一种用于得到对盐胁迫高敏感的植物的质粒载体及方法
阅读：648发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种用于得到对盐胁迫高敏感的植物的质粒载体及方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 植物 育种技术领域，具体涉及一种用于得到对 盐胁迫 高敏感的植物的质粒载体及方法。该质粒载体包含MdMAX1基因表达框和筛选标记，所述MdMAX1基因表达框由包含在植物中组成型表达的强启动子和由所述强启动子控制表达的MdMAX1基因，所述MdMAX1基因表达的蛋白序列如SEQ ID NO:1所示。该方法包括将质粒载体导入到植物细胞中，筛选携带有所述质粒载体的植物细胞，并将其培育成植株，即得到对盐胁迫高敏感的植物。该技术方案从苹果嘎啦中分离克隆出的抗盐相关基因完整编码区段的核苷酸序列，同时提供了该基因在抗盐的转基因拟南芥和 烟草 中的应用，可用于通过植物基因工程技术改善植物抗盐性和其他有益生产性状。，下面是一种用于得到对盐胁迫高敏感的植物的质粒载体及方法专利的具体信息内容。
1.一种用于得到对盐胁迫高敏感的植物的方法，其特征在于，包括以下步骤：质粒载体导入到植物细胞中，筛选携带有所述质粒载体的植物细胞，并将其培育成植株，即得到对盐胁迫高敏感的植物,所述质粒载体包含MdMAX1基因表达框和筛选标记，所述MdMAX1基因表达框由包含在植物中组成型表达的强启动子和由所述强启动子控制表达的MdMAX1基因，所述MdMAX1基因表达的蛋白序列如SEQ ID NO:1所示，所述MdMAX1基因的序列如SEQ ID NO:2所示，所述质粒载体由所述MdMAX1基因顺着CaMV35S启动子的转录方向插入到pCAMBIA
1300质粒的BamHⅠ和PsTⅠ之间得到。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物是拟南芥、苹果或烟草。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）用所述质粒载体转化农杆菌LBA4404，得到携带有所述质粒载体的农杆菌LBA4404；
2）用所述携带有所述质粒载体的农杆菌LBA4404制作为侵染液；
3）用所述侵染液侵染拟南芥花序，收集果荚，抗性筛选后，PCR 检测得到阳性转基因植株，经过连续多代筛选得到纯合体，收取种子，培养，得到对盐胁迫高敏感的拟南芥。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1） 将获得的拟南芥种子，分别用70%酒精消毒3min，4%次氯酸钠消毒8-10min，灭菌水冲洗5次，吸干水，播种于种子萌发培养基上，光培养，至小苗长出，移栽到基质培养到开花；
2） 选取农杆菌LBA4404单克隆菌落接种于10mL YEP液体培养基中，28℃、200 rpm，振荡培养至OD600为 0.6-0.8；取其中lmL菌液加入20mL YEP液体培养基内，28℃、200rpm，振荡培养至OD600为 0.6-0.8，离心收集菌体，用稀释液悬浮稀释20倍，得到侵染液，备用；
3）将拟南芥花序浸到侵染液中15-20s，收集果荚，50 mg • L-1 Hyg 抗性筛选后，PCR 检测得到阳性转基因植株，经过连续 3 代筛选得到 T3 代纯合体，收取种子，培养，得到对盐胁迫高敏感的拟南芥。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）用所述质粒载体转化农杆菌LBA4404，得到携带有所述质粒载体的农杆菌LBA4404；
2）用所述携带有所述质粒载体的农杆菌LBA4404转化为侵染液；
