技术领域
[0001] 本
发明涉及食品资源开发与应用领域，具体涉及一种具有抗氧化活性的小球藻胞外多糖。
背景技术
[0002] 微藻因生长周期短、不占农用耕地和油脂合成效率高等优势性能成为制备
生物燃料的理想原料之一，其研发投入对缓解我国
能源压
力、控制大气环境污染及社会经济可持续发展具有积极意义。然而，基于微藻的
生物燃料炼制由于其经济可行性低至今仍不能产业化，其主要原因之一在于较高的微藻油脂生产成本。因此，如何降低微藻油脂成本是实现微藻
生物柴油商业化的有效途径之一。
[0003] 目前众多研究者通过微藻油脂联产胞内其他组分(如虾青素、蛋白、叶黄素等)来拓展微藻多个应用途径，以期间接性地降低微藻油脂生产成本来实现微藻生物柴油产业化。如Araya等在平板光
生物反应器中利用三种小球藻生产油脂的同时联产叶黄素，通过培养条件优化同步提高了油脂和叶黄素的产量(Algal Research,2014,6:218-222)；陈等在氮胁迫条件下利用丝状桔色藻联产油脂和类胡萝卜素(Bioresource Technology,2016,214:567-573)以及Lamers等利用经氮饥饿诱导的杜氏盐藻同步生产类胡罗素和
脂肪酸(Journal of Biotechnology,2012,162:21-27)。尽管上述利用微藻油脂联产胞内其他组分策略，同步扩大了微藻的应用范围，在一定程度上降低了微藻油脂的生产成本，但上述联产组分均为胞内组分，其在后续分离制备过程中大大增加了分离提取成本，且有些组分如虾青素以酯化物形式存在藻细胞内，分离提取难度较大，对于降低微藻油脂生产成本收效甚微。
[0004] 事实上，微藻在
发酵培养积累胞内油脂过程中，尤其在
环境胁迫条件下(如营养缺乏、高光诱导、高
盐胁迫、低温培育、重
金属离子诱导等)会适应性地向胞外发酵培养基环境中分泌大量的多糖类物质，被称为胞外多糖(EPS)。此类胞外多糖或者多糖复合物因其黏度较大，可直接导致发酵培养基溶氧量急剧下降，易对微藻培养
进程造成不利影响，因而此类胞外多糖经常被忽略或直接作为副产物而舍弃。据研究报道显示，胞外多糖生理活性显著，具有抗氧化、抗病毒、抗
肿瘤和提高免疫功能等多重生物活性，且相对于其他微藻胞内组分(如
蛋白质、叶黄素、虾青素等)，此类多糖或者多糖复合物存在于微藻细胞壁外，易于与菌体分离，具有易提取、易纯化、后续操作简单等优势，因而其医学临床应用前景广阔。因此，利用微藻培养过程中向培养基分泌的胞外多糖不仅能充分挖掘这些副产物的高附加值，而且可为降低微藻油脂生产成本提供新思路，具有一定的社会经济效益。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种具有抗氧化活性的小球藻胞外多糖。
[0006] 本发明的技术方案是，一种具有抗氧化活性的小球藻胞外多糖，由盐胁迫协同光-暗交替模式液体培养的小球藻分泌和分离纯化得到，所述的小球藻胞外多糖平均相对分子量为131.79kDa，主要由摩尔百分比分别为19.81％、79.93％和0.25％的木糖、甘露糖和核糖组成(三者的摩尔百分比达到99.99％)，其对DPPH自由基、超氧阴离子、羟基自由基、ABTS自由基的清除效果均呈现明显的剂量效应。
[0007] 进一步地，所述的小球藻为Chlorella protothecoides CS-41种属。
[0008] 进一步地，所述的盐胁迫协同光-暗交替模式液体培养具体为：小球藻藻种经常规无菌操作法平板复壮后，接入液体培养基中培养数天获得小球藻接种
种子液，然后将种子液接入含
氯化钠的液体培养基中，并在光照-黑暗交替模式下培养数天获得小球藻培养液。
[0009] 进一步地，小球藻胞外多糖的分泌和分离纯化具体为：将盐胁迫协同光-暗交替模式液体培养数天的小球藻液离心收集上清，并以蒸馏
水洗涤离心管底小球藻泥数次后，合并所有上清，将所得上清进行减压浓缩和醇沉(通常为过夜醇沉)，离心收集获得沉淀物，以蒸馏水复溶沉淀物，再加入三氯甲烷-异丙醇复合
试剂除蛋白质，后经
透析、
冷冻干燥获得小球藻胞外粗多糖；将制得的小球藻胞外粗多糖复溶于缓冲液中，上样至阴离子交换层析柱中，以氯化钠溶液进行洗脱，以蒽
酮-
