唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白基因NtVP1、其编码蛋白、克隆方法
阅读：375发布：2020-05-12
专利汇可以提供唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白基因NtVP1、其编码蛋白、克隆方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于分子 生物 学领域，提供了唐古特白刺液泡膜H+‑PPase蛋白基因NtVP1及其编码蛋白，并提供了克隆所述基因的方法和构建包含所述基因的载体的方法。本发明的基因及其编码的蛋白在唐古特白刺抵御 盐胁迫 中起重要作用，为培育 植物 新品种提供新的选择。，下面是唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白基因NtVP1、其编码蛋白、克隆方法专利的具体信息内容。
1.一种唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白基因NtVP1，所述基因的全长cDNA序列如SEQ ID NO:6所示。
2.根据权利要求1所述的唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白基因NtVP1，其中，所述基因的编码区序列如SEQ ID NO:6的第106-2409位所示。
3.一种唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
4.一种克隆唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白基因NtVP1的方法，包括步骤：
1)根据与唐古特白刺有近缘关系的植物的液泡膜H+-PPase蛋白基因的保守区设计简并引物对；
2)以唐古特白刺叶片的总RNA为模板，利用步骤1)的简并引物对通过RT-PCR的方法得到cDNA片段；
3)根据步骤2)所获得的cDNA片段，设计3’RACE和5’RACE引物，通过巢式扩增得到全长cDNA序列。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述简并引物对为NtVP1-F1和NtVP1-R1：
NtVP1-F1：CATTCGCCATTCAGG(SEQ ID NO:1)，
NtVP1-R1：ACATAGCAGCCAAAGT(SEQ ID NO:2)；
其中，步骤2)获得序列如SEQ ID NO:3所示的cDNA片段，其长度为1156bp；
其中，步骤3)中，所述引物序列如下：
UPM：
CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(SEQ ID NO:10)；
3’RACE：TGCCAATCCAGTGGCAATAGTGCTGA(SEQ ID NO:4)；
5’RACE：ACAACTGCTGCCATCGGAAAGGGATT(SEQ ID NO:5)；
其中，获得的全长cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
6.一种表达载体或表达菌株，所述表达载体或表达菌株包含如权利要求1或2所述的唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白基因NtVP1。
7.根据权利要求6所述的表达载体或表达菌株，其中，所述表达载体是带有GFP的载体，所述表达菌株是农杆菌。
8.一种表达载体的构建方法，所述表达载体包含如权利要求1或2所述的唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白基因NtVP1，包括：1)在NtVP1基因的cDNA序列或其编码区序列的两端分别加上Xba I和Kpn I酶切位点，并连接到T载体，形成T-NtVP1载体；2)将T-NtVP1载体，以及pCG-GFP和pSN1301分别用Xba I和Kpn I进行酶切，并回收；3)将从T-NtVP1载体上酶切下来的基因片段与pCG-GFP和pSN1301载体的酶切片段连接。
9.一种将唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白基因NtVP1转染至植物的方法，包括将权利要求6所述的表达载体或表达菌株转化至拟南芥中。
