配列表の簡単な説明 [00183] 配列番号1はムロモナブの重鎖のアミノ酸配列である。

[00184] 配列番号2はムロモナブの軽鎖のアミノ酸配列である。

[00185] 配列番号3は組換えヒトIL−2のアミノ酸配列である。

[00186] 配列番号4はアルデスロイキンのアミノ酸配列である。

[00187] 配列番号5は組換えヒトIL−7のアミノ酸配列である。

[00188] 配列番号6は組換えヒトIL−15のアミノ酸配列である。

[00189] 配列番号7は組換えIL−21のアミノ酸配列である。

[00190] 配列番号8はヒトCD86のアミノ酸配列である。

[00191] 配列番号9はヒト4−1BBL(CD137L)のアミノ酸配列である。

[00192] 配列番号10はヒトOX40L(CD134L)のアミノ酸配列である。

[00193] 配列番号11はヒトCD28のアミノ酸配列である。

[00194] 配列番号12はヒトCTLA−4のアミノ酸配列である。

[00195] 配列番号13はヒト4−1BB(CD137)のアミノ酸配列である。

[00196] 配列番号14はヒトOX40(CD134)のアミノ酸配列である。

[00197] 配列番号15はpLV430G 4−1BBLエンプティベクターのヌクレオチド配列である。

[00198] 配列番号16はpLV430Gヒト4−1BBLベクターの4−1BBL CoOP部分のヌクレオチド配列である。

[00199] 配列番号17は4−1BBL PCRPのヌクレオチド配列である。

[00200] 配列番号18はpLV430G hCD86エンプティベクターのヌクレオチド配列である。

[00201] 配列番号19はpLV430GヒトhCD86ベクターのhCD86 CoOP部分のヌクレオチド配列である。

[00202] 配列番号20はpLV430GヒトhCD86ベクターのhCD86 CoOP B1 B2 PCRP部分のヌクレオチド配列である。

[00203] 配列番号21はpDONR221 hCD86ベクターのヌクレオチド配列である。

[00204] 配列番号22はpDONR221 4−1BBLベクターのヌクレオチド配列である。

[00205] 配列番号23はpLV430Gベクターのヌクレオチド配列である。

[00206] 配列番号24はpDONR221ベクターのヌクレオチド配列である。

[00207] 配列番号25はレンチウイルス作製用のpsPAX2ヘルパープラスミドのヌクレオチド配列である。

[00208] 配列番号26はレンチウイルス作製用のpCIGO−VSV.Gヘルパープラスミドのヌクレオチド配列である。

[00209] 配列番号27はmFc−7C12 scFvクローンのアミノ酸配列である。

[00210] 配列番号28はmFc−8B3 scFvクローンのアミノ酸配列である。

[00211] 配列番号29はmFC−7C12 scFvのヌクレオチド配列である。

[00212] 配列番号30はmFC−8B3 scFvのヌクレオチド配列である。

[00213] 配列番号31はデスティネーションベクターpLV4301Gのヌクレオチド配列である。

[00214] 配列番号32は、ドナーベクター1、pMK 7c12抗mFC scFv CoOp ECORV SacII L1R5のヌクレオチド配列である。

[00215] 配列番号33は、ドナーベクター2、pMK hCD8a足場TN L5 L2のヌクレオチド配列である。

[00216] 配列番号34は、レンチウイルス作製に使用される最終的なベクター、pLV4301G 7C12 scFv mIgG hCD8 flagのヌクレオチド配列である。

[00217] 配列番号35は、デスティネーションベクター、pLV4301Gのヌクレオチド配列である。

[00218] 配列番号36は、ドナーベクター1、pMK 8B3抗mFC scFv CoOp ECORV SacII L1R5のヌクレオチド配列である。

[00219] 配列番号37は、ドナーベクター2、pMK hCD8a足場TN L5 L2のヌクレオチド配列である。

[00220] 配列番号38は、レンチウイルス作製に使用される最終的なベクター、pLV4301G 8B3 scFv mIgG hCD8 flagのヌクレオチド配列である。

[00221] 配列番号39はレンチウイルス作製用のpLenti−C−Myc−DDK OX40Lベクターのヌクレオチド配列である。

[00222] 配列番号40は、テロメア長の定量的ポリメラーゼ連鎖反応測定に使用されるTel−1bプライマーのヌクレオチド配列である。

[00223] 配列番号41は、テロメア長の定量的ポリメラーゼ連鎖反応測定に使用されるTel−2bプライマーのヌクレオチド配列である。

[00224] 配列番号42は、テロメア長の定量的ポリメラーゼ連鎖反応測定に使用されるTel−1bプライマーのヌクレオチド配列である。

[00225] 配列番号43は、テロメア長の定量的ポリメラーゼ連鎖反応測定に使用されるTel−1bプライマーのヌクレオチド配列である。

発明の詳細な説明 [00226] 特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。本明細書において言及される特許及び刊行物は全て、全体として参照により援用される。

定義 [00227] 用語「共投与」、「共投与する」、「〜との組み合わせで投与される」、「〜との組み合わせで投与する」、「同時の」、及び「並行した」は、本明細書で使用する場合、両方の医薬品有効成分及び/又はその代謝産物がヒト対象に同じ時点で存在するようなヒト対象への2つ以上の医薬品有効成分の投与を包含する。共投与には、別個の組成物での同時投与、別個の組成物での異なる時点における投与、又は2つ以上の医薬品有効成分が存在する組成物での投与が含まれる。別個の組成物での同時投与及び両方の薬剤が存在する組成物での投与もまた本発明の方法に包含される。

[00228] 用語「インビボ」は、対象の体内で起こる事象を指す。

[00229] 用語「インビトロ」は、対象の体外で起こる事象を指す。インビトロアッセイは、生細胞又は死細胞を利用した細胞ベースのアッセイを包含し、また、インタクトな細胞を利用しない無細胞アッセイも包含し得る。

[00230] 用語「エキソビボ」は、対象の体から取り出された細胞、組織及び/又は臓器を処理すること又はそれに手順を施すことを伴う事象を指す。適切には、細胞、組織及び/又は臓器は手術又は治療方法において対象の体に戻され得る。

[00231] 用語「抗原」は、免疫応答を誘導する物質を指す。一部の実施形態において、抗原は、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子によって提示された場合に抗体又はT細胞受容体(TCR)による結合を受ける能力を有する分子である。用語「抗原」は、本明細書で使用する場合、T細胞エピトープもまた包含する。抗原は、加えて、免疫系により認識される能力を有する。一部の実施形態において、抗原は、Bリンパ球及び/又はTリンパ球の活性化につながる体液性免疫応答又は細胞性免疫応答を誘導する能力を有する。ある場合には、そのために抗原がTh細胞エピトープを含むか又はそれに連結されている必要があることもある。抗原はまた、1又は複数のエピトープ(例えば、B−及びT−エピトープ)も有し得る。一部の実施形態において、抗原は、好ましくは、その対応する抗体又はTCRと典型的には高度に特異的且つ選択的に反応し、他の抗原によって誘導され得る他の多数の抗体又はTCRとは反応しないであろう。

[00232] 用語「有効量」又は「治療有効量」は、意図した適用、限定しないが、疾患治療を達成するのに十分な本明細書に記載されるとおりの化合物又は化合物の組み合わせの量を指す。治療有効量は、意図した適用(インビトロ又はインビボ)、又は治療下のヒト対象及び疾患病態(例えば、対象の体重、年齢及び性別)、疾患病態の重症度、投与方法等に応じて異なってもよく、これは当業者が容易に判断することができる。この用語はまた、標的細胞において特定の応答(例えば、血小板粘着及び/又は細胞遊走の低減)を生じさせるであろう用量にも適用される。具体的な用量は、選択した詳細な化合物、従うべき投与レジメン、化合物が他の化合物との組み合わせで投与されるかどうか、投与タイミング、その投与先の組織、及び化合物を運ぶ物理的デリバリーシステムに応じて異なることになる。

[00233] 「治療効果」は、本明細書において当該の用語が使用されるとき、ヒト対象における治療利益及び/又は予防利益を包含する。予防効果としては、疾患又は病態の出現を遅延させる又は消失させること、疾患又は病態の症状の発生を遅延させる又は消失させること、疾患又は病態の進行を遅延させる、止める、又は好転させること、又はこれらの任意の組み合わせが挙げられる。

[00234] 「薬学的に許容可能な担体」又は「薬学的に許容可能な賦形剤」は、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、及び不活性成分を含むことが意図される。かかる薬学的に許容可能な担体又は薬学的に許容可能な賦形剤の医薬品有効成分への使用は当該技術分野において周知である。任意の従来の薬学的に許容可能な担体又は薬学的に許容可能な賦形剤が医薬品有効成分と適合しない場合を除き、本発明の治療用組成物中におけるその使用が企図される。他の薬物など、追加的な医薬品有効成分もまた、記載される組成物及び方法に取り入れることができる。

[00235] 用語「迅速拡大培養」は、1週間の期間で少なくとも約3倍(又は4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、又は9倍)、より好ましくは1週間の期間で少なくとも約10倍(又は20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、又は90倍)、又は最も好ましくは1週間の期間で少なくとも約100倍の抗原特異的TIL数の増加を意味する。幾つもの迅速拡大培養プロトコルが本明細書に記載される。

[00236] 本明細書において「腫瘍浸潤リンパ球」又は「TIL」とは、対象の血流を離れて腫瘍中に遊走した、当初白血球細胞として得られた細胞の集団が意味される。TILとしては、限定はされないが、CD8⁺細胞傷害性T細胞(リンパ球)、Th1及びTh17 CD4⁺ T細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞及びM1マクロファージが挙げられる。TILには、初代TIL及び二次TILの両方が含まれる。「初代TIL」は、本明細書に概説されるとおり患者組織試料から得られるものであり(時に本明細書において「新鮮に回収された」又は「第1のTIL集団」と称される)、及び「二次TIL」は、本明細書で考察するとおり拡大培養された又は増殖した任意のTIL細胞集団、限定しないが、例えばバルクTIL及び拡大培養されたTIL(適切な場合には「REP TIL」又は「ポストREP TIL」、又は「第2のTIL集団」又は「第3のTIL集団」)、である。