硫酸法监测洗脱液糖含量并绘制洗脱曲线，收集洗脱峰组分，将得到的洗脱峰组分经冻干、缓冲液复溶处理后上样至尺寸排阻层析柱中，再次采用蒽酮-硫酸法监测洗脱液糖含量并绘制洗脱曲线，收集的洗脱峰组分经透析、浓缩、冷冻干燥处理，即得纯化小球藻胞外多糖。
[0010] 进一步地，小球藻胞外多糖采用如下方法进行组成分析：将纯化获得的小球藻胞外多糖用超纯水配制成样品溶液，滤
膜过滤，取过滤样品液上样至高效凝胶渗透色谱HPGPC，确认小球藻胞外多糖纯度及相对分子
质量；然后另取纯化后的小球藻胞外多糖，经三氟乙酸
水解、
盐酸羟胺和吡啶肟化、乙酸酐酰化后，再以氯仿溶解乙酰化后产物进行GC-MS分析，测定小球藻胞外多糖的单糖组成，其气相色谱条件为：HP-5毛细管柱；进样量：2μL，进样口
温度250℃，流速1mL/min；升温程序：150℃保持2min，每分钟升温8℃至250℃，保持6min；另取纯化后的小球藻胞外多糖，经研细、压片机压片后在4000cm-1-500cm-1范围内进行红外
光谱扫描分析，获得小球藻胞外多糖的糖苷键类型；以AVANCEⅢHD 400mHZ型
核磁共振仪采集纯化后的小球藻胞外多糖1H NMR氢谱图，获得小球藻胞外多糖的单糖糖环构型。
[0011] 进一步地，小球藻胞外多糖采用如下方法进行抗氧化活性鉴定：以不同浓度梯度的纯化后的小球藻胞外多糖样品与DPPH-甲醇溶液等体积混匀，后避光静置数分钟，于570nm处测定其吸光度值，计算小球藻胞外多糖对DPPH自由基的清除率；以不同浓度梯度的纯化后的小球藻胞外多糖样品与NADH、NBT、Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)混匀，并加入PMS启动反应，测定其在560nm处的吸光值，并计算小球藻胞外多糖对超氧阴离子自由基的清除率；
以不同浓度梯度的纯化后的小球藻胞外多糖样品与FeSO4溶液混合，并加入H2O2启动反应，摇匀后静置，之后加入水杨酸-
乙醇溶液水浴反应，反应完成后在510nm下测定其吸光度值，+
并计算小球藻胞外多糖对羟基自由基的清除率；将ABTS·工作液与不同梯度浓度的纯化后的小球藻胞外多糖混合摇匀后，测定其在734nm处的吸光度值，并计算小球藻胞外多糖对ABTS自由基的清除率。
[0012] 本发明的有益效果在于：
[0013] (1)本发明首次从小球藻发酵培养基环境中分离出分泌于胞外的多糖，测定其平均相对分子量，分析其单糖组成并确定其具体的活性用途。
[0014] (2)小球藻胞外多糖对DPPH自由基、超氧阴离子、羟基自由基、ABTS自由基的清除效果均呈现明显的剂量效应，其IC50值分别为0.103±0.001mg/mL、0.029±0.001mg/mL、0.362±0.003mg/mL和0.093±0.003mg/mL。
[0015] (3)利用微藻培养过程中向培养基分泌的胞外多糖不仅能充分挖掘这些副产物的高附加值，而且可为降低用于生物柴油制备的微藻油脂的生产成本提供新思路，其社会经济效益显著。
附图说明
[0016] 图1是本发明小球藻抗氧化胞外多糖的DEAE Sepharose F.F.离子交换层析图。
[0017] 图2是本发明小球藻抗氧化胞外多糖的G-75凝胶柱层析图。
[0018] 图3是本发明小球藻抗氧化胞外多糖的HPLC-ELSD图。
[0019] 图4是本发明小球藻抗氧化胞外多糖的红外光谱图。
[0020] 图5是本发明小球藻抗氧化胞外多糖的核磁共振氢谱图。
[0021] 图6是本发明小球藻抗氧化胞外多糖对DPPH的清除作用图。
[0022] 图7是本发明小球藻抗氧化胞外多糖对超氧阴离子清除作用图。
[0023] 图8是本发明小球藻抗氧化胞外多糖对羟基自由基的清除作用图。
[0024] 图9是本发明小球藻抗氧化胞外多糖对ABTS自由基的清除作用图。
具体实施方式
[0025] 下面将结合具体
实施例对本发明做进一步的说明，但本发明并不限于此。
[0026] 实施例1
[0027] 1)盐胁迫协同光-暗交替模式液体培养小球藻
[0028] 以常规无菌操作方法，将小球藻藻种Chlorella protothecoides CS-41接种于Basal固体培养基上，光照培养5天获得复壮小球藻藻种。将复壮小球藻藻种挑取单菌落接种于液体Basal培养基中光照培养5天，获得一级小球藻种子液。以5％接种量将一级小球藻种子液接种到液体Basal培养基中，黑暗培养5天获得二级种子液。接着向含氯化钠(10‰
