厚藤脱水素基因IpDHN及其编码蛋白和应用
阅读：1023发布：2020-07-17
专利汇可以提供厚藤脱水素基因IpDHN及其编码蛋白和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了厚藤 盐胁迫 应答相关基因IpDHN，其编码的 氨 基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其cDNA阅读框序列如SEQ ID NO.2所示。本发明IpDHN基因编码的 蛋白质 IpDHN与提高酿酒 酵母 、大肠杆菌和 植物 的耐盐耐旱性相关。通过构建IpDHN基因的酵母、大肠杆菌和植物转基因超表达载体，将IpDHN基因在酵母、大肠杆菌和拟南芥中超表达，可以提高酵母、大肠杆菌和拟南芥对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性。该基因可应用于工程菌及植物针对高盐干旱胁迫的遗传工程育种，具有很大的应用价值。，下面是厚藤脱水素基因IpDHN及其编码蛋白和应用专利的具体信息内容。
1.氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的厚藤脱水素蛋白IpDHN和/或IpDHN基因在提高农作物对高盐/干旱的耐受中的应用，所述IpDHN基因的cDNA阅读框为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的厚藤脱水素蛋白的核苷酸序列。
2.氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的厚藤脱水素蛋白IpDHN和/或IpDHN基因在农作物转基因育种中改良农作物对高盐/干旱耐受性、和/或调控农作物对氧化胁迫耐受性的应用，所述厚藤脱水素蛋白基因IpDHN的cDNA阅读框为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的厚藤脱水素蛋白的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征为，所述农作物为拟南芥。
4.插入有IpDHN基因的酿酒酵母重组表达载体，其特征为，所述IpDHN基因的cDNA为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或编码为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的厚藤IpDHN蛋白的核苷酸序列。
5.权利要求4所述的酿酒酵母重组表达载体在提高工程菌株酿酒酵母对高盐和氧化胁迫的耐受性中的应用。
6.插入有IpDHN基因的大肠杆菌表达载体，其特征为，所述IpDHN基因的cDNA阅读框为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的厚藤IpDHN蛋白的核苷酸序列。
7.权利要求6大肠杆菌重组表达载体在提高工程菌大肠杆菌对高盐和干旱胁迫耐受性中的应用。
8.一种提高拟南芥耐盐和/或抗旱性的生物制剂，其特征为，其活性成份来源于权利要求4所述酿酒酵母重组表达载体或权利要求6所述大肠杆菌表达载体，或其活性成份含有调控厚藤IpDHN基因表达的生物制品，所述厚藤IpDHN基因的cDNA阅读框为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或所述IpMT基因为编码序列氨基酸序列如SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
9.一种提高拟南芥的耐盐和/或抗旱性的方法，其特征为，包括以下步骤：
(1)获得厚藤脱水素蛋白基因IpDHN的cDNA全长，其cDNA阅读框序列如SEQ ID NO.2所示；
(2)将含有IpDHN的cDNA全长的酵母表达载体pYES-DEST52重组质粒转化野生型酵母菌株W303，分别在含盐量5％-8.8％的培养基上测试转基因酵母的耐盐性；
(3)以含有厚藤脱水素蛋白基因cDNA的酵母表达载体pYES-DEST52重组质粒为模板，以引物分别扩增IpDHN基因的cDNA全长阅读框序列，用于获取插入至大肠杆菌蛋白表达载体pGEX 6p-1的cDNA阅读框片段；
并将得到的目的DNA片段进行回收，连接于大肠杆菌蛋白表达载体pGEX 6p-1上，形成重组载体IpDHN-pGEX 6p-1；
(4)将所述重组载体IpDHN-pGEX 6p-1转化进入大肠杆菌BL21感受态菌株中，诱导IpDHN基因在大肠杆菌中的超表达；
(5)以含有厚藤脱水素蛋白基因cDNA的酵母表达载体pYES-DEST52重组质粒为模板，以引物扩增IpDHN基因的cDNA全长阅读框序列，用于获取插入至拟南芥转基因超表达载体pMD1的cDNA阅读框片段，用于构建厚藤脱水素蛋白基因转基因超表达重组载体IpDHN-pMD1；
