌土壤，喷水保湿。转化过程如图2所示。
[0038] 在DNA水平上，利用PCR技术筛选转基因烟草阳性植株，采用改良的SDS法提取各个株系叶片总DNA，根据质粒上35s序列设计引物，共801bp，选取经PCR鉴定转基因烟草呈阳性的植株，如图3所示。
[0039] Trizol法提取获得所有在DNA水平上检测呈阳性的转基因烟草植株的RNA，测定每个样品RNA浓度，经过反转录获得相应cDNA模板，qRT-PCR检测各个植株atpA基因表达量，如图4所示。
[0040] 2、转基因烟草抗高盐胁迫能力增强
[0041] (1)转基因株系在盐胁迫下萌发早，萌发率高
[0042] WT、OE17、OE21、OE30四个株系分别种植于1/2MS培养基、含有150mM NaCl的1/2MS培养基、含有250mM NaCl的1/2MS培养基上(种子种植方法同2.4.2.2)，9天之后，拍照记录四个株系种子萌发情况，并调查15天内四个株系种子的发芽势(每个培养皿内种植20个种子、每个株系在每个NaCl浓度梯度上各种植三个培养皿，三次生物学重复)。转基因株系(OE17、OE21、OE30)与野生株系(WT)种子在含不同NaCl浓度培养基中萌发率分析表明，转基因株系在盐胁迫下萌发早，萌发率高(图5)。
[0043] 表1不同浓度NaCl处理下，15天内，各烟草种子萌发率
[0044]
[0045] (2)转基因烟草籽苗抗高盐胁迫能力增强。
[0046] 种植于1/2MS培养基中的WT、OE17、OE21、OE30四个株系种子，生长7天之后转移至含有0，150，250mM NaCl的1/2MS培养基中继续生长7天之，发现转基因株系与WT籽苗之间生长状态差异显著，由图6可以明显看出，在不含NaCl的1/2MS培养基中四个株系籽苗长势基本一致；在含有150mM NaCl的1/2MS培养基中，与转基因籽苗相比，WT籽苗的根长和子叶的生长均遭到抑制，具体表现为根长较短，子叶较小且有变黄现象；在含有250mM NaCl的1/2MS培养基中，高浓度NaCl对四个株系籽苗都存在不同程度的抑制作用，但是WT籽苗受NaCl胁迫伤害的程度要远远高于对照，表现为植株较矮小且子叶变黄。并且在盐胁迫后，转基因植株的根长和鲜重显著高于野生型，尤其是250mM NaCl处理。
[0047] (3)水培转基因烟草幼苗抗高盐胁迫能力增强。
[0048] 四个株系种子种植于1/2MS培养基中的，生长三周后移入1/2Hoagland培养液中培养，待幼苗长至四片真叶期转移至分别含有0，150，250mM NaCl的1/2Hoagland培养液中，随时观察幼苗表形变化，结果表明，在盐胁迫36h时，在含150mM NaCl的培养液中，WT与转基因株系生长状态存在差异，主要表现为WT株系出现变黄现象，苗体略微倾斜；含有250mM NaCl的培养液中转基因株系与WT相比生长状态差距较大，与转基因株系相比，WT株系枯黄萎蔫严重，产生严重倒伏现象(图7)。
[0049] 用250mM NaCl浇灌生长50天盆栽烟草，持续5天后，检测各个株系抗盐能力及高盐胁迫对各个株系光合作用的影响。荧光成像技术分析盐胁迫后叶绿素荧光强弱，结果表明，随着收到NaCl胁迫的发生，转基因株系与WT相比表现出更强的荧光(图8)，并且WT株系部分严重萎蔫叶片在YII荧光下，没有成像显示。由此可见，转基因烟草高盐胁迫下萎蔫程度减轻，并且具有较高的光合作用活性。
[0050] 3、转基因烟草抗干旱胁迫能力增强
[0051] 转基因烟草干旱胁迫下萎蔫程度减轻，并且具有较高的光合作用活性。
[0052] 长50天盆栽烟草，停止浇水6天后，检测各个株系抗干旱能力及干旱胁迫对各个株系光合作用的影响。结果表明，在干旱胁迫6天以后，WT盆栽植株出现大面积叶片黄化倒伏现象，相比之下，转基因植株黄化现象相对较少且倒伏较轻。荧光成像技术分析干旱胁迫后叶绿素荧光强弱，结果表明，随着干旱胁迫的发生，转基因株系与WT相比表现出更强的荧光(图9)，并且WT株系部分严重萎蔫叶片在YII荧光下，没有成像显示。
[0053] 以上实验结果表明，本发明克隆到的atpA基因具有提高植物抗非生物胁迫的功能，可以为植物抗高盐和干旱研究提供新的思路。
[0054] 以上实施例仅用于对本发明技术方案进行说明，但并不局限于此。本领域技术人员可以理解，除了可将atpA基因导入烟草中，提高烟草的非生物胁迫抗性外，还可以将其导入其他受体植物尤其是茄科植物中，以提高受体植物的非生物胁迫抗性。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种无土栽培营养液管控方法及系统 | 2020-05-12 | 570 |
| 一种富含γ-氨基丁酸的小麦芽茶的生产方法 | 2020-05-13 | 382 |
| 一种大豆菏豆12GmRBOH1基因盐诱导启动子及其应用 | 2020-05-13 | 180 |
| 引发剂衍生肽及其用途 | 2020-05-13 | 373 |
| 重度苏打盐碱地旱作农业土壤改良剂 | 2020-05-08 | 779 |
| 一种胡萝卜ABA应答元件结合蛋白基因DcABF3的序列及其应用 | 2020-05-13 | 140 |
| 唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白基因NtVP1、其编码蛋白、克隆方法 | 2020-05-12 | 375 |
| 一种用于棚室种植的微生物制剂及其应用 | 2020-05-08 | 427 |
| 大麦条纹病致病性基因Pgmiox及其应用 | 2020-05-11 | 129 |
| 一种细叶百合基因LpNAC6的克隆及其应用 | 2020-05-13 | 71 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
盐胁迫热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