10.如权利要求1或2所述的唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白基因NtVP1在制备或培育转基因植物中的应用。
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唐古特白刺液泡膜H-PPase蛋白基因NtVP1、其编码蛋白、克隆
方法
技术领域
背景技术
[0002] 液泡膜H+转运无机焦磷酸酶(V-H+-PPase)是一种独特的酸化液泡的质子泵，存在于陆生植物和少数藻类、原生动物及细菌中。该酶的主要功能如下：(1)质子泵功能：能够将无机焦磷酸(PPi)水解产生的自由能和H+质子跨膜转运体相耦联，将PPi水解为2个Pi的同时，将细胞质中的H+经液泡膜泵入液泡内，起质子泵的作用，同液泡膜H+-ATPase一起形成H+跨液泡膜电化学梯度，为各种溶质(氨基酸、糖类、阳离子及阴离子等)分子跨液泡膜的主动运输提供驱动力。(2)离子区域化功能：盐胁迫下，植物将细胞质内的大量无机离子区隔化至液泡，是植物抵御盐分的主要策略之一。在各种离子的主动运输过程中，液泡膜和质膜转运蛋白发挥着重要作用，而这种转运蛋白的驱动力，则来自于液泡膜质子泵所建立的H+跨+ +液泡膜电化学梯度。这预示着增加液泡膜质子泵基因的表达，能为液泡膜Na/H 逆向转运蛋白提供更强的驱动力，从而更进一步增强植物的耐盐性。(3)在植物生长发育中的作用：液泡膜H+-PPase与植物生长素的运输有密切关系，二者的相互作用会对植物的生长发育产生影响。(4)参与蔗糖的生物合成：植物体内的蔗糖在蔗糖合成酶和UDPG焦磷酸化酶的作用下，转化为葡萄糖和己糖磷酸盐，而此过程中会有较多的PPi产生，而这些PPi通常都被VHP清除。综合这些研究结果可见，液泡膜VHP在植物抗逆中起重要作用。
[0003] 唐古特白刺(Nitraria tangutorum)隶属于蒺藜科(Zygophyllaceae)白刺属(Nitraria)，是中国特有的盐生植物，主要分布于西北盐渍化荒漠。唐古特白刺根系发达，叶小且肉质化，具有抗风沙、抗干旱和耐盐碱等抗逆能力，是典型的聚盐型(将盐离子聚于液泡中)盐生植物，可在土壤含盐量达2％的地域正常生长，是我国西北荒漠植被的重要建群种之一。众多研究发现，Na+在液泡中的区隔化是植物在高盐胁迫下耐盐的必要环节，本申请人前期已对唐古特白刺中的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因NtNHX1成功克隆并对其表达进行了研究，结果发现NtNHX1基因存在于唐古特白刺的不同器官中且其受NaCl诱导并在盐处理初期其转录水平明显增加，这些结果均暗示NtNHX1基因在唐古特白刺的耐盐中起着重要的作用。如前所述可知，液泡膜H+-PPase质子泵为液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白提供驱动力，因此对唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白基因进行研究对于生产耐盐植物具有重要作用。但现有技术中还没有唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白基因及有关的报道。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白基因及其克隆方法，以解决现有技术中的上述问题。
[0005] 本发明的第一个方面是提供唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白基因NtVP1，上述基因的全长cDNA序列如SEQ ID NO:6所示。
[0006] 进一步地，所述基因的编码区序列如SEQ ID NO:6的第106-2409位所示。
[0007] 本发明的第二个方面是提供唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
[0008] 本发明的第三个方面是提供一种克隆唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白基因NtVP1的方法，包括步骤：
[0009] 1)根据与唐古特白刺有近缘关系的植物的液泡膜H+-PPase蛋白基因的保守区设计简并引物对，优选地，所述简并引物对为NtVP1-F1和NtVP1-R1：