将上述厚藤脱水素蛋白转基因超表达重组载体IpDHN-pMD1转化进入农杆菌GV3101感受态菌株中，通过拟南芥花序侵染法转化拟南芥植株，通过Kan抗性筛选获得拟南芥后代转基因后代。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征为，步骤(3)中的引物为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，和/或步骤(5)中的引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。
厚藤脱水素基因IpDHN及其编码蛋白和应用
技术领域
背景技术
[0002] 植物在其生长周期中，通常会遭受多种逆境胁迫，包括盐碱、干旱、水淹、冷冻、病虫害等，其中，非生物胁迫是影响植物生长、造成农作物减产的主要原因之一。在各种非生物胁迫中，高盐/干旱是最常见的失水胁迫，主要通过限制植物对水分的吸收，造成植物细胞内水分的丧失，从而影响植物正常的生理活动，并进一步抑制植物的生长。伴随着全球气候恶化、极端气候频发和世界人口持续增长导致的未来粮食安全需求，科学家正积极研究和开发农作物高抗逆的品种，而通过农作物的转基因育种正是应对这一问题的重要措施之一。这就需要挖掘具有提高作物抗逆性潜力的优异遗传资源和功能基因，而在这一过程中，可选择一些具有较高抗逆性、适应极端环境气候的植物进行深入研究，通过克隆高抗逆性野生植物资源的抗逆功能基因，并进一步挖掘该类基因的应用潜力。我国沿海地区地域辽阔，地理环境复杂，气候类型多样，农作物种质资源特别是抗旱、耐盐碱等优异性状的种质资源极其丰富。开展沿海地区抗旱耐盐碱农作物种质资源调查，并进一步筛选抗旱耐盐碱优异资源是抵御干旱、盐碱等极端自然灾害的有效途径，对抗旱耐盐新品种培育及我国粮食安全具有重要意义。
[0003] 厚藤是一种泛热带性分布型盐生植物(halophyte)，其耐盐耐旱性强、生长迅速，是一种抗逆性极佳的多年生藤本植物。厚藤主要生长于海滩上，是典型的沙砾海滩植物，它同时是沙砾不毛之地防风定沙第一线植物，可改变沙地微环境以利其他植物生长，具有美化海岸及定沙的功能。此外，厚藤花姿优美、花色艳丽，被称为“海滩花后”，同时也是一种常用的民间草药，因此还具有一定的园林价值和药用价值。
[0004] 脱水素(dehydrin，DHN)又称为第二类胚胎发育后期丰富蛋白(Late Embryogensis Abundant Proteins，LEA蛋白)，属于LEA-Ⅱ家族，是植物体内的一种具有高度热稳定性和亲水性的小分子蛋白，能够在植物处于失水状况下(如高盐、干旱以及冷冻)等逆境条件下大量表达，其在逆境下表达的强弱与植物抗逆能力有密切联系。多项研究表明，脱水素基因的表达与植物的耐盐性及抗旱性有着密切的关系。目前，人们在很多植物中克隆到脱水素基因，而多项植物转基因实验证明，过表达不同脱水素基因后可提高转基因植株的抗逆性。由于脱水素基因种类较多，根据结构上的差异，脱水素基因可以分为5大类，分别为：Kn，SKn，KnS，YnSKm，YnKm。不同类脱水素基因功能各异，加上脱水素基因在体内的实际功能还不十分清楚，因此有关脱水素基因的研究还有许多工作有待研究。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种耐盐、耐旱植物功能性蛋白——厚藤脱水素IpDHN及其应用。我们发现一个代表脱水素基因的克隆能够提高酵母菌株的耐盐性，本发明并克隆了该脱水素基因，功能研究表明，该基因可提高生物体的耐盐和抗旱能力。
[0006] 氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的厚藤脱水素蛋白IpDHN和/或IpDHN基因在提高植物对高盐/干旱的耐受中的应用，所述IpDHN基因的cDNA为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的厚藤脱水素蛋白的核苷酸序列。
[0007] 氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的厚藤脱水素蛋白IpDHN和/或IpDHN基因在农作物转基因育种中改良农作物对高盐/干旱耐受性、和/或调控农作物对氧化胁迫耐受性的应用，所述厚藤脱水素基因IpDHN的cDNA为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的厚藤脱水素蛋白的核苷酸序列。
[0008] 所述厚藤脱水素蛋白IpDHN，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因IpDHN的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。应当理解，考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本发明的保护范围内。