[00237] TILは、概して、細胞表面マーカーを使用して生化学的に定義することも、又は腫瘍に浸潤して治療を達成するその能力によって機能的に定義することもできる。TILは、概して、以下のバイオマーカー:CD4、CD8、TCRαβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD−1、及びCD25のうちの1又は複数の発現によって分類することができる。加えて、及び或いは、TILは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤するその能力によって機能的に定義することができる。

[00238] 本明細書において「凍結保存TIL」とは、TILが約−150℃〜−60℃の範囲で処理及び保存されることを意味する。一般的な凍結保存方法はまた、実施例を含め、本明細書の他の部分にも記載される。明確にするために言えば、「凍結保存TIL」は、初代TILの供給源として用いられ得る凍結組織試料と区別可能なものである。

[00239] 本明細書において「解凍した凍結保存TIL」とは、かつて凍結保存されていたが、次に処理により、室温以上、限定しないが、例えば細胞培養温度又はTILを患者に投与し得る温度、に戻されたTIL集団を意味する。

[00240] 本明細書において「細胞集団」(TILを含む)は、共通の形質を共有する多数の細胞を意味する。

[00241] 用語「セントラルメモリーT細胞」は、ヒトではCD45R0+であり、且つCCR7(CCR7^hi)及びCD62L(CD62^hi)を構成的に発現するT細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーT細胞の表面表現型にはまた、TCR、CD3、CD127(IL−7R)、及びIL−15Rも含まれる。セントラルメモリーT細胞の転写因子には、BCL−6、BCL−6B、MBD2、及びBMI1が含まれる。セントラルメモリーT細胞はTCR惹起後にエフェクター分子としてIL−2及びCD40Lを主に分泌する。セントラルメモリーT細胞は血中のCD4コンパートメントにおいて優勢であり、ヒトではリンパ節及び扁桃腺に比例的に高濃度化する。

[00242] 用語「エフェクターメモリーT細胞」は、セントラルメモリーT細胞と同様にCD45R0+であるが、CCR7の構成的発現が欠損しており(CCR7^lo)、且つCD62L発現が不均一であるか又は低い(CD62L^lo)、ヒト又は哺乳類T細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーT細胞の表面表現型にはまた、TCR、CD3、CD127(IL−7R)、及びIL−15Rも含まれる。セントラルメモリーT細胞の転写因子には、BLIMP1が含まれる。エフェクターメモリーT細胞は抗原刺激後に、インターフェロン−γ、IL−4、及びIL−5を含め、高レベルの炎症性サイトカインを急速に分泌する。エフェクターメモリーT細胞は血中のCD8コンパートメントにおいて優勢であり、ヒトでは肺、肝臓、及び腸に比例的に高濃度化する。CD8+ エフェクターメモリーT細胞は大量のパーフォリンを有する。

[00243] 2つ以上の核酸又はポリペプチドの文脈で用語「配列同一性」、「パーセント同一性」、及び「配列パーセント同一性」は、いかなる保存的アミノ酸置換も配列同一性の一部として考慮せず、対応が最大となるように比較及びアラインメント(必要に応じてギャップを導入する)したときに同じである、又は同じであるヌクレオチド若しくはアミノ酸残基を特定の割合だけ有する2つ以上の配列又は部分配列を指す。パーセント同一性は、配列比較ソフトウェア又はアルゴリズムを用いるか、又は目視検査によって測定することができる。アミノ酸又はヌクレオチド配列のアラインメントを達成するために使用し得る様々なアルゴリズム及びソフトウェアが当該技術分野において公知である。パーセント配列同一性の決定に好適なプログラムとしては、例えば、米国政府の国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)BLASTウェブサイトから利用可能なBLASTプログラムスイートが挙げられる。2つの配列間の比較は、BLASTN又はBLASTPのいずれかのアルゴリズムを使用して行うことができる。BLASTNは核酸配列の比較に使用され、一方、BLASTPはアミノ酸配列の比較に使用される。ALIGN、ALIGN-2(Genentech、South San Francisco, California)又はDNASTARから利用可能なMegAlignが、配列のアラインメントに使用し得る更なる公的に利用可能なソフトウェアプログラムである。当業者は、特定のアラインメントソフトウェアによるアラインメントを最大化するための適切なパラメータを決定することができる。特定の実施形態では、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。

[00244] 用語「保存的アミノ酸置換」は、抗体の抗原への結合又はタンパク質のそのリガンドへの結合を無効にしないアミノ酸配列修飾を意味する。保存的アミノ酸置換としては、あるクラスのアミノ酸における同じクラスのアミノ酸による置換が挙げられ、ここで、クラスは、共通の物理化学的アミノ酸側鎖特性及び例えば標準的なデイホフ頻度交換行列又はBLOSUM行列によって決定されるとおりの、天然に見られる相同タンパク質における高い置換頻度によって定義される。6つの一般的なアミノ酸側鎖クラスが分類されており、クラスI(Cys);クラスII(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly);クラスIII(Asn、Asp、Gln、Glu);クラスIV(His、Arg、Lys);クラスV(Ile、Leu、Val、Met);及びクラスVI(Phe、Tyr、Trp)が含まれる。例えば、AspをAsn、Gln、又はGluなどの別のクラスIII残基に代える置換は保存的置換である。従って、4−1BBL又はCD86タンパク質中の予測非必須アミノ酸残基が好ましくは同じクラスの別のアミノ酸残基に置き換えられる。抗原又はリガンド結合を消失させることのないアミノ酸保存的置換を同定する方法は当該技術分野において周知である(例えば、Brummell, et al., Biochemistry 1993, 32, 1180-1187;Kobayashi, et al., Protein Eng. 1999, 12, 879-884 (1999);及びBurks, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 412-417を参照のこと)。

[00245] 用語「レトロウイルス」は、その複製サイクルの間に逆転写酵素を利用するRNAウイルスを指し、ここで、レトロウイルスゲノムRNAは逆転写酵素によって二本鎖DNAに変換される。二本鎖DNA形態は感染細胞の染色体に組み込まれる(「プロウイルス」)。プロウイルスはRNAポリメラーゼIIの鋳型として働き、新規ウイルス粒子の産生に必要な構造タンパク質及び酵素をコードするRNA分子の発現を導く。プロウイルスの各末端には、「長末端反復配列」又は「LTR」と呼ばれる構造がある。LTRは、転写制御エレメント、ポリアデニル化シグナル並びにウイルスゲノムの複製及び組込みに必要な配列を含め、数多くの調節シグナルを含む。レトロウイルス科(Retroviridae)の中には、A型システルナウイルス属(Cisternavirus A)、A型オンコウイルス属(Oncovirus A)、B型オンコウイルス属(Oncovirus B)、C型オンコウイルス属(Oncovirus C)、D型オンコウイルス属(Oncovirus D)、レンチウイルス属(Lentivirus)、ガンマレトロウイルス属(Gammaretrovirus)、及びスプーマウイルス属(Spumavirus)を含め、幾つかの属が含まれる。一部のレトロウイルスは発癌性(即ち腫瘍形成性)であるが、そうでないものもある。オンコウイルスは、感受性のある種において肉腫、白血病、リンパ腫、及び乳癌を誘導する。レトロウイルスは多種多様な種に感染し、水平にも垂直にも伝播し得る。レトロウイルスは宿主DNAに組み込まれるため、宿主DNAの配列を細胞から細胞へと伝播させる能力を有する。例示的なガンマレトロウイルスベクターには、細胞表面リン酸輸送体受容体を用いて侵入し、次に増殖細胞染色体に永久に組み込まれるアンホトロピックなモロニーマウス白血病ウイルス(MLV−A)に由来するものが含まれる。アンホトロピックMLVベクター系は十分に確立されており、よく用いられる遺伝子デリバリーツールである(例えば、Gordon and Anderson, Curr. Op. Biotechnol., 1994, 5, 611-616及びMiller, et al., Meth. Enzymol., 1993, 217, 581-599(これらの開示は参照により本明細書に援用される)を参照のこと。

[00246] 用語「レンチウイルス」は、HIV(ヒト免疫不全ウイルス;HIV1型、及びHIV2型を含む)、ヒツジに脳炎(ビスナ)又は肺炎(マエディ)を引き起こすビスナ・マエディ、ヤギに免疫不全、関節炎、及び脳症を引き起こすヤギ関節炎脳炎ウイルス;ウマに自己免疫性溶血性貧血、及び脳症を引き起こすウマ伝染性貧血ウイルス;ネコに免疫不全を引き起こすネコ免疫不全ウイルス(FIV);ウシにリンパ節症、リンパ球増加症、及び場合により中枢神経系感染症を引き起こすウシ免疫不全ウイルス(BIV);及び類人霊長類に免疫不全及び脳症を引き起こすサル免疫不全ウイルス(SIV)を含む属を指す。これらのウイルスによって引き起こされる疾患は、長い潜伏期間及び経過の長期化を特徴とする。通常、これらのウイルスは単球及びマクロファージに潜伏感染し、そこから他の細胞に広がる。HIV、FIV、及びSIVはまた、Tリンパ球(即ちT細胞)にも容易に感染する。

