一种油菜组织培养快速繁殖及壮苗的方法专利检索-种子作物管理专利检索查询-专利查询网

一种油菜组织培养快速繁殖及壮苗的方法

阅读：273发布：2024-01-12

专利汇可以提供一种油菜组织培养快速繁殖及壮苗的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种油菜组织培养快速繁殖及壮苗的方法，具体包括将甘蓝型油菜Polima CMS恢复系627R、621R、616R油菜种子发芽后进行无菌苗的下胚轴或油菜子叶的预培养后在进行分化培养，每次培养都适用特定的培养基，得到不定芽后再置于添加有矮壮素的培养基中进行培养，得到壮苗。本发明所述方法实用性强，大幅提高油菜组织的繁殖速度，有利于不定芽的根须生长，得到强壮幼苗，建立和优化了恢复系油菜的快繁再生体系，可快速获得具有优良性状的油菜新种质。，下面是一种油菜组织培养快速繁殖及壮苗的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种油菜组织培养快速繁殖及壮苗的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1)发芽：挑选饱满、大小均匀和无病虫害的油菜种子，用75％酒精消毒1-2min，0.1％升汞消毒7-10min，再用无菌水冲洗3-5次，在无菌滤纸上晾干后，播种到1/2MS培养基上，在
20-30℃，12h光照和12h黑暗交替的条件下发芽；
2)油菜组织的预培养，切取步骤1)中培养6天的无菌苗的下胚轴或油菜子叶，置于预培养基M1中培养2-5天；
所述预培养基M1为：在MS培养基中，添加有0.5-2.0mg/L 2,4-D、0.5-1.0mg/L 6-BA、
25-35g/L蔗糖、6-10g/L琼脂；所述预培养基M1的PH值为5.8-5.9；
3)油菜组织的分化培养，将步骤2)中经过预培养的下胚轴或油菜子叶转移到分化培养基M2-N或M2-I中培养25-35天，得到不定芽；
所述分化培养基M2-N为：在MS培养基中，添加有2.5-3.5mg/L 6-BA、0.5-1.5mg/LNAA、
4-6mg/L AgNO3、25-35g/L蔗糖、6-10g/L琼脂；所述分化培养基M2-N的PH值为5.8-5.9；
所述分化培养基M2-I为：在MS培养基中，添加有2.5-3.5mg/L 6-BA、0.5-1.5mg/L IAA、
4-6mg/L AgNO3、25-35g/L蔗糖、6-10g/L琼脂；所述分化培养基M2-I的PH值为5.8-5.9。
2.根据权利要求1所述的一种油菜组织培养快速繁殖及壮苗的方法，其特征在于，还包括：
4)将步骤3)得到的不定芽转移到矮壮素生根培养基中，培养25-30天；
所述矮壮素生根培养基为：在MS培养基中，添加有10-15mg/L CCC、25-35g/L蔗糖、6-
10g/L琼脂，所述矮壮素生根培养基的PH值为5.8-5.9。
3.根据权利要求2所述的一种油菜组织培养快速繁殖及壮苗的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1)发芽：挑选饱满、大小均匀和无病虫害的油菜种子，用75％酒精消毒1-2min，0.1％升汞消毒7-10min，再用无菌水冲洗3-5次，在无菌滤纸上晾干后，播种到1/2MS培养基上，在
20-30℃，12h光照和12h黑暗交替的条件下发芽；
2)油菜组织的预培养，切取步骤1)中培养6天的无菌苗的下胚轴或油菜子叶，置于预培养基M1中培养3天；
所述预培养基M1为：在MS培养基中，添加有2.0mg/L 2,4-D、1.0mg/L 6-BA、30g/L蔗糖、
8g/L琼脂；所述预培养基M1的PH值为5.85；
3)油菜组织的分化培养，将步骤2)中经过预培养的下胚轴或油菜子叶转移到分化培养基M2-N或M2-I中培养30天，得到不定芽；
所述分化培养基M2-N为：在MS培养基中，添加有3mg/L 6-BA、1.0mg/LNAA、5mg/LAgNO3、
30g/L蔗糖、8g/L琼脂；所述分化培养基M2-N的PH值为5.85；
所述分化培养基M2-I为：在MS培养基中，添加有3mg/L 6-BA、1.0mg/LIAA、5mg/L AgNO3、
30g/L蔗糖、8g/L琼脂；所述分化培养基M2-I的PH值为5.85；
4)将步骤3)得到的不定芽转移到矮壮素生根培养基中，培养30天；
所述矮壮素生根培养基为：在MS培养基中，添加有15mg/L CCC、30g/L蔗糖、8g/L琼脂，所述矮壮素生根培养基的PH值为5.85。
4.根据权利要求1-3中任一权利要求所述的一种油菜组织培养快速繁殖及壮苗的方法，其特征在于，所述油菜种子来源于甘蓝型油菜Polima CMS恢复系627R、621R、616R中的一种或几种。

