一种枯草芽孢杆菌、菌剂、菌剂的制备方法和菌剂的应用专利检索-淀粉聚合物和橡胶专利检索查询-专利查询网

一种枯草芽孢杆菌、菌剂、菌剂的制备方法和菌剂的应用

阅读：149发布：2024-01-29

专利汇可以提供一种枯草芽孢杆菌、菌剂、菌剂的制备方法和菌剂的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种枯草芽孢杆菌、菌剂、菌剂的制备方法和菌剂的应用，该菌为枯草芽孢杆菌JQ‑001，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间：2015年11月9日，保藏登记号为CGMCCNo.11632；经种子活化、种子培养、发酵培养后可制得液体菌剂或固体菌剂；本发明进一步提供了所述枯草芽孢杆菌的菌剂制备方法，以及在制备防治水稻稻瘟病和马铃薯疮痂病药物中的应用。该菌剂具有很高的生物活性，其生产具备周期短、成本低的特点，同时该菌剂环境相容性好，在防治水稻稻瘟病和马铃薯疮痂病方面效果显著，对人畜无毒害作用，使用方便。，下面是一种枯草芽孢杆菌、菌剂、菌剂的制备方法和菌剂的应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于：枯草芽孢杆菌JQ-001，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏时间：2015年11月9日，保藏登记号为CGMCC No.11632。
2.一种枯草芽孢杆菌菌剂，其特征在于：以权利要求1所述的枯草芽孢杆菌JQ-001经种子活化、种子培养、发酵培养后制成的菌剂。
3.如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌菌剂，其特征在于：所述菌剂为液体菌剂或固体菌剂。
4.一种权利要求2所述的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，具体包括：
a.菌种活化：将低温保存的枯草芽孢杆菌JQ-001菌株接种于固体培养基上，于35-38℃培养34-38h，挑取单菌落转接到斜面培养基上，于35-38℃培养16-24h，用无菌水洗下培养基表面菌体作为接种液；
b.一级种子液制备：按照5％-10％的接种量向种子培养基中接入步骤a制备的接种液，转速200-260rpm，温度35-38℃，摇床培养16-24h，作为一级种子液；
c.二级种子液制备：按照0.5％-3％的接种量向种子培养基中接入步骤b制备的一级种子液，通气量为0.4-1.5vvm，搅拌速度为180-260rpm，培养时间为18-24h，作为二级种子液；
d.发酵培养：按照5％-10％的接种量向发酵培养基中接入步骤c制备的二级种子液，通气量为0.4-1.5vvm，搅拌速度为180rpm-260rpm，培养时间为24h-30h，得到发酵液；
e.将上述发酵液通过水洗和分子筛浓缩，得到枯草芽孢杆菌液体菌剂。
5.如权利要求4所述的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤b和步骤c中的种子培养基的组成成分及其重量百分比为：葡萄糖1-2％、蛋白胨1-1.5％、酵母粉0.6-
1％、牛肉膏0.5-0.7％、氯化钠0.5％，其余为水。
6.如权利要求4所述的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤d中的发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：葡萄糖3-5％、蛋白胨0.5-1.5％、酵母粉0.03-
0.08％、蛋白胨0.1-0.3％、豆粕粉0.5-1.5％、硫酸镁0.01-0.05％、硫酸锰0.01-0.05％，其余为水。
7.如权利要求4所述的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于：将步骤d所述发酵液进行喷雾干燥，进口温度150-200℃，出口温度50-90℃，加入喷雾载体可溶性淀粉，得到枯草芽孢杆菌粉剂。
8.如权利要求7所述的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于：按照重量百分比，将原料：枯草芽孢杆菌粉剂20-30％、白炭黑10-15％、硅藻土10-20％、十二烷基磺酸钠1-
10％、萘磺酸盐D-1002 2-10％、膨润土10-20％和润湿剂W-2001 2-10％混合均匀，然后粉碎至400目以上，得到枯草芽孢杆菌可湿性粉剂。
9.如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌菌剂的应用，其特征在于：所述菌剂在制备防治水稻稻瘟病和马铃薯疮痂病药物中的应用。

