一种与耐低氮胁迫和高盐胁迫相关的蛋白及其编码基因与应用
阅读：165发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种与耐低氮胁迫和高盐胁迫相关的蛋白及其编码基因与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种与耐低氮胁迫和高 盐胁迫 相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的 蛋白质 ，是如下a)或b)或c)的蛋白质：a) 氨 基酸序列是序列1所示的蛋白质；b)在序列1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。实验证明，本发明所提供的ZmCCT基因能够提高转ZmCCT基因植株后代中耐低氮胁迫和高盐胁迫抗性植株的比例，同时后代中的转ZmCCT基因阳性植株与阴性植株相比，对禾谷镰刀菌茎腐病的抗性有很大的提高。，下面是一种与耐低氮胁迫和高盐胁迫相关的蛋白及其编码基因与应用专利的具体信息内容。
1.如下任一所述在提高植物抗逆性或培育抗逆性提高的转基因植物中的应用；1）蛋白质，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
2）在SEQ ID NO：1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
3）编码1)所述的蛋白质的核酸分子；
4）含有3）所述核酸分子的表达盒；
5）含有3）所述核酸分子的重组载体；
6）含有4）所述表达盒的重组载体；
7）含有3）所述核酸分子的重组微生物；
8）含有4）所述表达盒的重组微生物；
9）含有5）所述重组载体的重组微生物；
10）含有6）所述重组载体的重组微生物；
所述植物为单子叶植物；
所述抗逆性为耐低氮性和/或抗盐性。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述核酸分子的编码序列是SEQ ID NO：2所示的cDNA分子。
3.一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法，包括将权利要求1中所述的蛋白质的编码基因导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的抗逆性高于所述受体植物；所述抗逆性为耐低氮性和/或抗盐性；所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2的第1-717位所示；
所述受体植物为单子叶植物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述转基因植物的耐低氮性和/或抗盐性高于所述受体植物体现在如下（D1）-（D8）中的任一种：
（D1）转基因植物的总根长高于所述受体植物；
（D2）转基因植物的主干根长高于所述受体植物；
（D3）转基因植物的主胚根长高于所述受体植物；
（D4）转基因植物的侧根长高于所述受体植物；
（D5）转基因植物的地下部干重高于所述受体植物；
（D6）转基因植物的地上部干重高于所述受体植物；
（D7）转基因植物的株高高于所述受体植物；
（D8）转基因植物的ZmABA2和ZmMPK5基因的表达水平高于所述受体植物。
一种与耐低氮胁迫和高盐胁迫相关的蛋白及其编码基因与
应用
技术领域
背景技术
[0002] 土壤贫瘠是影响世界范围内玉米产量不稳定的主要因素。世界14亿公顷的耕地土壤中，22.5％的土壤受到养分严重胁迫，只有约10.0％的土壤无养分胁迫或者轻度胁迫。玉米生产中，施用氮肥是玉米增产的重要措施之一，但在生产实践中存在两方面的问题。一是高产发达地区氮肥过量施用，不但导致氮肥利用率下降，生产成本提高，而且还有可能造成地下水硝酸盐超标；二是低产不发达地区往往由于氮肥施用不足，产量水平较低。鉴于氮肥施用增产的空间进一步减少，以及施用氮肥所带来的很多品质及环境问题，通过遗传学等手段选育氮高效的玉米品种才是解决粮食生产安全和环境保护的根本解决途径。
[0003] Moll等(Moll R H,Kamprath E J,Jackson W A.Analysis and interpretation of factors which contribute to efficiency of nitrogen utilization[J].Agronomy Journal,1982,74(3):562-564.)对氮效率做了经典的定义，即单位供氮量条件下的作物产量。氮高效可以分为两个部分，一为植物根系从土壤中吸收氮素的效率，二为植物体内氮素同化利用效率。Moll等认为氮利用效率在低氮条件下起主要的作用，而氮吸收效率在高氮条件下起主要作用。Ortiz-Monasterio等(Ortiz-Monasterio R,Sayre K D,Rajaram S,et al.Genetic progress in wheat yield and nitrogen use efficiency under four nitrogen rates[J].Crop Science,1997,37(3):898-904.)则认为低氮条件下氮效率的差异主要源自吸收效率，而高氮条件下利用率起主要作用。Lafitte和Edmeades(Lafitte H R,Edmeades G O.Improvement for tolerance to low soil nitrogen in tropical maize I.Selection criteria[J].Field Crops Research,1994,39(1):1-14.)认为低氮条件下氮利用效率与产量的相关性更好。米国华等(米国华,刘建安.玉米氮效率生理生化基础及遗传改良进展[J].玉米科学,1997,5(2):9-13.)结果显示，在高氮条件下吸收和利用效率二者并重。并且米国华等认为造成氮吸收效率和氮利用效率相对重要性的不同研究成果可能是由于不用基因型在不同环境中所引起的。
