技术领域
[0001] 本
发明属于
生物工程技术领域，具体涉及一种甘油发酵生产1，3-丙二醇的方法。
背景技术
[0002] 1，3-丙二醇（1，3-Propanediol，PDO）主要用于生产性能优异的新型聚酯PTT（Polytrimethylene Terephthalate）。由它合成的聚酯具有独特的性质和优异的性能，而且可以使聚酯塑料具有易于自然循环的可
生物降解特性。近年来，作为重要的有机合成原料和中间体，因其独特性能以及广泛的用途成为研究开发的热点。
[0003] 1，3-丙二醇工业生产方法主要有化学法和生物法两大类。生物法是目前研究的热点，根据原料不同可分为
葡萄糖一步转化法和甘油转化法。生物法虽然起步较早，但是直到二十世纪八十年代才逐渐引起人们的重视。与化学法相比，
微生物转化法具有条件温和、操作简便、选择性好、节省
能源、设备投资少和环境良好等特点，是一种生产成本最低、污染最少的方法，符合当今“绿色化工”和“
可持续性发展”的要求。
[0004] 目前以甘油为底物，利用克雷伯氏菌生物转化制备1，3-丙二醇的技术路线，由于其代谢途径简单、发酵菌种易于改造，所以该路线被广泛采用。克雷伯氏菌是一类典型的兼性厌
氧微生物，在厌氧、微氧以及好氧条件下均能生长，因此甘油经生物转化制备1，3-丙二醇工艺主要分为好氧模式、微氧模式以及厌氧模式。中国
专利CN1348007A公开了一种微生物微氧发酵生产1，3-丙二醇的方法，其所使用的微生物细胞不仅在厌氧条件下，而且在微氧条件下都能将甘油转化为1，3-丙二醇。近年来从克雷伯氏菌代谢途径入手，对好氧、微氧以及厌氧模式进行了深入研究，形成了多种技术方案。中国专利CN1434122A公开了一种采用两段双底物集成发酵生产1，3-丙二醇的方法，其二级
种子培养是以葡萄糖和甘油为混合双底物，将好氧条件下的二级种子培养和厌氧条件下的甘油厌氧转化集成在同一个
发酵罐中进行。中国专利CN101307335A公开了一种甘油厌氧发酵生产1，3-丙二醇的改进方法，其特征在于通过在发酵过程中加入
碱性
钙盐实现pH值在线调控，改善了甘油在还原与氧化两个支路之间的代谢，从而有利于菌体的生长和产物的生产。中国专利CN102864177A公开一种促进微生物发酵生产1，3-丙二醇的方法，发酵过程依次分为微氧发酵和厌氧发酵，当OD值大于7时由微氧发酵转变为厌氧发酵。该方法能够有效促进甘油的转化，大幅提高最终产物中1，3-丙二醇的浓度。
[0005] 随着生物技术的发展，利用基因工程的技术手段，通过菌种的改造以适应发酵工艺的设想也已实现。中国专利CN 106399217A公开了一株克雷伯氏菌arcA基因缺失株的构建及应用，其特征是利用同源重组的方法敲除产1,3-丙二醇克雷伯氏菌抑制TCA循环的关键基因arcA，提高微氧条件下细胞的TCA循环活
力，强化还原力再生，提高1,3-丙二醇产量。中国专利CN102199570A公开了一种构建基因工程菌以增强微生物产1，3-丙二醇的方法，包括构建插入苹果酸酶基因的表达载体；将插入苹果酸酶基因的表达载体转入产生1，3-丙二醇的宿主菌中；在发酵培养过程中添加诱导剂诱导苹果酸酶基因过量表达；采用有氧发酵并流加底物甘油的发酵方式生产1，3-丙二醇。
[0006] 上述方法虽然都从克雷伯氏菌兼性厌氧特征入手，通过阶段调控、菌种改造等方法，取得了一定的效果，但是从代谢途径机理研究发现：（1）厌氧条件下甘油的选择性最高，但过程中需要通入高通量的氮气以维持微氧条件，能耗较高；（2）微氧、好氧条件下，发酵副产物较多，目前多采用基因工程菌，但是发酵
水平不高。
发明内容
[0007] 针对
现有技术的不足，本发明提供了一种甘油发酵生产1，3-丙二醇的方法。本发明方法利用微藻细胞代谢和发酵体系的结合作用，强化了甘油代谢
中底物水平的氧化磷
酸化作用，提高了发酵水平。
[0008] 本发明一种甘油发酵生产1，3-丙二醇的方法，包括如下内容：（1）发酵菌种培养：在微氧条件下，以种子培养基进行发酵菌种的培养，获得发酵种子液；
