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一种应用植物种子评价全生物降解材料生态毒性的方法

阅读:552发布:2020-05-08

专利汇可以提供一种应用植物种子评价全生物降解材料生态毒性的方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种应用 植物 种子 评价 生物 降解 材料生态毒性的方法,包括以下步骤:(一)溶液提取:1)将降解材料制备成粉末或 块 状样品待用;2)在所述样品中加入 有机 溶剂 后密封浸泡;3)振荡所述样品和 有机溶剂 的浸泡溶液,并将溶液过滤后作为实验组,设双对照,分别是有机溶剂对照组合蒸馏 水 空白对照组;4)将实验组和双对照组溶液分别进行旋转 蒸发 ,水浴加热,获得实验组和双对照组的蒸馏提取溶液;5)溶解蒸馏提取溶液,分别得到实验组和双对照组的实验用提取液;(二)发芽实验及指标测定。本发明弥补了 现有技术 不能有效评价全生物降解材料生态毒性的 缺陷 ,能够更加准确、更加直观反应出全生物降解材料的生态毒性。,下面是一种应用植物种子评价全生物降解材料生态毒性的方法专利的具体信息内容。

1.一种应用植物种子评价全生物降解材料生态毒性的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(一)溶液提取
1)将降解材料制备成粉末或状样品待用;
2)在所述样品中加入有机溶剂后密封浸泡;
3)振荡所述样品和有机溶剂的浸泡溶液,并将溶液过滤后作为实验组,设双对照,分别是有机溶剂对照组和蒸馏空白对照组;
4)将实验组和双对照组溶液分别进行旋转蒸发,水浴加热,获得实验组和双对照组的蒸馏提取溶液;
5)溶解蒸馏提取溶液,分别得到实验组和双对照组的实验用提取液;
(二)发芽实验
1)选取单子叶和双子叶植物种子各科至少一种进行试验,要求所用的种子大小一致、饱满度、粒径等级相同,发芽率在95%以上;
2)在相同规格的培养皿中分别加入等量的实验组和双对照组的实验用提取液,在空白组的培养皿中加入等量蒸馏水;
3)在各培养皿中排放相同数量的植物种子,盖好培养皿,放置于组培室中进行培养,每日在各培养皿中加入相同量的相应提取液,保持恒重以补充所蒸发的水分,在保持提取液质量浓度恒定条件下进行发芽培养;
(三)种子发芽率和发芽势测定
以胚根生长至种子等长作为萌发的标准,每隔一段时间记录一次发芽数,计算烟苗的发芽率和发芽势;
(四)胚根指标测定
在设定时间随机选取各组相同数量的幼苗,切下胚根,测定幼苗苗高和根长,计算生物量和根苗比;
(五)物质代谢差异分析
取各组幼苗进行物质代谢差异分析;
(六)结果评估
比较实验组、双对照组植物种子的发芽率、发芽势、根苗比和生物量,同时评估实验组与对照组之间物质的差异。
2.根据权利要求1所述应用植物种子评价全生物降解材料生态毒性的方法,其特征在于,所述提取溶剂为甲基叔丁基醚。
3.根据权利要求1所述应用植物种子评价全生物降解材料生态毒性的方法,其特征在于,采用乙醇溶解蒸馏提取溶液。
4.根据权利要求1所述应用植物种子评价全生物降解材料生态毒性的方法,其特征在于,组培室中培养条件为:温度设定为26℃,相对湿度>85%,以胚根生长至种子等长作为萌发的标准,萌发前无光照培养,萌发后光暗比16:8h,光照条件下培养14d。
5.根据权利要求1所述应用植物种子评价全生物降解材料生态毒性的方法,其特征在于,物质代谢差异分析方法包括以下步骤:
1)提取:向幼苗样品中加入混合内标溶液,并加入混合提取溶液,涡旋,常温超声提取,再涡旋,离心,取上层清液于离心管中,得提取液备用;
2)吹干:用氮气吹干离心管中的提取液后,加入二氯甲烷,再次用氮气吹干离心管中的提取液;
3)反应:向离心管中加入甲基胺盐酸盐,封口密封后涡旋混匀,恒温金属浴40℃反应
120min,冷却至室温,离心,再加入BSTFA,封口密封后涡旋混匀,恒温金属浴70℃反应
90min,冷却至室温,再加入色谱纯乙腈,封口密封后涡旋混匀,恒温金属浴81℃反应90min,冷却至室温,涡旋混匀后离心,取上层清液,得反应溶液备用;
4)检测:取所述反应溶液进样,对溶液中含有的各种物质采用气相色谱-质谱检测器进行色谱定性与定量分析。
6.根据权利要求5所述应用植物种子评价全生物降解材料生态毒性的方法,其特征在于,色谱条件为:色谱柱:HP-5MS(60m×250μm×0.25μm)毛细管色谱柱,进样口温度:280℃;
进样量:2uL;分流比:20:1;柱流速:1.0mL/min;升温程序:60℃保持2min,然后以5℃/min升到230℃保持5min,8℃/min升到290℃保持23.5min,一共运行72min;质谱条件:离子源温度:230℃,四级杆温度:150℃;电离能:70eV,传输线温度:280℃,全扫描质量数范围45-
600aum,溶剂延迟:11.90min;采集模式:全扫描(Scan)采集;MS谱库:NIST08库和Willy08库。
7.根据权利要求5所述应用植物种子评价全生物降解材料生态毒性的方法,其特征在于,所述混合内标溶液中含有第一种内标物和第二种内标物,其中,第一种内标物由己二酸、苯基葡萄糖苷和正缬酸按10:4:4的体积比例混合而成,第二种内标物由甲醇与水按
1:1的体积比例混合而成。
8.根据权利要求5所述应用植物种子评价全生物降解材料生态毒性的方法,其特征在于,所述混合提取溶液由甲醇、三氯甲烷和水按2.5:1:1的体积比例混合而成。