[0009] 本发明的另一目的是公开一组厚藤脱水素IpDHN蛋白重组表达载体及其应用，该重组载体插入了IpDHN基因。将该重组载体转化进入酿酒酵母中，通过半乳糖诱导该基因在酵母中的超表达，能够在高盐和过氧化氢胁迫处理下，提高酵母对盐胁迫和氧化胁迫的耐受性。
[0010] 同时，公开构建厚藤IpDHN蛋白重组原核表达载体及其运用，该重组载体插入了IpDHN基因，将该载体转化进入大肠杆菌BL21菌株中，通过IPTG诱导该基因在大肠杆菌中的超表达，证明IpDHN基因能够提高工程菌大肠杆菌的耐盐和耐旱性。
[0011] 实现上述目的的技术方案如下：
[0012] 插入有IpDHN基因的酿酒酵母重组表达载体，所述IpDHN基因的cDNA为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或编码为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的厚藤IpDHN蛋白的核苷酸序列。
[0013] 上述酿酒酵母重组表达载体在提高工程菌株酿酒酵母对高盐和氧化胁迫的耐受性中的应用。
[0014] 插入有IpDHN基因的大肠杆菌表达载体，所述IpDHN基因的cDNA为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的厚藤IpDHN蛋白的核苷酸序列。
[0015] 上述大肠杆菌重组表达载体在提高工程菌大肠杆菌对高盐和干旱胁迫耐受性中的应用。
[0016] 此外，本发明的另一目的是公开了厚藤脱水素基因IpDHN在模式植物拟南芥中的超表达载体及其应用，该重组载体通过农杆菌介导的花序侵染法对拟南芥进行转基因，能够提高拟南芥的耐盐和抗旱性。
[0017] 实现上述目的的技术方案如下：
[0018] 本发明以厚藤幼苗为材料，提取RNA，并将RNA逆转录成cDNA，并将cDNA分别以pDONR222和pYES-DEST52为目标载体，采用 技术(Invitrogen)构建cDNA表达文库，并将文库质粒转化酵母对盐敏感的突变株AXT3，挑取耐盐酵母克隆，并提取质粒，对质粒进行测序，通过序列分析(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，获得厚藤脱水素基因IpDHN的cDNA全长，其序列如SEQ ID NO.2所示；
[0019] 将含有IpDHN的cDNA全长的酵母表达载体pYES-DEST52重组质粒转化野生型酵母菌株W303，以转化酵母表达载体pYES2空载体的W303为对照，分别在含盐量5％，7.5％和8.8％的培养基上测试转基因酵母的耐盐性；
[0020] 以含有厚藤脱水素基因cDNA的酵母表达载体pYES-DEST52重组质粒为模板，设计以下引物分别扩增IpDHN基因的cDNA全长阅读框序列，用于获取插入至大肠杆菌蛋白表达载体pGEX6p-1的cDNA阅读框片段。引物如SEQ ID NO.3(IpDHNEEF:5’-GGGGCCCCTGGGATCCATGGCGGAGGAGTGCCACCA-3’)和SEQ ID NO.4(IpDHNEER:5’-GGAATTCCGGGGATCC TTAATGGCATTCCCCACCCT-3’)所示；
[0021] 以上PCR采用高保真的Taq酶进行扩增，并将得到的目的DNA片段进行回收，连接于大肠杆菌蛋白表达载体pGEX 6p-1上(BamHI切点)，形成重组载体IpDHN-pGEX 6p-1，并测序。
[0022] 采用CaCl2的方法将上述厚藤脱水素大肠杆菌蛋白表达重组载体转化进入大肠杆菌BL21感受态菌株中，通过添加0.2mM的IPTG诱导IpDHN基因在大肠杆菌中的超表达。之后检测表达有厚藤脱水素蛋白的大肠杆菌的耐盐性和抗旱性；
[0023] 以含有厚藤脱水素基因cDNA的酵母表达载体pYES-DEST52重组质粒为模板，设计以下引物分别扩增IpDHN基因的cDNA全长阅读框序列，用于获取插入至拟南芥转基因超表达载体pMD1的cDNA阅读框片段，用于构建厚藤脱水素基因转基因超表达重组载体IpDHN-pMD1，插入位点为BamHI切点。引物如SEQ ID NO.5(IpDHNOXF:5’-GGACTCTAGAGGATCCATGGCGGAGGAGTGCCACCA-3’)和SEQ ID NO.6(IpDHNOXR:5’-GTCGACCCGGGGATCTTAATGGCATTCCCCACCC-3’)所示。
[0024] 采用CaCl2的方法将上述厚藤脱水素转基因超表达重组载体IpDHN-pMD1转化进入农杆菌GV3101感受态菌株中，通过拟南芥花序侵染法转化拟南芥植株，通过Kan抗性筛选获得转基因后代，对转基因超表达厚藤脱水素基因的拟南芥后代进行耐盐性和抗旱性检测。