[0004] 玉米的氮高效是一个复杂的过程。目前玉米氮高效吸收的生理机理包括：(1)良好的根系构型(形态和空间分布)和根系特征；(2)良好的根系的生理代谢活性(呼吸作用等)；(3)地上部分具备优良性状；(4)苗期植株体内单循环促进根系对氮素的吸收。而玉米高效利用氮素的生理机制包括：(1)具有高活性的氮代谢关键酶；(2) 营养元素之间的相互作用以及一些物质的影响；(3)库容的反馈作用；(4)液泡贮存NO3-的充分利用及地上部分氮素挥发的减少；(5)氮素向籽粒的再转移能力强。作物的大多数重要的农艺性状如产量、品质及抗逆性都是由多个数量性状基因位点(quantitative trait loci,QTL)控制的数量性状。目前许多研究结果表明作物的氮效率也是由多个数量遗传位点控制的。
[0005] 据第二次全国土壤普查资料统计，在不包括滨海滩涂的前提下，我国盐渍土面积为3487万公顷，约为5亿亩，可开发利用的面积达2亿亩。提高作物的耐盐碱能力，对于开发边际土地，提高粮食产量，都具有重要的意义。目前栽培玉米对田间需水量大，对盐碱适应能力相对较低。苗期对盐胁迫更为敏感，其极限盐浓度(指的植株生长受抑制产量下降的盐浓度)只有约1.7dsm-1，约0.1％NaCl，从遗传学上来讲，植物的耐盐性是由多基因控制的数量性状，遗传机理复杂，而且易受环境条件的影响。定位和克隆耐盐对于阐明植物耐盐机理和育种应用均具有重要的意义。目前对于作物耐盐性QTL的研宄中已有显著进展，比如小麦，大麦，大豆、水稻等等,其中水稻研究最为系统。然而对于玉米耐盐性的QTL研究进展缓慢。
发明内容
[0006] 本发明所要解决的技术问题是如何调控植物抗逆性。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种与植物抗逆性相关蛋白。
[0008] 本发明所提供的与植物抗逆性相关蛋白的名称为ZmCCT，为如下a)或b)或c)的蛋白质：
[0009] a)氨基酸序列是序列1所示的蛋白质；
[0010] b)在序列1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
[0011] c)将序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
[0012] 其中，序列1由238个氨基酸残基组成。
[0014] 表1、标签的序列
[0015]
[0016]
[0017] 上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0018] 上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0019] 上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0020] 为了解决上述技术问题，本发明的另一个目的是提供与上述蛋白质相关的生物材料。
[0021] 本发明提供的与上述蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：
[0022] A1)编码上述蛋白质的核酸分子；
[0023] A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
[0024] A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
[0025] A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
[0026] A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
[0027] A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
[0028] A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
[0029] A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
[0030] A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
[0031] A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
[0032] A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0033] A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
[0034] 上述相关生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
[0035] 1)其编码序列是序列2所示的cDNA分子或序列3所示的基因组DNA分子；
[0037] 3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
[0038] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0039] 其中，序列2由717个核苷酸组成，编码序列1所示的氨基酸序列。
[0040] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的编码ZmCCT的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的ZmCCT的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码ZmCCT且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0041] 这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0042] 上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
[0043] 上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
