番茄TGase基因在提高番茄非生物胁迫抗性中的应用
阅读：98发布：2020-05-13
专利汇可以提供番茄TGase基因在提高番茄非生物胁迫抗性中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供番茄TGase基因在提高番茄非 生物 胁迫抗性中的应用，包括如下步骤：(a)从 目标 植物 幼嫩 叶片 中提取总RNA；(b)将目标植物总RNA反转录成cDNA；(c)以步骤(b)获得的cDNA为模板，对TGase基因进行扩增，将TGase扩增产物连入 基础 载体得到番茄TGase基因的过表达载体；(d)将步骤(c)所得番茄TGase基因的过表达载体转入根癌农杆菌中，得到含番茄TGase基因过表达载体的根癌农杆菌工程菌A；(e)将步骤(d)所述含番茄TGase基因过表达载体的根癌农杆菌工程菌A转化至目标植物外植体，提高番茄TGase基因的表达，得到番茄TGase基因过表达的转基因植株。结果显示，提高番茄TGase基因在所述植物中的表达量，能够增强 非生物胁迫 的抗性。，下面是番茄TGase基因在提高番茄非生物胁迫抗性中的应用专利的具体信息内容。
1.番茄TGase基因，其特征在于，包含以下(1)、(2)中任一所述的核苷酸序列：
(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(2)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列有90％以上同源性且编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA分子。
2.权利要求1所述番茄TGase基因的特异引物对SlTGase，其特征在于，所述引物对SlTGase的核苷酸序列如下所示：
SlTGase-F：5’-TTGGCGCGCCATGGTTGCTCGGAGACTCGCCGTTA-3’(SEQ ID N O：3)；
SlTGase-R：5’-CGGGGTACCACTGCTACCTGCAAAGAGGTCAATG-3’(SEQ ID NO：4)。
3.一种利用番茄TGase基因提高目标植物非生物胁迫抗性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)从目标植物幼嫩叶片中提取总RNA；
(b)将步骤(a)中获得的目标植物总RNA反转录成cDNA；
(c)以步骤(b)获得的cDNA为模板，采用权利要求2所述引物，对TGase基因进行扩增得到TGase扩增产物，采用带有HA标签蛋白的植物表达载体作为基础载体，将所述基础载体用内切酶AscI和KpnI双酶切割后，将TGase扩增产物连入基础载体的启动子和HA标签蛋白之间，得到番茄TGase基因的过表达载体；
(d)将步骤(c)所得的番茄TGase基因的过表达载体转入根癌农杆菌EHA105中，得到含番茄TGase基因过表达载体的根癌农杆菌工程菌A；
(e)利用根癌农杆菌介导的遗传转化方法，将步骤(d)所述含番茄TGase基因过表达载体的根癌农杆菌工程菌A转化至目标植物外植体，提高番茄TGase基因的表达，得到番茄TGase基因过表达的转基因植株。
4.根据权利要求3所述的利用番茄TGase基因提高目标植物非生物胁迫抗性的方法，其特征在于，所述目标植物为双子叶植物。
5.根据权利要求3所述的利用番茄TGase基因提高目标植物非生物胁迫抗性的方法，其特征在于，所述目标植物为番茄。
6.权利要求1所述的番茄TGase基因、权利要求3中所述的番茄TGase基因的过表达载体、权利要求3中所述的含番茄TGase基因过表达载体的根癌农杆菌工程菌A在提高番茄非生物胁迫抗性中的应用。
7.根据权利要求6所述应用，所述非生物胁迫为高温胁迫、干旱胁迫、盐胁迫。
8.番茄TGase基因敲除的突变体植株的制备方法，其特征在于，该方法步骤如下：
(a)设计TGase基因的sgRNA序列：GATTGTTCCAGGTAATGAGACTGAA(SEQ ID NO.7)，合成的DNA序列退火成双链插入AtU6-sgRNA-AtUBQ-Cas9载体BbsI酶切位点，然后用HindIII和KpnI酶切AtU6-sgRNA-AtUBQ-Cas9载体，连接到pCAMBIA1301载体中得番茄TGase基因的CRISPR/Cas9载体；
(b)将步骤(a)所得番茄TGase基因的CRISPR/Cas9载体转入根癌农杆菌GV3101中，获得含番茄TGase基因CRISPR/Cas9载体的根癌农杆菌工程菌B；
(c)步骤(b)所得含番茄TGase基因CRISPR/Cas9载体的根癌农杆菌工程菌B导入目标植物，使得TGase蛋白不能翻译，得到番茄TGase基因敲除的突变体植株。
番茄TGase基因在提高番茄非生物胁迫抗性中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 近年来，随着我国设施园艺产业的迅速发展，设施栽培面积增加，设施蔬菜生产中常遭遇高温、盐害等逆境，引起番茄、黄瓜等设施蔬菜同化作用显著降低，进而影响其产量和品质，成为制约设施蔬菜产业发展的瓶颈问题。
