一种城市园林土壤改良方法
阅读：770发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种城市园林土壤改良方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种城市园林 土壤 改良方法，该方法包括：将连续种植杜鹃两年以上的城市园林土壤表层土0-20cm厚的土壤挖起，混入 河沙 后，再加入 生物 质 炭充分混合均匀，然后再将土壤夯平，该方法能够降低园林土壤pH值，增加土壤有机质含量，改变园林土壤微 生物群落 结构，引起杜鹃花 根际 过程中养分调控机制的变化响应从而提高根际养分的有效性，或持续促进部分特定 微生物 的生长，达到促进杜鹃花生长的目的，实现杜鹃栽培土壤与杜鹃生长的良性循环。，下面是一种城市园林土壤改良方法专利的具体信息内容。
1.一种城市园林土壤改良方法，其特征在于，该方法为将城市园林表层土与生物质炭、河沙充分混合均匀。
2.根据权利要求1所述的一种城市园林土壤改良方法，其特征在于，该方法为将城市园林距土壤表层10cm的表层土与生物质炭、河沙充分混合均匀。
3.根据权利要求1所述的一种城市园林土壤改良方法，其特征在于，所述城市园林土壤为连续种植杜鹃两年以上的城市园林土壤。
4.根据权利要求1所述的一种城市园林土壤改良方法，其特征在于，进一步的，河沙和园土的体积比为1:10。
5.根据权利要求1所述的一种城市园林土壤改良方法，其特征在于，基于表层土壤、河沙混合后总重量计，生物质炭施用量为1%-10%。
6.根据权利要求5所述的一种城市园林土壤改良方法，其特征在于，基于表层土壤、河沙混合后总重量计，生物质炭施用量为8%。
7.根据权利要求1所述的一种城市园林土壤改良方法，其特征在于，所述生物质炭为酒糟生物质炭，该生物质炭的制备包括以下步骤：
（1）将酿酒工艺中的废料酒糟晾干；
（2）以晾干后的酒糟为原料，在 450℃高温限氧条件下热裂解炭化1小时后获得酒糟炭化物；
（3）将酒糟炭化过程中获得的木醋液稀释10倍，将酒糟炭化物浸泡其中至少12小时后，过滤，在 75℃恒温环境下烘干得到固体混合物；
（4）将步骤（3）中的固体混合物粉碎后，过目数为2mm 的筛子后，得到最终的生物质炭，并于密封袋中保存。
8.根据权利要求1所述的一种城市园林土壤改良方法，其特征在于：所述生物质炭为衍生自水稻酒糟的生物质炭。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的一种城市园林土壤改良方法在改良土壤环境为pH为碱性、质地偏黏重、肥力低的城市园林上的应用。
10.根据权利要求1-8任意一项所述的一种城市园林土壤改良方法在主要栽培杜鹃花类喜酸花卉的城市园林上的应用。
一种城市园林土壤改良方法
技术领域
背景技术
[0002] 杜鹃花(Rhododendron)是我国十大传统名花之一，也是重要的园林花木和盆栽花卉。我国虽然是世界杜鹃花的发源地和现代分布中心，聚集了约70％的杜鹃花物种资源，但对杜鹃花的推广应用远远弱于欧美国家。杜鹃花抗旱性较差，且喜疏松、通气良好、有机质含量较高、pH值在4.5-6.5之间的酸性土壤。虽然杜鹃花已经在园林以及城市绿地中大量栽植应用，但由于城市土壤经常受到挖掘、搬运以及与大量工业废弃物、生活垃圾混合等人为干扰，自然土壤发生层被破坏，也引起pH偏高、有机质降低、养分失衡、盐碱化、板结等土壤退化的问题，使杜鹃花生长势衰弱，甚至大量死亡。此外，在栽培过程中通常采用单一的土壤施肥方式与化学肥料大量反复使用，一方面导致肥料利用率降低、养分流失严重、面源污染加剧；另一方面盐分积累与某些化学元素富集，造成“单盐毒害”和“拮抗”作用，诱发土壤盐渍化，严重破坏土壤的生物种群和功能多样性。魏翔莺(2016)的调查结果表明，目前城市绿地栽培多年的毛鹃苗木根系多呈发育不良的状态，暗色的老根多但用来吸收养分和水分的新鲜毛根少，缺少毛根导致植株生长衰弱。城市环境中不断退化的土壤和不良的气候抑制了杜鹃花根系的生长。目前虽有大量土壤改良文献，但是针对杜鹃花地栽土壤修复改良的实际应用未见述及。