[0044] 上述生物材料中，A2)所述的含有编码ZmCCT的核酸分子的表达盒(ZmCCT基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达ZmCCT的DNA，该DNA不但可包括启动ZmCCT转录的启动子，还可包括终止ZmCCT转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利
200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:
141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad 等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:
141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad 等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
[0045] 可用现有的表达载体构建含有所述ZmCCT基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。
使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0046] 上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
[0048] 上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
[0049] 为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述蛋白质或上述相关生物材料的新用途。
[0050] 本发明提供了上述蛋白质或上述相关生物材料在如下(1)-(6)中至少一种中的应用：
[0051] (1)调控植物对禾谷镰刀菌茎腐病的抗性；
[0052] (2)调控植物抗逆性；
[0053] (3)调控植物总根长和/或主干根长和/或主胚根长和/或侧根长和/或地下部干重和/或地上部干重和/或株高；
[0054] (4)调控与植物抗性相关基因的表达水平；
[0055] (5)培育抗禾谷镰刀菌茎腐病的转基因植物；
[0056] (6)培育抗逆性提高的转基因植物。
[0057] 上述应用中，所述调控为提高；所述抗逆性为耐低氮性和/或抗盐性；所述低氮具-1 - -1体为0.04mmolL NO3 ；所述高盐具体为50mmolL NaCl；所述调控植物抗逆性具体为在
0.04mmolL-1NO3-和/或50mmolL-1NaCl条件下，转ZmCCT植物的总根长高于所述受体植物和/或转ZmCCT植物的主干根长变长和/或转ZmCCT植物的主胚根长变长和/或转ZmCCT植物的侧根长变长和/或转ZmCCT植物的地下部干重提高和/或转ZmCCT植物的地上部干重提高和/或转ZmCCT植物的株高变高和/或转ZmCCT植物的抗性相关基因的表达水平提高。
0.04mmolL-1NO3-和/或50mmolL-1NaCl条件下，转ZmCCT植物的总根长高于所述受体植物和/或转ZmCCT植物的主干根长变长和/或转ZmCCT植物的主胚根长变长和/或转ZmCCT植物的侧根长变长和/或转ZmCCT植物的地下部干重提高和/或转ZmCCT植物的地上部干重提高和/或转ZmCCT植物的株高变高和/或转ZmCCT植物的抗性相关基因的表达水平提高。
[0058] 上述方法中，所述抗性相关基因为ZmABA2和ZmMPK5。
[0059] 为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法。
[0060] 本发明提供的培育抗逆性提高的转基因植物的方法包括将上述蛋白质的编码基因导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的抗逆性高于所述受体植物。
[0061] 上述方法中，
[0062] 所述抗逆性为耐低氮性和/或抗盐性；
[0063] 所述转基因植物的抗逆性高于所述受体植物体现在如下(D1)-(D7)中的任一种：
[0064] (D1)转基因植物的总根长高于所述受体植物；
[0065] (D2)转基因植物的主干根长高于所述受体植物；
[0066] (D3)转基因植物的主胚根长高于所述受体植物；
[0067] (D4)转基因植物的侧根长高于所述受体植物；
[0068] (D5)转基因植物的地下部干重高于所述受体植物；
[0069] (D6)转基因植物的地上部干重高于所述受体植物；
[0070] (D7)转基因植物的株高高于所述受体植物；
[0071] (D8)转基因植物的抗性相关基因的表达水平高于所述受体植物；所述抗性相关基因具体为ZmABA2和ZmMPK5。
[0072] 本发明还提供了一种培育抗禾谷镰刀菌茎腐病的转基因植物的方法。
[0073] 本发明提供的育抗禾谷镰刀菌茎腐病的转基因植物的方法包括将上述蛋白质的编码基因导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物对禾谷镰刀菌茎腐病的抗性高于所述受体植物。
[0074] 上述方法中，
[0075] 所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列2的第1-717位核苷酸分子。
[0076] 在本发明的实施例中，所述蛋白质的编码基因(即序列表中序列3所示的DNA分子)通过含有ZmCCT基因表达盒的ZmCCT基因重组表达载体导入所述受体植物中。所述含有ZmCCT基因表达盒的ZmCCT基因重组表达载体为重组表达载体pCAMBIA3301-ZmCCT；所述pCAMBIA3301-ZmCCT为在pCAMBIA3301载体的Sac I酶切位点间正向插入序列表中序列3所示的DNA分子，且保持pCAMBIA3301载体的其他序列不变得到载体。
[0077] 上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述ZmCCT基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