（2）微藻培养：在自养条件下进行微藻培养，获得微藻种子液；
（3）发酵过程：在发酵培养基中接入发酵种子液，在微氧条件下进行发酵，发酵至乙酸浓度大于3g/L时加入微藻种子液，培养至发酵结束；
（4）将终止发酵液pH调至碱性，静置分层后获得含有1，3-丙二醇的发酵清液。
[0009] 本发明中，步骤（1）所述的发酵菌为能够利用甘油发酵生产1，3-丙二醇的微生物，主要为兼性厌氧菌，具体如克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae）、弗氏柠檬杆菌（Citrobacter freundii）等，优选克雷伯杆菌。
[0010] 本发明中，步骤（1）将活化的发酵菌接种至种子培养基中，接种体积比为3%～10%，优选5%～10%；培养
温度为25～40℃，优选35～40℃；pH值为6～9，优选6.5～7.2。所述的微氧条件采用通入低空气量的形式，通气量小于0.1vvm，优选0.02～0.08vvm。
[0011] 本发明中，步骤（2）所述微藻来自于具有光能自养和兼养活性的微藻，即微藻同时具有利用光能自养生长和利用有机
碳源生长的特性，如可以选择绿藻类，具体如小球藻(Chlorella)、衣藻(Chlamydomonas)、栅藻(Scenedesmus)、
纤维藻(Ankistrodesmus)等中的至少一种。
[0012] 本发明中，步骤（2）所述自养培养的培养基可以采用本领域人员熟知的BG11、SE、BBM等培养微藻的液体培养基，优选BG11培养基。自养培养条件为：光照强度2000Lux～7000Lux，光暗时间比为7:5～2:1，pH值为7～9，温度为25～40℃，通气中CO2含量3v%～
10v%。培养至微藻种子液中藻细胞干重达到5g/L～20g/L。
[0013] 本发明中，步骤（3）发酵种子液的接种体积比为2%～20%，优选10%～15%。微氧条件为：空气通气量小于0.1vvm，优选0～0.05。发酵条件为：发酵温度为30～42℃，优选为35～40℃；搅拌转速为100～500rpm，优选200～400rpm；pH控制为6～7.5，优选6.8～7.2。
[0014] 本发明中，步骤（3）微藻种子液的加入体积比为2%～20%，优选5%～10%。加入微藻种子液后，pH控制在7.5～8.5，优选7.5～8。
[0015] 本发明中，步骤（3）发酵过程中流加甘油使发酵体系中甘油浓度控制在20g/L～40g/L。
[0016] 本发明中，步骤（3）发酵结束后，将终止发酵液pH调至8.5～10，优选8.5～9.5。调节pH可采用
质量浓度为30%～40%液体强碱，强碱为氢氧化钠、氢
氧化钙、氢氧化
钾等，优选氢氧化钠。
[0017] 与现有技术相比，本发明方法具有如下有益效果：（1）本发明将微藻的代谢特性与甘油转化制备1,3-丙二醇微氧发酵代谢途径进行有机结合，解决了发酵体系中二氧化碳溶解所产生的极性分子对发酵菌体的细胞毒性问题，同时通过对发酵副产物乙酸的内源性消耗，降低了发酵体系中离子浓度，利于延长发酵周期，提高发酵水平。而且将二者结合会使发酵体系pH值升高，从而减少pH调节剂的用量。
[0018] （2）本发明在发酵至乙酸浓度大于3g/L时接入微藻种子液，有利于甘油代谢中底物水平氧化
磷酸化的进行，为发酵菌体提供更多的ATP和还原力，有助于1,3-丙二醇的合成。
[0019] （3）本发明在发酵过程中控制pH为6-7.5，加入微藻后控制为7.5～8.5，在发酵结束后调至8.5～10，不仅有助于微藻细胞在发酵体系中促进发酵，而且提升pH有助于发酵结束后菌
体细胞的分离，易于获得发酵清液，从而减少了分离工序，提高了生产效率。
[0020] （4）本发明方法具有生产效率高，能耗低，具有良好的工业应用前景。
具体实施方式
[0021] 下面通过
实施例对本发明方法和效果作进一步详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0022] 以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均从常规生化
