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一种利用猫的肠道菌制造发酵咖啡的方法

阅读:653发布:2020-05-08

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1.一种利用猫的肠道菌制造发酵咖啡的方法,其特征在于,包括以下的步骤:a,麝香猫肠道菌群的分离与纯化培养:
第一步, 10g粪便与100mL无菌装入匀浆袋中,使用匀浆机拍打5min,高速冷冻离心机离心,去上清,制成匀浆液
第二步,鉴定:首先配制肠道致病菌鉴定培养基(蛋白胨17.2g,色酸 0.9g,Hepes 缓冲液 0.4g,混合色源 6.87g,琼脂 18g,纯净水 1L,pH 7.3)来鉴定肠道菌群中是否含有致病菌;
第三步,配制培养基:当鉴定无致病菌时,开始配置培养基,分别配制肉膏蛋白胨培养基、沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂、酵母菌富集培养基、伊红美蓝乳糖培养基以及Hektoen培养基各约500mL,分装,121℃灭菌15 min;
第四步,倒平板:牛肉膏蛋白胨培养基、沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂、酵母菌富集培养基、伊红美蓝乳糖培养基以及Hektoen培养基分别倒30个平板,做好标记;
第五步,制备不同浓度梯度的菌悬液:取10μL的匀浆液,加90uL的无菌水,制成浓度为
10-1的溶液。以此类推,配制10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 的菌悬液,在无菌条件下进行;
第六步,涂布平板:用移液枪和灭过菌的枪头,分别向牛肉膏蛋白胨培养基、沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂、酵母菌富集培养基、伊红美蓝乳糖培养基以及Hektoen培养基中加100 μL各浓度的各样的菌悬液,标记好浓度,样品名,均匀涂布,在无菌条件下进行;
第七步,恒温培养:将平板放在24℃条件下恒温培养24-48h,挑取典型生物单菌落进行划线纯化培养;
第八步,生理生化鉴定:平皿快速检测法,利用透明圈法、生长圈法和抑制圈法鉴定,利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应,将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的形态变化;
第九步,咖啡豆培养基进一步分离纯化:咖啡豆培养基组成:咖啡豆3.4091g/L,Na2HPO4为0.0564g/L,MgSO4为0.1611g/L和酵母粉3.5707g/L,将上述6)中挑取出的菌落在咖啡豆培养基中再进行培养,培养条件为20℃,24-48h,将培养后的单菌落按生长速度快慢分别挑取出来;
第十步,分子生物学鉴定:通过PCR扩增技术获得纯化菌种的扩增DNA并进行测序,数据库序列比对,对待分离菌株进一步确定,鉴定得出菌种分别为A、B、C和D。
b,发酵步骤:
第一步,原料筛选:筛选颗粒饱满、颜色正常的咖啡豆进行下述实验;
第二步,原料烘干:用50℃-70℃对咖啡豆进行热鼓风干燥,使得咖啡豆的湿度保持在50%-60%;
第三步,发酵:分别对上述分离出来的各种单菌接种在咖啡豆表面进行发酵,发酵结束后测定咖啡豆中色氨酸的含量,观察发酵结束咖啡豆咖啡豆用65-70℃对咖啡豆进行热风干燥,使得咖啡豆的湿度保持在55-60%;的颜色并分别对其进行感官评价,通过各个因素对咖啡豆的影响进行最终菌种的比例调节,接种在咖啡豆后,放入培养器,在35-40℃下发酵
20-36小时;
第四步,烘干:将发酵结束的猫屎咖啡放入鼓风干燥箱中,在35℃下处理3-6小时。