说明书全文

一种枯草芽孢杆菌、菌剂、菌剂的制备方法和菌剂的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌、菌剂、菌剂的制备方法和菌剂的应用。

背景技术

[0002] 稻瘟病是水稻重要病害之一，在世界各稻区均有发生，其中以叶部、节部发生为多，发生后可造成不同程度减产，严重时减产40％-50％，造成惨重损失。该病由稻梨孢菌引起，病菌以分生孢子和菌丝体在稻草和稻谷上越冬，翌年产生分生孢子借风雨传播到稻株上，萌发侵入寄主向邻近细胞扩展发病，形成中心病株。病部形成的分生孢子，借风雨传播进行再侵染，播种带菌种子可引起苗瘟。在自然条件下，稻瘟菌只侵染水稻，因此对水稻的生产威胁极大。

[0003] 目前对于该病的防治主要是用70％甲基托布津可湿性粉剂500倍液、50％多菌灵可湿性粉剂250倍液、25％使百克乳油2000倍液、强氯精可湿性粉剂500倍液、10％浸种灵乳油2500倍液、25％施保克乳油3000-4000倍液药剂浸种48-72小时处理或者是在发病时喷施30％克瘟散乳油500倍液、50％消菌灵水溶性粉剂500倍液、40％克百菌悬浮剂500倍液、
25％咪鲜胺乳油1500倍液、40％稻瘟灵可湿性粉400倍液、50％四氯苯酞可湿性粉剂400倍液、50％多菌灵可湿性粉剂500-600倍液、70％甲基托布津可湿性粉剂1000倍液、75％三环唑可湿性粉剂2000倍液、20％稻曲克敌可湿性粉剂1500倍液、20％毒菌锡胶悬剂400倍液等化学药剂。长期使用化学杀菌剂，导致病菌抗药性增强，只有加大用药剂量以及缩短喷药时间间隔来控制病害，不仅增加了生产成本也导致农药残留量越来越多大。大量使用化学药剂，容易造成土壤污染，酸碱失调，养分含量降低，土壤板结，严重影响作物的产量。因此采用生物防治来控制水稻稻瘟病是农业发展的必然趋势。而采用拮抗微生物防治病害是代替化学药剂的一种安全、无毒、有效的新方法。拮抗微生物不仅可以抑制病原菌的生长，还能增大土壤中微生物的数量，促进植物生长，对改善生态系统，保持生物多样性，维护生态平衡有着重要的作用。

[0004] 疮痂病被视为马铃薯生产中的世界性病害，在我国许多马铃薯主产区普遍存在，连作地、偏碱地及栽培管理不当的情况下发生程度更为严重。近年来，疮痂病在我国很多马铃薯生产地区相继发生，其中黑龙江、内蒙古、河北、山东、山西、陕西、贵州、甘肃、四川、湖南、湖北、云南等多个省区的马铃薯主产区均有关于该病的报道，基本覆盖了东北、华北、西北和西南。并且在气候干旱、土壤偏碱性、连作重茬严重的地区发病率较高。

[0005] 马铃薯疮痂病病菌主要为害块茎，从皮孔侵入，发病初期在块茎表皮产生褐色斑点，以后逐渐扩大，侵染点周围的组织坏死，块茎表面变粗糙，质地木栓化。同时依据病原菌种类的不同，在成熟的薯块上常表现为凸起或凹陷的表面病斑，严重时病斑连片，薯块的品质降低。同时，由于表皮组织被破坏后，易被其他病原菌侵染，造成块茎腐烂，严重影响马铃薯的外观，降低其品质和贮藏周期。

[0006] 利用生物防治土传病害是一种行之有效的防治措施，是植物保护中必不可少的组成部分。特别是利用自然界中原本存在的植物根际有益微生物对靶标病原微生物的拮抗作用，来控制病原微生物的危害，具有较小的环境风险，是一种环境友好的防治技术。随着人们对食品安全、生态安全重视，生物防治是实现现代化农业可持续发展的重要策略之一。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种新的枯草芽孢杆菌。