[0003] 生物质炭对农田土壤的修复与改良、以及对农作物产量与品质的影响近年来有大量的研究报道。研究表明，生物质炭施入农田中在不同的土壤条件及不同作物类型下能够改善土壤肥力，增加氮素利用效率，提高土壤磷、钾素有效性，促进作物养分吸收并提高作物生产力(Liu et al.,2013；Lehmann and Joseph,2015)。由于不同的生物质炭之间其养分含量、吸附能力等性质差别很大(Aller,2016)，因此不同的生物质炭类型会使得生物质炭对作物产量以及土壤质量的改善作用具有很大的变异性(Jeffery et al.,2011)。然而，目前对生物质炭的应用研究多侧重于对农田土壤的改良以及经济作物产量的保障，例如申请公布号为106747789A，名称为“一种醋糟生物质炭复配基质”的专利文件，公开了利用醋糟生物质应用与辣椒壮苗的具体过程，以及具体配方和制备过程，也未涉及生物质炭对园林退化土壤的改良及重要的城市绿化植物生长的影响。
[0004] 酒糟是酿酒过程中的直接下脚料，pH值低，并含有丰富的粗蛋白，约高出玉米含量的2—3倍，同时还含有多种微量元素、维生素、酵母菌等，赖氨酸、蛋氨酸和色氨酸的含量也很高，这是农作物秸秆作为生物质炭的常用原料所不能提供的。此外，酒糟中还含有相当丰富的醇酯及酸等发酵的产物，对作物生长有刺激作用，速效养分含量高，潜在养分供给时间长。并且，生物质炭和其炭化过程生成的木醋液，主要成分是乙酸，含有少量酮类、酚类、酯类等，可有效调节土壤pH，因此生物质炭非常适用于园林退化土壤的修复。但是在实践中，尚未出现采用酒糟炭修复园林土壤的案例和实际应用，也无相关文献和专利披露，目前，酒糟一般是至直接作为饲料或者经加工后作为饲料使用，应用范围有限，因此利用酒糟炭进行城市园林土壤修复的具体应用有待开发。
发明内容
[0005] 为解决上述问题，本发明人经过深入研究和大量实验，充分研究了土壤的改良要求以及生物质炭的性能，尤其是栽培杜鹃的城市园林土壤的退化原因、杜鹃栽培土壤要求以及酒糟炭的特性，提出了以下技术方案。
[0006] 在本发明的一方面，提供了一种城市园林土壤改良方法，该方法包括：将城市园林土壤表层土0-20cm厚的土壤挖起，优选10cm厚的表层土挖起，混入河沙后，再加入生物质炭充分混合均匀，然后再将土壤夯平。
[0007] 优选的，所述生物质炭为衍生自酒糟的生物质炭。
[0008] 优选的，所述城市园林土壤为连续种植杜鹃两年以上的城市园林土壤。
[0009] 更优选的，所述城市园林土壤为连续种植杜鹃五年以上的城市园林土壤。
[0010] 进一步的，河沙和园土的体积比为1:10。
[0011] 进一步的，基于表层土壤、河沙混合后总重量计，生物质炭的含量为1％-10％，优选8％。
[0012] 优选的，所述生物质炭为衍生自酒糟的生物质炭，更优选的，所述生物质炭为衍生自水稻酒糟的生物质炭。
[0013] 在本发明中，该生物质炭可以通过以下方法制备，该方法包括以下步骤：
[0014] (1)将酿酒工艺中的废料酒糟晾干；
[0016] (3)将酒糟炭化过程中获得的木醋液稀释10倍，将酒糟炭化物浸泡其中至少12小时后，过滤，在75℃恒温环境下烘干得到固体混合物；
[0017] (4)将步骤(3)中的固体混合物粉碎后，过目数为2mm的筛子后，得到最终的生物质炭，并于密封袋中保存。
[0018] 技术原理及有益效果：
[0019] 本发明人经研究发现，目前的研究多集中于周期为3-6月的农作物，其生长期较短，生物质炭的根际效应体现并不明显。而杜鹃花为多年生木本植物，生物质炭可长期吸附于根系，生物质炭的根系效应可能会更多地体现出来。
[0020] 生物质炭施入后调节土壤pH，提高保水性，降低盐度，提高土壤肥力，提高微生物对碳的代谢效率以及恢复微生物多样性；并通过自身性质及对土壤理化性质以及结构的改善，缓解园林退化土壤中的不利因素对杜鹃花生长产生的胁迫，促进杜鹃花根系的生长发育。
[0021] 本发明中生物质炭制备原料为酒糟，可以缓解酒糟易腐败变质所所带来的一系列环境问题，可实现废弃物的资源化再利用，同时也为有机废弃物炭化产物的应用开辟了一条新途径，提高了生物质炭和木醋液的社会效益。