2.根据权利要求1所述的一种利用猫的肠道菌制造发酵咖啡的方法,其特征是,所述咖啡豆用65-70℃对咖啡豆进行热风干燥,使得咖啡豆的湿度保持在55-60%。
3.根据权利要求1所述的一种利用猫的肠道菌制造发酵咖啡的方法,其特征是,所述分别对分离出来的A、B、C和D比例调节进行发酵,比例确定为2:1:2:1,并接种在咖啡豆后,放入培养器,在37℃下发酵30-36小时。

说明书全文

一种利用猫的肠道菌制造发酵咖啡的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及营养食品生产技术领域,尤其是一种利用猫的肠道菌制造发酵咖啡的方法。

背景技术

[0002] 咖啡是世界上三分之一的人口饮用的饮料,比其他任何饮料都多。在烘焙咖啡中含有1.3%的咖啡因,在速溶咖啡中含有0.8%的咖啡因。咖啡因使得中枢神经兴奋,具有利尿作用,还具有使平滑肌放松的作用以及使外周血管扩张的作用。并且,因为具有前列腺素合成抑制作用,所以也具有镇痛作用。因此对支气管哮喘、偏头痛、神经痛等有效果。
[0003] 咖啡对于人体有诸多好处:咖啡含有一定的营养成分,咖啡的烟酸含有维他命B,烘焙后的咖啡豆含量更高。并且有游离脂肪酸、咖啡因、单宁酸等;咖啡对皮肤有益处。咖啡可以促进代谢机能,活络消化器官,对便秘有很大功效。使用咖啡粉洗澡是一种温热疗法,有减肥的作用;咖啡有解酒的功能。酒后喝咖啡,将使由酒精转变而来的乙快速化,分解成和二氧化而排出体外;咖啡可以消除疲劳。要消除疲劳,必须补充营养、休息与睡眠、促进代谢功能,而咖啡则具有这些功能;一日三杯咖啡可预防胆结石。对于含咖啡因的咖啡,能刺激胆囊收缩,并减少胆汁内容易形成胆结石的胆固醇,最新美国哈佛大学研究人员发现,每天喝两到三杯咖啡的男性,得胆结石的机率低于40%;常喝咖啡可防止放射线伤害。放射线伤害尤其是电器的辐射已成为较突出的一种污染。印度笆巴原子研究人员在老鼠实验中得到这一结论,并表示可以应用到人类;咖啡的保健医疗功能。咖啡具有抗氧化及护心、强筋骨、利腰膝、开胃促食、消脂消积、利窍除湿、活血化淤、息止痉等作用;咖啡对情绪的影响。实验表明,一般人一天吸收300毫克(约3杯煮泡咖啡)的咖啡因,对一个人的机警和情绪会带来良好的影响。另外咖啡中含有少量色酸,色氨酸是一种必需氨基酸,是血清素的前体物质。血清素为神经传导物质,能让人放松,心情愉悦,减缓神经活动而引发睡意。
[0004] 目前,咖啡有两种,一种是对生豆进行烘焙并粉碎而使用的原豆咖啡,另一种是对咖啡提取物进行喷雾干燥及冻结干燥的速溶咖啡。原豆咖啡在浸出时因浸出量少而有效成分少,而速溶咖啡虽然浸出量多,但是有效成分没有分解,因而很多成分没有被吸收。
[0005] 通常,通过将湿润步骤、提取步骤及水解步骤组合起来的步骤式热处理工艺,使得以高分率进行烘焙并粉碎的咖啡固型粉可溶化,从而制造在市场上销售的可溶性咖啡。由于在利用热进行水解时所需要的非常高的温度,因而诱发异味,这样的工艺成为费用和投资昂贵的工艺。为了改善产品的品质、提高工艺的经济性,报告了各种方法,例如使用利用碳水化物分解酶的酶处理。这些方法具有一些优点,但是如干式粉碎处理一样的咖啡渣滓的预处理效率低下,从而整体收率低于最佳收率,也没有准备用于从最终产品分离出酶或者再使用酶的任何对策。
[0006] 关于发酵咖啡,作为在市场中流通的咖啡,有风渍咖啡和猫屎咖啡。风渍咖啡统称为在开放式仓库中一直受到湿润的季风影响的咖啡。目前最为普的风渍咖啡有印度的拉巴咖啡。该咖啡的最大特征在于酸度减少了。风渍咖啡虽然不是高品质的特调咖啡,但是因为独特的味道所以在欧洲流通。猫屎咖啡又称为麝香猫咖啡,“luwak"是印度尼西亚语,“Alamid”是菲律宾语,都是指“麝香猫”。两者只是名字不同,味道和香是一样的。猫屎咖啡的制造过程是通过以野生长尾巴的麝香猫为媒介的发酵过程来实现。主要在东南亚栖息的野生长尾巴麝香猫利用良好的嗅觉采摘并吃进既熟透又美味的称为棕榈坚果的咖啡豆。果肉部分被消化,未消化的咖啡豆种子作为排泄物排出。