[0008] 本发明的另一目的在于提供所述枯草芽孢杆菌菌剂及制备方法，

[0009] 本发明还有一目的在于提供利用所述枯草芽孢杆菌菌剂在制备防治植物病害药物中的应用。

[0010] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

[0011] 一种枯草芽孢杆菌，其特征在于：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JQ-001，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏时间：2015年11月9日，保藏登记号为CGMCC No.11632。

[0012] 本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JQ-001从黑龙江建三江农场连作5年以上水稻根基土壤中分离、纯化以及筛选步骤获得的，采用形态特征、生理生化实验、分子生物学鉴定法以及16SrDNA同源序列比对分析最终确定上述保藏编号的菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

[0013] 一种枯草芽孢杆菌菌剂，是枯草芽孢杆菌JQ-001经种子活化、种子培养、发酵培养后制成的菌剂；该菌剂包括液体菌剂和固体菌剂。

[0014] 以枯草芽孢杆菌为活性成分的菌剂的制作方法，具体步骤如下：

[0015] a.菌种活化：将低温保存的枯草芽孢杆菌JQ-001菌株接种于固体培养基上，于35-38℃培养34-36h；挑取单菌落转接到斜面培养基上，于35-38℃培养16-24h，用无菌水洗下培养基表面菌体作为接种液；

[0016] b.一级种子液制备：按照5％-10％的接种量向种子培养基中接入步骤a制备的接种液，转速200-260rpm，温度35-38℃，摇床培养16-24h，作为一级种子液；

[0017] c.二级种子液制备：按照0.5％-3％的接种量向种子培养基中接入步骤b制备的一级种子液，通气量为0.4-1.5vvm，搅拌速度为180-260rpm，培养时间为18-24h，作为二级种子液；

[0018] 种子培养基的组成成分及其重量百分比为：葡萄糖1％-2％、蛋白胨1％-1.5％、酵母粉0.6％-1％、牛肉膏0.5％-0.7％、氯化钠0.5％、其余为水；

[0019] d.发酵培养：按照5％-10％的接种量向发酵培养基中接入步骤c制备的二级种子液，通气量为0.4-1.5vvm，搅拌速度为180-260rpm，培养时间为24-30h，得到发酵液；

[0020] 发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：葡萄糖3％-5％、蛋白胨0.5％-1.5％、酵母粉0.03％-0.08％、蛋白胨0.1％-0.3％、豆粕粉0.5％-1.5％、硫酸镁0.01％-0.05％、硫酸锰0.01％-0.05％，其余为水；

[0021] e.将上述发酵液通过水洗和分子筛浓缩，得到枯草芽孢杆菌液体菌剂。

[0022] f.将上述发酵液喷雾干燥：进口温度150-200℃，出口温度50-90℃，加入喷雾载体可溶性淀粉，得到枯草芽孢杆菌粉剂菌剂。

[0023] g.将以下原料按重量百分比混合均匀：枯草芽孢杆菌粉剂20-30％；白炭黑10-15％；硅藻土：10-20％；十二烷基磺酸钠1-10％；萘磺酸盐D-1002 2-10％；膨润土10-20％，润湿剂W-2001 2-10％。然后利用气流粉碎机粉碎至400目以上，控制水分含量≤5％。得到枯草芽孢杆菌可湿性粉剂菌剂。

[0024] 进一步的，本发明还提供以上枯草芽孢杆菌菌剂在制备防治水稻稻瘟病和马铃薯疮痂病药物中的应用。

[0025] 本发明具有以下有益效果：

[0026] 由本发明枯草芽孢杆菌制得的菌剂喷洒到作物叶面上，能够定植在作物表面，占领病原菌生态位，抑制病原菌生长，对水稻稻瘟病病原菌抑制率达到91.3％以上；喷施到地面上通过渗透，同样可以抑制病原菌生长，其对马铃薯疮痂病病原菌抑制率达到89％以上；并能促进作物生长，增加作物产量，维护生态平衡。并且其液体菌剂的生产具有周期短，活性高、成本低的特点，利于工业化生产，而制备成固体菌剂，特别是制备成可湿性粉剂后可以延长保藏周期，方便使用。