试剂商店购买得到。
[0023] 本发明实施例中，以Waters 2695分离系统与Waters 2414示差检测器构成液相分析系统，其中分离柱选用Aminex HPX-87H
有机酸和醇分析柱用于酸类和醇类的分离。以
琥珀酸、乳酸、甘油、乙酸、1，3-丙二醇、
乙醇标准样品建立标准图谱，反应过程中进行产物分析。
[0024] 本发明实施例中，以分光光度计检测OD600、OD280，分别代表发酵液中固形物含量和蛋白类大分子含量。
[0025] 本发明实施例中，所用的菌种为已经公开的克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae），来自中国石化抚顺石油化工研究院专利菌种，菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No. 0798。
[0026] 本发明实施例中，所用纤维藻（Ankistrodesmus sp.）SS-B7，已经于2013年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 7478，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。该藻株已经于CN 105713836A中公开，并提交了保藏及存活证明。
[0027] 本发明实施例中，所用小球藻（Chlorella sp.）SF-B1已经于2015年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 11005，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0028] 本发明实施例中，克雷伯杆菌种子培养基与发酵培养基的基本组成见表1。
[0029] 表1 克雷伯杆菌种子培养基及发酵培养基本发明微藻培养采用BG11培养基，配方如表2、表3所示。
[0030] 表2 BG11培养基*表3 表1中A5+Co solution的组成
实施例1
（1）菌种培养：取活化的克雷伯杆菌菌液70mL，与630mL种子培养基混合于1L发酵罐中，进行微氧培养，通气量0.02vvm；培养条件为：培养温度为 37℃，搅拌转速为200rpm，pH控制在7.0，培养18h后获得发酵种子液。
[0031] （2）微藻培养：将对数生长期的纤维藻SS-B7藻液60mL与540mL微藻培养基混合于柱式反应器（内径为40mm，高度为500mm）中，培养过程中通入CO2含量为3v%的空气混合气，光照强度为4000Lux，培养温度为28℃，pH值控制在7.5，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养至微藻种子液中藻细胞干重达到18.2g/L。
[0032] （3）发酵过程：发酵罐体积选择15L，装液体积为7L。
[0033] 取700mL发酵种子液接入到6.3L发酵培养基中，进行微氧发酵，发酵过程中流加甘油，以维持发酵体系中甘油浓度在40g/L；发酵过程控制培养温度为37℃，pH为7.0，搅拌速度为400rpm。发酵至发酵液中乙酸浓度3.2g/L，加入微藻种子液350mL。其他控制参数不变。
[0034] 发酵40h后，经检测1，3-丙二醇浓度为75.64g/L，乙酸浓度为5.4g/L，电导率15.2mS/cm。结束发酵，以质量浓度30%的氢氧化钠调节pH至8.5，静置8h，发酵液分层，上层清液OD600、OD280检测值分别为1.1、12.4。
[0035] 实施例2（1）菌种培养：取活化的克雷伯杆菌菌液70mL，与630mL种子培养基混合于1L发酵罐中，进行微氧培养，空气通入量0.06vvm；培养条件为：培养温度为 37℃，搅拌转速为300rpm，pH控制在7.2，培养18h后获得发酵种子液。