[0010] NtVP1-F1：CATTCGCCATTCAGG(SEQ ID NO:1)，
[0011] NtVP1-R1：ACATAGCAGCCAAAGT(SEQ ID NO:2)；
[0013] 3)根据步骤2)所获得的cDNA片段，设计UPM引物、3’RACE和5’RACE引物，通过巢式扩增得到全长cDNA序列，所述全长cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；优选地，所述引物序列如下：
[0014] UPM(SEQ ID NO:10)：
[0015] CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT；
[0016] 3’RACE：TGCCAATCCAGTGGCAATAGTGCTGA(SEQ ID NO:4)；
[0017] 5’RACE：ACAACTGCTGCCATCGGAAAGGGATT(SEQ ID NO:5)。
[0018] 优选地，所述与唐古特白刺有近缘关系的植物是霸王。
[0019] 本发明的第四个方面是提供一种表达载体或表达菌株，所述表达载体或表达菌株包含SEQ ID NO:6所示的唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白基因NtVP1的cDNA序列或其编码区序列。优选地，所述表达载体是带有GFP基因的载体，所述表达菌株是农杆菌。
[0020] 本发明的第五个方面是提供一种表达载体的构建方法，所述表达载体包含SEQ ID NO:6所示的唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白基因NtVP1的cDNA序列或其编码区序列，包括：1)在NtVP1基因的cDNA序列或其编码区序列的两端分别加上Xba I和Kpn I酶切位点，并连接到T载体，形成T-NtVP1载体；2)将T-NtVP1载体，以及pCG-GFP和pSN1301分别用Xba I和Kpn I进行酶切，并回收；3)将从T-NtVP1载体上酶切下来的基因片段与pCG-GFP和pSN1301载体的酶切片段连接。
[0021] 本发明的第六个方面是提供一种将本发明的唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白基因NtVP1转染至植物的方法，包括将包含SEQ ID NO:6所示的唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白基因NtVP1的cDNA序列或其编码区序列的载体转化至拟南芥中。
[0022] 本发明的第七个方面是提供本发明的唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白基因NtVP1在制备或培育转基因植物中的应用。
[0023] 本发明利用与唐古特白刺亲缘关系较近的不同物种的液泡膜H+-PPase蛋白基因的保守区设计简并引物，利用RT-PCR和RACE方法，首次克隆到唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白基因NtVP1，并对该基因进行了功能分析，以及分别在非盐生环境与高盐胁迫情况下对其转录水平进行研究，从而在分子水平上明确该基因及其编码的酶蛋白在唐古特白刺抵御盐胁迫中的作用，为培育植物新品种提供新的选择。附图说明
[0024] 图1显示了唐古特白刺液泡膜H+-PPase(VP1)的cDNA序列和氨基酸序列。
[0025] 图2显示了不同物种来源的液泡膜H+-PPase(VP1)系统进化树分析图。
[0026] 图3显示了唐古特白刺液泡膜H+-PPase(NtVP1)生物信息学分析图：A、VP1蛋白结构域分析；B、VP1蛋白疏水性分析；C、VP1蛋白跨膜区分析；D、VP1蛋白二级结构预测。
[0027] 图4显示了唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白基因(NtVP1)在不同器官中的qRT-PCR表达分析图；A、不同器官中NtVP1基因的相对表达量；B、NaCl胁迫下唐古特白刺叶片中NtVP1基因的相对表达量。
[0028] 图5显示了pCG-GFP载体结构示意图。
[0029] 图6显示了pSN1301载体结构示意图。