[0022] 本发明中酒糟生物质炭pH为中性，经木醋液处理后pH为酸性，相较于秸秆、畜禽粪便等为原料的高pH值生物质炭，其施入后可降低园林土壤pH值，提供适于杜鹃生长的pH土壤环境，有利于杜鹃花根系的生长发育。
[0023] 随着土壤根际微生物的研究越来越受重视，近年来一些研究结果认为生物质炭对根际微生物的显著影响是促进根系生长发育、提高作物产量、增强作物抗病性的主要原因(Graber et al.,2010；Huang et al.,2015；Kolton et al.,2011；2017)。Graber等(2010)发现生物质炭添加入培养基后会促进植物生长，经分离和培养技术研究发现生长在添加生物质炭培养基中的胡椒的根际具有更多的植物促生菌，表明生物质炭中某些成分刺激了特定微生物的生长，从而促进了作物的生长。Kolton等(2017)研究发现生物质炭施用后显著提高了根际细菌多样性，并通过促进可降解酚类化合物的细菌从而提高了糖类和酚类化合物的代谢效率。生物质炭对土壤中受微生物调节的养分转化过程也有重要影响。很多研究发现生物质炭显著提高土壤中磷酸酶活性，促进土壤有机磷的矿化从而增加了土壤有效磷含量(Jin et al.,2016)。刘赛男(2016)通过培养实验研究发现生物质炭通过促进土壤中部分解磷以及解钾细菌的生长，进而提高土壤的磷、钾素有效性。
[0025] 图1：具体实施方式中实验例1-实验例6以及对照例中每组选取一个样本进行的杜鹃生长情况对照实物图。
具体实施方式
[0026] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0027] 实施例1：
[0028] 提供了一种城市园林土壤改良方法，该方法包括：将城市园林距土表10cm厚的表层土挖起，混入产自河南信阳的河沙后，河沙和园土的体积比为1:10，再加入生物质炭充分混合均匀，基于表层土壤、河沙混合后总重量计，生物质炭的含量为1％，然后再将土壤夯平；所述生物质炭为衍生自酒糟的生物质炭；所述城市园林土壤为连续种植杜鹃五年以上的城市园林土壤；
[0029] 所述生物质炭为衍生自酒糟的生物质炭；
[0030] 所述生物质炭为衍生自水稻酒糟的生物质炭；该生物质炭可以通过以下方法制备，该方法包括以下步骤：
[0031] (1)将水稻酿酒工艺中的废料酒糟晾干；
[0032] (2)以晾干后的酒糟为原料，在450℃高温限氧条件下热裂解炭化1小时后获得酒糟炭化物以及木醋液，出炭率为38.72％，液体比例为29.69％；
[0033] (3)将酒糟炭化过程中获得的木醋液稀释10倍，将酒糟炭化物浸泡其中至少12小时后，过滤，在75℃恒温环境下烘干得到固体混合物；
[0034] (4)将步骤(3)中的固体混合物粉碎后，过目数为2mm的筛子后，得到最终的生物质炭，并于密封袋中保存。
[0035] 实施例2-实施例6
[0036] 提供了一种城市园林土壤改良方法，除生物质炭的含量为不同外，其余方法步骤与实施例1相同，实施例2中生物质炭的含量为2％；实施例3中为生物质炭的含量为4％；实施例4中生物质炭的含量为6％；实施例5生物质炭的含量为8％；实施例6中生物质炭的含量为10％。
[0037] 本研究通过一年土培试验，研究生物质炭对城市园林退化土壤的改良及对杜鹃花生长的影响，筛选出影响效应最优的生物质炭施入量，并通过植物根际化学和生物学过程的响应阐述其影响机理。本实验可为生物质炭在园林绿地退化土壤的修复应用提供理论基础和技术支持。
[0038] 通过上述步骤制的实验用具体酒糟生物质炭pH为5.82；全氮含量2.7％；全磷含量0.76％；全钾含量0.9％；有机碳含量674g/kg；灰分含量37.96％。
[0039] 实验例1：
[0040] 以胭脂蜜品种杜鹃花为试验材料，通过盆栽试验证明其功能：
[0041] (1)采集城市园林退化土壤，本次实验主要采集点有：江苏省农科院(32°2’N,118°52’E)，国防园(32°3’N,118°44’E)，月牙湖公园(32°1’N,118°49’E)，均为五年以上杜鹃园林栽培土壤，通过对其理化指标及微生物指标的测定，计算土壤退化指数，最终选择退化较为严重的园林土壤。