说明书全文

一种油菜组织培养快速繁殖及壮苗的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及农作物培养领域，特别涉及一种油菜组织培养快速繁殖及壮苗的方法及应用。

背景技术

[0002] 油菜属于十字花科芸薹属，是世界四大油料作物之一，也是我国重要的油料作物之一。油菜种子可以榨取食用油，饼粕可用作饲料，茎杆可以食用，同时油菜花具有观赏价值，大面积种植促进了城郊赏花经济发展。油菜是可再生资源，被认为是生物柴油最理想的原料。随着农业生物技术的发展，油菜组织培养快速繁殖的体系建立和改良对加速油菜育种新资源的创建具有重要意义。植物组织培养是指利用植物离体的器官、组织或者细胞，在适宜的人工培养和无菌条件下进行培养，使其增殖、生长、发育形成植株的方法。植物器官发生途径是指在组织培养中，再生植株不是通过胚胎，而是通过分生中心直接分化器官，最终形成完整植株的总过程。通常分为器官间接发生途径和器官直接发生途径。器官间接发生途径是指外植体先诱导产生愈伤组织，然后愈伤组织再诱导产生芽和根系，主要优点是繁殖系数高，在短时间能够形成大量的器官分化，产生大量小植株。但是随着愈伤组织继代时间的延长，表现出的植株再生能力会逐渐降低，甚至消失。器官直接发生途径是指外植体在培养基上直接诱导产生芽和根，优点是细胞染色体倍数稳定，发生变异的频率低，保证所培养的试管苗保持来源母株良好的种性。叶腋间的发芽、不定芽如茎尖、花托等都可以诱导产生不定芽。总体来看，油菜的再生频率相对较低，这可能与外植体类型、基因型有关，因此建立高效、重复性强的诱导再生体系是创建油菜新资源的应用重点之一[1-6]。经过多年研究，国内外许多研究单位已经建立了适用性的油菜离体再生体系，然而研究表明油菜不同基因型、不同外植体之间最佳离体再生的培养条件存在差异，阻碍了油菜组织培养快速繁殖研究的发展[8-10]。在油菜快速繁殖的体系中，应用较多的外植体有大田植株的花、侧芽、无菌苗的子叶、下胚轴以及根段等，这些外植体在再生体系中能够短期内获得大量的植株，不受到季节和地点等因素的限制[11-12]。甘蓝型油菜(Brassica napus L.)627R，621R，616R是高产优质杂交油菜新品种的核心恢复系。

发明内容

[0003] 为了解决上述问题，本发明提供了一种油菜组织培养快速繁殖及壮苗的方法，所述方法建立了一个高效的恢复系油菜的快繁再生体系，可快速获得具有优良性状的油菜新种质。

[0004] 本发明的技术方案为：

[0005] 一种油菜组织培养快速繁殖及壮苗的方法，具体包括以下步骤：

[0006] 1)发芽：挑选饱满、大小均匀和无病虫害的油菜种子，用75％酒精消毒1-2min，0.1％升汞消毒7-10min，再用无菌水冲洗3-5次，在无菌滤纸上晾干后，播种到1/2MS培养基上，在20-30℃，12h光照和12h黑暗交替的条件下发芽；

[0007] 2)油菜组织的预培养，切取步骤1)中培养6天的无菌苗的下胚轴或油菜子叶，置于预培养基M1中培养2-5天；

[0008] 所述预培养基M1为：在MS培养基中，添加有0.5-2.0mg/L 2,4-D、0.5-1.0mg/L 6-BA、25-35g/L蔗糖、6-10g/L琼脂；所述预培养基M1的PH值为5.8-5.9；

[0009] 3)油菜组织的分化培养，将步骤2)中经过预培养的下胚轴或油菜子叶转移到分化培养基M2-N或M2-I中培养25-35天，得到不定芽；

[0010] 所述分化培养基M2-N为：在MS培养基中，添加有2.5-3.5mg/L 6-BA、0.5-1.5mg/L NAA、4-6mg/L AgNO3、25-35g/L蔗糖、6-10g/L琼脂；所述分化培养基M2-N的PH值为5.8-5.9；