[00247] 用語「抗CD3抗体」は、抗体又はその変異体、例えばモノクローナル抗体であって、成熟T細胞のT細胞抗原受容体におけるCD3受容体に対するヒト、ヒト化、キメラ又はマウス抗体を含むものを指す。抗CD3抗体には、ムロモナブとしても知られるOKT−3が含まれる。抗CD3抗体にはまた、T3及びCD3εとしても知られるUHCT1クローンも含まれる。他の抗CD3抗体には、例えば、オテリキシズマブ、テプリズマブ、及びビジリズマブが含まれる。

[00248] 用語「OKT−3」(本明細書では「OKT3」とも称される)は、成熟T細胞のT細胞抗原受容体におけるCD3受容体に対する、ヒト、ヒト化、キメラ、若しくはマウス抗体を含めたモノクローナル抗体又はその変異体を指し、OKT−3(30ng/mL、MACS GMP CD3 pure、Miltenyi Biotec GmbH、Bergisch Gladbach, Germany)及びムロモナブ又はその変異体、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、若しくはバイオシミラーなど、市販されている形態を含む。ムロモナブの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を表1に提供する(配列番号1及び配列番号2)。OKT−3の産生能を有するハイブリドーマが米国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection)に寄託されており、ATCC受託番号CRL 8001が付与されている。OKT−3の産生能を有するハイブリドーマはまた、欧州認証細胞培養株保存機関(European Collection of Authenticated Cell Cultures:ECACC)にも寄託されており、カタログ番号86022706が付与されている。

[00249] 用語「IL−2」(本明細書では「IL2」とも称される)は、インターロイキン−2として知られるT細胞成長因子を指し、そのヒト及び哺乳類形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー、及び変異体を含め、あらゆる形態のIL−2が含まれる。IL−2については、例えば、Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88及びMalek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79(これらの開示は参照により本明細書に援用される)に記載される。本発明での使用に好適な組換えヒトIL−2のアミノ酸配列を表2に提供する(配列番号3)。例えば、用語IL−2には、ヒトの組換え形態のIL−2、例えばアルデスロイキン(PROLEUKIN、使い捨てバイアル当たり2200万IUで複数の供給業者から市販されている)、並びにCellGenix, Inc.、Portsmouth, NH, USA(CELLGRO GMP)又はProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、East Brunswick, NJ, USA(カタログ番号CYT-209-b)によって商業的に供給されている組換えIL−2の形態及び他の販売業者からの他の市販の均等物が包含される。アルデスロイキン(des−アラニル−1,セリン−125ヒトIL−2)は、分子量が約15kDaの非グリコシル化ヒト組換え形態のIL−2である。本発明での使用に好適なアルデスロイキンのアミノ酸配列を表2に提供する(配列番号4)。用語IL−2にはまた、Nektar Therapeutics、South San Francisco, CA, USAから入手可能なペグ化IL2プロドラッグNKTR-214を含め、本明細書に記載されるとおりの、ペグ化形態のIL−2も包含される。本発明での使用に好適なNKTR-214及びペグ化IL−2が米国特許出願公開第2014/0328791 A1号及び国際公開第2012/065086 A1号(これらの開示は参照により本明細書に援用される)に記載されている。本発明での使用に好適な別の形態のコンジュゲート型IL−2が、米国特許第4,766,106号、同第5,206,344号、同第5,089,261号及び同第4902,502号(これらの開示は参照により本明細書に援用される)に記載されている。本発明での使用に好適なIL−2の製剤が米国特許第6,706,289号(この開示は参照により本明細書に援用される)に記載されている。

[00250] 用語「IL−7」(本明細書では「IL7」とも称される)は、インターロイキン7として知られるグリコシル化組織由来サイトカインを指し、これは間質及び上皮細胞、並びに樹状細胞から入手し得る。Fry and Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904。IL−7はT細胞の発達を刺激することができる。IL−7は、IL−7受容体αと共通γ鎖受容体とからなるヘテロ二量体のIL−7受容体に結合し、それが胸腺内でのT細胞発達及び末梢内での生存にとって重要な一連のシグナルとなる。本発明での使用に好適な組換えヒトIL−7は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、East Brunswick, NJ, USA(カタログ番号CYT-254)及びThermoFisher Scientific, Inc.、Waltham, MA, USA(ヒトIL−7組換えタンパク質、カタログ番号Gibco PHC0071)を含め、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトIL−7のアミノ酸配列を表2に提供する(配列番号5)。

[00251] 用語「IL−15」(本明細書では「IL15」とも称される)は、インターロイキン−15として知られるT細胞成長因子を指し、そのヒト及び哺乳類形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー、及び変異体を含め、あらゆる形態のIL−2が含まれる。IL−15については、例えば、Fehniger and Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32(この開示は参照により本明細書に援用される)に記載されている。IL−15はβ及びγシグナル伝達受容体サブユニットをIL−2と共有している。組換えヒトIL−15は、分子質量が12.8kDaの、114アミノ酸(及びN末端メチオニン)を含む単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトIL−15は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、East Brunswick, NJ, USA(カタログ番号CYT-230-b)及びThermoFisherScientific, Inc.、Waltham, MA, USA(ヒトIL−15組換えタンパク質、カタログ番号34-8159-82)を含め、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトIL−15のアミノ酸配列を表2に提供する(配列番号6)。

[00252] 用語「IL−21」(本明細書では「IL21」とも称される)は、インターロイキン−21として知られるプレイオトロピックサイトカインタンパク質を指し、そのヒト及び哺乳類形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー、及び変異体を含め、あらゆる形態のIL−21が含まれる。IL−21については、例えば、Spolski and Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95(この開示は参照により本明細書に援用される)に記載されている。IL−21は、主としてナチュラルキラーT細胞及び活性化ヒトCD4⁺ T細胞によって産生される。組換えヒトIL−21は、分子質量が15.4kDaの、132アミノ酸を含む単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトIL−21は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、East Brunswick, NJ, USA(カタログ番号CYT-408-b)及びThermoFisherScientific, Inc.、Waltham, MA, USA(ヒトIL−21組換えタンパク質、カタログ番号14-8219-80)を含め、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトIL−21のアミノ酸配列を表2に提供する(配列番号7)。

[00253] 用語「骨髄系細胞」は、本明細書で使用する場合、骨髄系列の細胞又はそれに由来する細胞を指す。骨髄系列には、顆粒球(好中球、好酸球、及び好塩基球)、単球、マクロファージ、赤血球、巨核球、及びマスト細胞の種々のサブセットを含めた幾つもの形態学的、表現型的、及び機能的に異なる細胞型が含まれる。特定の実施形態において、骨髄系細胞は、骨髄系列の細胞株に由来する細胞である。

[00254] 「MOLM−14」は、再発性急性単球性白血病の患者の末梢血から樹立されたヒト白血病細胞株を指し、初期の表現型の特徴付けから、少なくとも以下のマーカー:CD4、CD9、CD11a、CD13、CD14、CD15、CD32、CD33、CD64、CD65、CD87、CD92、CD93、CD116、CD118、及びCD155の存在が示された。Matsuo, et al., Leukemia 1997, 11, 1469-77。MOLM−14の更なる表現型の特徴付けから、HLA−A/B/C、CD64、CD80、ICOS−L、CD58のレベルがより高く、及びCD86のレベルがより低いことが見出された。MOLM−14細胞株はDSMZに受託番号ACC777で寄託されている。近縁のMOLM−13細胞株はDSMZに受託番号ACC554で寄託されている。本明細書で使用する場合、用語「MOLM−14細胞」は、MOLM−14細胞及び/又は寄託されたMOLM−14親細胞株に由来する細胞を指す。本明細書で使用する場合、用語「MOLM−13細胞」は、MOLM−13細胞及び/又は寄託されたMOLM−13親細胞株に由来する細胞を指す。

[00255] 「EM−3」は、フィラデルフィア染色体陽性CMLの患者の骨髄から樹立されたヒト細胞株を指す。Konopka, et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 1985, 82, 1810-4。EM−3細胞の表現型の特徴付けから、少なくとも以下のマーカー:CD13、CD15、及びCD33の存在が示される。EM−3細胞株はDSMZに受託番号ACC134で寄託されており、一方、近縁のEM−2細胞株はDSMZに受託番号ACC135で寄託されている。本明細書で使用する場合、用語「EM−3細胞」は、EM−3細胞及び/又は寄託されたEM−3親細胞株に由来する細胞を指す。

[00256] 本明細書で使用する場合、用語「CD86タンパク質」は、配列番号8に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質又は配列番号8に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%、例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を指し得る。

[00257] 本明細書で使用する場合、用語「4−1BBL」又は「CD137L」は、配列番号9に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質又は配列番号9に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%、例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を指し得る。

[00258] 本明細書で使用する場合、用語「OX40L」又は「CD137L」は、配列番号10に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質又は配列番号10に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%、例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を指し得る。