[0042] (2)采用长势基本一致，高度为5cm的一年生杜鹃花扦插苗为试验材料，在3月初进行盆栽试验；
[0043] (3)河沙和园土的体积比均为1:10，生物质炭的施用量为园土与河沙总质量的1％，在杜鹃花移栽前将生物质炭和河沙一次性施入土壤，并用铁锹搅拌均匀，充分混合后装盆，盆栽土壤每盆干重1kg，每盆种植2棵苗，每个实验例处理8盆，采用随机排列；
[0044] (4)水肥管理按常规措施统一标准，正常进行园林水肥管理，每次施水量为城市园林持水量。在春季3-5月，每隔7天浇水1次，每月施一次花多多生长平衡肥(N-20％，P2O5-20％，K2O-20％)，用量为1.5–2.0g/每公斤土壤；在夏季6-8月，每隔3天浇水1次，不施肥；秋季9-11月，每隔7天浇水1次，每45天施一次花多多促花肥(N-10％，P2O5-30％，K2O-20％)，用量为1.5–2.0g/每公斤土壤；冬季12-2月，每隔15天浇水1次，不施肥；
[0045] (5)在生长过程中对杜鹃的生物学特性和生长发育规律进行观测。在第二年四月杜鹃花开花期对植物样品及土壤样品进行收集。
[0046] 实验例2-实验例6：
[0047] 实验例2-6除了在步骤(3)中生物质炭施用比例不同以外，其他步骤与实验例1相同。
[0048] 对比例：
[0049] 对比例除了步骤(3)中不施用生物质炭外，其他其他步骤与实施例1相同。
[0050]
[0051]
[0052] 在生长过程中对杜鹃的生物学特性和生长发育规律进行观测。
[0053] 在杜鹃花生长时期对植物待测试样本进行收集；
[0054] 待测土壤样品收集：采用抖根法收集根围0-2mm范围内土壤作为根际土壤，并充分混合。过2mm筛混匀样品，去除根系、植物残体及其他杂质；部分土壤保存于4℃，用于pH等理化指标的测定；部分土壤保存于-20℃，用于分子生物学分析；部分样品自然风干用于土壤养分测定。
[0055] 地上部分和地下部分样品收集：根部清除土壤后，用去离子水洗净地上部分和地下部分后装入信封。放入烘箱中，105℃杀青30min，再将烘箱调至60℃，烘至恒重后称量。称量干重后粉碎，用于元素含量的测定。
[0056] 测试例1：杜鹃花生长指标和营养元素含量
[0057] 每株分枝数通过对样本直接计数获得，计算每组平均值；
[0058] 每株株高通过软尺进行测量，计算每组平均值；
[0059] 通过叶绿素测定仪对当年生成熟叶片进行叶绿素含量SPAD值测量，每株植株选取6片，计算每组平均值获得表1数据：
[0060] 表1：杜鹃花生长情况指标
[0061]样本平均值 平均枝条数(条) 平均株高(cm) 平均叶绿素含量
对照例1(CK) 1.88 9.3 11.8
实验例1(1％BC) 3.19 12.7 24.5
实验例2(2％BC) 3.25 11.8 27.1
实验例3(4％BC) 3.31 11.1 31.9
实验例4(6％BC) 2.25 10.6 30.5
实验例5(8％BC) 2.50 11.9 31.0
实验例6(10％BC) 3.69 10.2 36.5
对照例1(CK) 1.88 9.3 11.8
实验例1(1％BC) 3.19 12.7 24.5
实验例2(2％BC) 3.25 11.8 27.1
实验例3(4％BC) 3.31 11.1 31.9
实验例4(6％BC) 2.25 10.6 30.5
实验例5(8％BC) 2.50 11.9 31.0
实验例6(10％BC) 3.69 10.2 36.5
[0062] 采用根系扫描仪将根系样品扫描成图像，利用WinRhizo(Regent Instruments,2001)根系分析系统软件分析得到根系总长、总表面积以及须根数等参数，计算平均值获得表2数据：
[0063] 表2：杜鹃花根系生长发育指标
[0064] 样本平均值 根总长(cm) 根总表面积(cm2) 须根数(个)对照例1(CK) 115 24 472
实验例1(1％BC) 148 42 656
实验例2(2％BC) 176 44 765