[0011] 所述分化培养基M2-I为：在MS培养基中，添加有2.5-3.5mg/L 6-BA、0.5-1.5mg/L IAA、4-6mg/L AgNO3、25-35g/L蔗糖、6-10g/L琼脂；所述分化培养基M2-I的PH值为5.8-5.9。

[0012] 还包括：

[0013] 4)将步骤3)得到的不定芽转移到矮壮素生根培养基中，培养25-30天；

[0014] 所述矮壮素生根培养基为：在MS培养基中，添加有10-15mg/L CCC、25-35g/L蔗糖、6-10g/L琼脂，所述矮壮素生根培养基的PH值为5.8-5.9。

[0015] 一种油菜组织培养快速繁殖及壮苗的方法，优选的，具体包括以下步骤：

[0016] 1)发芽：挑选饱满、大小均匀和无病虫害的油菜种子，用75％酒精消毒1-2min，0.1％升汞消毒7-10min，再用无菌水冲洗3-5次，在无菌滤纸上晾干后，播种到1/2MS培养基上，在20-30℃，12h光照和12h黑暗交替的条件下发芽；

[0017] 2)油菜组织的预培养，切取步骤1)中培养6天的无菌苗的下胚轴或油菜子叶，置于预培养基M1中培养3天；

[0018] 所述预培养基M1为：在MS培养基中，添加有2.0mg/L 2,4-D、1.0mg/L 6-BA、30g/L蔗糖、8g/L琼脂；所述预培养基M1的PH值为5.85；

[0019] 3)油菜组织的分化培养，将步骤2)中经过预培养的下胚轴或油菜子叶转移到分化培养基M2-N或M2-I中培养30天，得到不定芽；

[0020] 所述分化培养基M2-N为：在MS培养基中，添加有3mg/L 6-BA、1.0mg/L NAA、5mg/L AgNO3、30g/L蔗糖、8g/L琼脂；所述分化培养基M2-N的PH值为5.85；

[0021] 所述分化培养基M2-I为：在MS培养基中，添加有3mg/L 6-BA、1.0mg/L IAA、5mg/L AgNO3、30g/L蔗糖、8g/L琼脂；所述分化培养基M2-I的PH值为5.85；

[0022] 4)将步骤3)得到的不定芽转移到矮壮素生根培养基中，培养30天；

[0023] 所述矮壮素生根培养基为：在MS培养基中，添加有15mg/L CCC、30g/L蔗糖、8g/L琼脂，所述矮壮素生根培养基的PH值为5.85。

[0024] 所述油菜种子来源于甘蓝型油菜Polima CMS恢复系627R、621R、616R中的一种或几种。

[0025] 本发明的技术效果为：

[0026] 本发明所述油菜组织培养快速繁殖及壮苗的方法，涉及油菜种子培养时间、预培养基和分化培养基的调配，以及添加有矮壮素的培养基的适用，形成了一个极其高效的培养系统，大幅提高油菜组织的出芽率，同时培养出的不定芽生根繁茂，幼苗生长壮实，所述方法加速油菜育种新资源的创建。附图说明

[0027] 图1为本发明所述实施例中下胚轴在分化培养基上愈伤组织效果图；

[0028] 图1中黑色箭头标识为结构致密的愈伤组织，容易快速分化成芽；白色箭头标识为松散的愈伤组织，随着培养时间延长出现褐化死亡，不能继续分化成芽。

[0029] 图2为本发明所述实施例中油菜下胚轴分化出芽过程之一效果图。

[0030] 图3为本发明所述实施例中油菜下胚轴分化出芽过程之一效果图。

[0031] 图4为本发明所述实施例中油菜下胚轴分化出芽过程之一效果图。

[0032] 图5为本发明所述实施例中油菜下胚轴分化出芽过程之一效果图。

[0033] 图6为本发明所述实施例中油菜下胚轴分化出芽过程之一效果图。

[0034] 图7为本发明所述实施例中油菜下胚轴分化出芽过程之一效果图。

[0035] 图2至图7，依次分别为油菜下胚轴分化出芽的各个过程。

[0036] 图8为本发明实验油菜在未施加矮壮素的成苗培养基中生长1周的油菜植株生长情况效果图。

[0037] 图9为本发明实施例在施加15mg/L矮壮素成苗培养基中生长1周的油菜植株生长情况效果图。

具体实施方式

[0038] 为更好理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。

[0039] 1.材料与方法

[0040] 1.1实验材料

[0041] 以甘蓝型油菜杂交品种Polima CMS恢复系627R，621R和616R材料田间种植植株和无菌种子实生苗下胚轴为外植体。

[0042] 1.2实验方法

[0043] 1.2.1无菌苗的获得

[0044] 挑选饱满、大小均匀和无病虫害的油菜种子，用75％酒精消毒1min，0.1％升汞消毒8min，之后再用无菌水冲洗3-5次，之后在无菌滤纸上晾干，播种到1/2MS培养基上，于25度，12h光照/12h黑暗条件发芽。