此时,麝香猫的口水和胃液等在消化过程中混合,经过消化器官发酵,减少咖啡特有的苦味,发出特有的味道和香。梦想的咖啡原豆就在麝香猫的排泄物中。生产少量猫屎咖啡的原因也在于,只能通过麝香猫生产的这一过程。到收获季节,附近居民在日出前收拾猫的排泄物。并且,在其中筛选咖啡生豆,清洗干净后在太阳下晒干。在剥下晒干的咖啡生豆的内皮后,经过烘焙(烘烤)过程就成为咖啡原豆的成品。但是,猫屎咖啡以每杯超过70,000韩元的高价出售,因此普通人很难在日常中享受咖啡,从而需要开发并推广一种减少咖啡特有的苦味而发出特有的味道和香的发酵咖啡。
[0007] 于此,本发明的发明人为了克服所述现有技术的问题,努力进行了锐意研究,结果确认到利用猫的肠道菌使得咖啡豆发酵后进行真空处理而生产猫屎咖啡的情况可制造出咖啡因浓度低、发出特有的味道和香的猫屎咖啡,从而完成了本发明。

发明内容

[0008] 为了克服现有的猫屎咖啡生产困难、价格昂贵的不足,本发明提供了一种利用猫的肠道菌制造发酵咖啡的方法,以猫粪便为原料对猫肠道菌群进行分离与纯化鉴定,通过PCR扩增技术获得纯化菌种的扩增DNA并进行测序,数据库序列比对,对待分离菌株进一步确定,鉴定得出菌种分别为A、B、C和D,将分离出的菌种按比例接种在咖啡豆后进行发酵和真空处理,使得制得的咖啡具有高含量的色氨酸,咖啡因浓度低,颜色正常,且具有独特的香味
[0009] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种利用猫的肠道菌制造发酵咖啡的方法,其特征在于,包括以下的步骤:a,麝香猫肠道菌群的分离与纯化培养:第一步, 10g粪便与100mL无菌水装入匀浆袋中,使用匀浆机拍打5min,高速冷冻离心机离心,去上清,制成匀浆液
[0010] 第二步,鉴定:首先配制肠道致病菌鉴定培养基(蛋白胨17.2g,色氨酸 0.9g,Hepes 缓冲液 0.4g,混合色源 6.87g,琼脂 18g,纯净水 1L,pH 7.3)来鉴定肠道菌群中是否含有致病菌;第三步,配制培养基:当鉴定无致病菌时,开始配置培养基,分别配制肉膏蛋白胨培养基、沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂、酵母菌富集培养基、伊红美蓝乳糖培养基以及Hektoen培养基各约500mL,分装,121℃灭菌15 min;
第四步,倒平板:牛肉膏蛋白胨培养基、沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂、酵母菌富集培养基、伊红美蓝乳糖培养基以及Hektoen培养基分别倒30个平板,做好标记;
第五步,制备不同浓度梯度的菌悬液:取10μL的匀浆液,加90uL的无菌水,制成浓度为
10-1的溶液。以此类推,配制10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 的菌悬液,在无菌条件下进行;
第六步,涂布平板:用移液枪和灭过菌的枪头,分别向牛肉膏蛋白胨培养基、沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂、酵母菌富集培养基、伊红美蓝乳糖培养基以及Hektoen培养基中加100 μL各浓度的各样的菌悬液,标记好浓度,样品名,均匀涂布,在无菌条件下进行;
第七步,恒温培养:将平板放在24℃条件下恒温培养24-48h,挑取典型生物单菌落进行划线纯化培养;
第八步,生理生化鉴定:平皿快速检测法,利用透明圈法、生长圈法和抑制圈法鉴定,利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应,将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的形态变化;