[0025] 在本发明中，我们公开了厚藤体内的一个脱水素基因，该基因IpDHN的表达能够提高酵母菌对盐和氧化胁迫的耐受性，提供了将该基因应用于工程菌酿酒酵母的耐盐和抗氧化遗传改良的应用；IpDHN在大肠杆菌中的表达能够提高工程菌大肠杆菌对高盐和干旱的耐受性，提供了将该基因用于包括大肠杆菌在内的工程菌耐盐和耐脱水的遗传改良方面的应用。本发明也简单阐述了可将该基因应用于植物的遗传改造，培育用于提高耐盐/耐旱性的转基因转基因植物。
[0026] 本发明的有益效果如下：
[0027] 在本发明中，我们通过cDNA文库筛选获得的厚藤脱水素IpDHN基因的进行应用性探索，发现该基因以下应用方式：(1)该基因在酿酒酵母中的超量表达能够提高酵母对高盐和氧化胁迫的耐受性；(2)通过诱导厚藤脱水素蛋白在大肠杆菌中表达后，能够提高大肠杆菌的耐盐性和耐旱性；(3)该基因在拟南芥中的超量表达能够提高转基因拟南芥对高盐和干旱胁迫的耐受性。
[0029] 图1示酿酒酵母重组表达载体IpDHN-pYES-DEST 52示意图。
[0030] 图2示转化IpDHN-pYES-DEST 52的转基因酵母对盐敏感的突变株AXT3对盐胁迫的耐受性提高。
[0031] 图3示转化IpDHN-pYES-DEST 52的转基因野生型酵母W303对盐胁迫的耐受性提高。
[0032] 图4示转化IpDHN-pYES-DEST 52的转基因酵母对H2O2敏感的突变株yap1Δ(A)和skn7Δ(B)对氧化胁迫的耐受性提高。
[0033] 图5示大肠杆菌重组蛋白表达载体IpDHN-pGEX 6p-1示意图。
[0034] 图6示转化IpDHN-pGEX 6p-1的转基因大肠杆菌对高盐(A)和脱水(B)胁迫的耐受性提高。图7示模式植物拟南芥转基因超表达载体IpDHN-pMD1示意图。
具体实施方式
[0035] 为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
[0036] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
[0037] 除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0038] 实施例1：通过厚藤cDNA酵母表达文库筛选获得厚藤脱水素基因IpDHN的cDNA全长[0039] 1.1厚藤全长cDNA表达文库的构建
[0040] 厚藤cDNA文库的构建主要参考CloneMiner II cDNA Library Construction Kit的说明书，采用 (Invitrogen)技术进行。具体包括以下步骤：总RNA提取、mRNA的分离、cDNA初级文库的构建和cDNA次级文库的构建。各步骤主要概述如下：
[0041] (1)总RNA提取
[0042] 取2g等量的厚藤叶片、叶芽、藤及幼根，在预冷的研钵中用液氮研磨成粉末，将粉末适量移至多个RNase-free的1.5mL离心管中，每个离心管加入1mL Trizol Reagent，迅速震荡混匀，并按照试剂说明书操作，获得厚藤不同组织的总RNA混合样。将干燥后的总RNA溶于100μL RNase-free的水中。用紫外分光光度计和1％的琼脂糖凝胶电泳测定总RNA的浓度和质量。
[0043] (2)mRNA的分离
[0044] 取大于500μg的厚藤总RNA，按照FastTrack MAG mRNA isolation Kit说明书分离纯化mRNA，用紫外分光光度法测定mRNA浓度，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。
[0045] (3)cDNA初级文库的构建
[0046] 取约3μg的厚藤mRNA，加入RNase-free的水至总体积为9μL；然后加入biotin-attB2-Oligo(dT)Primer(30pM)1uL和dNTPs(10mM each)1uL混匀，70℃5min，45℃孵育2min；加入SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR的5×First Strand Buffer 4μL和DTT(0.1M)2μL，最后加入3μL的SuperScript III逆转录酶至中反应体积为20μL，混匀后置于PCR仪上反应45℃20min；50℃20min；55℃20min。以上步骤为合成cDNA第一链。
[0047] 在cDNA第一链反应液中依次加入E.coli DNA Ligase，E.coli DNA Polymerase I，E.coli RNaseH和T4DNA Polymerase等合成第二链，此时即获得厚藤双链cDNA。将双链cDNA纯化后与attB1重组接头连接，连接好接头的厚藤双链cDNA使用CloneMiner II cDNA Library Construction Kit的分级分离层析柱，去除分子量小于500bp的小片段cDNA，保留大于500bp的cDNA片段用于后续的cDNA文库的构建。