[0030] 图7显示了唐古特白刺NtVP1基因已经连到T载体上的电泳图；其中，Marker为DL2000plus；1-6为6个检测的大肠杆菌克隆，其中2、4、5、6为4个阳性克隆。
[0031] 图8显示了对T-NtVP1载体进行Xba I和Kpn I双酶切后获得NtVP1的基因片段的电泳图。
[0032] 图9显示了对pCG-GFP和pSN1301载体进行Xba I和Kpn I双酶切后获得开环质粒的电泳图。
[0033] 图10显示了用NtVP1基因的特异引物T1和T2，对pCG-35S::NtVP1-GFP以及pSN1301-35S::NtVP1转化的阳性斑进行检测的电泳图。M:表示DL2000plus；左边VP1-pCG为pCG-35S::NtVP1-GFP阳性克隆检测结果；右边VP1-pSN1301为pSN1301-35S::NtVP1阳性克隆检测结果。
[0034] 图11显示了在30mmol/L NaCl胁迫后，T3代拟南芥植株和野生型拟南芥植株的叶绿素、脯氨酸与丙二醛含量及SOD活性的对比图；A、叶绿素含量对比图；B、脯氨酸含量对比图；C、丙二醛含量对比图；D、SOD活性对比图。
具体实施方式
[0035] 本发明通过以下具体实施例进一步说明，但本发明的范围不限于此。如无特殊说明，下述实施例中所使用的试剂、仪器、耗材等均为本领域普通试剂、仪器和耗材，可以从常规的化学用品商店或供货商处获得。如无特殊说明，以下实施例中所使用的方法是本领域中的常规方法；技术人员根据实验描述可以明确地知道如何进行所述实验。
[0036] 在本申请中，NtVP1表示唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白基因，NtVP1表示唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白。
[0037] 实施例一：唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白基因(NtVP1)的克隆
[0038] 根据对已克隆的10种物种(陆地棉(Gossypium hirsutum ADN96173.1)、葡萄(Vitis vinifera XP_002273207.1)、毛果杨(Populus trichocarpa XP_006381091.1)、拟南芥(NP_173021.1)、盐角草(AEI17666.1)、盐爪爪(Kalidium foliatum ABK91685.1)、水稻(BAA31523.1)、角果碱蓬(Suaeda corniculata ADQ00196.1)、盐穗木(Halostachys caspica ABO45933.1)、霸王(ABU92563.1))的该基因进行多序列比对，在氨基酸保守区设计一对简并引物NtVP1-F1(SEQ ID NO:1)和NtVP1-R1(SEQ ID NO:2)。提取唐古特白刺叶片的总RNA(Takara公司的RNAiso Plus)，通过RT-PCR的方法从唐古特白刺的总RNA扩增得到保守区cDNA片段(1156bp)(SEQ ID NO:3)。所述RT-PCR的方法如下：
[0039] 取8μl的总RNA、1μl 50μM寡聚(Dt)20、1μl 10mM dNTP混合物(均在冰上进行)，加入至0.2ml的无RNA酶的离心管中，轻轻混匀，马上65℃变性5min，然后立即放置冰上至少1min，紧接着按下表进行以下各组分的混匀。
[0040]
[0041] 将以上10μl的混合物，加至含有RNA/引物的混合物的离心管中，轻轻捶打混匀后，马上50℃50min，85℃5min。以上程序结束后，立即将离心管放置冰上1分钟，稍加离心后，将1μl的RNA酶H加入离心管中，37℃温育20min。合成第一链cDNA。将合成的cDNA作为模版，利用引物NtVP1-F1(SEQ ID NO:1)和NtVP1-R1(SEQ ID NO:2)进行保守区域PCR扩增和测序。
[0042] 基于已克隆得到的保守区cDNA片段，设计UPM引物(SEQ ID NO:10)、末端扩增引物5’RACE(SEQ ID NO:4)和3’RACE(SEQ ID NO:5)，通过cDNA末端快速扩增法(RACE)(Clontech公司的SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒)，从唐古特白刺叶片总RNA中扩增得到唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白基因的全长cDNA序列。经测序，该全长cDNA的长度为2810bp(SEQ ID NO:6)。
