一种互花米草甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶SaGAPDH及其编码基因与应用
阅读：1022发布：2020-07-26
专利汇可以提供一种互花米草甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶SaGAPDH及其编码基因与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种互花米草甘油 醛 ‑3‑ 磷酸 脱氢酶SaGAPDH及其编码基因与应用。该互花米草甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶SaGAPDH，是具有 序列表 中的SEQ ID NO.1所示的 氨 基酸序列的 蛋白质 。其编码基因的开放阅读框具有SEQ ID NO.2所示的DNA序列。SaGAPDH可以催化甘油醛3‑磷酸产生1,3‑二磷酸甘油酸。本发明还揭示了互花米草甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶SaGAPDH的宿主细胞提高 盐胁迫 抗性的方法。，下面是一种互花米草甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶SaGAPDH及其编码基因与应用专利的具体信息内容。
1.一种互花米草甘油醛-3-磷酸脱氢酶SaGAPDH，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的互花米草甘油醛-3-磷酸脱氢酶SaGAPDH基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.含有权利要求2所述的互花米草甘油醛-3-磷酸脱氢酶SaGAPDH基因的重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述载体可使互花米草甘油醛-3-磷酸脱氢酶SaGAPDH在大肠杆菌(Escherichia coli)宿主中进行异源表达。
5.含有权利要求1所述基因或权利要求2所述蛋白的宿主菌。
6.一种制备互花米草甘油醛-3-磷酸脱氢酶SaGAPDH的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用权利要求3的重组表达载体转化宿主细胞大肠杆菌，得到重组表达菌株；
2)培养重组表达菌株，实现重组互花米草甘油醛-3-磷酸脱氢酶SaGAPDH表达；
3)回收并纯化所表达的互花米草甘油醛-3-磷酸脱氢酶SaGAPDH。
7.权利要求1所述互花米草甘油醛-3-磷酸脱氢酶SaGAPDH在提高生物耐盐性中的应用。
一种互花米草甘油醛-3-磷酸脱氢酶SaGAPDH及其编码基因与
应用
技术领域
背景技术
[0002] 甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDHs)是生物体内高度保守的蛋白质。作为糖酵解途径的关键酶之一， GAPDHs在细胞的碳代谢中起着核心作用，是维持生命活动能量形成的最基本酶之一。目前发现，GAPDHs的功能具有多样性，参与细胞内膜分拣、受体介导的信号转导、细胞凋亡等事件，在许多细胞路径中起关键作用。高等植物GAPDH 是糖酵解、糖异生和卡尔文循环过程中的关键酶，同样是多功能酶，并在干旱、盐害等非生物胁迫中起着重要的作用。
[0003] 互花米草(Spartina alterniflora)是多年生草本植物，属于禾本科米草属。由于其秸秆密集粗壮、地下根茎发达，具有保滩护堤、促淤造陆等生态功能。另一方面，互花米草还具有较高的盐适应性，还是研究和发掘耐盐基因及其作用机制的优良材料。因此，开发和利用互花米草耐盐基因具有重要的意义。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种互花米草甘油醛-3-磷酸脱氢酶SaGAPDH，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0005] 本发明的另一目的是提供编码该甘油醛-3-磷酸脱氢酶SaGAPDH编码基因的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0006] 本发明的又一目的是提供甘油醛-3-磷酸脱氢酶SaGAPDH的功能。
[0007] 本发明所提供的甘油醛-3-磷酸脱氢酶SaGAPDH来源于互花米草 (Spartina alterniflora)，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008] 本发明所述的互花米草甘油醛-3-磷酸脱氢酶SaGAPDH的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，含有1014bp的最大开放阅读框，编码SEQ ID NO.1所示的337个氨基酸残基序列。
[0009] 含有本发明如SaGAPDH基因SEQ ID NO.2的原核表达载体。