[0027] 菌种保藏

[0028] 枯草芽孢杆菌JQ-001，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏时间：2015年11月9日，保藏登记号为CGMCC No.11632。附图说明

[0029] 图1是本发明的枯草芽孢杆菌的16SrDNA同源序列比对分析树状图。

具体实施方式

[0030] 以下结合具体实施列进一步说明：

[0031] 实施例一：枯草芽孢杆菌JQ-001菌株的分离与筛选：

[0032] 1、分离

[0033] (1)土壤采集：从黑龙江建三江农场连作5年以上水稻田里土壤表层到10cm处采集土样100g，一个地点平行采集5个样本，混合过40目分级筛。取100g筛下土壤用做分离。

[0034] (2)培养基配制：分别配制

[0035] NA培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏3.0g/L、氯化钠5g/L、琼脂18g/L pH＝7.0-7.2；

[0036] 和PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL；

[0037] 制作培养基平板。

[0038] (3)准确称取1g土壤置于250ml三角瓶中，加入99ml无菌水，摇床200rpm、30-37℃震荡30min。制成土壤悬浮液，按10倍梯度稀释至10-8。分别在NA培养基和PDA培养基中分离单菌落，分离到的单菌落分别在NA培养基和PDA培养基中活化4个周期。

[0039] 2、筛选

[0040] 将分离活化的JQ-001单菌落及其它菌种单菌落与水稻稻瘟病病原菌进行平板对峙实验，以下是筛选过程对峙实验及其结果：

[0041] 在PDA培养基平板中央接入预先培养的病原菌(水稻稻瘟病)，待生长大小合适时用直径9mm的打孔器打出菌斑，移至新的PDA培养基平板中央，在距离病原菌菌斑2cm处接种公司现有不同菌种，每个处理重复3次，置于25℃生化培养箱培养，观察各菌落直径，结果如表1所示。

[0042] 表1 JQ-001及其它菌株菌落直径(cm)

[0043]

[0044]

[0045] 从表1可看出JQ-001菌株对水稻稻瘟病的抑菌活性最高。继续做JQ-001菌株的拮抗实验，方法同上，测定抑菌率。得到如下结果，见表2。

[0046] 抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100％

[0047] 表2 JQ-001菌株对水稻稻瘟病室内抑菌活性测定

[0048]

[0049] 实施例二：枯草芽孢杆菌JQ-001菌株的鉴定

[0050] 1.微生物学特性：JQ-001菌株菌体呈短杆状，0.6-0.7μm×1.9-3.0μm，单个或成对排列，芽孢柱状，中生，孢囊稍膨大，革兰氏阳性。菌株在NA培养基、37℃培养24h，菌落乳白色、表面凸起，边缘不整齐，干燥不透明。

[0051] 2.生理生化特征：

[0052] 表3枯草芽孢杆菌JQ-001菌株的生理生化特征

[0053]检测项目特性检测项目特性检测项目特性
7％Nacl生长 + 精氨酸双水解酶 - 甘露醇 +
15℃生长 + β-半乳糖酶 - 淀粉水解 +
50℃生长 + H2S产生 - 柠檬酸利用 +
D-葡萄糖 + 赖氨酸脱羧酶 + 鸟氨酸脱羧酶 -

[0054] 注：“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应

[0055] 3.分子生物学鉴定：

[0056] 将JQ-001菌株的16SrDNA扩增序列在NCBI数据库中比对，与Bacillus subtilis同源性为99.38％，结合JQ-001菌株的形态特征、生理生化特征，确定JQ-001菌株属于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，以16SrDNA序列为基础的JQ-001菌株系统发育树如图1(图中菌种1即为JQ-001菌株)所示。