[0003] 番茄(Solanum lycopersicum L.)是我国设施园艺的主要栽培作物之一，适宜生长温度为22℃～26℃，对环境反应敏感。设施常年的生产中，各种各样的非生物胁迫已成为制约我国设施番茄高产优质的主要障碍。逆境条件下，番茄生长缓慢甚至停滞，生长发育受到抑制。此外，非生物胁迫还会干扰番茄的生殖生长，导致落花落果和果实发育不良。因此，发掘番茄抵御高温、干旱、盐害等逆境关键基因，对培育抗逆品种具有重要的理论指导意义。
[0004] 转谷氨酰胺酶(TGase)又称谷氨酰胺转胺酶，广泛存在于动植物体内，是一种催化谷氨酰基转移反应的转移酶，能催化蛋白质分子内或分子间的交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解。高等植物体内含有较高活性的TGase，并可催化多胺与蛋白结合，维持蛋白的稳定性。目前对TGase的研究主要集中在其对逆境胁迫的响应，小麦的TGase活性在老叶中表达较高，能够增加内源多胺含量，延缓植株衰老。但是，番茄TGase在逆境胁迫中的作用尚未报道，因此深入研究TGase的功能，对研发抗性品种具有一定的理论指导意义。
发明内容
[0005] 本发明目的是针对现有技术的不足，可以提供一种提高番茄非生物胁迫抗性的基因资源。
[0006] 本发明研究番茄TGase基因在提高植物非生物胁迫抗性中的应用，包括如下步骤：
[0007] (1)构建含番茄TGase基因过表达载体的根癌农杆菌工程菌A和含番茄TGase基因CRISPR/Cas9载体的根癌农杆菌工程菌B；
[0008] (2)将所述根癌农杆菌工程菌A介导转化目标植物外植体，制备得到番茄TGase基因过表达的转基因植株；将所述根癌农杆菌工程菌B浸染目标植物外植体，制备得到TGase基因突变体植株，即敲除了TGase基因，使得TGase蛋白不能翻译的番茄TGase基因敲除的突变体植株。
[0009] (3)将所述番茄TGase基因过表达的转基因植株和番茄TGase基因敲除的突变体植株分别进行高温胁迫处理，观察植物抗性表型。
[0010] (4)将所述番茄TGase基因过表达的转基因植株和番茄TGase基因敲除的突变体植株分别进行干旱胁迫处理，观察植物抗性表型。
[0011] (5)将所述番茄TGase基因过表达的转基因植株和番茄TGase基因敲除的突变体植株分别进行盐胁迫处理，观察植物抗性表型。
[0012] 在目的植物中对TGase基因进行抑制表达，可为任何可降低目的植物中所述TGase基因的表达的方法。在本发明中，在目的植物中对TGase基因进行抑制表达是通过CRISPR/Cas9的方式实现的。
[0013] 结果显示，TGase基因在植物中的表达量越低，对非生物胁迫越敏感；TGase基因在所述植物中的表达量越高，增强非生物胁迫的抗性。
[0014] 本发明具体技术方案如下：
[0015] 本发明的第一个目的是提供番茄TGase基因，所述番茄TGase基因包含以下(1)、(2)中任一所述的核苷酸序列：
[0016] 如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
[0017] 与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列有90％以上同源性且编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA分子。
[0018] 本发明的第二个目的是提供前述番茄TGase基因的特异引物对SlTGase，所述引物对SlTGase的核苷酸序列如下所示：
[0019] SlTGase-F：5’-TTGGCGCGCCATGGTTGCTCGGAGACTCGCCGTTA-3’(SEQ ID NO.3)；
[0020] SlTGase-R：5’-CGGGGTACCACTGCTACCTGCAAAGAGGTCAATG-3’(SEQ ID NO.4)。
[0021] 前述番茄TGase基因的克隆方法，所述方法包括以下步骤：
[0022] (1)从番茄幼嫩叶片中提取总RNA；
[0023] (2)将步骤(1)中获得的番茄总RNA反转录成cDNA；
[0024] (3)以步骤(2)获得的cDNA为模板、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所述引物序列为扩增引物，进行PCR扩增得番茄TGase基因。
[0025] 本发明的第三个目的是提供一种利用番茄TGase基因提高目标植物非生物胁迫抗性的方法，所述方法包括以下步骤：
[0026] (a)从目标植物幼嫩叶片中提取总RNA；
[0027] 从目标植物幼嫩叶片中提取总RNA采用Tiangen Plant total RNA extraction kit，其步骤为：
[0028] 1)取0.1g叶片在液氮中磨碎，加1mL裂解液，涡旋混匀；
[0029] 2)将均浆样品在15-30℃放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；
[0030] 3)4℃，12,000rpm离心5min，弃上清，转入一个新的无RNase的离心管中。
[0031] 4)加入200μL氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置3min；
[0032] 5)4℃，12,000rpm离心10min，样品会分为三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，水相的体积约为所用裂解液RZ试剂的50％。把水相转移到新管中，进行下一步操作；