[0043] 将所得全长cDNA序列提交至NCBI进行比对，发现该cDNA序列与陆地棉(Gossypium hirsutum)、盐爪爪(Kalidium foliatum)、葡萄(Vitis vinifera) 及盐芥(Thellungiella salsuginea)等植物的I型H+-PPase蛋白基因的同源性均＞80％，将该基因全长cDNA序列命名为NtVP1。
[0044] 利用NCBI将该cDNA序列翻译成氨基酸，获得唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白，命名为NtVP1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
[0045] 实施例二：不同物种的液泡膜H+-PPase蛋白序列比较
[0046] 从GenBank中选取10个来源于不同植物的液泡膜H+-PPase蛋白的氨基酸序列，分别为陆地棉(Gossypium hirsutum ADN96173.1)、葡萄(Vitis vinifera XP_002273207.1)、毛果杨(Populus trichocarpa XP_006381091.1)、拟南芥(NP_173021.1)、盐角草(AEI17666.1)、盐爪爪(Kalidium foliatum ABK91685.1)、水稻(BAA31523.1)、角果碱蓬(Suaeda corniculata ADQ00196.1)、盐穗木(Halostachys caspica ABO45933.1)、霸王(ABU92563.1)，利用DNAMAN软件，将这10个蛋白与本发明的NtVP1蛋白进行多重比较。结果显示，NtVP1氨基酸序列与已克隆的陆地棉H+-PPase蛋白同源性达93％，与拟南芥液泡膜H+-PPase蛋白AtVP1同源性为89.29％，而与拟南芥液泡膜H+-PPase蛋白AtVP2同源性只有
33.53％(AAF31163.1)。另外，NtVP1与其它植物液泡膜H+-PPase蛋白也有较高的同源性(图
1)。从图1可以看出，该蛋白含有3个保守区(CS1、CS2和CS3)，其中CS1保守区中含有DVGADLVGKVE序列，与(E/X)(X)7KXE构型相符合。该构型在许多植物液泡膜H+转运无机焦磷酸酶中都高度保守，且可能是作为焦磷酸(PPi)水解过程的底物结合位点存在。另外，从图1中还发现该蛋白含有‘EYYTS’基序，该基序涉及焦磷酸的水解与H+运输的偶联，且其存在于大多数其它液泡质子泵焦磷酸水解酶(V-PPases)中。
33.53％(AAF31163.1)。另外，NtVP1与其它植物液泡膜H+-PPase蛋白也有较高的同源性(图
1)。从图1可以看出，该蛋白含有3个保守区(CS1、CS2和CS3)，其中CS1保守区中含有DVGADLVGKVE序列，与(E/X)(X)7KXE构型相符合。该构型在许多植物液泡膜H+转运无机焦磷酸酶中都高度保守，且可能是作为焦磷酸(PPi)水解过程的底物结合位点存在。另外，从图1中还发现该蛋白含有‘EYYTS’基序，该基序涉及焦磷酸的水解与H+运输的偶联，且其存在于大多数其它液泡质子泵焦磷酸水解酶(V-PPases)中。
[0047] 实施例三：不同物种来源的液泡膜H+-PPase蛋白系统进化树
[0048] 在液泡膜H+-PPase蛋白序列的比对基础上，利用ClustalX软件对上述10 个来源+于不同植物中的液泡膜H-PPase蛋白(分别为陆地棉(Gossypium hirsutum ADN96173.1)、葡萄(Vitis vinifera XP_002273207.1)及(CAO41672.1)、毛果杨(Populus trichocarpa XP_006381091.1)、拟南芥(NP_173021.1)及(AAF31163.1)、盐角草(AEI17666.1)、盐爪爪(Kalidium foliatum ABK91685.1)、水稻(BAA31523.1)、角果碱蓬(Suaeda corniculata ADQ00196.1)、盐穗木(Halostachys caspica ABO45933.1)、霸王(ABU92563.1))以及本发明的NtVP1蛋白的氨基酸序列进行多序列匹配排列，然后采用MEGA5.1软件进行系统进化树的构建，该方法是根据Neighbor-joining法，通过Poisson distance法经过1000次bootstrap分析。结果(图2)表明，唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白基因NtVP1与同属于Ⅰ型的陆地棉GhVP1、拟南芥AtVP1、葡萄VvVP1等的遗传距离较近，而与同属于Ⅱ型的拟南芥AtVP2、葡萄VvVP2的遗传距离相对较远。