[0045] 1.2.2苗龄对油菜下胚轴分化的影响

[0046] 切取培养4、6、10天的无菌苗的下胚轴，和培养6天的油菜子叶放置在预培养M1(MS+2.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH 5.85)中预培养3天，然后转移到分化培养基M2-N(MS+3mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+5mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH 5.85)中培养，30天后统计油菜芽再生频率。

[0047] 1.2.3油菜子叶在两种分化培养基上的成苗率分析

[0048] 切取发芽6天无菌苗中子叶带有长度为0.2-0.3cm的叶柄，放置于预培养基M1(MS+2.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH 5.85)中预培养3天，之后转移到分化培养基M2-N(MS+3mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+5mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH5.85)或M2-I(MS+3mg/L 6-BA+1.0mg/L IAA+5mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH
5.85)上培养，统计出苗数目。1.2.4预培养基激素配比对油菜下胚轴分化的影响[0049] 切取生长6天油菜下胚轴，分别放置于含有不同浓度2，4-D(0.5、1.0、2mg/L)和6-BA(0.1、0.5、1.0mg/L)的预培养基中预培养3天，之后转移到分化培养基M2-I(MS+3mg/L 6-BA+1.0mg/L IAA+5mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH 5.85)中培养，30天后统计芽再生频率。

[0050] 1.2.5预培养时间对油菜下胚轴分化再生成苗影响

[0051] 切取试验中确定苗龄的油菜下胚轴，接种于1.2.3中最优化的预培养基中，分别预培养2、3、4、5、6天后，转移到分化培养基M2-I中培养，30天后统计出芽频率。

[0052] 1.2.6分化培养基中不同激素配比对油菜下胚轴分化的影响

[0053] 将培养6天油菜下胚轴切取后放置于预培养基M1上，3天，之后转移到设置不同激素配比的分化培养基(F1,F2,F3,F4,F5,F6)上。分化培养基F1同1.2.3中M2-N(MS+3mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+5mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH 5.85)，分化培养基F2(MS+4mg/L 6-BA+2.0mg/L NAA+5mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH 5.85)，分化培养基F3(MS+5mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+5mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH 5.85)，分化培养基F4同
1.2.3中M2-I(MS+3mg/L 6-BA+1.0mg/L IAA+5mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH
5.85)，分化培养基F5(MS+4mg/L 6-BA+2.0mg/L IAA+5mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH 5.85)，分化培养基F6(MS+5mg/L 6-BA+1.0mg/L IAA+5mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH 5.85)上培养，上培养，30天后统计出芽率。1.2.7不同浓度的矮壮素处理对不同油菜恢复系成苗后生物量积累的影响

[0054] 对三个不同材料分化出的芽转移到含有不同浓度(0mg/L，5mg/L,10mg/L,15mg/L)矮壮素(CCC)的MS培养基中，生长30天后统计不同处理下植株的平均根长，根鲜重和植株鲜重。

[0055] 1.2.8实验数据分析

[0056] 试验数据均采用SPSS 软件分析，差异显著性采用Duncan新复极差法进行多重比较。分化频率(％)＝再生不定芽总数/接种外植体总数×100％。

[0057] 2.结果与分析

[0058] 2.1不同苗龄对下胚轴分化的影响

[0059] 三个材料播种后，在发芽培养基上分别生长4天，6天，10天后，切断下胚轴转移到预培养M1(MS+2.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH 5.85)中预培养3天，然后转移到分化培养基M2-N(MS+3mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+5mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH 5.85)中培养，从表1可见，三个材料在苗龄为6天时，再生频率最高，可达到
67.16％，差异为极显著水平。苗龄小于6天，下胚轴的表皮组织容易失水死亡，导致后期再生频率低。苗龄大于6d后，下胚轴分化程度降低。苗龄为6天的下胚轴作为外植体利于芽的分化，可以得到较高的再生频率。

[0060] 表1不同苗龄对627R，621R和616R下胚轴分化的影响

[0061]