第九步,咖啡豆培养基进一步分离纯化:咖啡豆培养基组成:咖啡豆3.4091g/L,Na2HPO4为0.0564g/L,MgSO4为0.1611g/L和酵母粉3.5707g/L,将上述6)中挑取出的菌落在咖啡豆培养基中再进行培养,培养条件为20℃,24-48h,将培养后的单菌落按生长速度快慢分别挑取出来;
第十步,分子生物学鉴定:通过PCR扩增技术获得纯化菌种的扩增DNA并进行测序,数据库序列比对,对待分离菌株进一步确定,鉴定得出菌种分别为A、B、C和D。
[0011] b,发酵步骤:第一步,原料筛选:筛选颗粒饱满、颜色正常的咖啡豆进行下述实验;
第二步,原料烘干:用50℃-70℃对咖啡豆进行热风鼓风干燥,使得咖啡豆的湿度保持在50%-60%;
第三步,发酵:分别对上述分离出来的各种单菌接种在咖啡豆表面进行发酵,发酵结束后测定咖啡豆中色氨酸的含量,观察发酵结束咖啡豆咖啡豆用65-70℃对咖啡豆进行热风干燥,使得咖啡豆的湿度保持在55-60%;的颜色并分别对其进行感官评价,通过各个因素对咖啡豆的影响进行最终菌种的比例调节,接种在咖啡豆后,放入培养器,在35-40℃下发酵
20-36小时;
第四步,烘干:将发酵结束的猫屎咖啡放入鼓风干燥箱中,在35℃下处理3-6小时。
[0012] 进一步的,包括咖啡豆用65-70℃对咖啡豆进行热风干燥,使得咖啡豆的湿度保持在55-60%。
[0013] 进一步的,包括分别对分离出来的A、B、C和D比例调节进行发酵,比例确定为2:1:2:1,并接种在咖啡豆后,放入培养器,在37℃下发酵30-36小时。
[0014] 本发明的有益效果是,本发明的一种利用猫的肠道菌制造发酵咖啡的方法,制得的猫屎发酵咖啡含高浓度色氨酸,色氨酸是血清素的前体物质,血清素为神经传导物质,能让人放松,心情愉悦,减缓神经活动而引发睡意,同时咖啡因浓度低,苦味弱且具特殊香味,遵循健康饮食原则的同时适应大多数人群的口味需求。

具体实施方式

[0015] 一种利用猫的肠道菌制造发酵咖啡的方法,其特征在于,包括以下的步骤:a,麝香猫肠道菌群的分离与纯化培养:第一步, 10g粪便与100mL无菌水装入匀浆袋中,使用匀浆机拍打5min,高速冷冻离心机离心,去上清,制成匀浆液。
[0016] 第二步,鉴定:首先配制肠道致病菌鉴定培养基(蛋白胨17.2g,色氨酸 0.9g,Hepes 缓冲液 0.4g,混合色源 6.87g,琼脂 18g,纯净水 1L,pH 7.3)来鉴定肠道菌群中是否含有致病菌;第三步,配制培养基:当鉴定无致病菌时,开始配置培养基,分别配制牛肉膏蛋白胨培养基、沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂、酵母菌富集培养基、伊红美蓝乳糖培养基以及Hektoen培养基各约500mL,分装,121℃灭菌15 min;
第四步,倒平板:牛肉膏蛋白胨培养基、沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂、酵母菌富集培养基、伊红美蓝乳糖培养基以及Hektoen培养基分别倒30个平板,做好标记;
第五步,制备不同浓度梯度的菌悬液:取10μL的匀浆液,加90uL的无菌水,制成浓度为
10-1的溶液。以此类推,配制10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 的菌悬液,在无菌条件下进行;
第六步,涂布平板:用移液枪和灭过菌的枪头,分别向牛肉膏蛋白胨培养基、沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂、酵母菌富集培养基、伊红美蓝乳糖培养基以及Hektoen培养基中加100 μL各浓度的各样的菌悬液,标记好浓度,样品名,均匀涂布,在无菌条件下进行;
第七步,恒温培养:将平板放在24℃条件下恒温培养24-48h,挑取典型微生物单菌落进行划线纯化培养;