[0078] 上述方法中，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。
[0079] 上述方法中，所述受体植物为单子叶植物，为禾本科植物，为玉米，具体为玉米(Zea mays L.)品种HiⅡ。
[0080] 扩增所述ZmCCT基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
[0081] 实验证明，本发明所提供的ZmCCT基因能够提高转ZmCCT基因植株后代中耐低氮胁迫和高盐胁迫抗性植株的比例，同时后代中的转ZmCCT基因阳性植株与阴性植株相比，对禾谷镰刀菌茎腐病的抗性有很大的提高。附图说明
[0082] 图1为T0代转ZmCCT基因玉米植株进行PCR鉴定的电泳图谱。泳道1为D2000Marker，从下到上的条带大小依次为100bp，250bp，500bp，750bp，1kb以及2kb；泳道2、3、4、5、6、8、9、10、12、13、14、15、17、18、19、21、23、24、25和26均为转基因未成功个体；泳道7、11、16、20、22均为阳性转基因个体(条带大小为518bp)。
[0083] 图2为转ZmCCT基因阳性植株(P)及阴性植株(N)的抗病表现。其中，图2A为转ZmCCT基因阳性植株(P)及阴性植株(N)的植株表面；图2B为劈茎后转ZmCCT基因阳性植株(P)及阴性植株(N)。
[0084] 图3为T0代转ZmCCT基因玉米植株后代进行qRT-PCR鉴定的电泳图谱。泳道1为D2000Marker，上下两条带分别为250bp和100bp；泳道2、3、4、5、6、7均为阳性转基因个体(P)；8、9、10、11、12、13均为阴性转基因个体(N)；28和32均为PCR反应循环数；GAPDH为内参基因。
[0085] 图4为T1代材料的抗病率统计结果。其中，P代表转ZmCCT基因阳性植株，N 代表阴性植株。
[0086] 图5为T2/T3代材料的抗病率统计结果。其中，P代表转ZmCCT基因阳性植株，N代表阴性植株。
[0087] 图6为转基因T4代低氮高盐胁迫生长指标统计图。图6A为总根长统计；图6B为主胚根长统计；图6C为主干根长统计；图6D为侧根长统计；图6E为地下部干重统计；图6F为地上部干重统计。其中，TL-23(+)：转ZmCCT基因阳性植株，TL-23(-)：阴性植株，LNS(low nitrogen stress)：0.04mmol/L氮元素胁迫，HSS(High salty stress)：50mmol/L NaCl胁迫，Significant difference：*，P<0.05；**，P<0.01。
[0088] 图7为转ZmCCT基因阳性(TL+)和阴性(TL-)植株在正常(Mock)和低氮胁迫(LNS)处理后生长状态。其中，TL-23(+)：转ZmCCT基因阳性植株，TL-23(-)：阴性植株。
[0089] 图8为转ZmCCT基因阳性(TL+)和阴性(TL-)植株在正常(Mock)和高盐胁迫(HSS)处理后的生长状态。其中，TL-23(+)：转ZmCCT基因阳性植株，TL-23(-)：阴性植株。
[0090] 图9为ZmCCT在低氮和高盐胁迫后的表达变化。图9A为对照的根；图9B为对照的地上部；图9C为盐胁迫的根；图9D为盐胁迫的地上部；图9E为氮胁迫的根；图9F为氮胁迫的地上部。其中，TL-23(+)：转ZmCCT基因阳性植株，TL-23(-)：阴性植株。
[0091] 图10为ZmABA2在低氮和高盐胁迫后的表达变化。图10A为对照的根；图10B为对照的地上部；图10C为盐胁迫的根；图10D为盐胁迫的地上部；图10E为氮胁迫的根；图10F为氮胁迫的地上部。其中，TL-23(+)：转ZmCCT基因阳性植株，TL-23(-)：阴性植株。
[0092] 图11为ZmMPK5在低氮和高盐胁迫后的表达变化。图11A为对照的根；图11B为对照的地上部；图11C为盐胁迫的根；图11D为盐胁迫的地上部；图11E为氮胁迫的根；图11F为氮胁迫的地上部。其中，TL-23(+)：转ZmCCT基因阳性植株，TL-23(-)：阴性植株。
具体实施方式
[0093] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0094] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0095] 下述实施例中的玉米(Zea mays L.)自交系1145：国家农作物种质保存中心，其编号为0L010346，该玉米为高耐低氮胁迫和盐胁迫的品种(参见“Qin Yang,Guangming Yin,Yanling Guo,et al.A major QTL for resistance to Gibberella stalk rot in maize.Theor Appl Genet,(2010)121:673-687.”一文)。
[0096] 下述实施例中的玉米(Zea mays L.)品种HiⅡ：记载于“Lorena Moeller,Qinglei Gan,Kan Wang.Establishment and characterization of a maize Hi-II endosperm culture.In Viro Cellular&Developmental Biology-Plant,2012(48):283-294.”一文中的“maize Hi-II”。
[0097] 下述实施例中的质粒pCAMBIA3301：记载于“Huixia Shou,Reid G.Palmer,Kan Wang.Irreproducibility of the Soybean Pollen-Tube Pathway Transformation Procedure.Plant Molecular Biology Reporter,2002(20):325-334.”一文。
[0098] 下述实施例中农杆菌LBA4404是Clontech公司的Agrobacterium tumefaciens LBA4404 Electro-Cells，货号：9115。
[0099] 实施例1、与耐低氮胁迫和高盐胁迫相关的基因ZmCCT的获得