[0049] 实施例四：唐古特白刺液泡膜H+-PPase蛋白基因NtVP1的序列分析
[0050] NtVP1cDNA序列全长编码的蛋白序列为一个768个氨基酸的蛋白。根据序列推测，其分子量为80.5kDa，等电点为5.33；利用疏水性分析软件(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)可知，该蛋白的整个肽链中均匀地分布着疏水性氨基酸，且多于亲水性氨基酸(图3中的A)。因此，整个多肽链表现为疏水性，说明NtVP1蛋白符合膜蛋白的特征，属于疏水性蛋白(图3中的B)。利用TMHMM软件进行跨膜性分析，表明NtVP1含有14个跨膜区(图3中的C)，这与其它物种中液泡膜H+-PPase蛋白的跨膜结构域一致。用Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org/)对NtVP1蛋白结构进行分析，可见其与4a01.1.A模板的序列的相似性高达90.21％，属于质子焦磷酸酶模型(图3中的D)。
[0051] 实施例五：唐古特白刺NtVP1在NaCl高盐胁迫下的表达分析
[0052] 分别从唐古特白刺幼叶、幼茎和幼根中提取总RNA(北京天恩泽基因有限公司的柱式植物RNAout试剂盒)，分别取500ng为模板并反转录合成cDNA第1链(SuperScript III Reverse Transcriptase)。基于NtVP1cDNA全长序列，设计1对特异引物NtVP1-F8(SEQ NO 8)、NtVP1-R8(SEQ NO 9)，扩增得到长度为207bp的片段(SEQ ID NO:13)。以小果白刺Actin基因(Genbank：AB617805.1)为内参照，采用荧光定量PCR的方法对正常生长条件下唐古特白刺不同器官中NtVP1的表达进行检测。荧光定量PCR的实验条件为：95℃10min预变性，然后95℃15s、60℃1min，40个循环。荧光染料为SYBR Green I。
[0053] 结果表明，NtVP1在不同器官中均有表达，且在叶片中表达量>根中表达量>茎中表达量(图4中的A)。为探究唐古特白刺VP1基因是否受盐诱导和调节，进一步检测了-1200mmol·L NaCl胁迫1、3、6、12、24、48h时唐古特白刺叶片中NtVP1的表达水平。具体方法为：将唐古特白刺的种子播种在蛭石：草炭为3：1(V/V)的混合介质中，置于温室培养。选择生长正常且大小一致的3月龄苗用自来水培养，培养期间每隔4天换水1次。水培1周左右，采用0(CK)和200mmol〃L-1NaCl处理幼苗1、3、6、12、24、48h，每个处理3个重复，每个重复3株，共计108株。于上午10:00～11:00统一采取嫩叶组织。结果显示随着盐胁迫时间的延长，唐古特白刺NtVP1基因在叶片中表达量持续增加，胁迫12h时表达量最高，而后逐渐减弱(图4中的B)，这些结果说明NtVP1基因可能在唐古特白刺耐盐机制中发挥重要作用。
[0054] 实施例六：唐古特白刺NtVP1基因表达载体的构建
[0055] 首先确定pCG-GFP载体(图5)(辉骏生物)与pSN1301载体(图6)(辉骏生物)，在基因两端分别加上Xba I和Kpn I酶切位点，并连接到T载体(Transgen，CT11-01，http://www.transgen.com.cn/products/63.html)上；用基因特异引物T1和T2进行插入位点片段扩增，通过PCR检查获得含有NtVP1 基因条带，确认NtVP1基因已经连到T载体上(图7)。其中，T1和T2的引物序列分别为：T1:5’-GTTTGCCTTCGTCCTTCA-3’(SEQ ID NO:11)；T2:5’-CATTGTCCCATGCACCTC-3’(SEQ ID NO:12)。