[0057] 实施例三：枯草芽孢杆菌液体菌剂的制备

[0058] (1)菌种活化：将低温保存的枯草芽孢杆菌JQ-001菌株接种于LB固体培养基上，于36℃培养36h；挑取单菌落转接到LB斜面培养基上，于36℃培养20h，用无菌水洗下培养基表面菌体作为接种液。

[0059] (2)一级种子液制备：按照10％(体积百分比)的接种量向种子培养基中接入步骤(1)制备的接种液，转速220rpm，温度36℃，摇床培养20h，作为一级种子液。

[0060] (3)二级种子液制备：按照3％(体积百分比)的接种量向种子培养基中接入步骤(2)制备的一级种子液，通气量为1.0vvm，搅拌速度为220rpm，培养时间为20h。作为二级种子液。

[0061] 所述种子培养基的组成成分及其重量百分比为：葡萄糖2％、蛋白胨1.5％、酵母粉1％、牛肉膏0.7％、氯化钠0.5％，其余为水。

[0062] (4)发酵培养：按照10％(体积百分比)的接种量向发酵培养基中接入步骤(3)制备的二级种子液，通气量为1.0vvm，搅拌速度为220rpm，培养时间为28h，得到发酵液。

[0063] 所述发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：葡萄糖5％、蛋白胨1.5％、酵母粉0.08％、蛋白胨0.3％、豆粕粉1.5％、硫酸镁0.03％、硫酸锰0.03％，其余为水。

[0064] (5)将上述发酵液通过水洗和分子筛浓缩，得到活菌数为1000亿/毫升以上的枯草芽孢杆菌液体菌剂。

[0065] 实施例四：枯草芽孢杆菌粉剂菌剂的制备

[0066] 将实施例三所得到的发酵液进行喷雾干燥：进口温度190℃，出口温度80℃，加入喷雾载体可溶性淀粉。得到有效活菌数为1000亿/克以上的枯草芽孢杆菌粉剂菌剂。

[0067] 实施例五：枯草芽孢杆菌可湿性粉剂菌剂的制备一

[0068] 将以下原料按重量百分比混合均匀：实施例四所得到的枯草芽孢杆菌粉剂30％、白炭黑15％、硅藻土20％、十二烷基磺酸钠10％、萘磺酸盐D-1002：2％、膨润土15％、润湿剂W-2001：8％。然后利用气流粉碎机粉碎至400目以上，控制水分含量≤5％。得到400亿/克的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂菌剂。

[0069] 实施例六：枯草芽孢杆菌可湿性粉剂菌剂的制备二

[0070] 将以下原料按重量百分比混合均匀：实施例四所得到的枯草芽孢杆菌粉剂20％、白炭黑15％、硅藻土20％、十二烷基磺酸钠5％、萘磺酸盐D-1002：10％、膨润土20％、润湿剂W-2001：10％。然后利用气流粉碎机粉碎至400目以上，控制水分含量≤5％。得到300亿/克的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂菌剂。

[0071] 实施例七：枯草芽孢杆菌可湿性粉剂菌剂的制备三

[0072] 将以下原料按重量百分比混合均匀：实施例四所得到的枯草芽孢杆菌粉剂25％、白炭黑10％、硅藻土10％、十二烷基磺酸钠10％、萘磺酸盐D-1002：15％、膨润土20％、润湿剂W-2001：10％。然后利用气流粉碎机粉碎至400目以上，控制水分含量≤5％。得到200亿/克的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂菌剂。