第八步,生理生化鉴定:平皿快速检测法,利用透明圈法、生长圈法和抑制圈法鉴定,利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应,将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的形态变化;
第九步,咖啡豆培养基进一步分离纯化:咖啡豆培养基组成:咖啡豆3.4091g/L,Na2HPO4为0.0564g/L,MgSO4为0.1611g/L和酵母粉3.5707g/L,将上述6)中挑取出的菌落在咖啡豆培养基中再进行培养,培养条件为20℃,24-48h,将培养后的单菌落按生长速度快慢分别挑取出来;
第十步,分子生物学鉴定:通过PCR扩增技术获得纯化菌种的扩增DNA并进行测序,数据库序列比对,对待分离菌株进一步确定,鉴定得出菌种分别为A、B、C和D。
[0017] b,发酵步骤:第一步,原料筛选:筛选颗粒饱满、颜色正常的咖啡豆进行下述实验;
第二步,原料烘干:用50℃-70℃对咖啡豆进行热风鼓风干燥,使得咖啡豆的湿度保持在50%-60%;
第三步,发酵:分别对上述分离出来的各种单菌接种在咖啡豆表面进行发酵,发酵结束后测定咖啡豆中色氨酸的含量,观察发酵结束咖啡豆咖啡豆用65-70℃对咖啡豆进行热风干燥,使得咖啡豆的湿度保持在55-60%;的颜色并分别对其进行感官评价,通过各个因素对咖啡豆的影响进行最终菌种的比例调节,接种在咖啡豆后,放入培养器,在35-40℃下发酵
20-36小时;
第四步,烘干:将发酵结束的猫屎咖啡放入鼓风干燥箱中,在35℃下处理3-6小时。“猫的肠道菌”是指在猫粪便中分离纯化发现的细菌。
[0018] 具体实施例一:(1)麝香猫肠道菌群的分离与纯化培养:10g粪便与100mL无菌水装入匀浆袋中,使用匀浆机拍打5min,高速冷冻离心机离心,去上清,制成匀浆液;鉴定:首先配制肠道致病菌鉴定培养基(蛋白胨17.2g,色氨酸 0.9g,Hepes 缓冲液 0.4g,混合色源 6.87g,琼脂 18g,纯净水 1L,pH 7.3)来鉴定肠道菌群中是否含有致病菌,若无致病菌,则进行下述实验;配制培养基:分别配制牛肉膏蛋白胨培养基、沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂、酵母菌富集培养基、伊红美蓝乳糖培养基以及Hektoen培养基各约500mL,分装,121℃灭菌15 min;倒平板:牛肉膏蛋白胨培养基、沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂、酵母菌富集培养基、伊红美蓝乳糖培养基以及Hektoen培养基分别倒30个平板,做好标记;制备不同浓度梯度的菌悬液:
取10μL的匀浆液,加90uL的无菌水,制成浓度为10-1的溶液。以此类推,配制10-2、10-3、10-
4、10-5、10-6 的菌悬液,注意该步骤在无菌条件下进行;涂布平板:用移液枪和灭过菌的枪头,分别向牛肉膏蛋白胨培养基、沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂、酵母菌富集培养基、伊红美蓝乳糖培养基以及Hektoen培养基中加100 μL各浓度的各样的菌悬液,标记好浓度,样品名,均匀涂布,注意该步骤在无菌条件下进行;恒温培养:将平板放在24℃条件下恒温培养24h,挑取典型微生物单菌落进行划线纯化培养;生理生化鉴定:平皿快速检测法,利用透明圈法、生长圈法和抑制圈法鉴定,利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应,将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的形态变化;咖啡豆培养基进一步分离纯化:咖啡豆培养基组成:咖啡豆3.4091g/L,Na2HPO4为0.0564g/L,MgSO4为0.1611g/L和酵母粉3.5707g/L,将上述6)中挑取出的菌落在咖啡豆培养基中再进行培养,培养条件为20℃,24h,将培养后的单菌落按生长速度快慢分别挑取出来;分子生物学鉴定:通过PCR扩增技术获得纯化菌种的扩增DNA并进行测序,数据库序列比对,对待分离菌株进一步确定,鉴定得出菌种分别为A、B、C和D。