[0034] 7)向吸附柱CR3中加入500μL去蛋白液RD，4℃，12,000rpm离心30s，弃废液；
[0035] 8)向吸附柱CR3中加入600μL漂洗液RW，室温静止2min，4℃，12,000rpm离心30s，弃废液；
[0036] 9)重复操作步骤(8)；
[0037] 10)将吸附柱放入2mL收集管中，4℃，12,000rpm离心2min，去除残余废液；
[0038] 11)将吸附柱CR3转入一个新的离心管中，加入50μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min，4℃，12,000rpm离心2min；
[0040] (b)将步骤(a)中获得的目标植物总RNA反转录成cDNA；
[0041] 将目标植物总RNA反转录成cDNA采用Toyobo ReverTra Ace qPCR RT Kit。
[0042] (c)以步骤(b)获得的cDNA为模板，采用SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所述引物，对番茄TGase基因进行扩增得到TGase扩增产物，所述引物两端分别引入了限制性内切酶AscI和KpnI的识别位点；采用带有HA标签蛋白的植物表达载体作为基础载体，将所述基础载体用内切酶AscI和KpnI双酶切割后，将TGase扩增产物连入基础载体的启动子和HA标签蛋白之间，得到番茄TGase基因的过表达载体；
[0043] (d)将步骤(c)所得的番茄TGase基因的过表达载体转入根癌农杆菌EHA105中，得到含番茄TGase基因过表达载体的根癌农杆菌工程菌A；
[0044] (e)利用根癌农杆菌介导的遗传转化方法，将步骤(d)所述含番茄TGase基因过表达载体的根癌农杆菌工程菌A转化至目标植物外植体，提高番茄TGase基因的表达，得到番茄TGase基因过表达的转基因植株。
[0045] 进一步的，所述目标植物为双子叶植物。
[0046] 进一步的，所述目标植物为番茄。
[0047] 本发明的第四个目的是提供前述的番茄TGase基因、前述的番茄TGase基因的过表达载体、前述的含番茄TGase基因过表达载体的根癌农杆菌工程菌A在提高番茄非生物胁迫抗性中的应用。
[0048] 进一步的，所述非生物胁迫为高温胁迫、干旱胁迫和盐胁迫。
[0049] 本发明的第五个目的是提供番茄TGase基因敲除的突变体植株的制备方法，该方法步骤如下：
[0050] (a)利用CRISPR-P网站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)设计TGase基因的sgRNA序列：GATTGTTCCAGGTAATGAGACTGAA(SEQ ID NO.7)，合成的DNA序列退火成双链插入AtU6-sgRNA-AtUBQ-Cas9载体BbsI酶切位点，然后用HindIII和KpnI酶切AtU6-sgRNA-AtUBQ-Cas9载体，连接到pCAMBIA1301载体中得番茄TGase基因的CRISPR/Cas9载体；
[0051] (b)将步骤(a)所得番茄TGase基因的CRISPR/Cas9载体转入根癌农杆菌GV3101中，获得含番茄TGase基因CRISPR/Cas9载体的根癌农杆菌工程菌B；
[0052] (c)步骤(b)所得含番茄TGase基因CRISPR/Cas9载体的根癌农杆菌工程菌B导入目标植物，使得TGase蛋白不能翻译，得到番茄TGase基因敲除的突变体植株。
[0053] 本发明中番茄TGase基因敲除的突变体植株的鉴定方法如下：
[0054] 从番茄幼嫩叶片中提取总DNA采用CTAB，其步骤为：
[0056] (2)将粉末移入1.5mL离心管，加入800μL CTAB分离缓冲液，上下颠倒离心管，混合均匀。
[0057] (3)将盛有样品的离心管置于65℃水浴中保温30min，其间每隔3-4min轻摇混匀。低温12,000rpm离心5min，将上层水相转移至新的离心管中。
[0058] (4)加入等体积的Tris-酚和氯仿异戊醇，上下颠倒离心管，混合均匀；低温12,000rpm离心5min，将上层水相转移至新的离心管中。
[0059] (5)加入等体积的氯仿异戊醇上下颠倒离心管，混合均匀；低温12,000rpm离心5min，将上层水相转移至新的离心管中。
[0060] (6)加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，置于-20℃沉淀30min。
[0061] (7)低温12,000rpm离心5min去上清，加入500μL 70％乙醇洗涤沉淀，常温12,000rpm2min，去上清，沉淀尽量干燥。
[0062] (8)加入适量含有RNase的TE(20μL)溶解沉淀，37℃水浴30min，消化RNA。
[0063] (9)取适量基因组DNA样品，电泳检测。
[0064] (10)在sgRNA前后各设计一条引物sgRNA-2F：5′-CGGCGAAACATCATTTCAGA-3′[0065] (SEQ ID NO.5)，sgRNA-2R的序列为：5′-AGGAAGCTCCTCCCCACTAGCA-3′(SEQ ID NO.6)，进行PCR扩增，PCR产物由杭州擎科梓熙生物技术有限公司测序，用BioXM软件(V2.7)进行序列比对，筛选两个独立的番茄TGase基因敲除的突变体植株用于实验。