[0073] 实施例八：枯草芽孢杆菌液体菌剂防治水稻稻瘟病的应用

[0074] 8.1供试药剂

[0075] 本发明制备的枯草芽孢杆菌液体菌剂

[0076] 8.2供试作物与防治对象

[0077] 供试作物：水稻；防治对象：稻瘟病

[0078] 8.3试验地情况

[0079] 试验地设在黑龙江省松嫩平原、三江平原及中部地区水稻田，土壤类型为轻度沼泽化草甸土，有机质含量2.1％左右，pH6.2。

[0080] 8.4试验设计

[0081] 本试验以10亿/毫升的枯草芽孢杆菌液体菌剂为原液，在此基础上设计了原液稀释100倍、500倍、1000倍液及空白对照(清水处理)4个处理，每处理重复3次，共12个小区，随机区组排列，每小区面积10㎡。分别在水稻9.1～9.5期、孕穗期和齐穗期施药三次，不同处理均采用茎叶喷雾。

[0082] 8.5试验调查及计算方法

[0083] 8.5.1药效调查水稻稻瘟病采用对角线取样的方法调查，每处理取5点，每点取1穴，3次重复，计算出病情指数和防治效果。

[0084] 8.5.2药效计算方法

[0085]

[0086]

[0087]

[0088] 8.6、试验结果

[0089] 供试药剂对水稻稻瘟病防治效果如表4所示，10亿/毫升的枯草芽孢杆菌液体菌剂对水稻稻瘟病有明显的防治效果，其中10亿/毫升的枯草芽孢杆菌液体菌剂稀释100倍液防治效果最好，防效达64.7％。

[0090] 表4 10亿/毫升的枯草芽孢杆菌液体菌剂防治水稻稻瘟病田间效果试验结果[0091]处理组平均病害指数(％) 平均防治效果(％)
清水对照 40.03 -
液体菌剂稀释100倍 14.15 64.7
液体菌剂稀释500倍 16.23 59.5
液体菌剂稀释1000倍 17.86 55.4

[0092] 8.7小结

[0093] 从水稻稻瘟病病害指数和防治效果来看，10亿/毫升的枯草芽孢杆菌液体菌剂对水稻稻瘟病有较好的防治效果，稀释100倍液喷雾效果最佳，防治效果可以达到64.7％，病害指数明显小于对照处理。

[0094] 实施例九：枯草芽孢杆菌JQ-001粉剂菌剂防治水稻稻瘟病的应用

[0095] 9.1供试药剂

[0096] 本发明制备的枯草芽孢杆菌粉剂菌剂

[0097] 9.2供试作物与防治对象

[0098] 供试作物：水稻；防治对象：稻瘟病

[0099] 9.3试验地情况

[0100] 试验地设在黑龙江省松嫩平原、三江平原及中部地区水稻田，土壤类型为轻度沼泽化草甸土，有机质含量2.1％左右，pH6.2。

[0101] 9.4试验设计及安排

[0102] 本试验设计了100亿/克枯草芽孢杆菌粉剂菌剂50克/亩、150克/亩、250克/亩及空白对照4个处理，每处理重复3次，共12个小区，随机区组排列，每小区面积10㎡。分别在水稻9.1～9.5期、孕穗期和齐穗期施药三次，不同处理均采用茎叶喷雾。

[0103] 9.5试验调查及计算方法

[0104] 9.5.1药效调查水稻稻瘟病采用对角线取样的方法调查，每处理取5点，每点取1穴，3次重复，计算出病情指数和防治效果。

[0105] 9.5.2药效计算方法

[0106]

[0107]

[0108] 9.6试验结果

[0109] 供试药剂对水稻稻瘟病防治效果如表5所示，100亿/克枯草芽孢杆菌粉剂菌剂对水稻稻瘟病有明显的防治效果，其中100亿/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂250克/亩防治效果最好，防效达78.2％。

[0110] 表5 100亿/克粉剂菌剂防治水稻稻瘟病田间效果试验结果

[0111]处理组平均病害指数(％) 平均防治效果(％)
清水对照 40.03 -
枯草芽孢杆菌粉剂50克/亩 14.32 64.2
枯草芽孢杆菌粉剂150克/亩 11.28 71.8
枯草芽孢杆菌粉剂250克/亩 8.73 78.2