实验例3(4％BC) 186 43 767
实验例4(6％BC) 203 49 896
实验例5(8％BC) 204 52 901
实验例6(10％BC) 187 43 823
实验例1(1％BC) 148 42 656
实验例2(2％BC) 176 44 765
实验例3(4％BC) 186 43 767
实验例4(6％BC) 203 49 896
实验例5(8％BC) 204 52 901
实验例6(10％BC) 187 43 823
[0065] 将地下部分即根和地上部分即叶、茎、花分别称量干重后将植株样品粉碎，过1mm筛，用于测定植株养分含量；植株全氮含量利用H2SO4-H2O2消煮，半微量凯氏定氮法测定；全磷含量利用钒钼黄比色法(鲍士旦，2005)；全钾含量利用HNO3-H2O2消煮，火焰光度计法。各元素吸收量的计算方式：各部位的元素吸收量(mg)＝各部位元素含量(g/kg)*生物量(g)。
[0066] 表3：养分吸收指标
[0067]
[0068]
[0069] 通过表1结合图1可以看出，实验例1-6施用酒糟生物质炭，与对照例中未施用酒糟生物质炭的相比，杜鹃植株在枝条数、株高、叶绿素含量上均具有较大的优势；
[0070] 表2可以看出，实验例1-6施用酒糟生物质炭，与对照例中未施用酒糟生物质炭的相比，杜鹃植株在根系总长、总表面积以及须根数上均具有明显优势；
[0071] 表3可以看出，实验例1-6施用酒糟生物质炭，与对照例中未施用酒糟生物质炭的相比，植株在养分吸收量上有明显优势；
[0072] 综上，本发明所述土壤改良方法对园林土栽培的杜鹃生长及养分吸收有积极的影响，且促进根系发育，具有良好的根系效应。
[0073] 测试例2：杜鹃花成花质量
[0074] 在杜鹃花花期盛花期同一时间对植物样品进行统计，此时所有样本成花数量基本稳定，通过样本计数与测量获得以下数据：
[0075] 表4：成花质量结果表
[0076]
[0077] 通过表4可以看出，虽扦插苗较小，成花数量不多，但处理组和对照间存在明显优势。对照组在第二年无植株成花，实验例2-6施用2％-10％酒糟生物质炭与对照例相比，成花植株所占比例随生物质炭施入量的提高而提高；成花植株的成花量也随生物质炭施入量的提高而提高；成花植株的花径平均值在施入8％酒糟生物质炭的处理下达到最大。
[0078] 测试例3：生物质炭对根际土壤理化性质及养分含量的影响
[0079] 参照鲁如坤(2000)中的方法测定土壤pH、有机质等。土壤pH的固液比为1:5(m/v)；氮全量的测定用CNS元素分析仪(Elementar Variomax CNS Analyser，德国Elementar公司)测定；土壤速效磷含量采用钼锑抗比色法测定；速效钾含量采用火焰光度计法。
[0080] 表5土壤pH及养分含量指标
[0081]
[0082] 通过表5可以看出，实验例1-6施用酒糟生物质炭，与对照例中未施用酒糟生物质炭的相比，土壤pH碱性减弱，缓解了pH值过大对杜鹃花生长的胁迫；另外实验例1-6中有机质及其他养分含量均在合理范围内明显增加；
[0083] 综上，本发明所述土壤改良方法对杜鹃园林栽培土有一定的修复作用，提高土壤肥力。测试例4：生物质炭对根际土壤微生物群落丰度和多样性的影响
[0084] 土壤总DNA的提取：取-20℃保存的根际土壤提取土壤总DNA。土壤总DNA的提取采用MOBIO公司的土壤DNA快速提取试剂盒(PowerSoilTM DNA Isolation Kit,Mo Bio Laboratories Inc.,CA)提取土壤微生物基因组的DNA，提取的具体步骤按照说明书逐步进行。
[0085] 土壤细菌及真菌丰度测定：土壤细菌16S rRNA和真菌18S rRNA基因拷贝数采用荧光定量PCR技术(qPCR)测定。细菌16S rRNA引物序列为：F338，ACTCCTACGGGAGGCAGCAG；R158，ATTACCGCGGCTGCTGG。具体扩增程序为95℃3min；40 cycles of 95℃1min,56℃1min,
72℃1min。真菌18S rRNA引物序列为：NS1，GTAGTCATATGCTTGTCTC；FungR:
