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一种梨果实内韧皮部同化物卸载路径的荧光示踪方法

阅读：290发布：2023-12-31

专利汇可以提供一种梨果实内韧皮部同化物卸载路径的荧光示踪方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种梨果实内韧皮部同化物卸载路径的荧光示踪方法，步骤包括：荧光溶液的配制、荧光溶液的引入、采样、制备切片、观察拍照等过程，为研究果实内糖的转运提供了有效的方法。本发明以5(6)羧基荧光素酯(5(6)-carboxyfluoresein diacetate，CFDA)作为荧光示踪物质，在不需要专门设备和装置的条件下，通过果柄部位将CFDA溶液引入韧皮部，达到快速、有效地标记梨果实发育过程中韧皮部同化物卸载路径的目的。该方法的优点是不需要特殊的装置、操作简单、不易伤及木质部且荧光溶液不易蒸发，在荧光观察过程中不需样品的特殊处理、成本低廉。，下面是一种梨果实内韧皮部同化物卸载路径的荧光示踪方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种梨果实内韧皮部同化物卸载路径的荧光示踪方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)配制1～2mg/mL荧光染料CFDA溶液；
(2)步骤(1)配制的CFDA溶液的引入：轻轻磨擦果柄表皮，不要伤及木质部→迅速将棉花团缠绕在果柄上→用封口膜将棉花团封好→采用微量注射器将配制好的CFDA溶液缓慢注入棉花，每个果实注入150～250μl上述配制好的CFDA溶液→立即用封口膜密封针孔防止溶液外渗→然后用锡箔纸将果柄部位覆盖好，防止CFDA见光分解；
(3)采样：经CFDA溶液处理48～72h后采摘果实；
(4)制备切片：将新鲜的经CFDA溶液处理过的果实，切取带有维管束的果肉组织块，然后切片，每完成一个切片用载玻片直接沾取切片，使切片平铺于载玻片的中央；
(5)观察拍照：制备好的切片，立即用荧光显微镜观察CF在果实内的分布图像，防止荧光淬灭。
2.根据权利要求1所述的梨果实内韧皮部同化物卸载路径的荧光示踪方法，其特征在于配制1～2mg/mL荧光染料CFDA溶液的方法为：用体积比为1∶1的DMSO水溶液溶解CFDA，配成1～2mg/mL的CFDA溶液后避光备用。
3.根据权利要求1所述的梨果实内韧皮部同化物卸载路径的荧光示踪方法，其特征在于步骤(4)中所切取组织块的大小为1cm×1cm×2cm；制备切片时，使用冰冻切片机进行连续切片，切片前用普通胶水冷固20～30min、冷固温度为-20℃，切片厚度20μm；或者直接将果实的观察部位进行徒手横切或纵切，制备徒手切片。
4.根据权利要求1所述的梨果实内韧皮部同化物卸载路径的荧光示踪方法，其特征在于步骤(5)观察时采用488nm激光激发，蓝色滤光片检测图像，目镜为2.5×，物镜为10×。

说明书全文

一种梨果实内韧皮部同化物卸载路径的荧光示踪方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种梨果实内韧皮部同化物卸载路径的荧光示踪方法。是利用荧光染料5(6)羧基荧光素酯(CFDA)快速标记梨果实发育过程中来自源叶的光合产物在库器官内的卸载路径，属于植物细胞生理学的领域。

背景技术

[0002] 梨是世界及中国主栽果树之一，也是我国出口创汇的传统果品，在我国除海南省之外的省(市、区)均有梨树栽培，并且是许多省份(如河北、江苏、安徽等)的重要水果之一，已经成为我国很多地方农村经济发展的支柱产业。据中国统计年鉴，截至2010年底，我2
国梨树栽培总面积有110.5万hm，总产量1426.3万t，分别占世界梨总栽培面积和总产量的62％和64％以上，是世界上第一大产梨国家。