[0010] 将互花米草甘油醛-3-磷酸脱氢酶SaGAPDH插入E.coli表达载体 pET-28a(+)，获得重组表达载体pET28a-SaGAPDH。将获得的重组表达载体，转化E.coli表达系统，如E.coli BL21(DE3)表达载体，获得可表达互花米草甘油醛-3-磷酸脱氢酶SaGAPDH的E.coli重组表达菌株。
[0011] 有益效果：
[0012] 本发明在互花米草中克隆得到一种甘油醛-3-磷酸脱氢酶SaGAPDH的编码基因，SaGAPDH基因受盐胁迫的诱导表达。表达互花米草甘油醛-3-磷酸脱氢酶SaGAPDH的E.coli重组表达菌株与对照菌株相比，提高了耐盐性。
[0014] 图1是SaGAPDH基因在互花米草在盐胁迫处理下的诱导表达特性。
[0015] 图2是本发明蛋白质SaGAPDH在E.coli BL21(DE3)重组表达菌株中表达后的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图谱。其中：1，含有空载体pET28a(+) 的E.coli BL21(DE3)诱导6h；2，含有重组表达载体pET28a-SaGAPDH的E.coli BL21(DE3)诱导6h；3，蛋白Marker；4，纯化的SaGAPDH蛋白。
[0017] 图4是pH值对甘油醛-3-磷酸脱氢酶SaGAPDH酶活力影响曲线。
[0018] 图5是表达SaGAPDH蛋白重组菌株与对照菌株耐盐性比较。
具体实施方式
[0019] 以下结合具体实施例并附图，进一步阐述本发明。
[0021] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0022] 实施例1、互花米草甘油醛-3-磷酸脱氢酶SaGAPDH编码基因的克隆
[0024] 以从互花米草中提取的RNA反转录获得的cDNA为模板，利用具有序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的核苷酸引物序列，PCR扩增SaGAPDH 基因编码区片段。
[0025] 在紫外灯照射下，切下目标SaGAPDH基因DNA条带。然后采用多功能DNA纯化试剂盒(离心柱型)从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。将回收的DNA 片段连接到pMD19-T载体上，转化E.coli DH5α感受态细胞，经氨苄抗性筛选后挑取单克隆子进行菌落PCR验证。阳性克隆子经测序后，利用Blast软件进行比对分析，结果发现插入的片段与无芒隐子草(Cleistogenes songorica)甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因一致性达到94％。
[0026] SaGAPDH编码基因具有序列表中SEQ ID NO.2的核苷酸序列。自SEQ ID NO.2的5’-端第1-1014位核苷酸为SaGAPDH的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)，自SEQ ID NO.2的5’-端的第1-3位核苷酸为SaGAPDH编码基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO.2的5’-端的第1012-1014位核苷酸为 SaGAPDH编码基因的终止密码子TAG。互花米草甘油醛-3-磷酸脱氢酶 SaGAPDH基因编码一个含有337个氨基酸的蛋白质，具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列，用软件预测到该蛋白质的理论分子量大小为36.4KDa，等电点pI为 8.55。
[0027] 实施例2、互花米草甘油醛-3-磷酸脱氢酶SaGAPDH基因在盐胁迫(氯化钠)下的表达特性
[0028] 以长势一致(4-5叶片)的互花米草盆栽幼苗为材料，进行不同浓度(0、 100、200、400和800mM)的氯化钠处理；在处理后的不同时间点(0、1、2 和3d)分别选取互花米草相同部位的叶片，提取样品的RNA并反转录合成 cDNA。利用实时荧光定量PCR的技术对SaGAPDH基因在氯化钠胁迫下的表达进行研究。实时荧光定量PCR引物的分别具有序列表中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
[0029] 结果分析表明：SaGAPDH基因显著的受氯化钠胁迫的诱导表达。其中， 200mM氯化钠在处理时间2d时，SaGAPDH基因的表达量达到最高。
[0030] 实施例3、互花米草甘油醛-3-磷酸脱氢酶SaGAPDH基因在E.coli中的异源表达[0031] 一、携带SaGAPDH基因E.coli表达系统重组载体的构建
[0032] 以互花米草cDNA为模板，根据序列SEQ ID No.2设计引物，PCR扩增互花米草SaGAPDH基因编码区的DNA序列。引物两端分别引入Nde I和Xho I酶切位点和保护碱基；引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