[0062] 2.2油菜子叶在分化培养基中的再生分析

[0063] 将在预培养M1(MS+2.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH 5.85)中预培养3天的油菜子叶转移到分化培养基M2-N(MS+3mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+5mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH 5.85)或M2-I(MS+3mg/L 6-BA+1.0mg/L IAA+5mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH 5.85)上培养，实验结果表明对于627R和616R材料在M2-I分化培养基中再生频率显著高于M2-N培养基，而621R材料在M2-N培养基中再生频率高于M2-I(表2)。

[0064] 表2油菜子叶在分化培养基中再生率

[0065]

[0066] 2.3预培养激素配比对油菜下胚轴分化的影响

[0067] 将生长6天苗龄的627R，621R和616R的下胚轴切成长度为0.5-1cm，放置在不同激素配比的预培养基上生长3天，之后转移到M2-I分化培养基上生长，统计出芽数目。结果显示对于627R和621R材料，激素配比为2.0mg/L 2,4-D+1mg/L 6-BA和2.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L 6-BA时再生频率较高，差异极显著。616R材料在激素配比为2.0mg/L 2,4-D+1mg/L 6-BA再生频率较高，差异极显著(表3)。结果证明预培养基的激素配比为2.0mg/L 2,4-D+1mg/L 6-BA适合甘蓝型油菜的下胚轴分化出芽。

[0068] 表3预培养激素配比对油菜下胚轴

[0069]

[0070]

[0071] 2.4预培养时间对油菜下胚轴分化出芽的影响

[0072] 对三个材料在预培养基的激素配比为2.0mg/L 2,4-D+1mg/L 6-BA上分别预培养2、3、4、5、6天，之后转移分化培养基M2-I上继续生长，统计芽再生频率。结果显示预培养时间小于4天，之后转移到M2-I分化培养基上产生的愈伤组织结构致密紧凑，芽分化率呈现上升趋势(图1)；而当预培养时间过长，大于4天后会形成玻璃化松散型的愈伤组织，这类愈伤转移到分化培养基中，大多数会出现褐化死亡(图1)。对于627R材料，预培养时间为2-4天能够保证后期出芽频率为41.43％-47.76％；对621R材料预培养时间为2-3天能够保证在分化培养基中有着较高的出芽频率；对616R材料预培养时间为3天时，分化培养基中出芽频率为
65.23％(表4)。上述研究证明在激素配比为2.0mg/L 2,4-D+1mg/L 6-BA的预培养基中预培养时间2-4天能够保证后期转移到分化培养基中较高的出芽频率。

[0073] 表4预培养时间对不同材料的下胚轴分化的影响

[0074]

[0075]

[0076] 2.5分化培养基中不同激素配比对下胚轴两端愈伤出芽的影响

[0077] 选取6d苗龄油菜下胚轴，在M1(MS+2.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH 5.85)中预培养3天，再转移到不同激素配比的分化培养基F1(MS+3mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+5mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH 5.85)，分化培养基F2(MS+4mg/L 6-BA+2.0mg/L NAA+5mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH 5.85)，分化培养基F3(MS+5mg/L
6-BA+1.0mg/L NAA+5mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH 5.85)上培养，分化培养基F4(MS+3mg/L 6-BA+1.0mg/L IAA+5mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH 5.85)，分化培养基F5(MS+4mg/L 6-BA+2.0mg/L IAA+5mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH 5.85)，分化培养基F6(MS+5mg/L 6-BA+1.0mg/L IAA+5mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH 5.85)上培养，
30d后统计愈伤组织的出芽频率(图2)，结果显示在分化培养基的激素成分为6-BA和NAA的组合中，627R、621R和616R材料在分化培养基F1中的芽再生频率是最高的，差异表现为显著性(表5)。

[0078] 表5分化培养基中不同激素配比对不同油菜材料下胚轴分化的作用

[0079]

[0080]

[0081] 2.6不同浓度的矮壮素处理对不同油菜恢复系成苗后生物量积累的影响[0082] 将三个恢复系材料出芽后转移到加入不同浓度矮壮素的生根成苗培养基中，生长30天后考察植株的平均根长以及整株鲜重(表6)。对于627R材料处理后发现，在矮壮素浓度为15mg/L的培养基中生长30天后平均根长和整株鲜重显著高于其它处理后的材料。在
10mg/L和15mg/L矮壮素浓度处理下的621R材料的平均根长和整株鲜重显著性高于其它处理。616R材料在10mg/L和15mg/L矮壮素浓度处理下的根长显著高于其它处理，而在15mg/L矮壮素浓度处理下的整株鲜重高于其它处理。如图所示，添加15mg/L矮壮素后的油菜生长
30天后的叶片数目多，生长势优于未处理材料。