[00259] 用語「バイオシミラー」は、臨床的に不活性な成分に軽微な違いがあるにも関わらず、米国で認可されている先発バイオ製剤と高度に類似した、且つそれに関して製剤の安全性、純度、及び効力の点でそのバイオ製剤と先発製剤との間に臨床的に有意味な違いがない、モノクローナル抗体又は融合タンパク質を含めたバイオ製剤を意味する。更に、後発バイオ医薬品又は「バイオシミラー」医薬品は、欧州医薬品庁(European Medicines Agency)によって使用が既に許可されている別のバイオ医薬品に類似したバイオ医薬品である。用語「バイオシミラー」はまた、他の国及び地域の規制機関によっても同義的に使用される。バイオ製剤又はバイオ医薬品は、細菌又は酵母などの生物学的供給源によって作られる又はそれに由来する医薬品である。これはヒトインスリン又はエリスロポエチンなどの比較的小さい分子、又はモノクローナル抗体などの複合的な分子からなり得る。例えば、先発IL−2タンパク質がアルデスロイキン(PROLEUKIN)である場合、アルデスロイキンに準拠して医薬品規制当局により承認されたタンパク質は、アルデスロイキンと「バイオシミラー」であり、又はアルデスロイキンの「そのバイオシミラー」である。欧州では、後発バイオ医薬品又は「バイオシミラー」医薬品は、欧州医薬品庁(European Medicines Agency:EMA)によって使用が既に許可されている別のバイオ医薬品に類似したバイオ医薬品である。欧州における後発バイオ適用についての関連する法的根拠は、規則(EC)第726/2004号の第6条及び指令2001/83/ECの第10条(4)(その後の改正を含む)であり、従って欧州では、バイオシミラーは、規則(EC)第726/2004号の第6条及び指令2001/83/ECの第10条(4)に基づき認可を受け、認可が承認され、又は認可申請の対象となり得る。既に認可を受けている元のバイオ医薬品製剤は、欧州では「先発医薬品製剤」と称され得る。ある製剤がバイオシミラーと見なされるための要件の一部が、後発バイオ医薬品製剤に関するCHMPガイドライン(CHMP Guideline on Similar Biological Medicinal Products)に概説されている。加えて、モノクローナル抗体バイオシミラーに関するガイドラインを含め、製剤固有のガイドラインがEMAによって製剤毎に提供されており、そのウェブサイトに公開されている。本明細書に記載されるとおりのバイオシミラーは、品質特性、生物学的活性、作用機序、安全性プロファイル及び/又は有効性の点で先発医薬品製剤に類似したものであり得る。加えて、バイオシミラーは先発医薬品製剤と同じ病態の治療に使用される又はそれへの使用が意図されるものであり得る。従って、本明細書に記載されるとおりのバイオシミラーは、先発医薬品製剤に類似した又は高度に類似した品質特性を有すると見なされ得る。或いは、又は加えて、本明細書に記載されるとおりのバイオシミラーは、先発医薬品製剤に類似した又は高度に類似した生物学的活性を有すると見なされ得る。或いは、又は加えて、本明細書に記載されるとおりのバイオシミラーは、先発医薬品製剤に類似した又は高度に類似した安全性プロファイルを有すると見なされ得る。或いは、又は加えて、本明細書に記載されるとおりのバイオシミラーは、先発医薬品製剤に類似した又は高度に類似した有効性を有すると見なされ得る。本明細書に記載されるとおり、欧州におけるバイオシミラーは、EMAによって認可済みの先発医薬品製剤と比較される。しかしながら、一部の例では、バイオシミラーは、欧州経済地域外においてある種の試験で認可を受けたバイオ医薬品製剤(非EEA認可「対照薬」)と比較されてもよい。かかる試験には、例えば、ある種の臨床試験及びインビボ非臨床試験が含まれる。本明細書で使用する場合、用語「バイオシミラー」はまた、非EEA認可対照薬と比較済みの又はそれと比較され得るバイオ医薬品製剤にも関する。ある種のバイオシミラーは、抗体、抗体断片(例えば抗原結合部分)及び融合タンパク質などのタンパク質である。タンパク質バイオシミラーは、ポリペプチドの機能に有意な影響を及ぼさない軽微なアミノ酸構造の修飾(例えばアミノ酸の欠失、付加、及び/又は置換を含む)を有するアミノ酸配列を有し得る。バイオシミラーは、その先発医薬品製剤のアミノ酸配列と97%以上、例えば、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。バイオシミラーは、先発医薬品製剤の翻訳後修飾と異なる1又は複数の翻訳後修飾、例えば、限定しないが、グリコシル化、酸化、アミド分解、及び/又はトランケーションを含んでもよく、但しその差異が医薬品製剤の安全性及び/又は有効性に変化をもたらさないものとする。バイオシミラーは先発医薬品製剤と同一の又は異なるグリコシル化パターンを有し得る。特に、限定的ではないが、バイオシミラーは、先発医薬品製剤に関連する安全性についての懸念がその差異によって対処される又は対処されるように意図される場合、異なるグリコシル化パターンを有し得る。加えて、バイオシミラーは、例えばその強度、医薬品形態、製剤化、賦形剤及び/又は体裁の点で先発医薬品製剤から逸脱してもよく、但し医薬品製剤の安全性及び有効性が損なわれないものとする。バイオシミラーは、例えば薬物動態学的(PK)及び/又は薬力学的(PD)プロファイルの点で先発医薬品製剤と比較して差異を含み得るが、なおも認可を受ける又は認可に好適であると考えるのに十分に先発医薬品製剤に類似していると見なされる。ある種の状況では、バイオシミラーは先発医薬品製剤と比較して異なる結合特性を呈し、ここで、この異なる結合特性は、EMAなどの規制当局により後発バイオ製剤としての認可を妨げるものではないと見なされる。用語「バイオシミラー」はまた、他の国及び地域の規制機関によっても同義的に使用される。

[00260] 本明細書で使用する場合、用語「変異体」は、限定しないが、タンパク質、抗体又は融合タンパク質であって、参照タンパク質又は抗体のアミノ酸配列の範囲内の又はそれに隣接する特定の位置における1又は複数の置換、欠失及び/又は付加の点で参照タンパク質又は抗体のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含むタンパク質、抗体又は融合タンパク質を包含する。変異体は、参照タンパク質又は抗体のアミノ酸配列と比較して、そのアミノ酸配列に1又は複数の保存的置換を含み得る。保存的置換は、例えば、同様の荷電又は非荷電アミノ酸の置換を含み得る。変異体は、参照タンパク質又は抗体の抗原に特異的に結合する能力を保持している。用語「変異体」はまた、ペグ化抗体又はタンパク質も含む。

[00261] 「ペグ化」は、1又は複数のPEG基が抗体、抗体断片、又はタンパク質に結合するようになる条件下でポリエチレングリコール(PEG)、例えばPEGの反応性エステル又はアルデヒド誘導体などと典型的に反応する修飾された抗体、又はその断片、又はタンパク質を指す。ペグ化により、例えば、抗体又はタンパク質の生物学的(例えば血清)半減期が増加し得る。好ましくは、ペグ化は、反応性PEG分子(又は類似の反応性水溶性ポリマー)とのアシル化反応又はアルキル化反応で行われる。本明細書で使用する場合、用語「ポリエチレングリコール」は、モノ(C₁〜C₁₀)アルコキシ−若しくはアリールオキシ−ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール−マレイミドなど、他のタンパク質の誘導体化に用いられている形態のPEGのいずれかを包含することが意図される。ペグ化される抗体又はタンパク質は非グリコシル化抗体であってもよい。ペグ化方法は、例えば欧州特許第0154316号及び同第0401384号に記載されるとおり、当該技術分野において公知であり、本明細書に記載される抗体及びタンパク質に適用することができる。

[00262] 用語「約」及び「近似的に」は、ある値の統計的に意味のある範囲内であることを意味する。かかる範囲は、所与の値又は範囲のあるオーダー内、好ましくは50%以内、より好ましくは20%以内、より好ましくはなおも10%以内、及び更により好ましくは5%以内であり得る。用語「約」又は「近似的に」に包含される許容可能な変動は研究下の詳細な系に依存し、当業者は容易に理解することができる。更に、本明細書で使用する場合、用語「約」及び「近似的に」は、寸法、サイズ、配合、パラメータ、形状並びに他の数量及び特性が正確にそのものでなく、及び正確にそのものでなくてもよく、必要に応じて、公差、変換係数、丸め、測定誤差など、及び当業者に公知の他の要因を反映して、近似的であってもよく、及び/又はより大きくても若しくは小さくてもよいことを意味する。一般に、寸法、サイズ、配合、パラメータ、形状又は他の数量若しくは特性は、そのように明示されるか否かに関わらず、「約」又は「近似的」である。極めて異なるサイズ、形状及び寸法の実施形態は記載される構成を用い得ることが注記される。

[00263] 移行句「〜を含む(comprising)」、「〜から本質的になる(consisting essentially of)」、及び「〜からなる(consisting of)」は、出願当初及び補正後の形態の添付の特許請求の範囲において使用されるとき、存在する場合に、どのような記載されていない追加的クレーム要素又はステップが特許請求の範囲から除外されるかに関して特許請求の範囲を定義する。用語「〜を含む」は包含的又はオープンエンドであることが意図され、いかなる記載されていない追加の要素、方法、ステップ又は材料も除外しない。用語「〜からなる」は、クレームに指定されるもの以外のいかなる要素、ステップ又は材料も除外し、後者の材料の例では、指定される材料に通常付随する不純物も除外する。用語「〜から本質的になる」は、指定される要素、ステップ又は材料及び特許請求される発明の基本的な新規の特徴に実質的に影響しないものに範囲を限定する。本発明を具現化する本明細書に記載される全ての組成物、方法、及びキットが、代替的実施形態では、移行句「〜を含む」、「〜から本質的になる」、及び「〜からなる」のいずれかによってより具体的に定義され得る。

人工抗原提示細胞 [00264] ある実施形態において、本発明は、HLA−A/B/C、CD64、CD80、ICOS−L、及びCD58を発現し、且つ1又は複数の共刺激分子を発現するように修飾されている細胞を含む単離された人工抗原提示細胞(aAPC)を含む。ある実施形態において、本発明は、1又は複数の共刺激分子を発現するように修飾されているMOLM−14細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、1又は複数の共刺激分子を発現するように修飾されているMOLM−13細胞を含むaAPCを含む。

[00265] ある実施形態において、本発明は、HLA−A/B/C、CD64、CD80、ICOS−L、及びCD58を内因的に発現するMOLM−14細胞を含むaAPCを含み、ここで、細胞は、配列番号8に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾され、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はMOLM−14細胞の表面上に発現する。