[0066] 本发明中高温胁迫处理的步骤为：
[0067] 当番茄TGase基因过表达的转基因植株、番茄TGase基因敲除的突变体植株和野生型幼苗长至三叶一心时，挑选长势整齐一致的幼苗转移到人工气候箱(RXZ-500D智能型，江南仪器厂，宁波)。高温胁迫处理温度为42/42℃。
[0068] 高温胁迫处理时间0～48小时。
[0069] 进一步优选，高温胁迫处理时间为24小时。
[0070] 番茄TGase基因过表达的转基因植株和番茄TGase基因敲除的突变体植株以野生型番茄植株为空白对照。
[0071] 高温胁迫处理结束后与相同种植条件下未进行高温胁迫处理的对照组进行比对，观察番茄TGase基因过表达的转基因植株和番茄TGase基因敲除的突变体植株及野生型与未经胁迫处理的植株的各项性能差别。
[0072] 干旱胁迫处理的步骤为：
[0073] 当番茄TGase基因过表达的转基因植株、番茄TGase基因敲除的突变体植株和野生型植株长至五叶一心时，均浇水至饱和，之后每隔1～4天测量一次各自的相对土壤含水量(VWC)并根据失水量补充水分使土壤相对含水量保持一致，直至处理结束。
[0074] 干旱胁迫过程中控制土壤相对含水量从100％逐步降低至30％。
[0075] 干旱胁迫处理时间10～15天。
[0076] 进一步优选，干旱胁迫过程中每隔1天测量一次，干旱胁迫处理时间为13天。
[0077] 番茄TGase基因过表达的转基因植株和番茄TGase基因敲除的突变体植株以野生型番茄植株为空白对照。
[0078] 干旱胁迫处理结束后与相同种植条件下未进行干旱胁迫处理的对照组进行比对，观察番茄TGase基因过表达的转基因植株、番茄TGase基因敲除的突变体植株及野生型与未经胁迫处理的植株的各项性能差别。
[0079] 盐胁迫处理的步骤为：
[0080] 当番茄TGase基因过表达的转基因植株、番茄TGase基因敲除的突变体植株和野生型植株长至五叶一心时，每株苗每隔一天浇灌含有200mM NaCl的200ml ddH2O，直至处理结束。
[0081] 胁迫处理时间8天。
[0082] 番茄TGase基因过表达的转基因植株和番茄TGase基因敲除的突变体植株以及野生型番茄植株为空白对照。
[0083] 盐胁迫处理结束后与相同种植条件下未进行盐胁迫处理的对照组进行比对，观察番茄TGase基因过表达的转基因植株、番茄TGase基因敲除的突变体植株及野生型与未经胁迫处理的植株的各项性能差别。
[0084] 本发明技术方案所实现的有益效果为：
[0085] 经本发明研究发现，番茄TGase基因能够响应多种胁迫，当植物受到如高温、干旱和盐胁迫等逆境胁迫后，番茄TGase基因会被激活，加速多胺与蛋白结合，维持蛋白结构的稳定性，从而增强植株对逆境胁迫的抗性。因此，番茄TGase基因过表达可以增强植株的非生物胁迫抗性，而番茄TGase基因抑制表达导致植株非生物胁迫抗性减弱，因此，番茄TGase可以增强其非生物胁迫抗性。
[0087] 图1为实施例3中qRT-PCR检测番茄TGase基因过表达的转基因植株中番茄TGase基因相对表达量对比柱状图。其中WT为未转基因的野生型番茄Ailsa Craig，1#、2#、3#、4#表示番茄TGase基因过表达的四个独立的株系。
[0088] 图2为实施例4中番茄TGase基因敲除的突变体植株鉴定。
[0089] 图2A为测序结果和序列比对分析示意图，其中WT为未转基因的野生型番茄AilsaCraig，TGase-1、TGase-2为番茄TGase基因敲除的两个独立的株系。
[0090] 图2B为TGase-1突变体的测序结果。
[0091] 图2C为TGase-2突变体的测序结果。
[0092] 图3为实施例5中番茄TGase基因过表达的转基因植株和番茄TGase基因敲除的突变体植株以及野生型番茄植株高温胁迫下的表型图，标尺＝10cm。
[0093] 本发明附图中，WT为未转基因的野生型番茄Ailsa Craig，TGase-1、TGase-2为番茄TGase基因敲除的突变体植株，OE-1#、OE-2#为番茄TGase基因过表达的转基因植株，以下附图同。
[0094] 图4为实施例5中番茄TGase基因过表达的转基因植株和番茄TGase基因敲除的突变体植株以及野生型番茄植株高温胁迫下的电导率对比柱状图。
[0095] 图5为实施例5中番茄TGase基因过表达的转基因植株和番茄TGase基因敲除的突变体植株以及野生型番茄植株高温胁迫下的Fv/Fm。
[0096] 图5A为各组植株高温胁迫下的Fv/Fm对比荧光图像。
[0097] 图5B为各组植株高温胁迫下的Fv/Fm对比柱状图。
[0098] 图6为实施例6中番茄TGase基因过表达的转基因植株和番茄TGase基因敲除的突变体植株以及野生型番茄植株干旱胁迫下的表型图，标尺＝10cm。
[0099] 图7为实施例6中番茄TGase基因过表达的转基因植株和番茄TGase基因敲除的突变体植株以及野生型番茄植株干旱胁迫下的性状对比。
[0100] 图7A为各组植株电导率对比柱状图。
[0101] 图7B为各组植株相对含水量对比柱状图。
[0102] 图8为实施例7中番茄TGase基因过表达的转基因植株和番茄TGase基因敲除的突变体植株以及野生型番茄植株盐胁迫下的表型图，标尺＝10cm。