(2)发酵步骤:原料筛选:筛选颗粒饱满、颜色正常的咖啡豆进行下述实验;原料烘干:用50℃对咖啡豆进行热风鼓风干燥,使得咖啡豆的湿度保持在50%-60%;发酵:分别对上述分离出来的各种单菌接种在咖啡豆表面进行发酵,发酵结束后测定咖啡豆中色氨酸的含量,观察发酵结束咖啡豆的颜色并分别对其进行感官评价,调节菌种比例为1:1:1:1,接种在咖啡豆后,放入培养器,在35℃下发酵24小时;烘干:将发酵结束的猫屎咖啡放入鼓风干燥箱中,在35℃下处理6小时。
[0019] 具体实施例二:(1)麝香猫肠道菌群的分离与纯化培养:10g粪便与100mL无菌水装入匀浆袋中,使用匀浆机拍打5min,高速冷冻离心机离心,去上清,制成匀浆液;鉴定:首先配制肠道致病菌鉴定培养基(蛋白胨17.2g,色氨酸 0.9g,Hepes 缓冲液 0.4g,混合色源 6.87g,琼脂 18g,纯净水 1L,pH 7.3)来鉴定肠道菌群中是否含有致病菌,若无致病菌,则进行下述实验;配制培养基:分别配制牛肉膏蛋白胨培养基、沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂、酵母菌富集培养基、伊红美蓝乳糖培养基以及Hektoen培养基各约500mL,分装,121℃灭菌15 min;倒平板:牛肉膏蛋白胨培养基、沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂、酵母菌富集培养基、伊红美蓝乳糖培养基以及Hektoen培养基分别倒30个平板,做好标记;制备不同浓度梯度的菌悬液:
取10μL的匀浆液,加90uL的无菌水,制成浓度为10-1的溶液。以此类推,配制10-2、10-3、10-
4、10-5、10-6 的菌悬液,注意该步骤在无菌条件下进行;涂布平板:用移液枪和灭过菌的枪头,分别向牛肉膏蛋白胨培养基、沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂、酵母菌富集培养基、伊红美蓝乳糖培养基以及Hektoen培养基中加100 μL各浓度的各样的菌悬液,标记好浓度,样品名,均匀涂布,注意该步骤在无菌条件下进行;恒温培养:将平板放在24℃条件下恒温培养32h,挑取典型微生物单菌落进行划线纯化培养;生理生化鉴定:平皿快速检测法,利用透明圈法、生长圈法和抑制圈法鉴定,利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应,将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的形态变化;咖啡豆培养基进一步分离纯化:咖啡豆培养基组成:咖啡豆3.4091g/L,Na2HPO4为0.0564g/L,MgSO4为0.1611g/L和酵母粉3.5707g/L,将上述6)中挑取出的菌落在咖啡豆培养基中再进行培养,培养条件为20℃,24h,将培养后的单菌落按生长速度快慢分别挑取出来;分子生物学鉴定:通过PCR扩增技术获得纯化菌种的扩增DNA并进行测序,数据库序列比对,对待分离菌株进一步确定,鉴定得出菌种分别为A、B、C和D。(2)发酵步骤:原料筛选:筛选颗粒饱满、颜色正常的咖啡豆进行下述实验;原料烘干:用60℃对咖啡豆进行热风鼓风干燥,使得咖啡豆的湿度保持在50%-60%;发酵:分别对上述分离出来的各种单菌接种在咖啡豆表面进行发酵,发酵结束后测定咖啡豆中色氨酸的含量,观察发酵结束咖啡豆的颜色并分别对其进行感官评价,调节菌种比例为2:1:2:1,接种在咖啡豆后,放入培养器,在35℃下发酵28小时;烘干:将发酵结束的猫屎咖啡放入鼓风干燥箱中,在35℃下处理5小时。