[00266] ある実施形態において、本発明は、1又は複数のウイルスベクターが形質導入されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含み、ここで、1又は複数のウイルスベクターは、CD86をコードする核酸と、4−1BBLをコードする核酸とを含み、MOLM−14細胞はCD86と4−1BBLとを発現する。ある実施形態において、本発明は、1又は複数のウイルスベクターが形質導入されたMOLM−13細胞を含むaAPCを含み、ここで、1又は複数のウイルスベクターは、CD86をコードする核酸と、4−1BBLをコードする核酸とを含み、MOLM−13細胞はCD86と4−1BBLとを発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00267] ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列を含むCD86タンパク質と配列番号9に記載のアミノ酸配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はMOLM−14細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−13細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はMOLM−13細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00268] ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はMOLM−14細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はMOLM−14細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はMOLM−14細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はMOLM−14細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はMOLM−14細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はMOLM−14細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00269] ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−13細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はMOLM−13細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−13細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はMOLM−13細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00270] ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−13細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はMOLM−13細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−13細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はMOLM−13細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−13細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はMOLM−13細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−13細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はMOLM−13細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−13細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はMOLM−13細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−13細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はMOLM−13細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00271] ある実施形態において、本発明は、1又は複数のウイルスベクターが形質導入されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含み、ここで、1又は複数のウイルスベクターは、CD86をコードする核酸と、OX40Lをコードする核酸とを含み、MOLM−14細胞はCD86とOX40Lとを発現する。ある実施形態において、本発明は、1又は複数のウイルスベクターが形質導入されたMOLM−13細胞を含むaAPCを含み、ここで、1又は複数のウイルスベクターは、CD86をコードする核酸と、OX40Lをコードする核酸とを含み、MOLM−13細胞はCD86とOX40Lとを発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00272] ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列を含むCD86タンパク質と、配列番号10に記載のアミノ酸配列を含むOX40Lタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及びOX40Lタンパク質はMOLM−14細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含むCD86タンパク質と、配列番号10に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含むOX40Lタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−13細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及びOX40Lタンパク質はMOLM−13細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00273] ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号10に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含むOX40Lタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及びOX40Lタンパク質はMOLM−14細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号10に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含むOX40Lタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及びOX40Lタンパク質はMOLM−14細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号10に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含むOX40Lタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及びOX40Lタンパク質はMOLM−14細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号10に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含むOX40Lタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及びOX40Lタンパク質はMOLM−14細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号10に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含むOX40Lタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及びOX40Lタンパク質はMOLM−14細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号10に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含むOX40Lタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及びOX40Lタンパク質はMOLM−14細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00274] 前述の実施形態のいずれにおいても、MOLM−14又はMOLM−13細胞を含むaAPCがOX40Lと4−1BBLとの両方を発現するように修飾され得ることは理解されるであろう。

[00275] ヒトCD86、ヒト4−1BBL(CD137L)、及びヒトOX40L(CD134L)の配列を表3に提供する。

[00276] ある実施形態において、本発明は、配列番号13に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号13に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−13細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00277] ある実施形態において、本発明は、配列番号13に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号13に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号13に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号13に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号13に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号13に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00278] ある実施形態において、本発明は、配列番号13に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−13細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号13に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−13細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号13に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−13細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号13に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−13細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号13に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−13細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号13に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−13細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00279] ある実施形態において、本発明は、配列番号14に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号14に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−13細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00280] ある実施形態において、本発明は、配列番号14に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号14に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号14に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号14に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号14に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号14に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−14細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00281] ある実施形態において、本発明は、配列番号14に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−13細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号14に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−13細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号14に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−13細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号14に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−13細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号14に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−13細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号14に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたMOLM−13細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00282] ヒトCD86が結合するリガンド(CD28及びCTLA−4)、ヒト4−1BBLが結合するリガンド(4−1BB)、及びヒトOX40Lが結合するリガンド(OX40)の配列を表4に提供する。

[00283] ある実施形態において、本発明は、HLA−A/B/C、ICOS−L、及びCD58を発現し、且つ1又は複数の共刺激分子を発現するように修飾されている細胞を含む単離された人工抗原提示細胞(aAPC)を含み、ここで、aAPCはEM−3親細胞株に由来する。ある実施形態において、本発明は、1又は複数の共刺激分子を発現するように修飾されているEM−3細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、1又は複数の共刺激分子を発現するように修飾されているEM−2細胞を含むaAPCを含む。

[00284] ある実施形態において、本発明は、HLA−A/B/C、ICOS−L、及びCD58を発現するEM−3細胞を含むaAPCを含み、ここで、細胞は、配列番号8に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾され、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はEM−3細胞の表面上に発現する。

[00285] ある実施形態において、本発明は、1又は複数のウイルスベクターが形質導入されたEM−3細胞を含むaAPCを含み、ここで、1又は複数のウイルスベクターは、CD86をコードする核酸と、4−1BBLをコードする核酸とを含み、EM−3細胞はCD86と4−1BBLとを発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00286] ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたEM−3細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はEM−3細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00287] ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたEM−3細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はEM−3細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたEM−3細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はEM−3細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたEM−3細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はEM−3細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたEM−3細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はEM−3細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたEM−3細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はEM−3細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたEM−3細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はEM−3細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00288] ある実施形態において、本発明は、配列番号13に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたEM−3細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00289] ある実施形態において、本発明は、配列番号13に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたEM−3細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号13に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたEM−3細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号13に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたEM−3を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号13に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたEM−3細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号13に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたEM−3細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号13に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたEM−3細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00290] ある実施形態において、本発明は、更なる増殖シグナルを提供するOKT−3などのモノクローナル抗体のFcドメインに結合するため、本明細書に記載されるクローン7C12及び8B3など、単鎖断片可変(scFv)結合ドメインを発現するように修飾されたEM−3細胞を含むaAPCを含む。

[00291] ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたEM−2細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はEM−2細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00292] ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたEM−2細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はEM−2細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたEM−2細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はEM−2細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたEM−2細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はEM−2細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたEM−2細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はEM−2細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたEM−2細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はEM−2細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたEM−2細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はEM−2細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00293] ある実施形態において、本発明は、配列番号13に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたEM−2細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00294] ある実施形態において、本発明は、配列番号13に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたEM−2細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号13に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたEM−2細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号13に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたEM−2を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号13に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたEM−2細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号13に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたEM−2細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号13に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたEM−2細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00295] ある実施形態において、本発明は、更なる増殖シグナルを提供するOKT−3などのモノクローナル抗体のFcドメインに結合するため、本明細書に記載されるクローン7C12及び8B3など、単鎖断片可変(scFv)結合ドメインを発現するように修飾されたEM−2細胞を含むaAPCを含む。

[00296] ある実施形態において、本発明は、図96に図示すとおり修飾されたEM−3又はEM−2細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、図97に図示すとおり修飾されたEM−3又はEM−2細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、図98に図示すとおり修飾されたEM−3又はEM−2細胞を含むaAPCを含む。

[00297] ある実施形態において、本発明は、HLA−A/B/C、ICOS−L、及びCD58を発現するEM−3細胞を含むaAPCを含み、ここで、細胞は、配列番号8に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含むCD86タンパク質と、配列番号10に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含むOX40Lタンパク質とを発現するように修飾され、CD86タンパク質及びOX40Lタンパク質はEM−3細胞の表面上に発現する。

[00298] ある実施形態において、本発明は、1又は複数のウイルスベクターが形質導入されたEM−3細胞を含むaAPCを含み、ここで、1又は複数のウイルスベクターは、CD86をコードする核酸と、OX40Lをコードする核酸とを含み、EM−3細胞はCD86とOX40Lとを発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00299] ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列を含むCD86タンパク質と、配列番号10に記載のアミノ酸配列を含むOX40Lタンパク質とを発現するように修飾されたEM−3細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及びOX40Lタンパク質はEM−3細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00300] ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号10に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含むOX40Lタンパク質とを発現するように修飾されたEM−3細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及びOX40Lタンパク質はEM−3細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号10に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含むOX40Lタンパク質とを発現するように修飾されたEM−3細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及びOX40Lタンパク質はEM−3細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号10に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含むOX40Lタンパク質とを発現するように修飾されたEM−3細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及びOX40Lタンパク質はEM−3細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号10に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含むOX40Lタンパク質とを発現するように修飾されたEM−3細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及びOX40Lタンパク質はEM−3細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号10に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含むOX40Lタンパク質とを発現するように修飾されたEM−3細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及びOX40Lタンパク質はEM−3細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号10に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含むOX40Lタンパク質とを発現するように修飾されたEM−3細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及びOX40Lタンパク質はEM−3細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00301] ある実施形態において、本発明は、配列番号14に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたEM−3細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00302] ある実施形態において、本発明は、配列番号14に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたEM−3細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号14に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたEM−3細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号14に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたEM−3を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号14に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたEM−3細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号14に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたEM−3細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号14に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたEM−3細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00303] ある実施形態において、本発明は、更なる増殖シグナルを提供するOKT−3などのモノクローナル抗体のFcドメインに結合するため、本明細書に記載されるクローン7C12及び8B3など、単鎖断片可変(scFv)結合ドメインを発現するように修飾されたEM−3細胞を含むaAPCを含む。