[0048] 参照CloneMiner II cDNA Library Construction Kit的说明书进行BP重组反应构建cDNA初级文库。具体步骤包括：在洁净的PCR管中依次添加cDNA(100ng/μL)13μL，pDONR222(250ng/μL)2μL，BP II enzyme mix 5μL至总体积20μL，混合均匀后，置于25℃下进行BP重组反应16～20h。通过电穿孔仪将纯化后的BP重组反应产物导入大肠杆菌DH10B感受态细胞中，电击后迅速向电转杯中加入2ml SOC培养基，经预培养后，即为初级文库菌液。
[0049] (4)cDNA次级文库的构建
[0050] 采用LR重组反应进行cDNA次级文库的构建，具体步骤包括：初级文库用LB培养基扩增培养后，然后用PureLinkTM HQ Mini Plasmid DNA Purification Kit提取质粒。初级cDNA文库质粒使用适量的TE溶解，并采用紫外分光光度法测定浓度。将初级文库质粒浓度调整至300ng/μL，取1μL文库质粒依次加入pYES-DEST 52(300ng/uL)1μL，LR Clonase II Mix 1μL，补加双蒸水12μL至总体积20μL。置于25℃下进行LR重组反应16～20h。之后使用电穿孔仪将纯化后的LR重组反应产物导入大肠杆菌DH10B感受态细胞中，电击后迅速向电转杯中加入2mL SOC培养基，经预培养后，即为次级文库菌液。
[0051] 1.2厚藤cDNA文库的筛选
[0052] 厚藤cDNA文库的筛选采用质粒文库转化酵母盐敏感的突变株AXT3的方法。AXT3在含有75mM的NaCl的培养基上无法生长，而野生型酵母则可以正常生长。AXT3经转化酵母质粒文库后，涂布于含有75mM的NaCl的培养基上，经30℃培养3至7天，可得到若干个可以恢复对盐敏感的酵母克隆。对这些克隆扩增培养并提取质粒，即可获得多个厚藤耐盐基因，其中一个为编码厚藤脱水素IpDHN的cDNA全长序列。详细步骤如下：
[0053] (1)厚藤cDNA文库质粒的获取
[0054] 文库质粒的获取采用固体LB培养基平板扩增法，即根据文库的总克隆数，将厚藤次级文库菌液涂布于100个含有Amp抗生素14cm的LB平板上过夜37℃培养，确保文库的每个克隆都得到了等量的扩增。待长出菌落后，加液体LB培养基洗脱，碱裂解法提取质粒。
[0055] (2)厚藤cDNA文库质粒转化酵母盐敏感的突变株AXT3
[0056] 调整纯化后的次级文库质粒浓度至1μg/μL，采用乙酸锂法转化酵母对盐敏感的突变株AXT3。挑取酵母单克隆接种于液体YPD培养基中，30℃震荡培养过夜。之后按照1:100的比例将酵母菌液转接于新鲜的液体YPD培养基中，30℃震荡培养至OD600为0.5左右，锂盐溶液重悬，加适量鲑鱼精载体DNA，50％PEG。根据沉淀量稀释菌体，涂布于含有75mM的NaCl的酵母筛选培养基(酵母极限培养基添加腺嘌呤，缺少尿嘧啶)上培养，直至出现转化子。
[0057] 1.3厚藤脱水素基因IpDHN的cDNA全长的获得及序列分析
[0058] 在含有75mM的NaCl的酵母筛选培养基上挑取酵母单克隆，接菌于未添加NaCl的液体筛选培养基中进行扩增培养。离心收集酵母菌体后，按照HiPure Yeast Plasmid Mini Kit的说明书提取酵母质粒。由于酵母质粒含量较低，无法直接进行测序分析，故将酵母质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单克隆扩增培养后，采用碱裂解法提取质粒，进行测序分析。测序由广州艾基生物公司完成。
[0059] 测序后的cDNA核苷酸序列比较、翻译等在DNAStar7.0生物软件上进行，序列同源性分析采用BLAST程序，在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)网站上进行。
[0060] 测序结果表明，其中一个克隆含有编码厚藤脱水素蛋白的cDNA全长，其结构示意图如图1所示。去掉pYES-DEST 52载体序列后，厚藤脱水素蛋白的cDNA阅读框全长序列为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，其最长阅读框为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的厚藤IpDHN蛋白。
[0061] SEQ ID NO.1
[0062] 氨基酸序列
[0063] >IpDHN protein
[0064] MAEECHHNQKPAEEQVAVKAEDKGLLDFLGKKEEEKKPHCAEEEAISGEFGEKVHVSEPPHGVEYKEEKIKLHRSSSSSSSSSEEEYEEDGVIKKKKKEKKGLKEKIKEKLSGESKEEQKGEVDTSVPVEKCEDEEPEEKKGFLDKIKEKLPGGGHKKAEEEVPAPPPPAPAAPAAEHLEGEPKKGFLDKIKEKLPGYHPKTEEEKGIEKEKGGECH[0065] cDNA序列(涂阴影划线部分为cDNA阅读框SEQ ID NO.2，上游为5’非翻译区，下游为3’非翻译区)