[0020] 具体实施例三:(1)麝香猫肠道菌群的分离与纯化培养:10g粪便与100mL无菌水装入匀浆袋中,使用匀浆机拍打5min,高速冷冻离心机离心,去上清,制成匀浆液;鉴定:首先配制肠道致病菌鉴定培养基(蛋白胨17.2g,色氨酸 0.9g,Hepes 缓冲液 0.4g,混合色源 6.87g,琼脂 18g,纯净水 1L,pH 7.3)来鉴定肠道菌群中是否含有致病菌,若无致病菌,则进行下述实验;配制培养基:分别配制牛肉膏蛋白胨培养基、沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂、酵母菌富集培养基、伊红美蓝乳糖培养基以及Hektoen培养基各约500mL,分装,121℃灭菌15 min;倒平板:牛肉膏蛋白胨培养基、沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂、酵母菌富集培养基、伊红美蓝乳糖培养基以及Hektoen培养基分别倒30个平板,做好标记;制备不同浓度梯度的菌悬液:
取10μL的匀浆液,加90uL的无菌水,制成浓度为10-1的溶液。以此类推,配制10-2、10-3、10-
4、10-5、10-6 的菌悬液,注意该步骤在无菌条件下进行;涂布平板:用移液枪和灭过菌的枪头,分别向牛肉膏蛋白胨培养基、沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂、酵母菌富集培养基、伊红美蓝乳糖培养基以及Hektoen培养基中加100 μL各浓度的各样的菌悬液,标记好浓度,样品名,均匀涂布,注意该步骤在无菌条件下进行;恒温培养:将平板放在24℃条件下恒温培养48h,挑取典型微生物单菌落进行划线纯化培养;生理生化鉴定:平皿快速检测法,利用透明圈法、生长圈法和抑制圈法鉴定,利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应,将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的形态变化;咖啡豆培养基进一步分离纯化:咖啡豆培养基组成:咖啡豆3.4091g/L,Na2HPO4为0.0564g/L,MgSO4为0.1611g/L和酵母粉3.5707g/L,将上述6)中挑取出的菌落在咖啡豆培养基中再进行培养,培养条件为20℃,24h,将培养后的单菌落按生长速度快慢分别挑取出来;分子生物学鉴定:通过PCR扩增技术获得纯化菌种的扩增DNA并进行测序,数据库序列比对,对待分离菌株进一步确定,鉴定得出菌种分别为A、B、C和D。(2)发酵步骤:原料筛选:筛选颗粒饱满、颜色正常的咖啡豆进行下述实验;原料烘干:用65℃对咖啡豆进行热风鼓风干燥,使得咖啡豆的湿度保持在50%-60%;发酵:分别对上述分离出来的各种单菌接种在咖啡豆表面进行发酵,发酵结束后测定咖啡豆中色氨酸的含量,观察发酵结束咖啡豆的颜色并分别对其进行感官评价,调节菌种比例为2:1:1:1,接种在咖啡豆后,放入培养器,在35℃下发酵36小时;烘干:将发酵结束的猫屎咖啡放入鼓风干燥箱中,在35℃下处理4小时。
[0021] 种菌培养分离步骤:第一步, 10g粪便与100mL无菌水装入匀浆袋中,使用匀浆机拍打5min,高速冷冻离心机离心,去上清,制成匀浆液。
[0022] 第二步,鉴定:首先配制肠道致病菌鉴定培养基(蛋白胨17.2g,色氨酸 0.9g,Hepes 缓冲液 0.4g,混合色源 6.87g,琼脂 18g,纯净水 1L,pH 7.3)来鉴定肠道菌群中是否含有致病菌,若无致病菌,则进行下述实验;第三步,配制培养基:分别配制牛肉膏蛋白胨培养基、沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂、酵母菌富集培养基、伊红美蓝乳糖培养基以及Hektoen培养基各约500mL,分装,121℃灭菌15 min;