3) 用所述侵染液侵染烟草的幼嫩组织，分化培养得到初代芽体后切下进行继代培养，生根培养，得到对盐胁迫高敏感的烟草。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）播种：将获得的烟草种子，分别用70%酒精消毒1min，0.7%次氯酸钠消毒23-25min，灭菌水冲洗3次，吸干水，播种于种子萌发培养基上，光培养；
2）预培养：剪下幼嫩叶片，切成方形,叶片向光面向上摆放于预培养培养基上，倒置培养1d；
3）选取农杆菌LBA4404单克隆菌落接种于10mL YEP液体培养基中，28℃、200 rpm，振荡培养至OD600为 0.6-0.8；取其中lmL菌液加入20mL YEP液体培养基内，28℃、200rpm，振荡培养至OD600为 0.6-0.8，离心收集菌体，用MS液体培养基悬浮稀释20倍，得到侵染液，备用；
4）将经预培养的烟草叶片浸入菌液10 min，期间多次摇晃；然后倒掉菌液，用无菌滤纸吸干多余菌液，转移至共培养基上，封口，28℃暗培养1 d，之后，移至分化培养基上培养，每隔15 d更换一次培养基；
5）待芽长至2cm时，切下，部分继续继代培养，部分移入MS生根培养基上进行生根，根系发育好后，炼苗后移入盛有基质的营养钵中，温室常规管理，得到对盐胁迫高敏感的烟草。
一种用于得到对盐胁迫高敏感的植物的质粒载体及方法
技术领域
[0001] 本发明属于植物育种技术领域，具体涉及一种用于得到对盐胁迫高敏感的植物的质粒载体及方法。
背景技术
[0002] 植物经常处于逆境胁迫的环境中，植物应对胁迫常见的响应就是促进活性氧的积累（Halliwellet al.，1998）。RCD1蛋白是植物逆境和生长发育过程中一个重要的调节因子（Jaspers et al.，2009；Teotia S et al.，2009）。SRO是植物特有的小蛋白家族，在拟南芥中，该家族共有六个成员，包括RCD1和5个SROs (SIMILAR-TO-RCD-ONE)，即AtSRO1-AtSRO5（Jaspers et al.，2009）。RCD1蛋白包含一个保守的球状WWE结构域和一个PARP(poly ADP-ribose polymerase)结构域，WWE结构域可以调节特定蛋白质之间的相互作用（Aravindet al.，2001）。
[0003] 土壤盐渍度是一个影响植物生长和农业生产力的重要环境因素，盐渍土中的Na+在植物体细胞质中过度积累对植物生长发育是不利的（Liu et al.，2001）。SOS(salt overly sensitive)途径负责维持植物体内的Na+平衡（Zhu et al.，2002），Na+/H+逆向转运蛋白SOS1定位于质膜上，它可以将细胞内的Na+排出（Qiu et al.，2002）。拟南芥中，过量表达SOS1可以提高抗盐胁迫能力。前人研究表明，拟南芥SOS1和RCD1在盐胁迫和氧化胁迫时发生相互作用，共同参与植物的抗盐和抗氧化途径（Katiyar-Agarwal et al.，2006）。
[0004] 植物体内对氧化胁迫的响应有利于植物的正常生长发育。前人研究表明酵母的Yap1 (Yeast activator proteins 1)参与酵母细胞对H2O2引起的氧化胁迫反应，它作为H2O2转录因子在氧化胁迫信号中扮演重要角色（Carmel‐Harel et al.，2001；Fernandes et al.，1997）。植物中有许多参与氧化胁迫的相关因子已被深入研究，比如致病相关蛋白（RP）、抗坏血酸氧化酶（APX）、苯丙氨酸氨裂合酶（PAL）和谷胱甘肽-S-转移酶（GST）等（Teotia et al.，2009）。Belles-Boix等研究表明，拟南芥RCD1可以增强酵母抗氧化能力并互补Yap1突变酵母表型，表明AtRCD1在拟南芥的氧化胁迫中扮演重要的角色（Belles-Boix et al.，2000）。拟南芥突变体rcd1-1表现出对臭氧和超氧化物超敏感，引起超氧根离子的积累，并在短时间内传播病态（Overmyer et al.，2005）。此外，突变体还表现出对脱落酸、乙烯、茉莉酸甲酯敏感度降低，并且这几种植物激素调节基因的表达量也发生了改变（Overmyer et al.，2000）。因此，AtRCD1在调节拟南芥的生长发育及对环境胁迫的反应中发挥重要作用。