[0066] >IpDHN cDNA
[0067]ACATATATTGATTGTATTGACTGTTAAGGTATTGTTGGTATCAATCTTTTCATAATTTTCTCCTTTTTTGTTGAGTGATTGTGCC
GAAAGCTATGCATGCTGGGGGTTGCCATGATTGTGCTGTTTCTTTGATGGTCATTATTGTTATTATTATTTGTACCTTTTGCTTTTTTGCTTTGTTTGCTTTGCTTTGTTCTGTTTAATTCCCTTCGCTTTTGTATTTTTGATGATGAAGGATATATGGTTTGCTGTAAGTACTTTATGTGCTTAATATATATCACCAATATTTATAAGATACTCTTTTAATTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。
GAAAGCTATGCATGCTGGGGGTTGCCATGATTGTGCTGTTTCTTTGATGGTCATTATTGTTATTATTATTTGTACCTTTTGCTTTTTTGCTTTGTTTGCTTTGCTTTGTTCTGTTTAATTCCCTTCGCTTTTGTATTTTTGATGATGAAGGATATATGGTTTGCTGTAAGTACTTTATGTGCTTAATATATATCACCAATATTTATAAGATACTCTTTTAATTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。
[0068] 实施例2：IpDHN基因在酵母中超表达提高酵母的耐盐性和对氧化胁迫的耐受性[0069] 2.1IpDHN-pYES-DEST 52转化酵母菌株
[0070] 将测序结果得到验证的IpDHN-pYES-DEST 52重组质粒调整浓度至0.1μg/μL，采用乙酸锂法的方法分别转化酵母对盐敏感的突变株AXT3和对应的野生型酵母株系W303，以及转化酵母对H2O2敏感的突变株yap1Δ和skn7Δ和对应的野生型酵母株系WT。同时采用酵母表达载体空载体pYES2做对照，分别转化上述酵母株系。
[0071] 2.2IpDHN基因在酵母盐敏感突变株AXT3和野生型菌株W303中表达均可以提高转基因酵母的耐盐性
[0072] 挑取酵母菌株AXT3转化空载体pYES2和IpDHN基因超表达载体IpDHN-pYES-DEST 52的单克隆，接种于2ml添加了半乳糖的酵母极限液体培养基中，30℃恒温摇床(200rpm)培养至菌液OD600值达2。按照1:1、1:10、1:100、1:1000将菌液进行逐级稀释，分别吸取2μl逐级稀释的菌液滴至添加有50mM，75mM和200mM NaCl的酵母极限固体培养基平板上。30℃培养7天，观察酵母生长情况。
[0073] 如图2所示，超表达IpDHN基因的转基因酵母相比较于转化空载体pYES2的AXT3酵母突变株而言，能够在添加50mM和75mM NaCl的培养基平板上生长，而在添加200mM NaCl的培养基平板上也可以轻微生长；而未表达厚藤脱水素蛋白IpDHN的酵母(转化空载体pYES2)则不能生长，表明IpDHN基因在酵母中的表达能够提高酵母盐敏感突变株AXT3对盐胁迫的耐受性。
[0074] 同时，挑取野生型酵母株系W303转化空载体pYES2和IpDHN基因超表达载体IpDHN-pYE S-DEST 52的单克隆，按照上述方法进行液体培养基培养，并逐级稀释后滴至添加有5％，7.5％和8.8％(均为质量体积比)NaCl的酵母极限固体培养基平板上。30℃培养7天，观察酵母生长情况。
[0075] 如图3所示，超表达IpDHN基因的转基因酵母相比较于转化空载体pYES2的W303酵母突变株而言，能够在添加5％和7.5％NaCl的培养基平板上生长，且生长状况良好，而在添加8.8％NaCl的培养基平板上也可以轻微生长；而未表达厚藤脱水素蛋白IpDHN的酵母(转化空载体pYES2)则不能生长，表明IpDHN基因在酵母中的表达能够提高野生型酵母株系W303对盐胁迫的耐受性。
[0076] 2.3IpDHN基因在酵母对H2O2敏感突变株yap1Δ和skn7Δ中表达均可以提高转基因酵母对氧化胁迫的耐受性
[0077] 挑取酵母对H2O2敏感突变株yap1Δ和skn7Δ转化空载体pYES2和IpDHN基因超表达载体IpDHN-pYES-DEST 52的单克隆，同时也挑取野生型酵母WT转化空载体pYES2的单克隆作为对照，将上述克隆分别接种于2ml添加了半乳糖的酵母极限液体培养基中，30℃恒温摇床(200rpm)培养至菌液OD600值达2。按照1:1、1:10、1:100、1:1000将菌液进行逐级稀释，分别吸取2μl逐级稀释的菌液滴至添加有0.75mM的H2O2的酵母极限固体培养基平板上。30℃培养7天，观察酵母生长情况。