第四步,倒平板:牛肉膏蛋白胨培养基、沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂、酵母菌富集培养基、伊红美蓝乳糖培养基以及Hektoen培养基分别倒30个平板,做好标记;
第五步,制备不同浓度梯度的菌悬液:取10μL的匀浆液,加90uL的无菌水,制成浓度为
10-1的溶液。以此类推,配制10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 的菌悬液,注意该步骤在无菌条件下进行;
第六步,涂布平板:用移液枪和灭过菌的枪头,分别向牛肉膏蛋白胨培养基、沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂、酵母菌富集培养基、伊红美蓝乳糖培养基以及Hektoen培养基中加100 μL各浓度的各样的菌悬液,标记好浓度,样品名,均匀涂布,注意该步骤在无菌条件下进行;
第七步,恒温培养:将平板放在24℃条件下恒温培养24-48h,挑取典型微生物单菌落进行划线纯化培养;
第八步,生理生化鉴定:平皿快速检测法,利用透明圈法、生长圈法和抑制圈法鉴定,利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应,将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的形态变化;
第九步,咖啡豆培养基进一步分离纯化:咖啡豆培养基组成:咖啡豆3.4091g/L,Na2HPO4为0.0564g/L,MgSO4为0.1611g/L和酵母粉3.5707g/L,将上述6)中挑取出的菌落在咖啡豆培养基中再进行培养,培养条件为20℃,24-48h,将培养后的单菌落按生长速度快慢分别挑取出来;
第十步,分子生物学鉴定:通过PCR扩增技术获得纯化菌种的扩增DNA并进行测序,数据库序列比对,对待分离菌株进一步确定,鉴定得出菌种分别为A、B、C和D。
[0023] 发酵步骤:第一步,原料筛选:筛选颗粒饱满、颜色正常的咖啡豆进行下述实验;
第二步,原料烘干:用50℃-70℃对咖啡豆进行热风鼓风干燥,使得咖啡豆的湿度保持在50%-60%;
第三步,发酵:分别对上述分离出来的各种单菌接种在咖啡豆表面进行发酵,发酵结束后测定咖啡豆中色氨酸的含量,观察发酵结束咖啡豆的颜色并分别对其进行感官评价,通过各个因素对咖啡豆的影响进行最终菌种的比例调节,接种在咖啡豆后,放入培养器,在
35-40℃下发酵20-36小时;
色氨酸是一种必需氨基酸,是血清素的前体物质。血清素为神经传导物质,能让人放松,心情愉悦,减缓神经活动而引发睡意。色氮酸测定采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法。
利用反相高效液量色谱对A、B、C、D四种菌种发酵的猫屎咖啡中色氨酸含量进行检测,得出含量A>B>C>D;对A、B、C、D四种菌种发酵的猫屎咖啡进行感官评价,得出A味道甘甜,B味道苦涩,C味道甜中带涩,D味道苦涩;对A、B、C、D四种菌种发酵的猫屎咖啡进行颜色观察,A为赤红色,B为杏黄色,C为朱红色,D为藏青色,对比可得B比较被消费者所喜欢;对猫屎咖啡口感评价主要以入口后厚重、浓稠的质感,舌头对咖啡重量、质量的触觉印象为指标,综合对A、B、C、D四种菌种发酵的猫屎咖啡口感评价,可以得出D>B>C>A;综合以上评价可以得出A、B、C、D四种菌种发酵的猫屎咖啡中,A的色氨酸含量最高,B的色泽最深受消费者喜爱,C的味道最好,D的口感最顺口。
[0024] 烘干处理步骤:将发酵结束的猫屎咖啡放入鼓风干燥箱中,在35℃下处理3-6小时。
[0025] 下方是速溶咖啡的营养成分表:以上说明对本发明而言只是说明性的,而非限制性的,本领域普通技术人员理解,在不脱离所附权利要求所限定的精神和范围的情况下,可做出许多修改、变化或等效,但都将落入本发明的保护范围内。
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