[0100] 一、与耐低氮胁迫和高盐胁迫相关的基因ZmCCT全长cDNA序列的获得
[0101] 采用伤根土埋法(参见“宋佐衡等.保健栽培措施对玉米茎腐病控制效应研究,辽宁农业科学.1993年第05期”)将禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schw.)分生孢子人工接种于处于抽雄期的高耐低氮胁迫的玉米(Zea mays L.)自交系1145的植株。接种后16h，取其叶片。使用Invitrogen公司提供的TriZol试剂提取总RNA。使用BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit，利用基因特异的引物—5'RACE引物(5'GSPB)和3'RACE引物(3'GSPA)(见表1)，以及试剂盒中提供的通用引物，并参照试剂盒说明书来扩增5’RACE产物和3’RACE产物，并对其测序。将得到的目的基因ZmCCT的5’端序列和3’端序列进行序列拼接，得到ZmCCT基因的全长cDNA序列，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。
[0102] 表1、基因功能鉴定所用的所有引物序列信息
[0103]
[0104] 为了进一步证实上述拼接所得的ZmCCT基因全长cDNA序列(序列2)的正确性，设计如下用于扩增ZmCCT基因全长cDNA序列的特异性引物。
[0105] 引物1：5'-ATGTCGTCGGGGCCAGCAGC-3'(序列表中序列2的第1-20位)；
[0106] 引物2：5'-TTGCCAAGGTAACCGAATGA-3'(序列表中序列2的第698-717位的反向互补序列)。
[0107] 以上述总RNA反转录所得的cDNA为模板，利用上述引物1和引物2进行扩增，将扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，经PCR扩增获得了长度约为720bp的片段。回收并纯化该产物，将其连接到pEASY-T1载体(北京全式金生物技术 有限公司)上，进行测序鉴定。测序结果表明，该PCR扩增产物与上述拼接得到的序列2完全相同，即ZmCCT基因的全长cDNA序列如序列表中序列2所示，ORF为序列2的第1-717位，编码序列表中序列1所示的蛋白，将该蛋白命名为ZmCCT。
[0108] 二、与耐低氮胁迫和高盐胁迫相关的基因ZmCCT基因组DNA序列的获得
[0109] 采用伤根土埋法(参见“宋佐衡等.保健栽培措施对玉米茎腐病控制效应研究,辽宁农业科学.1993年第05期”)将禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schw.)分生孢子人工接种处于抽雄期的高耐低氮胁迫的玉米(Zea mays L.)自交系1145的植株。接种后16h，取其叶片，利用SDS碱式裂解法提取基因组DNA。
[0110] 以上述获得的基因组DNA为模板，利用上述引物1和引物2进行PCR扩增，将扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，经PCR扩增获得了长度约为2600bp的片段。回收并纯化该产物，将其连接到pEASY-T1载体(北京全式金生物技术有限公司)上，进行测序鉴定。测序结果表明，该产物的核苷酸序列为序列表中序列3的第5136-7682位，其中第5136-5609位为第一外显子序列，第5610-7439位为内含子序列，第7440-7682位为第二外显子序列。
[0111] 三、含有ZmCCT基因组DNA序列的基因组区段的获得
[0112] 制备两端均带有限制性内切酶Sac I识别位点的“含有ZmCCT基因组DNA序列的基因组区段序列”，即“GAGCTC+序列3+GAGCTC”，记为DNA片段甲。将DNA片段甲连接到pEASY-T1载体(北京全式金生物技术有限公司)上，所得重组质粒命名为pEASY-ZmCCT。对pEASY-ZmCCT进行测序鉴定。
[0113] 测序结果表明，插入pEASY-T1载体的外源基因序列正为“GAGCTC+序列3+GAGCTC”。其中，序列3的第1-5135位为启动子序列；第5136-7682位为ZmCCT基因的基因组序列(第
5136-5609位为第一外显子序列，第7440-7682位为第二外显子序列，第5610-7439位为内含子序列)；第7683-8147位为非翻译区序列。
5136-5609位为第一外显子序列，第7440-7682位为第二外显子序列，第5610-7439位为内含子序列)；第7683-8147位为非翻译区序列。
[0114] 实施例2、转ZmCCT基因玉米的获得及其功能鉴定
[0115] 一、重组表达载体pCAMBIA3301-ZmCCT的构建
[0116] 用限制性内切酶Sac I酶切实施例1步骤三所得的重组质粒pEASY-ZmCCT，回收目的片段(含有ZmCCT基因组DNA序列的基因组区段，约8.1K)，将其与同样经Sac I酶切的pCAMBIA3301载体的骨架片段相连，获得重组质粒pCAMBIA3301-ZmCCT。
[0117] 对所得的重组质粒进行Sac I酶切鉴定，并对经酶切鉴定表明含有大小约为8.1kb目的条带的重组质粒进行测序，测序结果表明：pCAMBIA3301-ZmCCT为在pCAMBIA3301载体的Sac I酶切位点间正向插入序列表中序列3所示的DNA分子，且保持pCAMBIA3301载体的其他序列不变得到载体。在重组表达载体 pCAMBIA3301-ZmCCT中，启动ZmCCT基因组DNA序列转录的启动子为序列3的第1-5135位。
[0118] 二、转ZmCCT基因玉米的获得
[0119] 1、农杆菌的转化及鉴定
[0120] 将步骤一构建的重组表达载体pCAMBIA3301-ZmCCT导入农杆菌LBA4404。具体操作如下：
[0121] (1)将5μl浓度为100ng/μl的pCAMBIA3301-ZmCCT质粒DNA加入到50μl LBA4404农杆菌感受态细胞中，轻弹混匀，并置于冰上30分钟。
[0122] (2)将(1)中的混合物在液氮中冷冻1分钟。
[0123] (3)将(2)中冷冻的混合物在37℃水浴条件下孵育5分钟。