[00304] ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列を含むCD86タンパク質と、配列番号10に記載のアミノ酸配列を含むOX40Lタンパク質とを発現するように修飾されたEM−2細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及びOX40Lタンパク質はEM−2細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00305] ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号10に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含むOX40Lタンパク質とを発現するように修飾されたEM−2細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及びOX40Lタンパク質はEM−2細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号10に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含むOX40Lタンパク質とを発現するように修飾されたEM−2細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及びOX40Lタンパク質はEM−2細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号10に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含むOX40Lタンパク質とを発現するように修飾されたEM−2細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及びOX40Lタンパク質はEM−2細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号10に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含むOX40Lタンパク質とを発現するように修飾されたEM−2細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及びOX40Lタンパク質はEM−2細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号10に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含むOX40Lタンパク質とを発現するように修飾されたEM−2細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及びOX40Lタンパク質はEM−2細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号10に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含むOX40Lタンパク質とを発現するように修飾されたEM−2細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及びOX40Lタンパク質はEM−2細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00306] ある実施形態において、本発明は、配列番号14に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたEM−2細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00307] ある実施形態において、本発明は、配列番号14に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたEM−2細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号14に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたEM−2細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号14に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたEM−2を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号14に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたEM−2細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号14に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたEM−2細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号14に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号11又は配列番号12に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたEM−2細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00308] ある実施形態において、本発明は、更なる増殖シグナルを提供するOKT−3などのモノクローナル抗体のFcドメインに結合するため、本明細書に記載されるクローン7C12及び8B3など、単鎖断片可変(scFv)結合ドメインを発現するように修飾されたEM−2細胞を含むaAPCを含む。

[00309] ある実施形態において、本発明は、図96に図示すとおり修飾されたEM−3又はEM−2細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、図97に図示すとおり修飾されたEM−3又はEM−2細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、図98に図示すとおり修飾されたEM−3又はEM−2細胞を含むaAPCを含む。

[00310] 前述の実施形態のいずれにおいても、EM−3又はEM−2細胞を含むaAPCがOX40Lと4−1BBLとの両方を発現するように修飾されてもよいことが理解される。

[00311] ある実施形態において、本発明は、CD58を発現し、且つ1又は複数の共刺激分子を発現するように修飾されている細胞を含む単離された人工抗原提示細胞(aAPC)を含み、ここで、aAPCはK562系列親細胞株に由来する。ある実施形態において、本発明は、1又は複数の共刺激分子を発現するように修飾されているK562系列細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、K562系列親細胞株は受託番号ATCC CCL−243で寄託されており、また、欧州認証細胞培養株保存機関にも寄託されている(ECACCECACC 89121407)。

[00312] ある実施形態において、本発明は、CD58を発現するK562系列細胞を含むaAPCを含み、ここで、細胞は、配列番号8に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾され、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はK562系列細胞の表面上に発現する。

[00313] ある実施形態において、本発明は、1又は複数のウイルスベクターが形質導入されたK562系列細胞を含むaAPCを含み、ここで、1又は複数のウイルスベクターは、CD86をコードする核酸と、4−1BBLをコードする核酸とを含み、K562系列細胞はCD86と4−1BBLとを発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00314] ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたK562系列細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はK562系列細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00315] ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたK562系列細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はK562系列細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたK562系列細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はK562系列細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたK562系列細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はK562系列細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたK562系列細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はK562系列細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたK562系列細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はK562系列細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号8に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含むCD86タンパク質と、配列番号9に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含む4−1BBLタンパク質とを発現するように修飾されたK562系列細胞を含むaAPCを含み、ここで、CD86タンパク質及び4−1BBLタンパク質はK562系列細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00316] ある実施形態において、本発明は、配列番号11に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号12又は配列番号13に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたK562系列細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00317] ある実施形態において、本発明は、配列番号11に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号12又は配列番号13に記載のアミノ酸配列と99%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたK562系列細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号11に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号12又は配列番号13に記載のアミノ酸配列と98%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたK562系列細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号11に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号12又は配列番号13に記載のアミノ酸配列と97%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたK562系列を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号11に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号12又は配列番号13に記載のアミノ酸配列と96%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたK562系列細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号11に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号12又は配列番号13に記載のアミノ酸配列と95%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたK562系列細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号11に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含む第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質と、配列番号12又は配列番号13に記載のアミノ酸配列と90%より高い同一性を有する配列を含む第4のタンパク質に結合する第3のタンパク質とを発現するように修飾されたK562系列細胞を含むaAPCを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のaAPCの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。

[00318] ある実施形態において、本発明は、更なる増殖シグナルを提供するOKT−3などのモノクローナル抗体のFcドメインに結合するため、本明細書に記載されるクローン7C12及び8B3など、単鎖断片可変(scFv)結合ドメインを発現するように修飾されたK562系列細胞を含むaAPCを含む。

人工抗原提示細胞の調製方法 [00319] ある実施形態において、aAPCを調製する方法は、CD86及び4−1BBLの産生用遺伝子の安定取込みステップを含む。ある実施形態において、aAPCを調製する方法は、レトロウイルス形質導入ステップを含む。ある実施形態において、aAPCを調製する方法は、レンチウイルス形質導入ステップを含む。レンチウイルス形質導入システムは当該技術分野において公知であり、例えば、Levine, et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. 2006,103, 17372-77;Zufferey, et al., Nat. Biotechnol. 1997,15, 871-75;Dull, et al., J. Virology 1998, 72, 8463-71、及び米国特許第6,627,442号(これらの各々の開示は参照により本明細書に援用される)に記載されている。ある実施形態において、aAPCを調製する方法は、ガンマレトロウイルス形質導入ステップを含む。ガンマレトロウイルス形質導入システムは当該技術分野において公知であり、例えば、Cepko and Pear, Cur. Prot. Mol. Biol. 1996, 9.9.1-9.9.16(この開示は参照により本明細書に援用される)に記載されている。ある実施形態において、aAPCを調製する方法は、トランスポゾン媒介性遺伝子導入ステップを含む。トランスポゾン媒介性遺伝子導入システムは当該技術分野において公知であり、トランスポザーゼがDNA発現ベクターとして提供されるか、又は発現可能RNA若しくはタンパク質として提供されて、トランスジェニック細胞においてトランスポザーゼの長期発現が起こらないシステム、例えば、mRNA(例えば、cap及びポリAテールを含むmRNA)として提供されるトランスポザーゼが含まれる。好適なトランスポゾン媒介性遺伝子導入システム、例えば、SB10、SB11、及びSB100xなどのサケ科型Tel様トランスポザーゼ(SB又はスリーピング・ビューティー(Sleeping Beauty)トランスポザーゼ)、及び酵素活性が増加した改変酵素について、例えば、Hackett, et al.,Mol. Therapy 2010,18, 674-83及び米国特許第6,489,458号(これらの各々の開示は参照により本明細書に援用される)に記載されている。

[00320] ある実施形態において、aAPCを調製する方法は、CD86及び4−1BBLの一過性産生用遺伝子の安定取込みステップを含む。ある実施形態において、aAPCを調製する方法は、電気穿孔ステップを含む。電気穿孔方法は当該技術分野において公知であり、例えば、Tsong, Biophys. J. 1991, 60, 297-306、及び米国特許出願公開第2014/0227237 A1号(これらの各々の開示は参照により本明細書に援用される)に記載されている。ある実施形態において、aAPCを調製する方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションステップを含む。リン酸カルシウムトランスフェクション方法(リン酸カルシウムDNA沈殿、細胞表面コーティング、及びエンドサイトーシス)は当該技術分野において公知であり、Graham and van der Eb, Virology 1973, 52, 456-467;Wigler, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1979, 76, 1373-1376;及びChen and Okayarea, Mol. Cell. Biol. 1987, 7, 2745-2752;並びに米国特許第5,593,875号(これらの各々の開示は参照により本明細書に援用される)に記載されている。ある実施形態において、aAPCを調製する方法は、リポソームトランスフェクションステップを含む。リポソームトランスフェクション方法、例えば、ろ水中のカチオン性脂質N−[1−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル]−n,n,n−トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)とジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(phophotidylethanolamine)(DOPE)との1:1(w/w)リポソーム配合物を用いる方法などは当該技術分野において公知であり、Rose, et al., Biotechniques 1991,10, 520-525及びFeigner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 7413-7417並びに米国特許第5,279,833号;同第5,908,635号;同第6,056,938号;同第6,110,490号;同第6,534,484号;及び同第7,687,070号(これらの各々の開示は参照により本明細書に援用される)に記載されている。ある実施形態において、aAPCを調製する方法は、米国特許第5,766,902号;同第6,025,337号;同第6,410,517号;同第6,475,994号;及び同第7,189,705号(これらの各々の開示は参照により本明細書に援用される)に記載される方法を用いたトランスフェクションステップを含む。

[00321] ある実施形態において、aAPCの形質導入は、初めにGatewayクローニング方法(ThermoFisher, Inc.から市販されている)を用いてレンチウイルス形質導入用のベクターを調製し、続いてこのベクター及び本明細書の他の部分にもまた記載されるとおりの1又は複数の関連するヘルパープラスミドを使用してレンチウイルス形質導入することにより行われる。Gatewayクローニング方法では、ある遺伝子を選択し(CD86など)、次にプライマーを提供し、attBタグ付加プライマー対の助けによりPCR技術を用いて増幅する。次にBP反応を用いてこのPCR断片をattP部位を含むドナーベクター(pDONR221などのpDONR)と組み合わせると、エントリークローンが提供される。attB部位とattP部位との間の組み込み反応によってPCR断片がドナーベクターと組み合わされる。得られるエントリークローンは、attL部位に隣接した目的の遺伝子を含む。次にLR反応を用いてエントリークローンをデスティネーションベクターと組み合わせると、発現ベクターが作製される。LR反応では、attL及びattR部位並びにクロナーゼ(clonase)酵素を使用した組換え反応を用いてエントリークローンがデスティネーションベクター(pLV430Gなど)に連結される。attL部位はエントリークローンに既に存在し、一方、デスティネーションベクターはattR部位を含む。LR反応を行うと、同時反応で目的の配列が1又は複数のデスティネーションベクターに移る。

[00322] 一部の実施形態において、本明細書に記載されるaAPCは血清ベースの培地下及び/又は無血清培地下で成長させ、維持してもよい。例示的方法によれば、aAPCは24ウェルプレートにおいてウェル当たり約1×10⁶細胞の細胞密度で3〜5日間培養してもよい。次に細胞を遠心によって単離及び/又は洗浄し、培地中に再懸濁するか、又は適切な凍結保存培地(例えば、CryoStor 10(BioLife Solutions))に凍結保存して−80℃のフリーザーで保管してもよい。