[0083] 表6不同浓度矮壮素处理后30天油菜生长状况

[0084]

[0085]

[0086] 本试验研究表明，甘蓝型油菜优良恢复系627R，621R和616R组织培养快速成苗，壮苗的体系中，生长调节剂配比、预培养时间、无菌苗的苗龄等因素密切相关。对于无菌苗快速繁殖体系中，发芽6天的无菌苗的下胚轴或者子叶在预培养(MS+2.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH 5.85)3天后转移到分化培养基如(MS+3mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+5mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH 5.85)或者(MS+3mg/L 6-BA+1.0mg/L IAA+
5mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH 5.85)生长可以获得较高的芽再生频率，出苗后转移到生根壮苗培养基(MS+15mg/L CCC+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH 5.85)中的继续生长30天。
上述建立的实验体系在优良恢复系材料中应用能够快速获得生长势优的油菜植株，加速了油菜新种质资源的繁殖与鉴定实验流程。

[0087] 根据上述实验整理得到系统的实施例

[0088] 实施例1

[0089] 1)发芽：挑选饱满、大小均匀和无病虫害的甘蓝型油菜Polima CMS恢复系627R油菜种子，用75％酒精消毒1min，0.1％升汞消毒8min，再用无菌水冲洗3-5次，在无菌滤纸上晾干后，播种到1/2MS培养基上，在25℃，12h光照和12h黑暗交替的条件下发芽；

[0090] 2)油菜组织的预培养，切取步骤1)中培养6天的无菌苗的下胚轴，置于预培养基M1中培养3天；

[0091] 所述预培养基M1为：在MS培养基中，添加有2.0mg/L 2,4-D、1.0mg/L 6-BA、30g/L蔗糖、8g/L琼脂；所述预培养基M1的PH值为5.85；

[0092] 3)油菜组织的分化培养，将步骤2)中经过预培养的下胚轴转移到分化培养基M2-N中培养30天，得到不定芽；

[0093] 所述分化培养基M2-N为：在MS培养基中，添加有3mg/L 6-BA、1.0mg/L NAA、5mg/L AgNO3、30g/L蔗糖、8g/L琼脂；所述分化培养基M2-N的PH值为5.85；

[0094] 4)将步骤3)得到的不定芽转移到矮壮素生根培养基中，培养30天；

[0095] 所述矮壮素生根培养基为：在MS培养基中，添加有15mg/L CCC、30g/L蔗糖、8g/L琼脂，所述矮壮素生根培养基的PH值为5.85。

[0096] 实施例2

[0097] 1)发芽：挑选饱满、大小均匀和无病虫害的甘蓝型油菜Polima CMS恢复系621R油菜种子，用75％酒精消毒1min，0.1％升汞消毒8min，再用无菌水冲洗3-5次，在无菌滤纸上晾干后，播种到1/2MS培养基上，在25℃，12h光照和12h黑暗交替的条件下发芽；

[0098] 2)油菜组织的预培养，切取步骤1)中培养6天的无菌苗的下胚轴，置于预培养基M1中培养3天；

[0099] 所述预培养基M1为：在MS培养基中，添加有2.0mg/L 2,4-D、1.0mg/L 6-BA、30g/L蔗糖、8g/L琼脂；所述预培养基M1的PH值为5.85；

[0100] 3)油菜组织的分化培养，将步骤2)中经过预培养的下胚轴转移到分化培养基M2-N中培养30天，得到不定芽；

[0101] 所述分化培养基M2-N为：在MS培养基中，添加有3mg/L 6-BA、1.0mg/L NAA、5mg/L AgNO3、30g/L蔗糖、8g/L琼脂；所述分化培养基M2-N的PH值为5.85；

[0102] 4)将步骤3)得到的不定芽转移到矮壮素生根培养基中，培养30天；

[0103] 所述矮壮素生根培养基为：在MS培养基中，添加有15mg/L CCC、30g/L蔗糖、8g/L琼脂，所述矮壮素生根培养基的PH值为5.85。

[0104] 实施例3

[0105] 1)发芽：挑选饱满、大小均匀和无病虫害的甘蓝型油菜Polima CMS恢复系616R油菜种子，用75％酒精消毒1min，0.1％升汞消毒8min，再用无菌水冲洗3-5次，在无菌滤纸上晾干后，播种到1/2MS培养基上，在25℃，12h光照和12h黑暗交替的条件下发芽；