[0103] 图9为实施例7中番茄TGase基因过表达的转基因植株和番茄TGase基因敲除的突变体植株以及野生型番茄植株盐胁迫下的电导率对比柱状图。
[0104] 图10为实施例7中番茄TGase基因过表达的转基因植株和番茄TGase基因敲除的突变体植株以及野生型番茄植株盐胁迫下的Fv/Fm。
[0105] 图10A为各组植株盐胁迫下的Fv/Fm对比荧光图像。
[0106] 图10B为各组植株盐胁迫下的Fv/Fm对比柱状图。
[0107] 图11为实施例7中番茄TGase基因过表达的转基因植株和番茄TGase基因敲除的突变体植株以及野生型番茄植株盐胁迫下的性状对比。
[0108] 图11A为各组植株鲜重对比柱状图。
[0109] 图11B为各组植株干重对比柱状图。
[0110] 图11C为各组植株叶绿素含量对比柱状图。
具体实施方式
[0111] 下面结合具体实施例和附图对本发明进一步进行描述。
[0112] 下述实施例中所用实验方法如无特殊说明，均为常规方法，包括PCR、纯化、酶切、连接、转化、测序等几个步骤。
[0113] 下述实施例中所用实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0114] 实施例1番茄TGase基因的克隆及番茄TGase基因的过表达载体构建[0115] 1.番茄总RNA提取
[0116] 采用Plant total RNA extraction kit(TIANGEN)提取番茄幼嫩叶片的总RNA，其步骤为：
[0117] (1)取0.1g番茄叶片在液氮中磨碎，加1mL裂解液，后用均浆仪处理；
[0118] (2)将均浆样品在15-30℃放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；
[0119] (3)4℃，12,000rpm离心5min，去上清，转入一个新的无RNase的离心管中。
[0120] (4)加入200μL氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置3min；
[0121] (5)4℃，12,000rpm离心10min，样品会分为三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，水相的体积约为所用裂解液RZ试剂的50％。把水相转移到新管中，进行下一步操作；
[0122] (6)缓慢加入0.5倍体积的无水乙醇，混合均匀(此时可能会出现沉淀)。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3，4℃12,000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液；
[0123] (7)向吸附柱CR3中加入500μL去蛋白液RD，4℃，12,000rpm离心30s，弃废液；
[0124] (8)向吸附柱CR3中加入600μL漂洗液RW，室温静止2min，4℃，12,000rpm离心30s，弃废液；
[0125] (9)重复操作步骤(8)；
[0126] (10)将吸附柱放入2mL收集管中，4℃，12,000rpm离心2min，去除残余废液；
[0127] (11)将吸附柱CR3转入一个新的离心管中，加入50μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min，4℃，12,000rpm离心2min；
[0128] (12)用紫外分光光度计测定OD260/OD280检验RNA样品含量与纯度，浓度为835ng/μL，OD260/OD280＝2.12。
[0129] 2.基因克隆及番茄TGase基因的过表达载体pFGC1008-35S-TGase-HA构建[0130] 采用ReverTra Ace qPCR RT Kit(Toyobo)，将1μg番茄总RNA反转录成cDNA。
[0131] 根据番茄TGase基因的编码序列，设计扩增出完整框的引物(如表1中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的SlTGase-F和SlTGase-R)，并在引物上分别加上限制性酶切位点AscI和KpnI；采用SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示引物对番茄TGase基因进行扩增，扩增产物采用AscI和KpnI酶切，将带有HA标签蛋白的pFGC1008-HA载体用限制性内切酶AscI和KpnI双酶切后，将酶切后的扩增产物连入线性化的pFGC1008-HA载体的35S启动子和HA标签蛋白之间，得到番茄TGase基因的过表达载体pFGC1008-35S-TGase-HA，由杭州擎科梓熙生物技术有限公司测序，测序结果如SEQ TD NO.1所示，所编码的蛋白序列如SEQ TD NO.2所示，结果表明所克隆的序列与solgenomics中公布的序列(Solyc01g097440.3)一致。
[0132] PCR反应体系如下：
[0133]
[0134] PCR反应条件设置：
[0135]
[0137]
[0138] 3.根癌农杆菌工程菌构建
[0139] 将番茄TGase基因的过表达载体pFGC1008-35S-TGase-HA转入根癌农杆菌EHA105中，获得含番茄TGase基因过表达载体的根癌农杆菌工程菌A。