[0005] 拟南芥中，AtRCD1的同源基因AtSROs在PARP(Poly ADP-ribose polymerase)催化中心和C-末端的RST[RCD-SRO-TAF4(TATA-box-binding protein-associated factor 4)]结构域上与AtRCD1具有高度保守性（Jaspers et al.，2009）。研究表明，AtSRO1与AtRCD1之间在功能上存在部分功能冗余, AtSRO1同样参与到非生物胁迫反应当中（Ahlfors et al.，2009；Jaspers et al.，2009；Overmyer et al.，2000），AtSRO5表达明显受盐胁迫诱导（Borsani et al.，2005），AtSRO2、AtSRO3和AtSRO5也显示出对多种非生物胁迫下转录子水平的变化,比如强光、盐处理及O（3 Jaspers et al.，2010）。然而AtSRO4的研究相对较少，没有相关类似的功能。
[0006] 在拟南芥中RCD1已经进行了克隆和功能鉴定，但是在苹果中的尚未见报道。因此，需要一种得到对盐胁迫具有增强抗性的植物的方法。
发明内容
[0007] 为解决现有技术的不足，本发明提供了一种用于得到对盐胁迫高敏感的植物的质粒载体及方法。该技术方案从苹果嘎啦中分离克隆出的抗盐相关基因完整编码区段的核苷酸序列，同时提供了该基因在抗盐的转基因拟南芥和烟草中的应用，可用于通过植物基因工程技术改善植物抗盐性和其他有益生产性状。
[0008] 一种用于得到对盐胁迫高敏感的植物的质粒载体，包含MdMAX1基因表达框和筛选标记，所述MdMAX1基因表达框由包含在植物中组成型表达的强启动子和由所述强启动子控制表达的MdMAX1基因，所述MdMAX1基因表达的蛋白序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009] 该基因片段来源于嘎啦苹果组培苗，其通过特殊设计的引物扩增嘎啦基因组DNA获得，其中所述的引物包括引物1， 5-CCATCACCAATCTATTAAACCT-3，引物2，5-CAAGAACATTACAGGACTGAAG-3，得到cDNA全长序列。该基因的开放阅读框（open reading frame, ORF）为1623bp，编码540个氨基酸。之后利用强启动子（花椰菜花叶病毒35S启动子）驱动原理的转基因技术，将MdMAX1基因的超量表达载体转入拟南芥和烟草中，从而获得转基因植株。超量表达MdMAX1基因的转基因拟南芥在盐胁迫下，萌发率明显降低，叶片中活性氧物质含量显著增多；同时MdMAX1基因表达量显著提高的遗传转化烟草对盐胁迫更加敏感，说明MdMAX1基因在植株抗盐中发挥重要作用。
[0010] 优选的，所述MdMAX1基因的序列如SEQ ID NO:2所示。
[0011] 优选的，所述植物是拟南芥、苹果或烟草。
[0012] 优选的，所述质粒载体由所述MdMAX1基因顺着CaMV35S启动子的转录方向插入到pCAMBIA 1300质粒的BamHⅠ和PsTⅠ之间得到。
[0013] 本发明还提供了一种用于得到对盐胁迫高敏感的植物的方法，包括以下步骤：将权利要求1-4中任一项所述的质粒载体导入到植物细胞中，筛选携带有所述质粒载体的植物细胞，并将其培育成植株，即得到对盐胁迫高敏感的植物。
[0014] 具体的，所述植物是拟南芥、苹果或烟草。
[0015] 当为拟南芥时，用于得到对盐胁迫高敏感的植物的方法包括以下步骤：
[0016] 1）用所述质粒载体转化农杆菌LBA4404，得到携带有所述质粒载体的农杆菌LBA4404；
[0017] 2）用所述携带有所述质粒载体的农杆菌LBA4404制作为侵染液；