盐度)的Basal液体培养基中接种1％的二级种子液，并在光-暗交替(8h光照：16h黑暗)模式下培养7天获得小球藻培养液。
[0029] 2)小球藻胞外多糖分离纯化与制备
[0030] 将步骤1)中培养7天获得的小球藻培养液在8000rpm离心15min，收集上清，并用蒸馏水洗涤离心管底小球藻泥3～5次，合并所有上清。将合并所得上清液进行减压浓缩，以4倍浓缩液体积的无水乙醇醇沉过夜，离心收集获得沉淀物，将醇沉获得的沉淀物用蒸馏水进行复溶，将三氯甲烷-异丙醇复合试剂(4:1，v/v)加入复溶样品溶液(注：复溶样品溶液和复合试剂的体积比为1:1)剧烈震荡5min以除去蛋白质，后静置分层取最上层溶液(此过程重复2～3次)，合并所有上层溶液进行透析、冷冻干燥获得小球藻胞外粗多糖。
[0031] 将上述制得的小球藻胞外粗多糖重溶于20mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)，上样至DEAE Sepharose F.F.阴离子交换层析柱中，并分别用0、0.1、0.3mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，同时采用蒽酮-硫酸法监测各离心管洗脱液中糖含量并绘制洗脱曲线(如图1所示)，并同步收集0.3mol/L NaCl洗脱峰组分。将收集的洗脱峰组分经透析、冷冻干燥处理后重新溶解于0.01mol/L NaCl中，随后上样至Sephadex G-75凝胶柱中，以0.01mol/L NaCl为流动相进行洗脱，采用蒽酮-硫酸法监测各管洗脱液中的糖含量并绘制洗脱曲线(如图2所示)，收集洗脱峰组分，经透析、浓缩、冷冻干燥处理后获得纯化小球藻胞外多糖。
[0032] 3)小球藻胞外多糖组成分析
[0033] 小球藻胞外多糖纯度和分子量测定：将步骤2)中纯化获得的小球藻胞外多糖采用超纯水配制成10mg/mL的样品液，经0.22μm滤膜过滤后取约20μL上样至高效凝胶渗透色谱HPGPC进行图谱
数据采集。如图3结果所示，小球藻胞外多糖为单一狭窄的对称峰，保留时间为6.87min，可以判断其为单一组分纯品，其平均相对分子量为131.79kDa。
[0034] 小球藻胞外多糖单糖组成测定：称取20mg步骤2)纯化后的小球藻胞外多糖，加入10mL浓度为2mol/L的三氟乙酸，在110℃条件下水解6h，将水解产物干燥后加入2mL甲醇，重复3-4次，以除去三氟乙酸，然后将除去三氟乙酸的多糖样品加入10mg盐酸羟胺和0.6mL吡啶混合，90℃水浴反应30min，室温冷却后加入0.5mL乙酸酐在90℃下继续反应30min，反应后的产物经干燥后用1mL氯仿溶解进行GC-MS分析小球藻胞外多糖的单糖组成。其色谱条件为：HP-5毛细管柱；进样量：2μL，进样口温度250℃，流速1mL/min；升温程序：150℃保持
2min，每分钟升温8℃至250℃，保持6min。GC-MS分析结果表明，小球藻胞外多糖中存在木糖、甘露糖和核糖，且其摩尔百分比分别为19.81：79.93：0.25。
[0035] 小球藻胞外多糖红外光谱分析：取步骤2)纯化后的小球藻胞外多糖1～2mg与干燥溴化
钾粉末混合，研细后，用压片机压成1mm薄片用于红外光谱分析，红外扫描范围为4000cm-1-500cm-1。如图4所示，小球藻胞外多糖在3427.66cm-1处的强O-H伸缩振动吸收峰，
2926.79cm-1处的强C-H伸缩振动吸收峰，是典型的多糖特征吸收峰。1511.98cm-1附近是C-H的弯曲振动，1402.0cm-1附近是C-H的
变形振动，1384.38cm-1附近是CH3-的对称变
角振动，
1249.49cm-1附近是C-O的伸缩振动，1068.04cm-1附近是吡喃糖环的C-O-C和C-O-H单键的吸收峰，904.49cm-1附近是β-糖苷键的吸收峰，说明小球藻胞外多糖的键型是β-糖苷键，
804.21cm-1附近有吸收峰证明小球藻胞外多糖中含有吡喃甘露糖。