[0140] 实施例2番茄TGase基因的CRISPR/Cas9载体构建
[0141] 利用CRISPR-P网站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)设计TGase基因的sgRNA序列：GATTGTTCCAGGTAATGAGACTGAA(SEQ ID NO.7)。进而合成一对sgRNA引物(表2中的sgRNA-F和sgRNA-R)，将合成的sgRNA稀释成100mM并退火成双链，连入AtU6-sgRNA-AtUBQ-Cas9载体，然后再将其连入植物转化载体pCAMBIA1301。
[0142] 退火反应体系如下：
[0143]
[0144] PCR反应条件设置：
[0145]
[0146] 表2 sgRNA引物序列表
[0147]
[0148] 3.根癌农杆菌工程菌构建
[0149] 将构建好的番茄TGase基因的CRISPR/Cas9载体转入根癌农杆菌EHA105中，获得含番茄TGase基因的Cas9载体的根癌农杆菌工程菌B。
[0150] 实施例3构建番茄TGase基因过表达的转基因植株
[0151] 1培养无菌苗
[0152] 番茄Ailsa Craig种子用自来水浸泡(或用摇床28℃200r/min)6-8h，然后用75％酒精消毒30sec，之后在10％NaClO中消毒15min(用摇床28℃200r/min)，灭菌蒸馏水冲洗3次并转移到灭菌器皿，接种于1/2MS培养基。25℃黑暗条件下培养至发芽，转入光照培养室，幼苗生长条件为25℃、16h光照/8h黑暗，光照强度1800lx。
[0153] 2准备外植体、培养农杆菌
[0154] 种子发芽后6d，将无菌苗的子叶用刀切下，子叶带有一小段叶柄，置入看护培养基KCMS中预培养1d(避光，过夜即可，看护培养时间过长容易导致侵染过度)。在含有抗生素的LB平板上挑取农杆菌单菌落，接种于20mL含有抗生素的LB中，28℃、200r/min过夜培养至对数中期(OD600≈1.0，约16-24h)。先摇菌，再切子叶(12-20h之间接种)。
[0155] 3转化再生
[0156] 3.1侵染
[0157] 培养好的含番茄TGase基因过表达载体的根癌农杆菌工程菌A菌液转到10mL离心管(封口膜封口)，4℃4000r/min离心10min；倒出培养基，加入悬浮培养基MS0.2，摇匀。将3～4皿的子叶外植体转移到倒有MS0.2的灭菌培养皿中，倒入悬浮好的菌液至OD600≈0.2～0.3(7-8mLMS0.2，其中2-3mL倒入培养皿)暗下接种感染4-5min，并轻轻晃动培养皿。将外植体转移到灭菌滤纸上，吸干残留的菌液，回接到KCMS上，22℃共培养2d(避光)。反面朝上。
[0158] 3.2选择培养、再生
[0159] 共培养后，将外植体小心的转入MRS1(2Z+)上，2～3周后转入MRS2(0.2Z+)中培养，选择培养的过程中要及时清理污染的材料，直至长出再生芽。
[0160] 4.再生芽生根、移栽
[0161] 待再生芽长至1cm左右时，将芽切下(可以不切，以免伤害生根部位)，放入生根培养基中生根。2周后对生根良好、长至5cm左右的转化苗进行炼苗，移栽至一次性塑料杯中，成活后移栽至花盆中，得番茄TGase基因过表达植株,转基因植株的qRT-PCR验证结果如图1。
[0162] 结果显示，与野生型对照(WT)相比，番茄TGase基因过表达植株的四个独立的株系1#、2#、3#、4#的TGase基因相对表达量均明显提高。
[0163] 实施例4构建番茄TGase基因敲除的突变体植株
[0164] 1获取无菌苗
[0165] 番茄Ailsa Craig种子在28℃200r/min摇6-8h，然后用75％酒精消毒30s，之后用10％NaClO中消毒15min(用摇床28℃200r/min)，灭菌水冲洗5次并转移到灭菌锥形瓶中，接种于1/2MS培养基。25℃黑暗条件下培养至发芽，转入光照培养室，幼苗生长条件为25℃、
16h光照/8h黑暗，光照强度1800lx。
16h光照/8h黑暗，光照强度1800lx。
[0166] 2准备外植体、培养农杆菌
[0167] 种子发芽后6d，将无菌苗的子叶用刀切下，子叶带有一小段叶柄，置入看护培养基KCMS中预培养1d。在含有抗生素的LB平板上挑取农杆菌单菌落，接种于20mL含有抗生素的LB中，28℃、200r/min过夜培养至OD600≈1.0。
[0168] 3转化再生
[0169] 3.1侵染
[0170] 培养好的根癌农杆菌工程菌B菌液转到10mL离心管，4℃4,000r/min离心10min；倒出培养基，加入悬浮培养基MS0.2，摇匀。将3～4皿的子叶外植体转移到倒有MS0.2的灭菌培养皿中，倒入悬浮好的菌液至OD600≈0.2～0.3暗下接种感染2-3min，并轻轻晃动培养皿。将外植体转移到灭菌滤纸上，吸干残留的菌液，回接到KCMS上，22℃共培养2d(避光)。反面朝上
[0171] 3.2选择培养、再生
[0172] 共培养后，将外植体小心的转入MRS1(2Z+)上，2～3周后转入MRS2(0.2Z+)中培养，选择培养的过程中要及时清理污染的材料，直至长出再生芽。
[0173] 4.再生芽生根、移栽
[0174] 待再生芽长至1cm左右时，将芽切下，放入生根培养基中生根。2周后对生根良好、长至5cm左右的转化苗进行炼苗，移栽至一次性塑料杯中，成活后移栽至花盆中。