[0019] 具体的，包括以下步骤：
[0021] 2） 选取农杆菌LBA4404单克隆菌落接种于10mL YEP液体培养基中，28℃、200 rpm，振荡培养至OD600为 0.6-0.8；取其中lmL菌液加入20mL YEP液体培养基内，28℃、200rpm，振荡培养至OD600为 0.6-0.8，离心收集菌体，用稀释液悬浮稀释20倍，得到侵染液，备用；
[0022] 3）将拟南芥花序浸到侵染液中15-20s，收集果荚，50 mg • L-1 Hyg 抗性筛选后，PCR 检测得到阳性转基因植株，经过连续 3 代筛选得到 T3 代纯合体，收取种子，培养，得到对盐胁迫高敏感的拟南芥。
[0023] 当为烟草时，用于得到对盐胁迫高敏感的植物的方法包括以下步骤：
[0024] 1）用所述质粒载体转化农杆菌LBA4404，得到携带有所述质粒载体的农杆菌LBA4404；
[0025] 2）用所述携带有所述质粒载体的农杆菌LBA4404转化为侵染液；
[0026] 3) 用所述侵染液侵染烟草的幼嫩组织，分化培养得到初代芽体后切下进行继代培养，生根培养，得到对盐胁迫高敏感的烟草。
[0027] 具体的，包括以下步骤：
[0028] 1）播种：将获得的烟草种子，分别用70%酒精消毒1min，0.7%次氯酸钠消毒23-25min，灭菌水冲洗3次，吸干水。播种于种子萌发培养基上，光培养；
[0029] 2）预培养：剪下幼嫩叶片，切成方形,叶片向光面向上摆放于预培养培养基上，倒置培养1d；
[0030] 3）选取农杆菌LBA4404单克隆菌落接种于10mL YEP液体培养基中，28℃、200 rpm，振荡培养至OD600为 0.6-0.8；取其中lmL菌液加入20mL YEP液体培养基内，28℃、200rpm，振荡培养至OD600为 0.6-0.8，离心收集菌体，用MS液体培养基悬浮稀释20倍，得到侵染液，备用；
[0031] 4）将经预培养的烟草叶片浸入菌液10 min，期间多次摇晃；然后倒掉菌液，用无菌滤纸吸干多余菌液，转移至共培养基上，封口，28℃暗培养1 d，之后，移至分化培养基上培养，每隔15 d更换一次培养基。
[0034] 图1：MdMAX1与其同源基因蛋白序列比对。
[0035] 图2：嘎啦组培苗在不同逆境处理条件下，MdMAX1基因的相对表达量。
[0036] 分别用100mMNaCl（左图）和300mM甘露醇（右图）处理嘎啦苹果组培苗，分别于0h、3h、6h、12h、24h取样，用液氮固定，进行RNA提取并反转录作为模板，检测MdMAX1基因的相对表达量。
[0037] 图3：超量表达构建载体 pCAMBIA1300图谱。
[0038] 图4：野生型拟南芥（col）和转基因拟南芥株系(#3、#5、#7、#8)的半定量RT-PCR以及定量PCR检测MdMAX1基因表达量。野生型拟南芥（col）中MdMAX1表达量为1。
[0039] 图5：盐和甘露醇胁迫下拟南芥种子萌发实验。（A-C）在1/2MS，150mMNaCl、300mM甘露醇培养基下，野生型拟南芥（col）和转基因拟南芥株系(#3、#5、#7、#8)萌发情况观察及统计。（D）不同浓度NaCl（75mM、125mM和150mM）处理以及不同浓度甘露醇（200mM、300mM）处理，拟南芥萌发情况统计。
[0040] 图6：DAB和NBT染色观察离体叶片活性氧积累情况。野生型拟南芥（col）和转基因拟南芥株系(#3、#5、#7、#8)离体叶片150mMNaCl和200mM甘露醇处理4h,DAB和NBT染色观察叶片中活性氧（H2O2和O2-）含量。
[0041] 图7：野生型烟草（NC89）和转基因拟南芥株系(MAX1-9、MAX1-11和MAX1-17)定量PCR检测MdMAX1基因表达量。基因表达量最低的MAX1-11株系中MdMAX1基因表达量设定为1。
[0042] 图8：野生型烟草（NC89）和转基因拟南芥株系(MAX1-9、MAX1-11和MAX1-17)用300mMNaCl处理15天后表型观察。