[0056] 将T-NtVP1载体，以及pCG-GFP和pSN1301分别用Xba I和Kpn I进行酶切，获得NtVP1基因片段(图8)与pSN1301和pCG-GFP开环载体(图9)，将NtVP1基因连接pSN1301和pCG-GFP，转化大肠杆菌，然后挑菌PCR检测，获得检测图(图10)，证明载体构建完成，获得阳性菌克隆。对NtVP1基因连接pSN1301载体进行测序分析，所测到的基因侧翼序列都是载体的序列。证明NtVP1基因已经连接到表达载体上了。
[0057] 实施例七：唐古特白刺NtVP1基因转化
[0058] 将实施例六构建的两种双元载体分别转化到农杆菌C58中，培养，接种到5ml含有抗生素(利福平20mg/L，卡那霉素50mg/L)的LB液体培养基中，28℃下震荡培养2天。将1ml培养的农杆菌转移到100ml含有抗生素的LB液体培养基中，28℃继续震荡培养24小时。将菌液倒入离心管中，6000rpm/min，室温条件下，离心10分钟，然后将上清倒出。沉淀用200ml浸染液(10％蔗糖，含0.02％silwet)重悬，形成均匀的农杆菌悬浮液(OD600＝0.8)，并将农杆菌悬浮液转移到一个敞口的器皿中(500ml烧杯)。选取初果期的健壮拟南芥，带盆钵倒扣于盛有农杆菌悬浮液的容器上方，只将整个花序浸入上述农杆菌悬浮液中约20-30秒，将盆钵取下，横放于暗箱中约24小时。24小时后将处理过的拟南芥植株放于22～25℃的光照条件下正常生长，三周后收取成熟种子。
[0059] 实施例八：拟南芥盐胁迫验证分析
[0060] 将实施例七中收获的拟南芥种子播种到含有25mg/L潮霉素的1/2MS培养基中进行筛选，待长出两片真叶时移栽到含有草炭土和蛭石的培养基中(草炭土：珍珠岩＝1：1)，将拟南芥植株放于22～25℃的光照条件下正常生长，三周后收取成熟种子。重复上述操作，直至收取到T3代种子(TR)。将T3代拟南芥种子(TR)与野生型拟南芥种子(WT)分别播种培养，待移栽后两周，进行NaCl胁迫处理。分别设置对照组(0)和处理组(1)，各设三个重复，其中处理为30mmol/L NaCl。胁迫处理4d后收取叶片，立即液氮冷冻，分别测量叶绿素含量、脯氨酸含量、丙二醛含量与SOD活性变化。
[0061] 结果表明，T3代植株的叶绿素含量在对照(TR0)时为0.0334mg/g，盐胁迫处理后(TR1)为0.0338mg/g，无显著性差异(p>0.05)；丙二醛含量在对照(TR0)时为0.0025umol/g，在盐胁迫处理(TR1)后变为0.0031umol/g，也无显著性差异(p>0.05)；而T3代植株脯氨酸含量在盐胁迫前后分别为33.38ug/gFw(TR0)与105.47ug/gFw(TR1)，盐胁迫后含量显著升高，存在显著性差异(p<0.05)；SOD活性在对照(TR0)时为7.445U/gFW，盐胁迫处理(TR1)后变为17.056U/gFW，SOD活性经盐胁迫处理后显著升高，存在显著性差异(p<0.05)(图11)。
[0062] 野生型植株在盐胁迫后，叶绿素含量由0.039mg/g(WT0)变为0.029mg/g(WT1)，存在显著性差异(p<0.05)；丙二醛含量由0.0034umol/g(WT0)上升到0.0048umol/g(WT1)，也存在显著性差异(p<0.05)；脯氨酸含量由55.43ug/gFw(WT0)变为68.52ug/gFw(WT1)，差异不显著(p>0.05)；SOD活性在对照组中为5.42U/gFW(WT0)，在盐胁迫处理后为6.77U/gFW(WT1)，同样无显著性差异(p>0.05)(图11)。
[0063] 本结果说明盐胁迫促进了T3代植株渗透调节物质脯氨酸的合成，丙二醛含量增加不显著，叶绿素的合成与降解未受到显著影响，表明膜系统更加稳定；同时SOD活性显著增加证明了其清除超氧负离子自由基能力增强。以上试验证明，NtVP1基因在拟南芥植株中成功转化使T3代植株耐盐性得到显著提高，即NtVP1基因在提高植物耐盐性方面具有积极作用。
[0065] SEQ ID NO:1：CATTCGCCATTCAGG
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[0067] SEQ ID NO:3：
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[0073] SEQ ID NO:7：
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