[0112] 9.7小结

[0113] 从水稻稻瘟病病害指数和防治效果来看，100亿/克枯草芽孢杆菌粉剂菌剂对水稻稻瘟病有较好的防治效果，每亩施用250克效果最佳，防治效果可以达到78.2％，病害指数明显小于对照处理。

[0114] 实施例十：枯草芽孢杆菌可湿性粉剂菌剂防治水稻稻瘟病的应用

[0115] 10.1供试药剂

[0116] 本发明制备的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂

[0117] 10.2供试作物与防治对象

[0118] 供试作物：水稻；防治对象：稻瘟病

[0119] 10.3试验地情况

[0120] 试验地设在黑龙江省松嫩平原、三江平原及中部地区水稻田，土壤类型为轻度沼泽化草甸土，有机质含量2.1％左右，pH6.2。

[0121] 10.4试验设计及安排

[0122] 本试验设计了300亿/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂20克/亩、50克/亩、80克/亩及空白对照4个处理，每处理重复3次，共12个小区，随机区组排列，每小区面积20㎡。分别在水稻9.1～9.5期、孕穗期和齐穗期施药三次。不同处理均采用茎叶喷雾，喷液量15升/亩。

[0123] 10.5试验调查及计算方法

[0124] 10.5.1药效调查水稻稻瘟病采用对角线取样的方法调查，每处理取5点，每点取1穴，3次重复，计算出病情指数和防治效果。

[0125] 10.5.2药效计算方法

[0126]

[0127]

[0128] 10.6、试验结果

[0129] 供试药剂对水稻稻瘟病防治效果如表6所示，300亿/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对水稻稻瘟病有明显的防治效果，其中300亿/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂80克/亩防治效果最好，防效达75.6％。

[0130] 表6 300亿/克可湿性粉剂防治水稻稻瘟病田间效果试验结果

[0131]处理组平均病害指数(％) 平均防治效果(％)
清水对照 40.03 -
可湿性粉剂20克/亩 15.27 61.85
可湿性粉剂50克/亩 10.69 73.30
可湿性粉剂80克/亩 6.78 82.56

[0132] 10.7小结

[0133] 从水稻稻瘟病病害指数和防治效果来看，300亿/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对水稻稻瘟病有较好的防治效果，每亩施用80克效果最佳，防治效果可以达到82.56％，病害指数明显小于对照处理。

[0134] 实施例十一：JQ-001菌株对马铃薯疮痂病病原菌拮抗效果测定

[0135] 固体培养基：NA培养基、高氏一号培养基:可溶性淀粉20g、KNO3 1g、NaCl0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4 0.5g、FeSO4 0.01g琼脂粉16g、蒸馏水1000ml、pH7.4，配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其它成分，融化后，补足水分至1000ml，然后用100ml锥形瓶平均分装13瓶，121℃灭菌30min。

[0136] 液体培养基(枯草发酵培养基)：葡萄糖20g、玉米浆干粉5g、蛋白胨1g、酵母粉0.5g、MnSO420ml、MgSO410ml、自来水500ml、pH7.5，121℃灭菌30min。

[0137] 一、实验方法：采用平板对峙培养法

[0138] 1、马铃薯疮痂病病原菌分离纯化培养

[0139] 取样地点：河北省张北县大囫囵村大田内。

[0140] 用刀片取发病马铃薯块茎的病健交界处，先用升汞及酒精进行杀菌消毒处理后，接入高氏一号培养基中，每个培养皿内接入4块，在25℃恒温培养箱中培养6天后用打孔器取长病菌板进行纯化培养，备用。

[0141] 2、枯草芽孢杆菌JQ-001发酵液的制备

[0142] 将保存在斜面上的菌种用接种环接入营养琼脂平板上划线培养，37℃恒温培养24h活化。将活化的菌株接入装有50ml发酵培养基的500ml三角瓶中，在34℃、230r/min条件下，摇床振荡培养25h，制备菌种发酵液，待其完全产芽孢后，测定发酵液活菌数量为100亿/毫升。