[00323] 一部の実施形態において、本明細書に記載されるaAPCは血清ベースの培地の存在下で成長させてもよい。一部の実施形態において、本明細書に記載されるaAPCは、ヒト血清(hSerum)含有培地(例えば、10%hSerumのcDMEM)を含む血清ベースの培地の存在下で成長させてもよい。一部の実施形態において、血清ベースの培地の存在下で成長させるaAPCは、aMOLM−13細胞、aMOLM−14細胞、及びaEM3細胞からなる群から選択され得る。

[00324] 一部の実施形態において、本明細書に記載されるaAPCは無血清培地の存在下で成長させてもよい。一部の実施形態において、無血清培地は、CTS Optmizer(ThermoFisher)、Xvivo-20(Lonza)、Prime T Cell CDM(Irvine)、XFSM(MesenCult)などからなる群から選択され得る。一部の実施形態において、無血清培地の存在下で成長させるaAPCは、aMOLM−13細胞、aMOLM−14細胞、及びaEM3細胞からなる群から選択され得る。

腫瘍浸潤リンパ球及びT細胞の拡大培養方法 [00325] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を拡大培養する方法を含み、この方法は、少なくとも1つのTILを含むTIL集団を本明細書に記載されるaAPCと接触させることを含み、ここで、前記aAPCは、TILの細胞表面上に発現する共刺激分子に特異的に結合する少なくとも1つの共刺激リガンドを含み、前記共刺激分子が前記共刺激リガンドに結合するとTILの増殖が誘導され、それによりTILが特異的に拡大する。

[00326] ある実施形態において、本発明は、本開示のaAPCのいずれかを使用して腫瘍浸潤リンパ球(TIL)集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、Jin, et al., J. Immunotherapy 2012, 35, 283-292(この開示は参照により本明細書に援用される)に記載されるとおりのステップを含む。例えば、腫瘍を酵素培地に置き、約1分間機械的に解離し得る。次に混合物を37℃5%CO₂で30分間インキュベートし、次に再び約1分間機械的に破壊し得る。37℃5%CO₂で30分間インキュベートした後、腫瘍を3度目に約1分間機械的に破壊し得る。3度目の機械的破壊後に大型の組織片が存在する場合、1回又は2回の更なる機械的解離が、37℃5%CO₂での更に30分間のインキュベーションを伴い又は伴わず試料に適用されてもよい。最終回のインキュベーションの終了時、細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有する場合、Ficollを使用した密度勾配分離を実施して、そうした細胞を除去し得る。TIL培養は24ウェルプレート(Costar24ウェル細胞培養クラスター、平底;Corning Incorporated、Corning, NY)で開始したが、各ウェルには、IL−2(6000IU/mL;Chiron Corp.、Emeryville, CA)を含む2mLの完全培地(CM)中1×10⁶個の腫瘍消化物細胞又は約1〜8mm³のサイズの1個の腫瘍断片を播種し得る。CMは、10%ヒトAB血清、25mMヘペス、及び10mg/mLゲンタマイシンを補足したGlutaMAX含有RPMI 1640からなる。培養は、10cm²ガス透過性シリコン底を有する40mL容量のガス透過性フラスコ(G-Rex 10;Wilson Wolf Manufacturing、New Brightonで開始してもよく、各フラスコには、10〜40mLのIL−2含有CM中10〜40×10⁶個の腫瘍消化物生細胞又は5〜30個の腫瘍断片をロードし得る。G-Rex 10及び24ウェルプレートを加湿インキュベーターにおいて37℃5%CO₂でインキュベートしてもよく、培養開始から5日後、培地の半分を取り出して新鮮なCM及びIL−2を補充してもよく、5日目以降、2〜3日毎に培地の半分を交換し得る。TILの迅速拡大培養プロトコル(REP)は、本開示のaAPCを使用して、本明細書の他の部分に記載されるとおり、T−175フラスコ及びガス透過性バッグ又はガス透過性G-Rexフラスコを使用して実施し得る。T−175フラスコにおけるREPについては、各フラスコ内の150mLの培地中に1×10⁶個のTILを懸濁し得る。3000IU/mLのIL−2及び30ng/mLの抗CD3抗体(OKT−3)を補足したCM及びAIM-V培地の1対1混合物(50/50培地)中において、TILを本開示のaAPCと本明細書に記載される比で培養し得る。T−175フラスコは37℃5%CO₂でインキュベートし得る。5日目に、3000IU/mLのIL−2を含有する50/50培地を使用して培地の半分を交換し得る。7日目、2つのT−175フラスコからの細胞を3Lバッグに合わせてもよく、その300mLのTIL懸濁液に5%ヒトAB血清及び3000IU/mLのIL−2を含有する300mLのAIM-Vを加え得る。毎日又は2日毎に各バッグの細胞数をカウントしてもよく、新鮮培地を加えて細胞数を0.5〜2.0×10⁶細胞/mLに保ち得る。100cm²ガス透過性シリコン底を有する500mL容量フラスコ(例えば、G-Rex 100、Wilson Wolf Manufacturing、本明細書の他の部分に記載されるとおり)におけるREPについては、3000IU/mLのIL−2及び30ng/mLの抗CD3抗体(OKT−3)を補足した400mLの50/50培地中において、5×10⁶又は10×10⁶個のTILをaAPCと本明細書に記載される比(例えば1:100)で培養し得る。G-Rex100フラスコは37℃5%CO₂でインキュベートし得る。5日目、250mLの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、1500rpm(491g)で10分間遠心し得る。得られたTILペレットは、3000IU/mLのIL−2を含有する150mLの新鮮50/50培地に再懸濁し、G-Rex 100フラスコに戻し加え得る。G-Rex 100フラスコ内でTILを連続的に拡大培養する場合、7日目に各フラスコ中に存在する300mLの培地に各G-Rex 100のTILを懸濁してもよく、この細胞懸濁液は、3つのG-Rex100フラスコの播種に使用し得る3つの100mLアリコートに分割し得る。次に5%ヒトAB血清及び3000IU/mLのIL−2を含有する約150mLのAIM-Vを各フラスコに加え得る。次にG-Rex100フラスコを37℃5%CO₂でインキュベートしてもよく、4日後、各G-Rex100フラスコに3000IU/mLのIL−2を含有する150mLのAIM-Vを加え得る。この後、培養14日目に細胞を回収することによりREPを完了し得る。

[00327] 本明細書に記載されるとおり、TILは有利には無血清培地の存在下で拡大培養し得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるTIL拡大培養方法は、血清ベースの培地(例えば、完全培地又はCM1)よりむしろ、無血清培地の使用を含み得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるTIL拡大培養方法は、血清ベースの培地よりむしろ、無血清培地を使用し得る。一部の実施形態において、無血清培地は、CTS Optmizer(ThermoFisher)、Xvivo-20(Lonza)、Prime T Cell CDM(Irvine)などからなる群から選択され得る。

[00328] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、 (a)骨髄系細胞を1又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞(aAPC)集団を入手するステップであって、1又は複数のウイルスベクターが、CD86をコードする核酸と、4−1BBLをコードする核酸とを含み、骨髄系細胞がCD86タンパク質と4−1BBLタンパク質とを発現するステップ、及び (b)細胞培養培地中でTIL集団をaAPC集団と接触させるステップ を含む。

[00329] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、 (a)骨髄系細胞を1又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞(aAPC)集団を入手するステップであって、1又は複数のウイルスベクターが、CD86をコードする核酸と、4−1BBLをコードする核酸とを含み、骨髄系細胞がCD86タンパク質と4−1BBLタンパク質とを発現するステップ、及び (b)細胞培養培地中でTIL集団をaAPC集団と接触させるステップ を含み、ここで、細胞培養培地は約3000IU/mLの初期濃度のIL−2と、約30ng/mLの初期濃度のOKT−3抗体とを更に含む。

[00330] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、 (a)骨髄系細胞を1又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞(aAPC)集団を入手するステップであって、1又は複数のウイルスベクターが、CD86をコードする核酸と、4−1BBLをコードする核酸とを含み、骨髄系細胞がCD86タンパク質と4−1BBLタンパク質とを発現するステップ、及び (b)細胞培養培地中でTIL集団をaAPC集団と接触させるステップ を含み、ここで、APC集団は、細胞培養培地においてTIL集団を7日の期間で少なくとも50倍に拡大する。

[00331] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、 (a)骨髄系細胞を1又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞(aAPC)集団を入手するステップであって、1又は複数のウイルスベクターが、CD86をコードする核酸と、4−1BBLをコードする核酸とを含み、骨髄系細胞がCD86タンパク質と4−1BBLタンパク質とを発現するステップ、及び (b)細胞培養培地中でTIL集団をaAPC集団と接触させるステップ を含み、ここで、骨髄系細胞はHLA−A/B/C、ICOS−L、及びCD58を内因的に発現する。

[00332] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、 (a)骨髄系細胞を1又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞(aAPC)集団を入手するステップであって、1又は複数のウイルスベクターが、CD86をコードする核酸と、4−1BBLをコードする核酸とを含み、骨髄系細胞がCD86タンパク質と4−1BBLタンパク質とを発現するステップ、及び (b)細胞培養培地中でTIL集団をaAPC集団と接触させるステップ を含み、ここで、骨髄系細胞はMOLM−14細胞である。

[00333] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、 (a)骨髄系細胞を1又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞(aAPC)集団を入手するステップであって、1又は複数のウイルスベクターが、CD86をコードする核酸と、4−1BBLをコードする核酸とを含み、骨髄系細胞がCD86タンパク質と4−1BBLタンパク質とを発現するステップ、及び (b)細胞培養培地中でTIL集団をaAPC集団と接触させるステップ を含み、ここで、骨髄系細胞はMOLM−13細胞である。