ATTCCCCGTTACCCGTTG。具体扩增程序为95℃3min；40 cycles of 95℃1min,57℃1min,72℃
1min。荧光定量原理是荧光染料SYBR Green I可与双链DNA结合后发光，再根据荧光信号检测出PCR体系模板中双链DNA的数量。土壤提取的DNA浓度先用NanoDrop ND-1000微量分光光度计测定，再将DNA稀释到15ngμL-1。本实验中采用的定量PCR仪为ABI 7500定量PCR仪。
具体的反应体系为25μL反应体系：包括12.5μL扩增酶混合物SYBR premix EX Taq TM，9.5μL无菌超纯水，10μM正反向引物各1μL，DNA模板1μL(15ng)。在每次扩增中，均做溶解曲线分析以确保来自于PCR产物的片段大小是否正确；并采用标准曲线法进行绝对定量测定，将已插入与待测样品相同扩增片段且已知拷贝数的克隆质粒进行10倍系列稀释，作为PCR扩增的模板，即可得到标准曲线。质粒的制作方法：首先将细菌16SrRNA基因和真菌18SrRNA基因的PCR扩增产物用纯化试剂盒纯化，连接至pEASY-T3克隆载体(Promega,Madison,WI)，并转化至大肠杆菌DH5α中。然后，利用蓝白斑法筛选阳性克隆，以载体引物进行PCR扩增，并通过测序以确定其含有正确目的基因。最后，将阳性克隆子扩大培养后提取质粒，纯化，用分光光度计测定质粒浓度。因为载体大小及插入目的基因的PCR片段长度均已知，即可根据质粒的浓度计算出质粒的基因拷贝数。最后将质粒进行10倍系列稀释用来做标准曲线。本试验用于制作标准曲线的质粒的拷贝数在103-109之间，扩增效率在98％和109％之间，R2＞
0.99。定量PCR后计算平均值得到表6细菌、真菌丰度及细菌/真菌比的结果：
72℃1min。真菌18S rRNA引物序列为：NS1，GTAGTCATATGCTTGTCTC；FungR:
ATTCCCCGTTACCCGTTG。具体扩增程序为95℃3min；40 cycles of 95℃1min,57℃1min,72℃
1min。荧光定量原理是荧光染料SYBR Green I可与双链DNA结合后发光，再根据荧光信号检测出PCR体系模板中双链DNA的数量。土壤提取的DNA浓度先用NanoDrop ND-1000微量分光光度计测定，再将DNA稀释到15ngμL-1。本实验中采用的定量PCR仪为ABI 7500定量PCR仪。
具体的反应体系为25μL反应体系：包括12.5μL扩增酶混合物SYBR premix EX Taq TM，9.5μL无菌超纯水，10μM正反向引物各1μL，DNA模板1μL(15ng)。在每次扩增中，均做溶解曲线分析以确保来自于PCR产物的片段大小是否正确；并采用标准曲线法进行绝对定量测定，将已插入与待测样品相同扩增片段且已知拷贝数的克隆质粒进行10倍系列稀释，作为PCR扩增的模板，即可得到标准曲线。质粒的制作方法：首先将细菌16SrRNA基因和真菌18SrRNA基因的PCR扩增产物用纯化试剂盒纯化，连接至pEASY-T3克隆载体(Promega,Madison,WI)，并转化至大肠杆菌DH5α中。然后，利用蓝白斑法筛选阳性克隆，以载体引物进行PCR扩增，并通过测序以确定其含有正确目的基因。最后，将阳性克隆子扩大培养后提取质粒，纯化，用分光光度计测定质粒浓度。因为载体大小及插入目的基因的PCR片段长度均已知，即可根据质粒的浓度计算出质粒的基因拷贝数。最后将质粒进行10倍系列稀释用来做标准曲线。本试验用于制作标准曲线的质粒的拷贝数在103-109之间，扩增效率在98％和109％之间，R2＞
0.99。定量PCR后计算平均值得到表6细菌、真菌丰度及细菌/真菌比的结果：
[0086] 表6细菌、真菌丰度指标
[0087]
[0088] 通过表6可以看出，实验例1-6施用酒糟生物质炭，与对照例中未施用酒糟生物质炭的相比，土壤细菌丰度小幅降低，真菌丰度大幅提高，细菌/真菌比明显降低。真菌在土壤微团聚体的形成和稳定以及维持土壤有机质稳定方面起重要作用。一般认为，真菌相对于细菌更能够有效的利用有机底物。本结果说明生物质炭的施入有利于土壤的可持续利用，使得土壤微生物群落结构朝向更健康的方向发展。