[0106] 2)油菜组织的预培养，切取步骤1)中培养6天的无菌苗的下胚轴，置于预培养基M1中培养3天；

[0107] 所述预培养基M1为：在MS培养基中，添加有2.0mg/L 2,4-D、1.0mg/L 6-BA、30g/L蔗糖、8g/L琼脂；所述预培养基M1的PH值为5.85；

[0108] 3)油菜组织的分化培养，将步骤2)中经过预培养的下胚轴转移到分化培养基M2-N中培养30天，得到不定芽；

[0109] 所述分化培养基M2-N为：在MS培养基中，添加有3mg/L 6-BA、1.0mg/L NAA、5mg/L AgNO3、30g/L蔗糖、8g/L琼脂；所述分化培养基M2-N的PH值为5.85；

[0110] 4)将步骤3)得到的不定芽转移到矮壮素生根培养基中，培养30天；

[0111] 所述矮壮素生根培养基为：在MS培养基中，添加有15mg/L CCC、30g/L蔗糖、8g/L琼脂，所述矮壮素生根培养基的PH值为5.85。

[0112] 实施例4

[0113] 1)发芽：挑选饱满、大小均匀和无病虫害的甘蓝型油菜Polima CMS恢复系627R油菜种子，用75％酒精消毒1min，0.1％升汞消毒8min，再用无菌水冲洗3-5次，在无菌滤纸上晾干后，播种到1/2MS培养基上，在25℃，12h光照和12h黑暗交替的条件下发芽；

[0114] 2)油菜组织的预培养，切取步骤1)中培养6天的油菜子叶，置于预培养基M1中培养3天；

[0115] 所述预培养基M1为：在MS培养基中，添加有2.0mg/L 2,4-D、1.0mg/L 6-BA、30g/L蔗糖、8g/L琼脂；所述预培养基M1的PH值为5.85；

[0116] 3)油菜组织的分化培养，将步骤2)中经过预培养的油菜子叶转移到分化培养基M2-N中培养30天，得到不定芽；

[0117] 所述分化培养基M2-N为：在MS培养基中，添加有3mg/L 6-BA、1.0mg/L NAA、5mg/L AgNO3、30g/L蔗糖、8g/L琼脂；所述分化培养基M2-N的PH值为5.85；

[0118] 4)将步骤3)得到的不定芽转移到矮壮素生根培养基中，培养30天；

[0119] 所述矮壮素生根培养基为：在MS培养基中，添加有15mg/L CCC、30g/L蔗糖、8g/L琼脂，所述矮壮素生根培养基的PH值为5.85。

[0120] 实施例5

[0121] 1)发芽：挑选饱满、大小均匀和无病虫害的甘蓝型油菜Polima CMS恢复系621R油菜种子，用75％酒精消毒1min，0.1％升汞消毒8min，再用无菌水冲洗3-5次，在无菌滤纸上晾干后，播种到1/2MS培养基上，在25℃，12h光照和12h黑暗交替的条件下发芽；

[0122] 2)油菜组织的预培养，切取步骤1)中培养6天的油菜子叶，置于预培养基M1中培养3天；

[0123] 所述预培养基M1为：在MS培养基中，添加有2.0mg/L 2,4-D、1.0mg/L 6-BA、30g/L蔗糖、8g/L琼脂；所述预培养基M1的PH值为5.85；

[0124] 3)油菜组织的分化培养，将步骤2)中经过预培养的油菜子叶转移到分化培养基M2-I中培养30天，得到不定芽；

[0125] 所述分化培养基M2-I为：在MS培养基中，添加有3mg/L 6-BA、1.0mg/L IAA、5mg/L AgNO3、30g/L蔗糖、8g/L琼脂；所述分化培养基M2-I的PH值为5.85；

[0126] 4)将步骤3)得到的不定芽转移到矮壮素生根培养基中，培养30天；

[0127] 所述矮壮素生根培养基为：在MS培养基中，添加有15mg/L CCC、30g/L蔗糖、8g/L琼脂，所述矮壮素生根培养基的PH值为5.85。

[0128] 实施例6

[0129] 1)发芽：挑选饱满、大小均匀和无病虫害的甘蓝型油菜Polima CMS恢复系616R油菜种子，用75％酒精消毒1min，0.1％升汞消毒8min，再用无菌水冲洗3-5次，在无菌滤纸上晾干后，播种到1/2MS培养基上，在25℃，12h光照和12h黑暗交替的条件下发芽；