说明书全文

一种应用植物种子评价全生物降解材料生态毒性的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种应用植物种子评价全生物降解材料生态毒性的方法,属于全生物降解材料生态毒性评价领域。

背景技术

[0002] 塑料是20世纪初研发出来的新型材料,20世纪50年代成为一个新兴行业并得到快发展,80年代时已被广泛应用于多个领域,如航空、汽车、日用家电、日用品、包装、建材及医疗器材等。近年来,我国塑料工业保持快速发展的态势,产销量都位居全球首位,塑料制品产量约占世界总产量的20%。2014年以来,我国塑料制品年产量均超过7000万吨,2017年达到7515.5万吨。但大量的一次性塑料包装物被使用废弃,给环境带来非常严重的问题。如一次性发泡塑料饭盒和塑料袋盛装食物严重影响着人类的身体健康。当温度达到65℃时,一次性发泡塑料餐具中的有害物质将渗入到食物中,会对人的肝脏、肾脏及中枢神经系统等造成损害。农田里的废农地膜、塑料袋长期残留在田中,会影响农作物分、养分的吸收,抑制农作物的生长发育,造成农作物的减产。调查显示多年覆膜农田的平均残膜量在71.9~259.1kg/hm2,西北农田土壤中残膜量要明显高于华北和西南地区。若羊等家畜误食混入农作物秸秆和饲料的残膜碎片后,会引起肠胃功能不良,甚至导致死亡。更有甚者,各环节产生的微塑料进入大气和水体循环,已严重危害人体健康。
[0003] 在此背景下,全生物降解材料以及采用全生物降解材料制备的相关塑料制品研发与应用已势在必行。生物降解材料是一种在自然界如土壤和/或沙土等条件下,和/或特定条件如堆肥化条件下或消化条件下或水性培养液中,由自然界存在的微生物作用引起降解,并最终完全降解变成二氧化(CO2)和/或甲烷(CH4)、水(H2O)及其所含元素的矿化无机盐以及新的生物质的材料。作为一种新兴材料,针对其降解产物进行安全性评价却鲜有报道,本发明旨在通过对全生物降解材料进行生物毒性评价,以为全生物降解材料的发展和应用提供参考。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种应用植物种子评价全生物降解材料生态毒性的方法。
[0005] 本发明的技术方案是:一种应用植物种子评价全生物降解材料生态毒性的方法,包括以下步骤:
[0006] (一)溶液提取
[0007] 1)将降解材料制备成粉末或状样品待用;
[0008] 2)在所述样品中加入有机溶剂后密封浸泡;
[0009] 3)振荡所述样品和有机溶剂的浸泡溶液,并将溶液过滤后作为实验组,设双对照,分别是有机溶剂对照和蒸馏水空白对照组;
[0010] 4)将实验组和双对照组溶液分别进行旋转蒸发,水浴加热,获得实验组和双对照组的蒸馏提取溶液;
[0011] 5)溶解蒸馏提取溶液,分别得到实验组和双对照组的实验用提取液;
[0012] (二)发芽实验
[0013] 1)选取单子叶和双子叶植物种子各科至少一种进行试验,要求所用的种子大小一致、饱满度、粒径等级相同,发芽率在95%以上;
[0014] 2)在相同规格的培养皿中分别加入等量的实验组和双对照组的实验用提取液,在空白组的培养皿中加入等量蒸馏水;
[0015] 3)在各培养皿中排放相同数量的植物种子,盖好培养皿,放置于组培室中进行培养,每日在各培养皿中加入相同量的相应提取液,保持恒重以补充所蒸发的水分,在保持提取液质量浓度恒定条件下进行发芽培养;
[0016] (三)种子发芽率和发芽势测定