[0078] 如图4所示，超表达IpDHN基因的转基因酵母相比较于转化空载体pYES2的yap1Δ酵母突变株而言，能够在添加0.75mM H2O2的培养基平板上生长；而未表达厚藤脱水素蛋白IpDH N的酵母yap1Δ(转化空载体pYES2)则几乎不能生长(图4A)。同样，超表达IpDHN基因的转基因酵母skn7Δ也能够在添加0.75mM H2O2的培养基平板上生长；而未表达厚藤脱水素蛋白IpDHN的酵母skn7Δ(转化空载体pYES2)则几乎不能生长(图4B)。这些结果表明IpDHN基因在H2O2敏感酵母突变株yap1Δ和skn7Δ中的表达能够提高酵母对氧化胁迫胁迫的耐受性。
[0079] 实施例3：IpDHN基因在大肠杆菌中超表达提高大肠杆菌的耐盐性和耐脱水性[0080] 3.1大肠杆菌重组蛋白表达载体IpDHN-pGEX 6p-1的构建
[0081] 以含有厚藤脱水素基因cDNA的酵母表达载体pYES-DEST 52重组质粒为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为引物，采用高保真的Taq酶通过PCR扩增IpDHN基因的cDNA阅读框全长。采用的PCR体系参考TaKaRa公司PrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffer说明书。扩增的DNA片段依照Magen公司HiPure Gel Pure DNA Kits说明书。回收得到的片段用于插入至大肠杆菌重组蛋白表达载体pGEX 6p-1中。pGEX 6p-1质粒经BamHI单酶切处理，回收线性化质粒。回收后的IpDHN的cDNA阅读框PCR片段和线性化pGEX 6p-1质粒经Nanodrop公司紫外分光光度计测定浓度，采用TaKaRa(Clontech)公司的 HD Cloning Kit进行DNA片段和载体的同源重组连接。按照说明书的方法将反应产物转化大肠杆菌JM109感受态菌株。挑取单克隆，提取质粒，经测序鉴定为正确的阳性克隆后，保存质粒备用。经测序分析后，IpDHN的cDNA的阅读框核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。构建好的大肠杆菌重组蛋白表达载体IpDHN-pGEX 6p-1如图5所示。
[0082] 3.2厚藤脱水素IpDHN蛋白在大肠杆菌中的诱导表达
[0083] 采用碱裂解法提取IpDHN-pGEX 6p-1重组质粒，并转化进入大肠杆菌BL21感受态菌株中，挑取单克隆至液体LB培养基中，通过添加0.2mM的IPTG诱导IpDHN基因在大肠杆菌中的超表达。
[0084] 3.3表达有厚藤脱水素IpDHN的大肠杆菌的耐盐性检测
[0085] 挑取转化厚藤脱水素蛋白表达载体IpDHN-pGEX 6p-1的大肠杆菌单克隆，以转化pGEX6p-1空载体的大肠杆菌单克隆为对照，分别接种于液体LB培养基中(添加终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素)，在恒温摇床(37℃，200rpm)中培养12小时。之后按照1:100的比例转接于新鲜的液体LB培养基(添加终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素)中，培养2到4小时至OD600值达0.5，之后添加终浓度为0.2mM的IPTG诱导培养2到4小时至OD600值达1。按照1:1、1:10、1:100、1:1000将菌液进行逐级稀释，分别吸取2μl逐级稀释的菌液滴至添加有1％NaCl(对照，145mM NaCl)和4％NaCl(高盐胁迫，680mM NaCl)的LB培养基(培养基中添加终浓度为
0.2mM的IPTG和100μg/ml的氨苄青霉素)上，37℃培养12至24小时，观察大肠杆菌生长情况。
0.2mM的IPTG和100μg/ml的氨苄青霉素)上，37℃培养12至24小时，观察大肠杆菌生长情况。
[0086] 如图6A所示，在添加低浓度NaCl(LB培养基，1％NaCl)的正常生长条件下，转化空载体pGEX 6p-1和表达IpDHN蛋白(转化IpDHN蛋白表达载体IpDHN-pGEX 6p-1)的大肠杆菌的生长状况一致，但在高盐浓度(LB培养基，4％NaCl)的正常生长条件下，转化表达IpDHN蛋白载体(IpDHN蛋白表达载体IpDHN-pGEX 6p-1)的大肠杆菌的生长状况要远远优于仅转化空载体pGEX 6p-1的大肠杆菌，表明厚藤脱水素IpDHN蛋白在大肠杆菌中能够提高大肠杆菌的耐盐性。
[0087] 3.4表达有厚藤脱水素IpDHN的大肠杆菌的耐脱水性检测