[0036] 小球藻胞外多糖核磁共振氢谱分析：采用氘代水将步骤2)纯化后的小球藻胞外多糖样品溶解，离心取上清，并转置于核磁管中，由AVANCEⅢHD 400mHZ型核磁共振仪采集小球藻胞外多糖1H NMR氢谱图。如图5所示，小球藻胞外多糖在δ4.5ppm-5.5ppm之间有3个
信号峰，证明小球藻胞外多糖中含有3种单糖，与单糖组成分析结果相一致。小球藻胞外多糖信号峰集在δ>5.00ppm区域有一个信号峰(δ5.04ppm)，在δ<5.00ppm区域内有两个信号峰(δ4.96ppm和δ4.86ppm)，表明小球藻胞外多糖既有α型的糖环结构又有β型的糖环结构。
[0037] 4)小球藻胞外多糖抗氧化活性鉴定
[0038] 小球藻胞外多糖DPPH自由基清除活性：将0.1mmol/L的DPPH-甲醇溶液与125μg/mL～1000μg/mL的小球藻胞外多糖样品溶液等体积混合，摇匀后避光静置30min，于570nm处测定其吸光度值(正对照为维生素C)，并根据式1计算小球藻胞外多糖对DPPH自由基的清除率。如图6所示，小球藻胞外多糖对DPPH自由基的清除效果呈明显的剂量效应，当小球藻胞外多糖作用浓度为1000μg/mL时，对DPPH自由基的清除率为93.89±0.09％，其IC50值为0.103±0.001mg/mL。
[0039]
[0040] 其中，A0为蒸馏水空白组，Ai0为维生素C对照组，Ai为小球藻胞外多糖实验组。
[0041] 小球藻胞外多糖超氧阴离子自由基清除活性：将125μg/mL至1000μg/mL浓度范围内的小球藻胞外多糖样品与100μL 0.78mmol/L的NADH，100μL 0.5mmol/L的NBT，700μL 16mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)充分混匀，后加入100μL 0.1mmol/L的PMS启动反应，在560nm处测定其吸光度值(正对照为
没食子酸)，并根据式2计算小球藻胞外多糖清除超氧阴离子的活性。如图7所示，在小球藻胞外多糖浓度为125μg/mL至1000μg/mL范围内，小球藻胞外多糖表现出显著的超氧阴离子清除活性，其活性与多糖浓度呈正相关，在1000μg/mL作用浓度下，小球藻胞外多糖超氧阴离子清除率为98.15±1.01％，其IC50值为0.029±
0.001mg/mL。
[0042]
[0043] 其中，A0为蒸馏水空白组，AC0为没食子酸对照组，AC为小球藻胞外多糖实验组。
[0044] 小球藻胞外多糖羟基自由基清除活性：向125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL不同浓度的小球藻胞外多糖样品液中加入9mmol/L的FeSO4溶液后，加入H2O2启动反应，摇匀后静置10min。之后加入反应液质量50％乙醇配置的9mmol/L水杨酸-乙醇溶液，于37℃水浴反应30min。反应完成后在510nm下测定其吸光度值(正对照为维生素C)，并根据式3计算小球藻胞外多糖对羟基自由基的清除活性。如图8所示，小球藻胞外多糖在1000μg/mL的作用浓度下，对羟基自由基的清除率为80.97±0.26％，其IC50值为0.362±0.003mg/mL。
[0045]
[0046] 其中，A0为蒸馏水空白组，Ax0为维生素C对照组，Ax为小球藻胞外多糖实验组。
[0047] 小球藻胞外多糖ABTS自由基清除活性：配制7.4mmol/L的ABTS液与2.6mmol/L的+K2S2O8液，并等体积混合制成ABTS·工作液，摇匀后于室温、黑暗环境静置12h备用(用时将工作液稀释至OD734＝0.7)。将ABTS+·工作液分别与125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL浓度的小球藻胞外多糖样品以4:1的体积比混合摇匀，测定其在734nm下的吸光度值，并根据式4计算小球藻胞外多糖对ABTS自由基的清除活性。如图9所示，在小球藻胞外多糖样品浓度125μg/mL至1000μg/mL范围内，对ABTS自由基的清除活性与多糖浓度呈正相关，其IC50值为0.093±0.003mg/mL。
[0048]
[0049] 其中，A0为蒸馏水空白组，Ay0为维生素C对照组，Ay为小球藻胞外多糖实验组。