[0175] 5.TGase突变体植株的鉴定
[0176] 将获得再生苗，经过自交，在F1代中挑选出已经分离掉Cas9的植株并进行测序。
[0177] 本发明中番茄TGase基因敲除的突变体植株的鉴定方法如下：
[0178] 从番茄幼嫩叶片中提取总DNA采用CTAB，其步骤为：
[0179] (1)取待测植株0.5g新鲜植物叶片置于研钵中，加入适量液氮，迅速研磨成均匀粉末。
[0180] (2)将粉末移入1.5mL离心管，加入800μL CTAB分离缓冲液，上下颠倒离心管，混合均匀。
[0181] (3)将盛有样品的离心管置于65℃水浴中保温30min，其间每隔3-4min轻摇混匀。低温12,000rpm离心5min，将上层水相转移至新的离心管中。
[0182] (4)加入等体积的Tris-酚和氯仿异戊醇，上下颠倒离心管，混合均匀；低温12,000rpm离心5min，将上层水相转移至新的离心管中。
[0183] (5)加入等体积的氯仿异戊醇上下颠倒离心管，混合均匀；低温12,000rpm离心5min，将上层水相转移至新的离心管中。
[0184] (6)加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，置于-20℃沉淀30min。
[0185] (7)低温12,000rpm离心5min去上清，加入500μL 70％乙醇洗涤沉淀，常温12,000rpm2min，去上清，沉淀尽量干燥。
[0186] (8)加入适量含有RNase的TE(20μL)溶解沉淀，37℃水浴30min，消化RNA。
[0187] (9)取适量基因组DNA样品，电泳检测。
[0188] (10)在sgRNA前后各设计一条引物sgRNA-2F：5′-CGGCGAAACATCATTTCAGA-3′(SEQ TD NO.5)，sgRNA-2R的序列为：5′-AGGAAGCTCCTCCCCACTAGCA-3′(SEQ TD NO.6)，进行PCR扩增，PCR产物由杭州擎科梓熙生物技术有限公司测序，用BioXM软件(V2.7)进行序列比对。
[0189] 根据测序结果和序列比对分析，获得纯合的TGase突变体，突变体的验证结果如图2所示，TGase-1缺失10个碱基，TGase-2多一个碱基，突变后氨基酸不能正常翻译，由此，筛选两个独立的番茄TGase基因敲除的突变体植株TGase-1、TGase-2用于后续实验。
[0190] 实施例5对实施例3制备得到的番茄TGase基因过表达的转基因植株和实施例4制备得到的番茄TGase基因敲除的突变体植株高温胁迫处理
[0191] 高温胁迫处理的具体方法如下：
[0192] 本研究分为野生型番茄Ailsa Craig空白对照组、番茄TGase基因过表达的转基因植株组、番茄TGase基因敲除的突变体植株组。
[0193] 当番茄TGase基因过表达植株OE-1#、OE-2#，番茄TGase基因敲除的突变体植株TGase-1、TGase-2和野生型番茄Ailsa Craig幼苗长至三叶一心时，各挑选长势整齐一致的幼苗分为两组，一组为未经胁迫处理的对照组，一组为高温胁迫实验组。
[0194] 对照组转移到人工气候箱(RXZ-500D智能型，江南仪器厂，宁波)。处理温度为25/22℃(昼/夜)。
[0195] 实验组转移到人工气候箱(RXZ-500D智能型，江南仪器厂，宁波)。高温胁迫处理温度为42/42℃(昼/夜)。高温胁迫处理时间为24小时。
[0196] 实验结束即出现表型后拍照并测定电导率和Fv/Fm。结果如图3～5所示，图中WT为未转基因的野生型番茄Ailsa Craig，TGase-1、TGase-2为番茄TGase基因敲除的突变体植株，OE-1#、OE-2#为番茄TGase基因过表达的转基因植株。
[0197] 结果表明，高温处理24小时后，过表达植株没有出现失水症状，相反的是，突变体和WT植株大部分叶片出现萎蔫症状，且突变体更为严重(图3)。所有的对照植株的电解质渗透率(EL)没有显著性差异，但是，高温处理后，TGase-1和TGase-2突变体植株的EL比WT植株分别增加了13.4％和9.45％；然而，与WT植株相比，两个TGase过表达植株的EL分别降低了21.41％和25.0％(图4)。另外，对照条件下，植株的Fv/Fm没有显著差异，高温胁迫下，突变体和WT植株的Fv/Fm显著下降，WT植株明显高于突变体植株，且过表达植株的Fv/Fm明显高于WT植株(图5A和图5B)。
[0198] 综上，TGase沉默后的植株对高温更为敏感，相反，番茄TGase基因过表达的转基因植株的抗旱性显著增强，番茄TGase基因过表达能够增强植株的高温抗性。
[0199] 实施例6对实施例3制备得到的番茄TGase基因过表达的转基因植株和实施例4制备得到的番茄TGase基因敲除的突变体植株干旱胁迫处理
[0200] 干旱胁迫处理的具体方法如下：
[0201] 本研究分为野生型番茄Ailsa Craig空白对照组、番茄TGase基因过表达的转基因植株组、番茄TGase基因敲除的突变体植株组。
[0202] 当番茄TGase基因过表达植株OE-1#、OE-2#，番茄TGase基因敲除的突变体植株TGase-1、TGase-2和野生型番茄Ailsa Craig幼苗长至三叶一心时，挑选长势整齐一致的幼苗分为两组，一组为未经胁迫处理的对照组，一组为干旱胁迫实验组。