[0033] 对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带纯化回收，将回收的 DNA片段连接到pMD19-T载体上，转化E.coli DH5α感受态细胞，经氨苄抗性筛选，挑取克隆子进行菌落PCR验证后提取质粒测序，得到含有Nde I和Xho I 酶切位点及编码SaGAPDH基因的质粒pMD19T-SaGAPDH。
[0034] 将质粒pMD19T-SaGAPDH和空载体质粒pET28a(+)分别在30℃条件下用Nde I和Xho I双酶切12h后，酶切产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，回收，用T4DNA连接酶4℃连接过夜。连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取卡那霉素抗性的单克隆，提取质粒，以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8引物进行PCR鉴定，并将PCR鉴定正确的阳性克隆子进行测序鉴定。将测序正确的含有SEQ ID NO.1序列并与6×组氨酸(His)融合的重组载体命名为 pET28a-SaGAPDH。
[0035] 二、重组表达载体pET28a-SaGAPDH转化宿主、阳性克隆鉴定
[0036] 将步骤一中构建的重组表达载体pET28a-SaGAPDH转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，同时将pET28a空载体E.coli BL21(DE3)，作为对照菌。挑取卡那霉素抗性的单克隆，以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8引物进行PCR检测。将菌落PCR验证阳性的克隆子，用于蛋白的诱导表达。
[0037] 三、SaGAPDH基因的原核表达和纯化
[0038] 将步骤二中鉴定正确的克隆培养过夜，再将细菌100倍稀释于含有卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基中培养，待菌液生长至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG(终浓度为0.1mM)进行诱导培养，16℃诱导12h，同时将含有pET28a(+)空载体E.coli BL21(DE3)作为对照菌。取诱导过的菌液1mL，离心收集菌体(4000rpm，10min)，菌体蛋白进行镍柱纯化，并经12％SDS-PAGE电泳检测。结果表明，在IPTG诱导下，含有重组表达载体pET28a-SaGAPDH的 E.coli BL21(DE3)中成功表达了SaGAPDH蛋白，且重组表达的SaGAPDH蛋白表观分子量与理论分子量相近(图2)。
[0039] 实施例4、温度对互花米草甘油醛-3-磷酸脱氢酶SaGAPDH酶活力的影响。
[0040] 酶最适温度测试时的条件为：温度范围为15～50℃、底物为1.2μM D- 甘油醛3-磷酸、4mM氧化型辅酶I(NAD+)、10mM Na3AsO4、3mM二硫苏糖醇、50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)。在不同温度下测定的最高酶活力设置为 100％。
[0041] 如图3所示，互花米草甘油醛-3-磷酸脱氢酶SaGAPDH最适反应温度为37℃。当反应低于37℃时，随着温度的逐渐升高，SaGAPDH的酶活力逐渐增加。在最适反应温度(37℃)条件下，SaGAPDH的酶活力是15℃条件下的 2.3倍。随着反应温度的升高，SaGAPDH的酶活力则有所降低。
[0042] 实施例5、pH值对互花米草甘油醛-3-磷酸脱氢酶SaGAPDH酶活力的影响。
[0043] 酶的最适pH是在不同pH条件下进行分析的，如pH 6.0～9.0(Tris-HCl 缓冲液，50mM)。在不同pH下测定的最高酶活力设置为100％。在不同pH缓冲液处理条件下，SaGAPDH的最适pH为8.5。当pH在6.5～8.5之间时，随着 pH的增加，SaGAPDH的相对酶活力逐渐增大。
而pH在6.0～6.5之间时随着pH 的增加，SaGAPDH的相对酶活力逐渐减小(图4)。
而pH在6.0～6.5之间时随着pH 的增加，SaGAPDH的相对酶活力逐渐减小(图4)。
[0044] 实施例6、表达互花米草甘油醛-3-磷酸脱氢酶SaGAPDH重组大肠杆菌耐盐性分析。
[0045] 根据实施案例2中构建的空载体pET28a(+)和重组表达载体 pET28a-SaGAPDH表达菌株，用0.1mM IPTG诱导培养至OD600＝0.5，并设置不受IPTG诱导的对照。随后将培养的菌体进行梯度稀释(分别设置稀释梯度为0、 1:10,1:100,1:1000,and 1:10000)，并点播5μL在含有对照(171mM NaCl)及 800mM NaCl和800mM KCl的LB固体培养上。随后，将平板放置于37℃继续生长至菌斑出现(12-16h)，结果如图5所示。
[0046] 图5表明，重组表达载体pET28a-SaGAPDH表达菌株相较于空载体 pET28a(+)表达菌株具有较高的盐胁迫耐受性。
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