[0003] 果实是梨树的经济‘库’器官，果实品质的优劣直接关系到梨产业能否在市场竞争中获得长足发展。来自源叶的光合产物以山梨醇和蔗糖的形态经韧皮部运输进入果实贮藏或进一步利用，不仅成为果实品质和其他营养成分及芳香物质合成的基础原料，而且可作为重要的信号分子参与果实发育相关基因的表达及整个植物源-库活性的调节，这一观点已被大家认同。高等植物中的物质运输主要在维管束中进行，而韧皮部则是其中负责同化物在体内运输的主要组织。库器官内的韧皮部同化物卸载的路径主要有共质体途径(symplastic)和质外体途径(apoplastic)。共质体途径是通过胞间连丝进行的，质外体途径则是跨膜运动，需要特异的载体介导和能量驱动。目前普遍认为，卸载路径在很大程度上决定了同化物从‘源’到‘库’的一系列转运过程，对卸出效率有着关键性的调控作用，最终影响到果实的品质。揭示果实发育过程中同化物卸载的路径，对于促进果实内糖的积累和转化，实现优质高产具有重要的理论意义和实践价值，越来越受到人们的重视。

[0004] 梨果实中有发达的维管组织系统，除侧生心皮束外，其他主要维管束均位于薄壁组织内，这些维管束的分支遍及整个果肉，形成一种网结状系统，源源不断地为果实的生长发育提供必需的物质。长期以来，由于研究条件的限制，严重制约了人们对梨果实发育过程中韧皮部同化物卸载路径的认识。近年来，5(6)羧基荧光素酯(CFDA)作为一种比较理想的荧光示踪物质被用于不同类型库器官中同化物的卸载路径研究，通过放射自显影技术证明其运输方式同同化物的卸载方式相类似。其原理是：当CFDA被装载到细胞里，就会被内源酯酶分解成为有荧光信号的5(6)羧基荧光素(CF)，变成了膜不透性的共质体同化物卸载的荧光指示剂。通过在荧光显微镜下观察CF在库器官内的分布情况，就可以了解韧皮部同化物卸载的路径，比传统的显微放射自显影技术更安全、更简单。

[0005] 但是，我们以梨果实为研究材料时发现，在CFDA标记过程中，若通过其他作物上采用的电流注射法、压力注射法和显微注射法则需要专门的设备且技术要求高，而Eppendorf管棉线渐渗法和叶片涂抹法虽然不需要专门的设备，但操作过程繁琐、容易伤及木质部和韧皮部，且荧光染料溶液蒸发，都达不到理想的标记效果。为此，我们通过实验建立了一种更为有效的、可快速示踪梨果实韧皮部同化物卸载路径的荧光标记方法，获得了理想的结果，具有重要的实践应用价值。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种梨果实内韧皮部同化物卸载路径的荧光示踪方法，应用该方法可快速了解梨果实发育过程中来自源叶的光合产物在库器官内卸出的路径，具有操作简单、方便实用及结果理想等优点。

[0007] 本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

[0008] 一种梨果实内韧皮部同化物卸载路径的荧光示踪方法，包括以下步骤：

[0009] (1)配制1～2mg/mL荧光染料5(6)羧基荧光素酯(5(6)-carboxyfluoresein diacetate，CFDA)溶液；

[0010] (2)步骤(1)配制的CFDA溶液的引入：轻轻磨擦果柄表皮，不要伤及木质部→迅速将棉花团缠绕在果柄上→用封口膜将棉花团封好→采用微量注射器将配制好的CFDA溶液缓慢注入棉花，每个果实注入150～250μl上述配制好的CFDA溶液→立即用封口膜密封针孔防止溶液外渗→然后用锡箔纸将果柄部位覆盖好，防止CFDA见光分解；

[0011] (3)采样：经CFDA溶液处理48～72h后采摘果实；

[0012] (4)制备切片：将新鲜的经CFDA溶液处理过的果实，切取带有维管束的果肉组织块，然后切片，每完成一个切片用载玻片直接沾取切片，使切片平铺于载玻片的中央；

[0013] (5)观察拍照：制备好的切片，立即用荧光显微镜观察5(6)羧基荧光素(carboxyfluoresein，CF)在果实内的分布图像，防止荧光淬灭。

[0014] 上述的梨果实内韧皮部同化物卸载路径的荧光示踪方法，配制1～2mg/mL荧光染料CFDA溶液的方法为：用体积比为1∶1的DMSO水溶液溶解CFDA，配成1～2mg/mL的CFDA溶液后避光备用。