[0017] 以胚根生长至种子等长作为萌发的标准,每隔一段时间记录一次发芽数,计算烟苗的发芽率和发芽势;
[0018] (四)胚根指标测定
[0019] 在设定时间随机选取各组相同数量的幼苗,切下胚根,测定幼苗苗高和根长,计算生物量和根苗比;
[0020] (五)物质代谢差异分析
[0021] 取各组幼苗进行物质代谢差异分析;
[0022] (六)结果评估
[0023] 比较实验组、双对照组植物种子的发芽率、发芽势、根苗比和生物量,同时评估实验组与对照之间物质的差异。
[0024] 优选的,所述提取溶剂为甲基叔丁基醚。
[0025] 优选的,采用乙醇溶解蒸馏提取溶液。
[0026] 优选的,组培室中培养条件为:温度设定为26℃,相对湿度>85%,以胚根生长至种子等长作为萌发的标准,萌发前无光照培养,萌发后光暗比16:8h,光照条件下培养14d。
[0027] 优选的,物质代谢差异分析方法包括以下步骤:
[0028] 1)提取:向幼苗样品中加入混合内标溶液,并加入混合提取溶液,涡旋,常温超声提取,再涡旋,离心,取上层清液于离心管中,得提取液备用;
[0029] 2)吹干:用氮气吹干离心管中的提取液后,加入二氯甲烷,再次用氮气吹干离心管中的提取液;
[0030] 3)反应:向离心管中加入甲氧基胺盐酸盐,封口密封后涡旋混匀,恒温金属浴40℃反应120min,冷却至室温,离心,再加入BSTFA,封口密封后涡旋混匀,恒温金属浴70℃反应90min,冷却至室温,再加入色谱纯乙腈,封口密封后涡旋混匀,恒温金属浴81℃反应90min,冷却至室温,涡旋混匀后离心,取上层清液,得反应溶液备用;
[0031] 4)检测:取所述反应溶液进样,对溶液中含有的各种物质采用气相色谱-质谱检测器进行色谱定性与定量分析。
[0032] 优选的,色谱条件为:色谱柱:HP-5MS(60m×250μm×0.25μm)毛细管色谱柱,进样口温度:280℃;进样量:2uL;分流比:20:1;柱流速:1.0mL/min;升温程序:60℃保持2min,然后以5℃/min升到230℃保持5min,8℃/min升到290℃保持23.5min,一共运行72min;质谱条件:离子源温度:230℃,四级杆温度:150℃;电离能:70eV,传输线温度:280℃,全扫描质量数范围45-600aum,溶剂延迟:11.90min;采集模式:全扫描(Scan)采集;MS谱库:NIST08库和Willy08库。
[0033] 优选的,所述混合内标溶液中含有第一种内标物和第二种内标物,其中,第一种内标物由己二酸、苯基葡萄糖苷和正缬酸按10:4:4的体积比例混合而成,第二种内标物由甲醇与水按1:1的体积比例混合而成。
[0034] 优选的,所述混合提取溶液由甲醇、三氯甲烷和水按2.5:1:1的体积比例混合而成。
[0035] 本发明的有益效果是:本发明通过有机溶剂处理全生物降解材料,使全生物降解材料充分溶解蒸馏成提取溶液,并用该提取溶液作为实验组,再用有机溶剂对照组和蒸馏水空白对照组作为双对照组,根据实验组和双对照组处理的发芽实验来评价全生物降解材料对作物的生态毒性。
[0036] 本发明所提供的应用植物种子评价全生物降解材料生态毒性的方法,弥补了现有技术不能有效评价全生物降解材料生态毒性的缺陷,能够更加准确、更加直观反应出全生物降解材料的生态毒性,而基于这些测定、分析结果,进一步可为全生物降解材料与生态污染之间的关联性分析并且为全生物降解材料,特别是全生物降解地膜的改良生产奠定一定的基础