[0036] （2）微藻培养：将对数生长期的纤维藻SS-B7藻液30mL与570mL培养基混合于柱式反应器（内径为40mm，高度为500mm）中，培养过程中通入CO2含量为10v%的空气混合气，光照强度为7000Lux，培养温度为37℃，pH值控制在7.5，光照周期为24h，光暗时间比为16:8，培养至微藻种子液中藻细胞干重达到19.6g/L。
[0037] （3）发酵过程：发酵罐体积选择15L，装液体积为7L。
[0038] 取1050mL发酵种子液接入到5.95L发酵培养基中，进行微氧发酵，发酵过程中流加甘油，以维持发酵体系中甘油浓度在30g/L；发酵过程控制培养温度为37℃，pH为7.2，搅拌速度为300rpm。发酵至稳定期，加入微藻种子液600mL。其他控制参数不变。
[0039] 发酵40h后，经检测1，3-丙二醇浓度为76.21g/L，乙酸浓度为3.2g/L，电导率14.1mS/cm。结束发酵，以质量浓度30%的氢氧化钾调节pH至9，静置8h，发酵液分层，上层清液OD600、OD280检测值分别为0.9、11.3。
[0040] 实施例3发酵过程及工艺条件同实施例1。不同在于：发酵过程中加入微藻种子液后，调控pH为
7.5。
[0041] 发酵40h后，经检测1，3-丙二醇浓度为78.2g/L，乙酸浓度为4.6g/L，电导率16.8mS/cm。结束发酵，pH调至8.5，静置8h，发酵液分层，上层清液OD600、OD280检测值分别为
1.0、10.6。
[0042] 实施例4发酵过程及工艺条件同实施例2。不同在于：发酵过程中加入微藻种子液后，调控pH为
8.5。
[0043] 发酵40h后，经检测1，3-丙二醇浓度为72.1g/L，乙酸浓度为2.8g/L，电导率13.6mS/cm。结束发酵，pH调至9，静置8h，发酵液分层，上层清液OD600、OD280检测值分别为
0.8、10.4。
[0044] 实施例5发酵过程及工艺条件同实施例1。不同在于：微藻采用小球藻（Chlorella sp.）SF-B1。
[0045] 发酵40h后，经检测1，3-丙二醇浓度为76.37g/L，乙酸浓度为5.5g/L，电导率15.1mS/cm。结束发酵，以质量浓度30%的氢氧化钠调节pH调至8.5，静置8h，发酵液分层，上层清液OD600、OD280检测值分别为1.2、12.3。
[0046] 实施例6发酵过程及工艺条件同实施例1。不同在于：步骤（3）发酵过程中微氧采用通入空气的形式，空气通入量0.05vvm。
[0047] 发酵40h后，经检测1，3-丙二醇浓度为76.14g/L，乙酸浓度为5.2g/L，电导率14.6mS/cm。结束发酵，以质量浓度30%的氢氧化钠调节pH调至8.5，静置8h，发酵液分层，上层清液OD600、OD280检测值分别为1.2、12.6。
[0048] 比较例 1发酵过程及工艺条件同实施例1。不同在于选用仅具有光能自养性能不具有异养生长特性的三
角褐指藻（Phacodactylum tricornutum）代替纤维藻SS-B7。
[0049] 发酵40h后，经检测1，3-丙二醇浓度为56.32g/L，乙酸浓度为13.3g/L，电导率27.7mS/cm。结束发酵，pH调至8.5，静置8h，发酵液分层，上层清液OD600、OD280检测值分别为
3.3、25.9。
[0050] 比较例 2发酵过程及工艺条件同实施例1。不同在于：按照中国专利CN103103129A公开的“同步混合培养”方式，将发酵种子液和微藻种子液同步加入到发酵体系中，其余过程与实施例1完全相同。发酵40h后，经检测1，3-丙二醇浓度为55.26g/L，乙酸浓度为12.9g/L，电导率
27.2mS/cm。结束发酵，pH调至8.5，静置8h，发酵液分层，上层清液OD600、OD280检测值分别为
2.9、24.6。
[0051] 比较例 3发酵过程及工艺条件同实施例1。不同在于：步骤（3）发酵结束后，将终止发酵液pH不进行调节。静置8h，发酵液分层，上层清液OD600、OD280检测值分别为3.3、25.9。