[0130] 2)油菜组织的预培养，切取步骤1)中培养6天的油菜子叶，置于预培养基M1中培养3天；

[0131] 所述预培养基M1为：在MS培养基中，添加有2.0mg/L 2,4-D、1.0mg/L 6-BA、30g/L蔗糖、8g/L琼脂；所述预培养基M1的PH值为5.85；

[0132] 3)油菜组织的分化培养，将步骤2)中经过预培养的油菜子叶转移到分化培养基M2-I中培养30天，得到不定芽；

[0133] 所述分化培养基M2-I为：在MS培养基中，添加有3mg/L 6-BA、1.0mg/L IAA、5mg/L AgNO3、30g/L蔗糖、8g/L琼脂；所述分化培养基M2-I的PH值为5.85；

[0134] 4)将步骤3)得到的不定芽转移到矮壮素生根培养基中，培养30天；

[0135] 所述矮壮素生根培养基为：在MS培养基中，添加有15mg/L CCC、30g/L蔗糖、8g/L琼脂，所述矮壮素生根培养基的PH值为5.85。

[0136] 根据实施例1-6的结果显示，体系中出芽率均较高，生根培养后，其中627R材料在生根培养基中生长30天平均根长20.88cm，平均鲜重为0.4g；621R材料在生根培养基中生长30天平均根长20.88cm，平均鲜重为0.31g；616R材料在生根培养基中生长30天平均根长
21.61cm，平均鲜重0.37g。

[0137] 当然，以上仅是本发明的具体应用范围，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

[0138] 参考文献

[0139] [1]王艳,曾幼玲,张富春,等.新疆甘蓝型油菜下胚轴的组织培养和植株再生研究[J].新疆农业科学,2005,42(1)：24-28.

[0140] [2]王景雪，孙毅，崔贵梅等.在油菜组织培养中激素及基因型对胚轴分化的影响[J].中国油料作物学报，2000，20(1)：11-18.

[0141] [3]赵云，王海燕，王茂林，张义正.基因型对油菜子叶外植体再生植株的影响[J].中国油料，1997，19(4)：1-4

[0142] [4]刘海燕,隆小华,刘兆普.南盐油1号油菜的组织培养及植株再生研究[J].江苏农业科学,2010(3)：59-61.

[0143] [5]夏鸿亮,汪洪.沪油16号油菜的组织培养和植株再生[J].种子,2011,30(10)：92-93.

[0144] [6]裴冬丽.白菜型油菜高效离体再生体系的建立.北方园艺,2011(1)：127-129.[0145] [8]Pua EC,Asha MP,Nagy F,et al.Transgenic plants ofBrassica napus L.Nature Biotechnology,1987,5：815-817.

[0146] [9]Damgaard O,Rasmussen O.Direct regeneration of transformed shoots in Brassica napus from hypocotyl infections withAgrobacterium rhizogenes[J].Plant Molecule Biology,1991,17：1-8.

[0147] [10]Ovesna J,Ptacek L,Opatrny Z.Factor influencing the regeneration capacity of oilseed rape and cauliflower in transformation experiments[J].Biologia Plantarum,1993,35(1)：107-112.

[0148] [11]唐桂香,周伟军.AgNO3对甘蓝型油菜子叶柄外植体植株再生的影响[J].中国油料作物学报,2001,23(3):9-11.

[0149] [12]杨长友，袁中厚，郑小敏，张涛.甘蓝型油菜高效离体再生体系的建立[J].生物技术通报，2013(1)：111-115.

标题	发布/更新时间	阅读量
一种焦耳级三波长可调谐单频脉冲激光器	2020-05-08	816
一种应用植物种子评价全生物降解材料生态毒性的方法	2020-05-08	585
一种带有除尘进料斗的玉米种子振动输送装置	2020-05-08	386
一种具有双筛箱功能的风筛式玉米种子清选机	2020-05-08	345
一种防治草地贪夜蛾农药的药剂及其制备方法	2020-05-08	50
一种基于贝叶斯估计和种子节点邻居集合的链路预测方法	2020-05-11	481
一种降低褐化提高农杆菌介导蓖麻遗传转化率的方法	2020-05-08	330
一种基于图和局部盒子搜索获取团块的计算方法	2020-05-08	831
一种甘油发酵生产1，3-丙二醇的方法	2020-05-08	893
一种安全无副作用的应用干细胞疗法控制血糖的方法	2020-05-08	555

一种油菜组织培养快速繁殖及壮苗的方法

一种油菜组织培养快速繁殖及壮苗的方法

技术领域

背景技术

发明内容

具体实施方式

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：