具体实施方式
[0043] 以下对本发明的原理和特征进行描述，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本领域现有技术。
[0044] 实施例1：分离克隆MdMAX1基因和基因结构分析
[0045] 1. 从苹果嘎啦品种中分离克隆MdMAX1基因
[0046] （1）嘎啦组培叶片RNA提取及反转录
[0049] 根据NCBI查到的拟南芥中MAX1基因保守氨基酸序列，设计兼并引物（MdMAX1-F,MdMAX1-R），以实例1步骤一）反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增。
[0050] MdMAX1-F： 5’- CCATCACCAATCTATTAAACCT -3’，其序列如SEQ. ID. NO.3所示；
[0051] MdMAX1-R： 5’- CAAGAACATTACAGGACTGAAG -3’，其序列如SEQ. ID. NO.4所示；
[0052] PCR扩增体系方法同MdSIMYB1专利（专利号201210197919.5）中实例1步骤四）中2）的PCR体系。
[0053] PCR反应程序：94℃预变性5分钟；循环参数为94℃变性40秒、56℃退火40秒、72℃延伸90秒，进行32个循环；72℃充分延伸10分钟。
[0054] PCR反应结束后，PCR产物进行回收、载体连接、转化（具体方法参见专利201210197919.5实例1步骤四）中的1），在北京六合华大基因科技股份有限公司进行序列测定后，得到MdMAX1基因，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。测序正确的单克隆，碱法提取pMD18-T-MdMAX1的质粒DNA，-20℃保存，用于后续功能验证实验。
[0055] 2. 苹果MdMAX1基因产物的结构和氨基酸序列分析
[0056] 该基因的开放阅读框（open reading frame, ORF）为1623bp。由此推得，该基因编码540个氨基酸。将其氨基酸序列在国际基因库中检索，发现与已公布的拟南芥，葡萄，油菜等基因有较高的同源性。所以我们将该基因命名为MdMAX1。（附图1）
[0057] 实施例2：MdMAX1基因在盐胁迫处理下表达模式分析
[0058] （1）将生长状况一致的苹果嘎啦组培苗，分别用NaCl（100 mM）、甘露醇（300mM）处理苹果组培苗0h、3h、6h、12h、24h，用未处理的状态一致的材料做对照。材料取好后液氮中迅速固定，提取RNA并反转录得cDNA。。
[0059] （2）在MdMAX1基因的非保守区设计特异引物MdMAX1（qRT）-F、MdMAX1（qRT）-R，及苹果的内参引物Md18S-F、Md18S-R。
[0060] Md18S-F：5’-AAACGGCTACCACATCCA-3’；
[0061] Md18S-R：5’-CACCAGACTTGCCCTCCA-3’；
[0062] MdMAX1（qRT）-F: 5’- ATCAGCCACCACAGCATTCACAT -3’；
[0063] MdMAX1（qRT）-R：5’- GCGGTCCAAATCCATCAATCTCTGC -3’；
[0064] （3）用实例3步骤（1）中所得的cDNA为模板，用苹果内参引物Md18S-F和Md18S-R调整这些cDNA模板，使各cDNA模板浓度一致。
[0065] 反应程序为：94℃预变性4分钟；循环参数为94℃变性25秒、56℃退火25秒、72℃延伸30秒，运行25个循环；72℃后延伸l0分钟。扩增产物在1%琼脂糖凝胶上做电泳分析，用Lab Assistant TM Gel 3000Series凝胶成像分析仪检测条带亮度，据结果将cDNA稀释至适当倍数，使其浓度一致。