具体实施方式

[0037] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施,本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进,因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
[0038] 有机溶剂的选择:通过对溶剂的筛选,除二氯甲烷能够溶解所有降解材料(膜),但不能溶解PE外,其它溶剂都不溶解降解材料(膜)与PE,但二氯甲烷不好过滤,存在1)过滤后存在塑料残留;2)过滤时损坏滤膜;3)存在某些类型的降解材料(膜)完全无法过滤等问题,且溶解的降解材料(膜)残留导致色谱仪器残留严重。
[0039] 表1不同溶剂对不同降解材料(膜)的提取效率比较
[0040]
[0041] 从上表1可以看到,二氯甲烷具有最大的提取效率,提取降解材料(膜)中的物质种类与含量都最高,但二氯甲烷重复性稍差,且过滤后存在塑料残留与易损坏滤膜等缺点。因此,本发明实施例选择甲基叔丁基醚作为提取溶剂,甲基叔丁基醚提取效率高,重复性好,且易过滤,能较好的对降解材料(膜)中的主要挥发性成分进行提取。
[0042] 本发明实施例一种应用植物种子评价全生物降解材料生态毒性的方法,包括以下步骤:
[0043] (一)溶液提取
[0044] 1)将降解材料(膜)制备成粉末或小块状样品待用。
[0045] 2)在样品装入锥形瓶中,加入有机溶剂甲基叔丁基醚,浸泡12h,密封锥形瓶,以防止甲基叔丁基醚挥发。
[0046] 3)将样品和有机溶剂振荡5分钟,使用双层纱布将溶液过滤到蒸馏烧瓶中作为实验组,设双对照,分别是有机溶剂对照组合蒸馏水空白对照组。
[0047] 4)将实验组和双对照组溶液分别进行旋转蒸发,放在水浴锅上加热,水浴锅的温度40℃,抽真空500mbar,转速为74rpm,旋转蒸发仪装置的一端接有平底烧瓶(接盛有实验过程中流出的废液),另外一端连接过滤到蒸馏烧瓶中的(实验组、双对照组)溶液,获得实验组和双对照组的蒸馏提取溶液。
[0048] 5)用1~2mL乙醇溶解蒸馏提取溶液,分别得到实验组和双对照组的实验用提取液。
[0049] (二)发芽实验
[0050] 1)选取单子叶和双子叶植物种子各科至少一种进行试验,要求所用的种子大小一致、饱满度、粒径等级相同,发芽率在95%以上。本实施例以双子叶烟草种子为例。
[0051] 2)参照《烟草种子检验规程》(YC/T20-1994),进行发芽试验。在相同规格的培养皿(垫两层滤纸)中分别加入5.00mL的实验组和双对照组的实验用提取液,空白组为蒸馏水。
[0052] 3)然后随机抽取均匀、饱满的烟草种子100粒,按一定距离排放在各培养皿上,盖好培养皿,放置于组培室中进行培养,温度设定为26℃,相对湿度>85%,以胚根生长至种子等长作为萌发的标准,萌发前无光照培养,萌发后光暗比16:8h,光照条件下培养14d,每日在各培养皿中用移液枪加入相同量的相应提取液,保持恒重以补充所蒸发的水分,在保持提取液质量浓度恒定条件下进行发芽培养。
[0053] (三)种子发芽率和发芽势测定
[0054] 以胚根生长至种子等长作为萌发的标准,每隔一段时间,例如24h记录一次发芽数,计算烟苗的发芽率和发芽势。发芽速度越快越整齐一致,说明种子活越高。
[0055] 发芽率(GER,%)=(种子的发芽数/供试种子数)×100%
[0056] 发芽势(GEP,%)=(种子发芽高峰期的数量/供试种子数)×100%(注:每24h记录1次发芽数,发芽最多的1d即为发芽高峰期。)
[0057] 在种子活力方面,发芽势和发芽率是重要的两个指标,发芽率与发芽势也可提示种子的生产性能。因此,通过种子发芽率和发芽势可以有效的评价全生物降解材料对植物的毒性。