[0143] 3、发酵液处理

[0144] 将测定好活菌数量的发酵液稀释成0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0亿/毫升菌量，用1ml移液枪分别取各个浓度菌液3ml与灭菌并冷却至45℃熔融态的高氏一号培养基(此培养基用100ml锥形瓶定量分装75ml)按1:25比例混匀，制成带菌平板，平均每板含有1ml菌液；以不接种枯草芽孢杆菌JQ-001的发酵液与培养基混匀倒成的平板为对照。在平板中接入预先培养的马铃薯疮痂病病菌，用直径5mm的打孔器打出菌块，接入凝固的培养皿内，每平板均匀接种两块，每处理重复3次。25℃恒温箱中倒扣培养6天。

[0145] 4、试验数据处理

[0146] 待对照菌丝长满板时，拍照记录，观察菌体长势情况并采用十字交叉法测量菌落直径，抑菌圈直径，计算平均值和相对抑菌率，记录菌落直径大小，比较不同菌量对马铃薯疮痂病的抑制效果，按照下列公式计算抑菌率。

[0147] 抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100％

[0148] 5、结果展示

[0149] 表7枯草芽孢杆菌JQ-001对马铃薯疮痂病病原菌拮抗实验结果

[0150]

[0151] 实施例十二：JQ-001菌株菌液及粉剂防治马铃薯疮痂病大田实验

[0152] 本试验设计了发酵菌液(活菌含量100亿/毫升)或者使用粉剂稀释成活菌含量100亿/毫升的菌液直接喷施于土壤的小区试验，50亿/平方米(处理组一)、20亿/平方米(处理组二)、10亿/平方米(处理组三)及空白对照(清水处理)共4个处理，重复4次，共16个小区，每小区面积10m2，各小区随机排列。于马铃薯疮痂病幼苗期、开花现蕾期，生长后期浇灌。

[0153] 生防率＝(对照组发病率-试验组发病率)/对照组发病率×100％

[0154] 表8枯草芽孢杆菌JQ-001菌液处理马铃薯时发病情况

[0155]

[0156]

[0157] 表9枯草芽孢杆菌JQ-001菌液处理马铃薯时防治效果

[0158]处理组平均病害指数(％) 平均防治效果(％)
第一组 6.13 89.59
第二组 18.59 68.45
第三组 21.52 63.48

[0159] 由试验结果可知，即使在发酵菌液或者等同浓度的菌液使用量偏低的情况下依然对疮痂病有较好的试验效果，其中50亿/平方米处理的实验效果最好，达到了89.59％。

[0160] 实施例十三：JQ-001菌株可湿性粉剂防治马铃薯疮痂病大田实验

[0161] 本试验设计了300亿/克JQ-001菌株可湿性粉剂50克/亩(处理组四)、100克/亩(处理组五)、150克/亩(处理组六)及空白对照(清水处理)共4个处理，重复4次，共16个小区，每小区面积10m2，各小区随机排列。于马铃薯疮痂病发病前喷施，每隔7天施药1次，连续施药3次。结果如下：

[0162] 生防率＝(对照组发病率-试验组发病率)/对照组发病率×100％。

[0163] 表10可湿性粉剂防治实验中发病率结果

[0164]处理组总薯块数发病块数发病率
清水处理 155 78 50.32％
处理组四 157 54 34.39％
处理组五 151 27 17.88％
处理组六 149 11 7.38％

[0165] 表11可湿性粉剂处理时平均病害指数和平均防治效果

[0166]处理组平均病害指数(％) 平均防治效果(％)
第四组 34.39 31.66
第五组 17.88 64.47
第六组 7.38 85.33

[0167] 结果表明，本发明提供的枯草芽孢杆菌JQ-001可湿性粉剂能够显著降低马铃薯疮痂病的发病率，对马铃薯疮痂病的生防率达到85％以上，最终起到了显著提高了马铃薯的品质和保证其储存的时间。

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一种枯草芽孢杆菌、菌剂、菌剂的制备方法和菌剂的应用

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