[0124] (4)向(3)中得到的混合液中加入1ml的YEP液体培养基。28℃条件下，120rpm培养4小时。
[0125] (5)将(4)中得到的培养液1000rpm离心30秒，弃去上清液，得到底层细胞悬浮液。
[0126] (6)向(5)中得到的细胞悬浮液中加入100ul的YEP液体培养基，重悬细胞，并将重悬混合液涂在含有卡纳霉素和利福平的固体培养基上。
[0127] (7)将(6)中涂好的固体培养基在黑暗条件下，于28℃培养36-48小时。
[0128] (8)将(7)中培养得到的菌落进行菌体PCR鉴定及测序鉴定得到阳性转化菌株。
[0129] 对转化后的重组农杆菌用引物3和引物4组成的引物对进行PCR鉴定。将经鉴定表明含有序列3所示ZmCCT基因组区段(PCR目的条带大小约为8.1kb)的农杆菌LBA4404命名为LBA4404/pCAMBIA3301-ZmCCT。同时设置转入pCAMBIA3301空载体的农杆菌对照，将转入pCAMBIA3301空载体的农杆菌LBA4404命名为LBA4404/pCAMBIA3301。
[0130] 引物3：5'-GAGCTCTTGTTGCGACTTGT-3'(序列表中序列3的第1-20位)；
[0131] 引物4：5'-GAGCTCGACAAACAGTACAT-3'(序列表中序列3的第8128-8147位的反向互补序列)。
[0132] 2、重组农杆菌对玉米植株的转化及鉴定
[0133] 将上述所得的重组农杆菌LBA4404/pCAMBIA3301-ZmCCT(或空载体对照LBA4404/pCAMBIA3301)转化玉米(Zea mays L.)品种HiⅡ。
[0134] 用事先活化好的重组农杆菌浸泡玉米愈伤组织，获得转化愈伤组织，转化后，用除草剂进行抗性筛选，获得转基因苗，即转入pCAMBIA3301-ZmCCT的玉米植株和转入pCAMBIA3301空载体的玉米植株。
[0135] 进一步对上述获得的转基因玉米植株(T0代)进行PCR鉴定，筛选PCR阳性株 系。提取转基因玉米植株的基因组DNA，作为模板，对转入pCAMBIA3301-ZmCCT的玉米植株进行PCR鉴定，以序列3所示ZmCCT基因组区段和pCAMBIA3301载体自身序列为靶基因，以引物对(LBCCT F/R)进行PCR扩增。同时设置未转基因的受体亲本玉米(Zea mays L.)品种HiⅡ作为对照。
[0136] LBCCT FP：5’-TAGCTAGCTCCACCACAGCA-3’(序列3的第7693-7712位)；
[0137] LBCCT RP：5’-TGTGGAATTGTGAGCGGATA-3’(该序列对应pCAMBIA3301载体上自带序列)。
[0138] 对转入pCAMBIA3301-ZmCCT的玉米植株进行PCR鉴定的结果(图1)显示扩增出预期大小目的条带(518bp)的转基因玉米为阳性，其中获得的5个T0代转基因阳性植株记为Y3-1、Y3-14、Y3-18、Y3-23和Y3-25。
[0139] 三、转ZmCCT基因玉米的抗病性鉴定
[0140] (一)实验方法
[0141] 将步骤二获得的5个T0代转ZmCCT基因植株Y3-1、Y3-14、Y3-18、Y3-23和Y3-25，进行自交后得到5个转基因T1代群体，将T1代群体种植于北京上庄试验田，每个转基因T1代群体均种植137株，用于鉴定每个单株对禾谷镰刀菌茎腐病的抗性性状，并结合基因型的分析来鉴定ZmCCT基因的功能。实验重复3次，结果取平均值。具体操作如下：
[0142] 1、基因型分析及ZmCCT基因表达量测定：
[0143] (1)基因型分析
[0144] 由于未纯合的转基因阳性植株在后代会发生分离，即后代群体中会出现转基因阳性以及阴性植株，这样可以把以上5个T0代转ZmCCT基因植株后代群体分成两种基因型，即阳性(P)和阴性(N)。
[0145] 采取PCR基因分型的方法，用pCAMBIA3301-ZmCCT载体特异的一对引物(LBCCT F/R，序列同上)PCR鉴定以上5个T0代转ZmCCT基因植株后代群体的基因型，能够扩出条带(518bp)的个体为转基因阳性个体(P)，不能扩出相应条带的个体为转基因阴性个体(N)。
[0146] (2)ZmCCT基因表达量测定
[0147] 分别以步骤(1)转ZmCCT基因阳性的植株群体(P)和转ZmCCT基因阴性的植株群体(N)为实验材料。提取各实验材料的总RNA。RNA提取用TIANGEN RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒，提取方法同说明书。
[0148] 使用反转录试剂盒(Fermentas)，将RNA反转录成cDNA，存于-80℃备用。
[0149] 采用试剂盒SYBR Premix EX Taq Kit(宝生物工程)，按照试剂盒说明书进行qRT-PCR，检测ZmCCT基因的表达量。
[0150] 正向引物：5’-ATGAGAACGACGACCAGCCT-3’(序列3的第5455-5474位)；
[0151] 反向引物：5’-GACGACTGATCTACCGGCAT-3’(序列3的第7418-7537位的反向互补序列)。(注：跨内含子的引物，以cDNA为模版)
[0152] 反应体系：20ul。
[0153] 反应程序：Step 1：94℃for 3min；
[0154] Step 2：94℃for 30s；
[0155] Step 3：60℃for 30s；
[0156] Step 4：72℃for 30s；
[0157] Step 5：Go to step 2for 28or 32cycles；(这里为重复的循环数)
[0158] Step 6：72℃for 10min；
[0159] Step 7：5℃forever。
[0160] 内参基因采用GAPDH。内参基因的扩增引物为5’-ATCAACGGCTTCGGAAGGAT-3’和5’-CCGTGGACGGTGTCGTACTT-3’
[0161] 同时设置步骤二中鉴定得到的转入pCAMBIA3301空载体的玉米阳性植株作为空载体对照(CK)，设置未转基因的受体亲本的玉米(Zea mays L.)品种HiⅡ作为亲本对照(WT)。
[0162] 2、对禾谷镰刀菌茎腐病的抗性性状的分析：