[0089] 土壤细菌、真菌群落结构多样性分析：提取样品总DNA后，采用细菌16SrRNA基因的通用引物515F：GTGCCAGCMGCCGCGG 907R：CCGTCAATTCMTTTRAGTTT。真菌18SrRNA基因ITS通用引物1737F：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA 907R：GCTGCGTTCTTCATCGATGC，合并引物接头，进行PCR扩增。20μl反应体系包括1xreaction buffer(NEBQ5TM)，0.3mMdNTP，0.25μM of F primer，0.25μM of index primer，1U Q5TMDNA polymerase(neb)和1μl diluted template。扩增条件为95℃预变性2min；95℃变性0.5min，52℃退火0.5min,72℃延伸0.5min，共25个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物用2％琼脂糖检测，并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，文库质检合格后用于上机测序。测序方法采用Illumina Hiseq 2500 PE250双端测序，得到的原始图像数据文件，经碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列(Sequenced Reads)。
[0090] 根据PE reads之间的Overlap关系，将Hiseq测序得到的双端序列数据拼接(Merge)成一条序列(Tags)，同时对Reads的质量和Merge的效果进行质控过滤。主要有如下三个步骤：(1)PE reads拼接：使用FLASH v1.2.7软件，按照最小overlap长度为10bp，overlap区允许的最大错配比率为0.2，对每个样品的reads进行拼接，得到的拼接序列即原始Tags数据(Raw Tags)；(2)Tags过滤：使用Trimmomatic v0.33软件，对拼接得到的Raw Tags进行过滤，参数为设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后长度小于Tags长度75％的Tags，得到高质量的Tags数据；(3)去除嵌合体：使用UCHIME v4.2软件，鉴定并去除嵌合体序列，得到最终有效数据(Effective Tags)。
[0091] 将优化后的Clean Tags按照97％的序列相似性水平进行聚类，划分OTU，通过数据库比对，对不同样品内微生物进行物种组成分类、丰度及样品间差异等一系列分析。计算平均值得到表7细菌、真菌群落多样性的结果：
[0092] 表7微生物多样性指标
[0093]
[0094]
[0095] 通过表7可以看出，Shannon:香农-威纳指数指数，显示了微生物群落功能多样性的相对多度，数值越高，生物多样性就越高；Simpson:辛普森多样性指数，代表微生物群落中最常见物种的优势度，数值越大，说明群落多样性越低，因此实验例1-6施用酒糟生物质炭，与对照例中未施用酒糟生物质炭的相比，土壤中生物多样性明显改善。
[0096] 综合以上测试结果表明，生物质炭施入后，土壤微生物群落结构发生改变，引起杜鹃花根际过程中养分调控机制的变化响应从而提高根际养分的有效性，或持续促进部分特定微生物的生长，达到促进杜鹃花生长的目的，实现杜鹃栽培土壤与杜鹃生长的良性循环。
[0097] 对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0098] 此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
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