[0088] 挑取转化厚藤脱水素蛋白表达载体IpDHN-pGEX 6p-1的大肠杆菌单克隆，以转化pGEX6p-1空载体的大肠杆菌单克隆为对照，分别接种于液体LB培养基中(添加终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素)，在恒温摇床(37℃，200rpm)中培养12小时。之后按照1:100的比例转接于新鲜的液体LB培养基(添加终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素)中，培养2到4小时至OD600值达0.5，之后添加终浓度为0.2mM的IPTG诱导培养2到4小时至OD600值达1。分别取1μL的菌液各六份，三份为对照，另外三份置于37℃干燥培养箱中干燥1小时至菌体完全干燥，之后再加入1mL的新鲜液体培养基恢复培养0.5小时，涂布至LB培养基平板上，对照则直接涂布于LB培养基平板上，37℃培养12至24小时，观察大肠杆菌的克隆数。
[0089] 如图6B所示，未经脱水干燥处理的菌液，对照(转化pGEX 6p-1空载体)和表达IpDHN蛋白的大肠杆菌(转化IpDHN-pGEX 6p-1)1μL原始菌液形成的单克隆菌落(CFU)介于6x106和7x106之间，两者并没有显著性差异。1μL原始菌液经脱水干燥后，表达IpDHN蛋白的大肠杆菌(转化IpDHN-pGEX 6p-1)形成的单克隆菌落数要远远多于仅转化pGEX 6p-1空载体的大肠杆菌，两者有极显著的差异，表明厚藤脱水素IpDHN蛋白在大肠杆菌中能够提高大肠杆菌的耐脱水性(耐旱性)。
[0090] 实施例4：IpDHN基因在拟南芥中超表达提高拟南芥的耐盐性和耐旱性[0091] 4.1拟南芥转基因超表达载体IpDHN-pMD1的构建
[0092] 以含有厚藤脱水素基因cDNA的酵母表达载体pYES-DEST 52重组质粒为模板，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为引物，采用高保真的Taq酶通过PCR扩增IpDHN基因的cDNA阅读框全长。采用的PCR体系参考TaKaRa公司PrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffer说明书。扩增的DNA片段依照Magen公司HiPure Gel Pure DNA Kits说明书。回收得到的片段用于插入至拟南芥转基因超表达载体pMD1中。pMD1质粒经BamHI单酶切处理，回收线性化质粒。回收后的IpDHN的cDNA阅读框PCR片段和线性化pMD1质粒经Nanodrop公司紫外分光光度计测定浓度，采用TaKaRa(Clontech)公司的 HD Cloning Kit进行DNA片段和载体的同源重组连接。按照说明书的方法将反应产物转化大肠杆菌JM109感受态菌株。挑取单克隆，提取质粒，经测序鉴定为正确的阳性克隆后，保存质粒IpDHN-pMD1备用。
[0093] 4.2拟南芥转基因超表达植株的获取
[0094] 采用冻融法将植物转基因超表达载体IpDHN-pMD1转化进入农杆菌GV3101中，得到重组农杆菌。
[0095] 然后利用重组农杆菌，通过花浸泡法(Clough SJ,Bent AF.1998.Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J.16:735-743)将IpDHN基因导入哥伦比亚生态型(Col)拟南芥，得到T1代种子。
[0096] T1代种子收获后在MS培养基(含有50mg/L卡那霉素)中筛选抗性植株，将抗性植株移栽到土中，收获T2代种子。将T2代种子培育为植株(T2代植株)，提取叶片的基因组DNA，用引物对SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6进行PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的植株即为T2代转基因植株。T2代转基因植株自交产生T3代种子，对T3代种子进行卡那霉素抗性筛选，全部具有卡那霉素抗性的即为纯合体。随机选取三个转基因纯合体株系的T3代种子进行耐盐和耐旱性的鉴定。
[0097] 4.3拟南芥转基因超表达植株后代的耐盐性和耐旱性检测
[0098] 随机选取三个转基因植株纯合株系(OX1、OX2、OX3)的T3代种子(每个株系50粒)，以野生型拟南芥(WT)的种子(50粒)为对照，分别进行如下耐盐性鉴定：将各个株系植株的种子同时播种在含有300mM的NaCl的MS培养基平板上，置于22光照培养箱(16小时光照/8小时黑暗)中，萌发6天后，统计萌发率。与野生型相比，转基因超表达IpDHN基因的转基因株系种子的萌发率均高于野生型拟南芥对照的种子，表明转基因超表达IpDHN的拟南芥种子萌发过程能够提高对盐胁迫耐受性。
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