[0163] 采取土埋伤根的方法(参见“宋佐衡等.保健栽培措施对玉米茎腐病控制效应研究,辽宁农业科学.1993年第05期”)，用禾谷镰刀菌对未纯合的转基因后代群体植株进行接菌处理，具体步骤：在玉米植株吐丝器后，在距离玉米植株5-10厘米处竖直向下切断部分毛细根，抛开土壤，埋入60-80克用玉米籽粒扩繁的禾谷镰刀菌Fusarium graminearum，并浇水保湿。
[0164] 进一步，对经步骤1鉴定为转ZmCCT基因阳性的植株群体(P)和转ZmCCT基因阴性的植株群体(N)分别进行抗病性植株比例统计。具体如下：用禾谷镰刀菌人工接种大约45天后，将玉米植株做劈茎处理，茎基部及根中空且有腐烂现象的认定为感病株，茎基部及根完整且正常的认定为抗病株(图2)。分别将转ZmCCT基因阳性的植株群体(P)和转ZmCCT基因阴性的植株群体(N)中抗病植株的比例计算出来。
[0165] 同时设置步骤二中鉴定得到的转入pCAMBIA3301空载体的玉米阳性植株作为空载体对照(CK)，设置未转基因的受体亲本的玉米(Zea mays L.)品种HiⅡ作为亲本对照(WT)。
[0166] 另外，将经上述基因型分析鉴定为转基因阳性的T1代植株自交，获得T2代群体；将经上述基因型分析鉴定为转基因阳性的T2代植株自交，获得T3代群体。对T2代群体和T3代群体也采用如上的方法进行基因型分析和抗病性性状分析。
[0167] (二)实验结果
[0168] 1、5个T0代转ZmCCT基因植株后代ZmCCT基因表达量测定
[0169] 结果如图3所示，从图中可以看出，5个T0代转ZmCCT基因植株后代群体中，阳性转基因植株(P)的ZmCCT基因表达量远远高于阴性转基因材料(N)。而作为亲本对照(WT)和空载体对照(CK)的两玉米植株中ZmCCT基因表达量与阴性转基因材料(N)相比，基本一致，无统计学差异。
[0170] 2、5个T0代转ZmCCT基因植株后代抗病性测定
[0171] 结果显示：在T1代群体水平上(图4)，Y3-1、Y3-23及Y3-25中阳性植株(P)的抗病植株比例相对于阴性植株(N)均有显著性的提高，其中Y3-1中阳性植株(P)的抗病植株比例较阴性植株(N)提高达33％，Y3-23中阳性植株(P)的抗病植株比例较阴性植株(N)提高达13％，Y3-25中阳性植株(P)的抗病植株比例较阴性植株(N)提高达10％。
[0172] 在T2代群体水平上(图5)，Y3-1、Y3-18、Y3-23及Y3-25中阳性植株(P)的抗病植株比例相对于阴性植株(N)均有显著性的提高，其中Y3-1中阳性植株(P)的抗病植株比例较阴性植株(N)提高达35％，Y3-18中阳性植株(P)的抗病植株比例较阴性植株(N)提高达17％，Y3-23中阳性植株(P)的抗病植株比例较阴性植株(N)提高达25％，Y3-25中阳性植株(P)的抗病植株比例较阴性植株(N)提高达9％。
[0173] 选取T2代转基因阳性的Y3-23自交，获得T3代群体。结果显示，在T3代群体水平上(图5)，Y3-23中阳性植株(P)的抗病植株比例相对于阴性植株(N)仍有显著性的提高，Y3-23中阳性植株(P)的抗病植株比例较阴性植株(N)提高达7％。
[0174] 3、亲本对照及空载体对照抗病性测定
[0175] 相比于以上5个T0代转ZmCCT基因植株后代的鉴定结果(图4和图5)，未转基因的玉米(Zea mays L.)品种HiⅡ(WT)中的抗病植株比例仅为5％，远低于以上5个T0代转ZmCCT基因植株后代中的抗病植株比例。空载体对照的实验结果与亲本对照基本一致，无统计学差异。
[0176] 综合以上1-3的结果，可见相对于未转基因的亲本对照和空载体对照，以上5个T0代转ZmCCT基因植株后代中的抗病植株比例大大提高，且后代中的阳性植株(P)中抗病植株比例远高于阴性植株(N)，同时阳性植株(P)中ZmCCT基因的表达量也远高于阴性植株(N)。
[0177] 四、转ZmCCT基因玉米的耐低氮和高盐胁迫分析
[0178] (一)ZmCCT转基因玉米苗期根部性状和干重测量
[0179] (1)实验方法
[0180] 将经上述基因型分析鉴定为转基因阳性的T4代转ZmCCT基因玉米种子在人工气候室水培种植条件下，苗期进行低氮和高盐胁迫，胁迫处理一周后对根部性状、株高、SPAD值等进行测量，烘干至恒重后测量干重。用t测验方法进行统计分析。
[0181] (2)实验步骤
[0182] 将T4代转ZmCCT基因玉米种子用10％(v/v)H2O2消毒30分钟，去离子水冲洗后，饱和CaSO4浸泡6小时，避光在人工气候室生长2天，待种子发芽大概1-2cm时，挑选长势一致的种子，用滤纸卷苗，从一侧开始卷成圆柱纸卷，移入小水桶中生长至1叶1心期，挑选长势一致的幼苗，移入1L营养液(Hoagland’s营养液：0.75mmolL-1K2SO4、0.1mmolL-1KCl、0.25mmolL-1KH2PO4、0.65mmolL-1MgSO4、0.13mmolL-1EDTA-Fe、1.0μmolL-1MnSO4、1.0μmolL-1ZnSO4、0.1μmolL-1CuSO4、0.005μmolL-1(NH4)6Mo7O24)的培养罐中，每罐4株。生长条件控制为28℃/22℃，
16/8h光照/黑暗，日循环。16h光照期间光通量密度为250–300μmolm-2s-1。幼苗移入培养罐后，先用1/2(c/c)培养液预培养两天，再用完全营养液培养至3叶1心期，分别进行低氮(0.04mmolL-1NO3-)、高盐(50mmolL-1NaCl)胁迫处理，再培养7天。N元素由Ca(NO3)2提供，在低氮胁迫处理中，Ca2+以CaCl2形式补充到4mmolL-1NO3-的水平。PH值用1mmol/L NaOH调节至
6.0。电动气泵提供氧气，营养液每两天更换一次，每个处理进行三个重复。
16/8h光照/黑暗，日循环。16h光照期间光通量密度为250–300μmolm-2s-1。幼苗移入培养罐后，先用1/2(c/c)培养液预培养两天，再用完全营养液培养至3叶1心期，分别进行低氮(0.04mmolL-1NO3-)、高盐(50mmolL-1NaCl)胁迫处理，再培养7天。N元素由Ca(NO3)2提供，在低氮胁迫处理中，Ca2+以CaCl2形式补充到4mmolL-1NO3-的水平。PH值用1mmol/L NaOH调节至