[0066] （4）用浓度一致的cDNA模板进行定量PCR，检测嘎啦组培苗经逆境处理后MdMAX1基因的表达差异。
[0067] 结果显示MdMAX1基因经盐和甘露醇胁迫处理后表达上调，表明该基因受盐和甘露醇胁迫诱导（附图2 左NaCl处理，右甘露醇处理）
[0068] 实施例3：MdMAX1基因载体的构建
[0069] 为研究MdMAX1基因的功能，将包含有MdMAX1基因编码区在内的共1623bp片段正确插入表达载体pCAMBIA 1300上。（附图3）
[0070] （1）利用DNAMAN等软件，根据分离出的MdMAX1基因的核苷酸序列（SEQ. ID. NO:1），设计带酶切位点的引物EMdMAX1-F和EMdMAX1-R，以实例1步骤二）中4）所保存的pMD18-T-MdMAX1的质粒DNA为模板，进行PCR反应。
[0071] EMdMAX1-F：5’- GGATCCCCATCACCAATCTATTAAACCT -3’ 其序列如SEQ. ID. NO.5所示；
[0072] 划横线部分为BamHⅠ酶切位点;
[0073] EMdMAX1-R：5’-CTGCAGCAAGAACATTACAGGACTGAAG -3’ 其序列如SEQ. ID. NO.6所示；
[0074] 划横线部分为PstⅠ酶切位点;
[0075] （2）PCR反应结束后，进行1.0%琼脂糖凝胶电泳、PCR产物回收、载体连接、转化、测序（具体步骤参见专利201210197919.5实例1步骤四）中的1）。碱法提取其质粒DNA，用BamHⅠ和PstⅠ双酶切，鉴定正确后用于后面的实验。
[0076] （3）用BamHⅠ和PstⅠ两个内切酶，同时双酶切中的（2）所得质粒DNA与pCAMBIA 1300质粒，回收MdMAX1的片段和pCAMBIA 1300载体片段，用T4连接酶将二者连接起来。筛选阳性克隆进行测序，从中选择正确的重组子pCAMBIA 1300- MdMAX1。
[0077] （4）用构建好的重组子pCAMBIA 1300- MdMAX1转化农杆菌LB4404感受态细胞。进行PCR鉴定，挑取阳性菌落进行测序。测序正确的重组子pCAMBIA 1300- MdMAX1单克隆用于后面拟南芥和烟草的转化。
[0078] 实施例4：转基因拟南芥和烟草的获得
[0079] （1）获得转基因拟南芥
[0080] 1. 将获得的拟南芥种子，分别用70%酒精消毒3min，4%次氯酸钠消毒8-10min(期间多次摇晃)，灭菌水冲洗5次，吸干水。播种于种子萌发培养基上（直接铺于表面），光培养（25-28℃，16h长日照/8h短日照，10d），至小苗长出。移栽到基质培养到开花。
[0081] 2. 挑取农杆菌单克隆菌落接种于10mL YEP液体培养基(含50mg/L 潮霉素)中，28℃、200 rpm，振荡培养至OD600为 0.6-0.8 (约48h)；取其中lmL菌液加入20mL YEP液体培养基内，28℃、200rpm，振荡培养至OD600为 0.6-0.8（约5h）。离心收集菌体，用侵染液（含0.05g/ml 蔗糖、0.03-0.05% Silweet）悬浮稀释20倍，备用；
[0082] 3. 将拟南芥花序浸到侵染液中15-20s，收集果荚，50 mg · L-1 Hyg 抗性筛选后，PCR 检测得到阳性转基因植株，经过连续 3 代筛选得到 T3 代纯合体，收取种子，进行表型分析。
[0083] （2）获得转基因烟草
[0084] 1.播种：将获得的烟草种子，分别用70%酒精消毒1min，0.7%次氯酸钠消毒23-25min(期间多次摇晃)，灭菌水冲洗3次，吸干水。播种于种子萌发培养基上（直接铺于表面），光培养（25-28℃，16h长日照/8h短日照，15d）。
[0085] 2.预培养：剪下幼嫩叶片，切成方形（约1cm）,叶片向光面向上摆放于预培养培养基上，倒置培养1d。