[0015] 上述的梨果实内韧皮部同化物卸载路径的荧光示踪方法，步骤(4)中所切取组织块的大小为1cm×1cm×2cm；制备切片时，使用冰冻切片机进行连续切片，切片前用普通胶水冷固20～30min、冷固温度为-20℃，切片厚度20μm；或者直接将果实的观察部位(即所切取的组织块)进行徒手横切或纵切，制备徒手切片。

[0016] 上述的梨果实内韧皮部同化物卸载路径的荧光示踪方法，步骤(5)观察时采用488nm激光激发，蓝色滤光片检测图像，目镜为2.5×，物镜为10×。

[0017] 该技术方案主要包括：荧光染料CFDA溶液的配制、CFDA溶液的引入、采样、制备切片、观察拍照等主要环节。

[0018] 本发明的有益效果：

[0019] (1)该方法采用的荧光染料CFDA对细胞无毒、化学惰性，且量子产率比较高，在尽量不损害卸载机制的情况下，可从活细胞水平适时追踪不同发育时期梨果实内同化物的卸载路径，比传统的显微放射自显影技术更安全、更简单。

[0020] (2)该方法具有已有方法所不具有的优点，如荧光示踪剂的引入不需要专门的设备和装置、操作简单、不易伤及木质部、荧光溶液不易蒸发等优点，在荧光观察过程中也不需样品的特殊处理、成本低廉，可快速、有效地获得理想的标记结果。

[0021] (3)应用该方法示踪梨果实发育过程中同化物的卸载路径，有助于我们认识梨果实品质形成中同化物在库细胞中的转运与积累机制，为梨的优质高产提供理论依据。附图说明

[0022] 图1以‘爱甘水’为例，梨果实内CFDA溶液引入的方法。

[0023] 其中，1-表皮 2-韧皮部 3-木质部 4-棉花 5-封口膜 6-锡箔纸。

[0024] 图2梨果实冰冻切片的取样部位。

[0025] 其中，7-维管束 8-果梗，即CFDA溶液引入部位 9-表皮 10-果肉 11-腹侧心皮维管束 12-种子 13-主要取样部位

[0026] 图3荧光显微镜观察的梨果实内CF分布图像。

[0027] 其中，a-冰冻切片结果 b-徒手横切片结果 c-徒手纵切片结果

具体实施方式

[0028] 1、用体积比为1∶1的DMSO水溶液溶解CFDA，配成1～2mg/mL的CFDA溶液后避光备用。荧光染料CFDA不溶于水，可根据用量分装后于-20℃冰箱避光保存、即用即配。

[0029] 2、在晴天选择向阳部位的健康果实，将果柄冲洗干净后擦干→轻轻磨擦果柄表皮，不要伤及木质部→迅速将棉花团缠绕在果柄上→用封口膜将棉花团封好，封口膜不能太紧→采用微量注射器小心操作将配制好的CFDA溶液缓慢注入棉花，每个果实注入约150～250μl上述配好的CFDA溶液→立即用封口膜密封针孔防止溶液外渗→然后用锡箔纸将果柄部位覆盖好，防止CFDA见光分解，保证溶液随着韧皮流缓慢进入果实。

[0030] 3、经CFDA溶液处理48～72h后采摘果实，用冰盒带回实验室。

[0031] 4、将新鲜的经CFDA处理过的果实，参照图2切取带有维管束的果肉组织块，大小为1cm×1cm×2cm，使用冰冻切片机(比如，用Leica CM1850冰冻切片机)进行连续切片，切片前将组织块用普通胶水冷固20～30min、冷固温度为-20℃，切片厚度20μm；或者直接将果实的观察部位进行徒手横切或纵切，制备徒手切片。每完成一个切片用载玻片直接沾取切片，使切片平铺于载玻片的中央。

[0032] 5、制备好的切片，立即用荧光显微镜观察CF在果实内的分布图像，以防荧光淬灭。观察时采用488nm激光激发，蓝色滤光片检测图像，目镜为2.5×，物镜为10×。荧光显微镜观察的梨果实内CF分布图像见图3，结果显示：荧光示踪剂CF始终被限制在韧皮部中，没有任何扩散到果肉组织中的迹象，说明同化物在梨果实内的卸载为质外体途径，反之为共质体途径。

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