6.0。电动气泵提供氧气，营养液每两天更换一次，每个处理进行三个重复。
[0183] (3)测量指标
[0184] 胁迫处理7天后的玉米苗，用去离子水冲洗，分成地上部和地下部两个部分，用Image J软件测量根部扫描图片，测定的性状有：总根长(TRL，Total root length)、主胚根长(PRL，total primary radicle length)、主干根长(MRL，main root length)和侧根长(LRL，lateral root length)；70℃/48h将地上部和地下部烘干至恒重，称量地上部干重(SDW，shoot dry weight)和地下部干重(RDW，root dry weight)；用尺子测量株高(PH，Plant height)。每个性状测10株苗，取平均值。
[0185] (4)实验结果
[0186] T测验统计测量结果表明，T4代转ZmCCT基因玉米植株与阴性植株相比，总根长、侧根长和株高在正常对照环境中(Mock)具有显著差异，主干根长和地下部干重具有极显著差异；在低氮胁迫处理(LNS)后，总根长、侧根长、地下部干重、地上部干重和株高具有极显著差异，主干根长具有显著性差异，T4代转ZmCCT基因玉米植株的总根长、侧根长、地下部干重、地上部干重、株高和主干根长明显高于阴性植株；在高盐处理(HSS)后，测量的所有性状，转基因阳性植株均与阴性植株具有显著性差异，T4代转ZmCCT基因玉米植株的总根长、主干根长、主胚根长、侧根长、地下部干重、地上部干重和株高均明显高于阴性植株；T4代转ZmCCT基因玉米植株 的总根长、主干根长、侧根长、地下部干重、地上部干重和株高均明显高于阴性植株。T4代转ZmCCT基因玉米植株在低氮和盐胁迫条件下表现出很强的生长适应性(图6和表2)。
[0187] 表2、T4代转ZmCCT基因玉米低氮高盐胁迫生长指标统计表
[0188]
[0189] 由于T4代转ZmCCT基因玉米植株与阴性植株本身生长势差异较大，进行多因素方差分析，分析结果如表3所示。总根长、主干根长和地下部干重在低氮胁迫条件下具有显著性差异，总根长，主胚根长，侧根长和株高在盐胁迫条件下具有显著性差异。
[0190] 表3、T4代转ZmCCT基因玉米低氮高盐胁迫生长指标多因素方差分析表
[0191]
[0192]
[0193] 综上结果，转ZmCCT基因阳性植株苗期在低氮和盐胁迫条件下，根系生长更为发达，具有很强的适应性，ZmCCT具有提高玉米苗期抗低氮和高盐胁迫的作用(图7，图8)。
[0194] (二)互补测验转基因材料苗期低氮和高盐胁迫条件表达研究
[0195] (1)实验内容
[0196] 取三叶一心期的T4代转ZmCCT基因玉米植株和阴性植株，在50mmol NaCl高盐胁迫处理和0.04mmol低氮胁迫后不同时间点(0、3、6和9小时)的根和叶进行表达分析，每个样品每个时间点随机取5株混合在一起进行表达研究，每个样品设3个重复，实验重复3次。
[0197] (2)实验操作过程
[0198] RNA提取用TIANGEN RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒，提取方法同说明书。RNA反转录用全式金公司的TransScript First-Strand cDNA SuperMix(AT301-03)，操作方法同说明书。合成的cDNA用DEPC-ddH2O稀释到适当浓度，产物于-20℃保存，备用。
[0199] qRT-PCR用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM II(RR820A)，用RoterGene6000进行检测。应用比较CT值法(2-ΔΔCt)进行基因表达的相对定量(Livak and Schmittgen2001)。内参基因选GAPDH及表达量测定引物如表4所示。
[0200] qRT-PCR程序：95℃，5min；95℃，10S，60℃，20s，40cycles；mealting curve analysis。
[0201] qRT-PCR反应体系(20μl)：SYBR Primix Ex TaqTM II(2×)10μl、Forward Primer(10μM)0.4μl、Reverse Primer(10μM)0.4μl、cDNA 2μl、ddH2O 7.2μl。
[0202] 表4、内参基因选GAPDH及表达量测定引物
[0203]
[0204] (三)实验结果
[0205] T4代转ZmCCT基因玉米植株在低氮和盐胁迫的条件下，出现诱导表达的现象(图9)，T4代转ZmCCT基因玉米植株(TL-23(+))在低氮和高盐胁迫的条件下根和地上部表达量均升高，3小时达到峰值，表达量约是处理0小时T4代转ZmCCT基因玉米植株的5.86倍和9.71倍，然后出现下降的现象，阴性植株则没有这样的现象。
[0206] ZmABA2和ZmMPK5被报道参与玉米ABA诱导的抗氧化防御反应。ZmABA2和ZmMPK5表达量升高可以增强玉米的抗盐胁迫、干旱胁迫和氧化胁迫等非生物胁迫的能力，增强玉米对环境的适应能力(Ma,Ni et al.2015)。
[0207] 在低氮和高盐胁迫的条件下，ZmABA2在T4代转ZmCCT基因玉米植株(TL-23(+)) 根和地上部表达量均升高(图10)，除低氮胁迫根部，3小时均达到峰值，表达量约为胁迫处理开始时的2-4倍，然后出现下降的现象，阴性植株(TL-23(-))盐胁迫的根部、低氮胁迫的根部和地上部出现诱导表达的现象，但表达量上升幅度远小于转ZmCCT基因阳性植株。
[0208] 在低氮和高盐胁迫的条件下，ZmMPK5在T4代转ZmCCT基因阳性植株(TL-23(+))根和地上部表达量均升高(图11)，胁迫处理三小时表达量高于阴性植株(TL-23(-))4-6倍。
[0209] 综上实验结果，转ZmCCT基因玉米植株在低氮和高盐胁迫处理后，ZmCCT表达量升高，3小时达到峰值。在低氮和高盐胁迫处理后，与提高玉米抗性相关的基因ZmABA2和ZmMPK5在转ZmCCT基因阳性植株中的表达量增幅也远高于阴性植株。说明ZmCCT基因具有提高玉米苗期抗低氮和高盐胁迫的功能。
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