[0086] 3.挑取农杆菌单克隆菌落接种于10mL YEP液体培养基(含50mg/L 潮霉素)中，28℃、200 rpm，振荡培养至OD600为 0.6-0.8 (约48h)；取其中lmL菌液加入20mL YEP液体培养基内，28℃、200rpm，振荡培养至OD600为 0.6-0.8（约5h）。离心收集菌体，用MS液体培养基悬浮稀释20倍，备用；
[0087] 4.将经预培养的烟草叶片浸入菌液10 min，期间多次摇晃；然后倒掉菌液，用无菌滤纸吸干多余菌液，转移至共培养基上，封口，28℃暗培养1 d。之后，移至分化培养基上培养（条件：28℃，光照时间16h/d，光照强度2000 Lux）。每隔15 d更换一次培养基。
[0088] 5.待芽长至2cm左右时，切下，部分继续继代培养，部分移入MS生根培养基上进行生根。根系发育好后，炼苗后移入盛有基质的营养钵中，温室常规管理。
[0089] 种子萌发培养基：1/2 MS
[0090] 烟草预培养、共培养培养基：MS+NAA 0.5 mg/L +6-BA 2 mg/L
[0091] 烟草分化培养基：MS+ NAA 0.5 mg/L +6-BA 2 mg/L + Hyg 30mg/L+ Cb250mg/L.[0092] 烟草生根培养基： MS +IAA 0.1 mg/L
[0093] 实施例5：MdMAX1基因在拟南芥中功能验证
[0094] 利用筛选培养基（含100 mg/L潮霉素）筛选抗潮霉素阳性的候选转基因株系，共获得4个35S:MdMAX1阳性株系(#3、#5、#7和#8)；为进一步鉴定转基因株系，在进行继代培养时，每株系各取0.1g左右的组培苗，提取相应的RNA，反转录并进行半定量RT-PCR检测和定量，以确定这些株系中MdMAX1基因的表达水平。结果显示，MdMAX1基因在#3、#5、#7及#8中过量表达（附图4）。
[0095] 为了进一步确定转基因植株的功能，我们在盐胁迫条件下对拟南芥的萌发率进行统计，同时观察拟南芥叶片在胁迫下氧化性物质的积累情况。
[0096] 1）种子处理。将获得的拟南芥种子（col，#3，#5，#7，#8），分别用70%酒精消毒3min，4%次氯酸钠消毒8-10min(期间多次摇晃)，灭菌水冲洗5次，吸干水。播种于种子萌发培养基上（1/2MS，含75mM、100mM、125mM、150mMNaCl及200mM、300mM甘露醇）。4℃层积处理4天后至光下培养（25-28℃，16h长日照/8h短日照，10d）。
[0097] 2）种子萌发统计。光学显微镜下观察统计种子萌发率。
[0098] 3）结果观察。在1/2 MS培养基上，野生型和转基因株系种子萌发没有明显的差异；在含有150mMNaCl和300mM甘露醇的培养基上，转基因株系种子萌发比野生型明显慢，同时在不同浓度NaCl和甘露醇处理的培养基上，也显示出同样的结果（附图5）。对离体的叶片NaCl和甘露醇处理后，观察活性氧含量，结果显示，转基因株系叶片中活性氧物质（H2O2 和O2−）含量比野生型更多。（附图6）这说明超量表达MdMAX1基因的转基因拟南芥对盐胁迫更敏感。
[0099] 实施例6：MdMAX1基因在烟草中功能验证
[0100] 按照实施例5所示的方法，准备超量表达MdMAX1基因的转基因烟草。定量PCR结果显示，获得MAX1-9，MAX1-11，MAX1-17三个转基因烟草。（附图7）
[0101] 选择生长状态良好且均一的3个转基因株系和野生型的烟草幼苗，进行盐胁迫逆境处理。如图所示，在盐处理15天后，转基因烟草显示出更严重的枯萎表型。结果表明，超量表达MdMAX1基因的转基因烟草对盐胁迫更敏感。（附图8）。
[0102] 综上所述，这些结果充分说明了MdMAX1基因是一个抗盐相关的基因，该基因的过量表达可以降低植株的抗盐能力。
[0103] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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