[0058] (四)胚根指标测定
[0059] 在设定时间,例如第14天随机选取各组相同数量(例如10根)的幼苗,每个处理设3次重复,切下胚根,测定幼苗苗高和根长,计算生物量(根和苗的重量)和根苗比(高度比)。
[0060] 根苗比=根长/苗高。
[0061] (五)物质代谢差异分析
[0062] 取各组幼苗进行物质代谢差异分析,具体包括以下步骤:
[0063] 1)提取:精确称取供试样品50mg鲜烟叶(50mL塑料离心管),加入混合内标40μL(第一种内标物由己二酸10mg/mL、苯基葡萄糖苷8.04mg/mL、正缬氨酸4.9mg/mL按体积比10:4:4配制,第二种内标物由甲醇与水按1:1配制),加入混合3ml提取液(由甲醇、三氯甲烷和水按体积比2.5:1:1配制),鲜烟叶均质1分钟提取,涡旋1min,常温超声提取40分钟(中途涡旋
1次,涡旋1min),最后再涡旋1min,置于3000-5000rpm下离心5分钟,小心取上层清液600μL提取液于2mL离心管中,得提取液备用。
[0064] 2)吹干:用氮气吹干离心管中的提取液后,加入二氯甲烷,再次用氮气吹干离心管中的提取液。具体地,先用氮气吹一个半小时到两小时,中间每隔20-30min观察液面下降情况,根据实际情况适度调节吹针的高度,气体流量(流量不要太大,不要使液体飞溅出离心管或沾到针上),在观察到离心管内无明显液体后加入100μL二氯甲烷,依次添加完后即刻从第一个离心管开始适度调节针的高度,吹的时间保持在一个半小时,即可回收,用封口膜密封低温保存(如果离心管壁上有水气,用纸擦干)。每次的氮气用量基本上在3-4个压左。
[0065] 3)反应:鲜烟叶取600μL提取液氮气吹干(吹干后可以放置于4℃冷藏,封口膜密封好,用之前恢复到室温,擦干净水气,再打开进行下一步),加入40μL 25-30(最好30)mg/mL甲氧基胺盐酸盐-加1个、盖1个(用干吡啶配制-用大瓶吡啶即可),封口膜密封后涡旋混匀5min,恒温金属浴40℃反应120min(60min时拿出涡旋1次,大约30s),冷却至室温,稍微离心,再加入200μLBSTFA(TMCSL 1%)。加1个、盖1个,封口膜密封后涡旋混匀30s,恒温金属浴
70℃反应90min(45min时稍微涡旋10s),冷却至室温,再加入90μL色谱纯乙腈,封口膜密封后涡旋混匀30s,恒温金属浴81℃反应90min(45min时稍微涡旋10s),冷却至室温,涡旋混匀后离心3min,取上层清液100μL,得反应溶液备用。
[0066] 4)检测:取反应溶液于250μL内衬管中进样,对溶液中含有的各种物质采用气相色谱-质谱检测器进行色谱定性与定量分析。优选的,色谱条件为:色谱柱:HP-5MS(60m×250μm×0.25μm)毛细管色谱柱,进样口温度:280℃;进样量:2uL;分流比:20:1;柱流速:1.0mL/min;升温程序:60℃保持2min,然后以5℃/min升到230℃保持5min,8℃/min升到290℃保持23.5min,一共运行72min;质谱条件:离子源温度:230℃,四级杆温度:150℃;电离能:70eV,传输线温度:280℃,全扫描质量数范围45-600aum,溶剂延迟:11.90min;采集模式:全扫描(Scan)采集;MS谱库:NIST08库和Willy08库。
[0067] (六)结果评估
[0068] 根据多次实验结果,实验组烟草种子的发芽率、发芽势、生物量和根苗比与对照组对应数值相比小于90%为全生物降解材料对植物种子产生了毒性影响,大于90%为未产生毒性影响。
[0069] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
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