[0203] 当番茄长至五叶一心时干旱胁迫实验组和对照组同时浇水至饱和，之后对照组植株正常浇水，直至实验结束；干旱胁迫实验组之后每隔1天ZigWSN记录仪测量一次相对土壤含水量(VWC)并根据失水量补充水分使水分保持一致，直至处理结束，干旱胁迫实验组整个干旱胁迫过程中控制相对土壤含水量从100％缓慢降低至30％左右，干旱胁迫时间为13天。
[0204] 实验结束即出现表型后拍照并测定电导率和Fv/Fm。实验结果见图6～7所示，图中WT为未转基因的野生型番茄Ailsa Craig，TGase-1、TGase-2为番茄TGase基因敲除的突变体植株，OE-1#、OE-2#为番茄TGase基因过表达的转基因植株。
[0205] 结果表明，干旱处理后，番茄TGase基因过表达的转基因植株OE-1#和OE-2#只有部分老叶表现出失水症状，而大部分叶片仍然保持绿色，相反的是，番茄TGase基因敲除的突变体植株TGase-1、TGase-2的叶子呈现极度萎蔫(图6)。所有的对照植株的相对含水量(RWC)没有显著差异。然而，干旱胁迫下，TGase-1和TGase-2突变体植株的RWC比WT植株分别降低了17％和16.6％；OE-1#和OE-2#植株的RWC分别比WT植株增加10.7％和17.18％(图7B)。另外，所有的对照植株的导电率(EL)没有显著性差异，但是，干旱处理后，TGase-1和TGase-2突变体植株的导电率(EL)比WT植株分别增加了19％和16％；然而，与WT植株相比，两个TGase过表达植株的EL分别降低了5.72％和5.25％(图7A)。
[0206] 综上，TGase沉默后植株对干旱更为敏感，相反，番茄TGase基因过表达的转基因植株的抗旱性显著增强，番茄TGase基因过表达能够增加植株的抗旱性。
[0207] 实施例7对实施例3制备得到的番茄TGase基因过表达的转基因植株和实施例4制备得到的番茄TGase基因敲除的突变体植株盐胁迫处理
[0208] 盐胁迫处理的具体方法如下：
[0209] 本研究分为野生型番茄Ailsa Craig空白对照组、番茄TGase基因过表达的转基因植株组、番茄TGase基因敲除的突变体植株组。
[0210] 当番茄TGase基因过表达植株OE-1#、OE-2#，番茄TGase基因敲除的突变体植株TGase-1、TGase-2和野生型番茄Ailsa Craig幼苗长至三叶一心时，挑选长势整齐一致的幼苗分为两组，一组为未经胁迫处理的对照组，一组为盐胁迫实验组。
[0211] 当番茄长至五叶一心时盐胁迫实验组和对照组同时浇水至饱和，之后对照组植株正常浇水，直至实验结束；盐胁迫实验组每株苗每隔一天浇灌含有200mM NaCl的200ml ddH2O，直至处理结束。盐胁迫处理时间8天。
[0212] 实验结束即出现表型后拍照并测定电导率和Fv/Fm。结果如图8～11所示，图中WT为未转基因的野生型番茄Ailsa Craig，TGase-1、TGase-2为番茄TGase基因敲除的突变体植株，OE-1#、OE-2#为番茄TGase基因过表达的转基因植株。
[0213] 如图所示，所有的对照植株没有显著差异，但盐胁迫处理8d后，番茄TGase基因敲除的突变体植株TGase-1、TGase-2的子叶开始失绿，WT和突变体植株TGase-1、TGase-2的叶片开始萎黄，而WT植株的状态优于突变体植株，相反番茄TGase基因过表达的转基因植株OE-1#和OE-2#的叶片依旧保持绿色，明显优于WT植株(图8)。为了确认观察到的表型，我们测定了WT、TGase-1、TGase-2和OE-1#、OE-2#植株的叶绿素含量。结果表明，所有对照植株的叶绿素含量没有显著性差异。盐胁迫处理后，TGase-1和TGase-2植株的叶绿素含量比他们的对照植株分别少了61.0％和61.8％。尽管盐胁迫处理后WT和OE-1#、OE-2#植株中的叶绿素含量都有所减少，但OE-1#、OE-2#植株中的含量显著高于WT植株(图11B)，另外，盐胁迫处理后，番茄TGase基因过表达的转基因植株OE-1#和OE-2#的干鲜重明显的高于WT和番茄TGase基因敲除的突变体植株TGase-1、TGase-2(图11A和C)；此外，番茄TGase基因过表达的转基因植株OE-1#和OE-2#的Fv/Fm明显高于WT和突变体植株TGase-1、TGase-2(图10A和图10B)，且番茄TGase基因过表达的转基因植株OE-1#和OE-2#的EL明显高于WT和突变体植株TGase-1、TGase-2(图9)。
[0214] 综上，沉默TGase后明显降低了番茄对盐胁迫的抗性，相反，番茄TGase基因过表达的转基因植株的抗盐性明显高于WT植株，番茄TGase基因过表达能够增加植株的盐胁迫抗性。
[0215] 经本发明研究发现，番茄TGase基因能够响应多种胁迫，当植物受到如高温、干旱和盐胁迫等逆境胁迫后，番茄TGase基因会被激活，加速多胺与蛋白结合，维持蛋白结构的稳定性，从而增强植株对逆境胁迫的抗性。因此，番茄TGase基因过表达可以增强植株的非生物胁迫抗性，而番茄TGase基因抑制表达导致植株非生物胁迫抗性减弱，因此，番茄TGase可以增强其非生物胁迫抗性。
[0216] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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