[00334] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、 (c)骨髄系細胞を1又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞(aAPC)集団を入手するステップであって、1又は複数のウイルスベクターが、CD86をコードする核酸と、4−1BBLをコードする核酸とを含み、骨髄系細胞がCD86タンパク質と4−1BBLタンパク質とを発現するステップ、及び (d)細胞培養培地中でTIL集団をaAPC集団と接触させるステップ を含み、ここで、骨髄系細胞はEM−3細胞である。

[00335] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、 (a)骨髄系細胞を1又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞(aAPC)集団を入手するステップであって、1又は複数のウイルスベクターが、CD86をコードする核酸と、4−1BBLをコードする核酸とを含み、骨髄系細胞がCD86タンパク質と4−1BBLタンパク質とを発現するステップ、及び (b)細胞培養培地中でTIL集団をaAPC集団と接触させるステップ を含み、ここで、CD86タンパク質は配列番号8に記載のアミノ酸配列、又はその保存的アミノ酸置換を含み、4−1BBLタンパク質は配列番号9に記載のアミノ酸配列、又はその保存的アミノ酸置換を含む。

[00336] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、 (a)骨髄系細胞を1又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞(aAPC)集団を入手するステップであって、1又は複数のウイルスベクターが、CD86をコードする核酸と、4−1BBLをコードする核酸とを含み、骨髄系細胞がCD86タンパク質と4−1BBLタンパク質とを発現するステップ、及び (b)細胞培養培地中でTIL集団をaAPC集団と接触させるステップ を含み、ここで、CD86をコードする核酸は配列番号19に記載の核酸配列を含み、4−1BBLをコードする核酸は配列番号16に記載の核酸配列を含む。

[00337] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、 (a)骨髄系細胞を1又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞(aAPC)集団を入手するステップであって、1又は複数のウイルスベクターが、CD86をコードする核酸と、4−1BBLをコードする核酸とを含み、骨髄系細胞がCD86タンパク質と4−1BBLタンパク質とを発現するステップ、及び (b)細胞培養培地中でTIL集団をaAPC集団と接触させるステップを含み、ここで、拡大培養はガス透過性容器を使用して行われる。

[00338] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、 (a)骨髄系細胞を1又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞(aAPC)集団を入手するステップであって、1又は複数のウイルスベクターが、CD86をコードする核酸と、4−1BBLをコードする核酸とを含み、骨髄系細胞がCD86タンパク質と4−1BBLタンパク質とを発現するステップ、及び (b)細胞培養培地中でTIL集団をaAPC集団と接触させるステップ を含み、ここで、TIL集団とaAPC集団との比は1:200〜1:400である。

[00339] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、 (a)骨髄系細胞を1又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞(aAPC)集団を入手するステップであって、1又は複数のウイルスベクターが、CD86をコードする核酸と、4−1BBLをコードする核酸とを含み、骨髄系細胞がCD86タンパク質と4−1BBLタンパク質とを発現するステップ、及び (b)細胞培養培地中でTIL集団をaAPC集団と接触させるステップ を含み、ここで、TIL集団とaAPC集団との比は約1:300である。

[00340] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を拡大培養する方法を提供し、この方法は、TIL集団を含むTIL集団を骨髄系人工抗原提示細胞(aAPC)と接触させることを含み、ここで、骨髄系aAPCは、TIL上の少なくとも2つの共刺激分子に特異的に結合する少なくとも2つの共刺激リガンドを含み、共刺激分子が共刺激リガンドに結合するとTILの増殖が誘導され、それによりTILが特異的に拡大し、及び少なくとも2つの共刺激リガンドはCD86及び4−1BBLを含む。

[00341] 前述の実施形態のいずれにおいても、aAPCは4−1BBLに加えてOX40Lを更に含んでもよく、又は4−1BBLの代わりにOX40Lを含んでもよい。

[00342] ある実施形態において、拡大培養する方法又は癌を治療する方法は、患者腫瘍試料からTILを入手するステップを含む。患者腫瘍試料は当該技術分野において公知の方法を用いて得てもよい。例えば、TILは、酵素的腫瘍消化物及び鋭的剥離からの腫瘍断片(約1〜約8mm³のサイズ)から培養されてもよい。かかる腫瘍消化物は、酵素培地(例えば、ロズウェルパーク記念研究所(Roswell Park Memorial Institute:RPMI)1640緩衝液、2mMグルタミン酸塩、10mcg/mLゲンタマイシン、30単位/mLのDNアーゼ及び1.0mg/mLのコラゲナーゼ)中でのインキュベーションと、それに続く機械的解離(例えば、組織解離装置を用いる)によって作製されてもよい。腫瘍消化物は、腫瘍を酵素培地中に置き、腫瘍を約1分間機械的に解離した後、続いて37℃5%CO₂で30分間インキュベートし、続いてごく小さい組織片しか存在しなくなるまで前述の条件下で機械的解離及びインキュベーションのサイクルを繰り返すことにより作製されてもよい。この処理の終了時、細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有する場合、FICOLL分枝状親水性多糖を使用した密度勾配分離を実施して、それらの細胞を除去し得る。米国特許出願公開第2012/0244133 A1号(この開示は参照により本明細書に援用される)に記載されるものなど、当該技術分野において公知の代替的な方法を用いてもよい。前述の方法のいずれも、TILの拡大培養方法又は癌の治療方法に関して本明細書に記載される任意の実施形態において用いることができる。

[00343] ある実施形態において、REPは、任意の好適な方法によって本開示のaAPCを使用してガス透過性容器内で実施することができる。例えば、TILは、インターロイキン−2(IL−2)又はインターロイキン−15(IL−15)の存在下で非特異的T細胞受容体刺激を用いて迅速に拡大培養することができる。非特異的T細胞受容体刺激としては、例えば、約30ng/mLの抗CD3抗体、例えば、モノクローナル抗CD3抗体であるOKT−3(Ortho-McNeil、Raritan, NJ, USA又はMiltenyi Biotech、Auburn, CA, USAから市販されている)又はUHCT−1(BioLegend、San Diego, CA, USAから市販されている)を挙げることができる。TILは、任意選択で300IU/mL IL−2又はIL−15などのT細胞成長因子の存在下で、ヒト白血球抗原A2(HLA−A2)結合ペプチド、例えば、0.3μM MART−1:26−35(27L)又はgp100:209−217(210M)など、任意選択でベクターから発現させることのできる、1つ又は複数のエピトープなど、その抗原性部分を含めた癌の1又は複数の抗原によってインビトロでTILを更に刺激することにより、迅速に拡大培養することができる。他の好適な抗原としては、例えば、NY−ESO−1、TRP−1、TRP−2、チロシナーゼ癌抗原、MAGE−A3、SSX−2、及びVEGFR2、又はその抗原性部分を挙げることができる。TILはまた、HLA−A2発現抗原提示細胞にパルスした癌の同じ1つ又は複数の抗原による再刺激によっても迅速に拡大培養し得る。或いは、TILは、例えば照射自己リンパ球によるか、又は照射HLA−A2+同種異系リンパ球及びIL−2によって更に再刺激することができる。

[00344] ある実施形態において、TILの拡大培養方法は、約5000mL〜約25000mLの細胞培養培地、約5000mL〜約10000mLの細胞培養培地、又は約5800mL〜約8700mLの細胞培養培地を使用することを含み得る。ある実施形態において、TILの拡大培養方法は、約1000mL〜約2000mLの細胞培地、約2000mL〜約3000mLの細胞培養培地、約3000mL〜約4000mLの細胞培養培地、約4000mL〜約5000mLの細胞培養培地、約5000mL〜約6000mLの細胞培養培地、約6000mL〜約7000mLの細胞培養培地、約7000mL〜約8000mLの細胞培養培地、約8000mL〜約9000mLの細胞培養培地、約9000mL〜約10000mLの細胞培養培地、約10000mL〜約15000mLの細胞培養培地、約15000mL〜約20000mLの細胞培養培地、又は約20000mL〜約25000mLの細胞培養培地を使用することを含み得る。ある実施形態において、TIL数の拡大には1種類以下の細胞培養培地が使用される。任意の好適な細胞培養培地、例えば、AIM-V細胞培地(L−グルタミン、50μM硫酸ストレプトマイシン、及び10μM硫酸ゲンタマイシン)細胞培養培地(Invitrogen、Carlsbad, CA, USA)を使用し得る。この点に関して、本発明の方法では有利には、TIL数の拡大に必要な培地の量及び培地の種類の数が減少する。ある実施形態において、TIL数の拡大は、2日又は3日おき以下の頻度で細胞をフィードすることを含み得る。ガス透過性容器内で細胞の数を拡大すると、細胞の拡大培養に必要なフィーディング頻度が減少することにより細胞の数の拡大に必要な手順が簡便になる。

[00345] ある実施形態において、迅速拡大培養はガス透過性容器を使用して行われる。かかる実施形態は、細胞集団を約5×10⁵細胞/cm²から10×10⁶〜30×10⁶細胞/cm²へと拡大培養することを可能にする。ある実施形態において、この拡大培養はフィーディングなしに行われる。ある実施形態において、この拡大培養は、培地がガス透過性フラスコ内に約10cmの高さで存在する限りフィーディングなしに行われる。ある実施形態において、これにはフィーディングはないが、1又は複数のサイトカインの添加はある。ある実施形態において、サイトカインは、サイトカインを培地と混合する必要は一切ななしにボーラスとして添加することができる。かかる容器、装置、及び方法は当該技術分野において公知で、TILの拡大培養に用いられており、米国特許出願公開第2014/0377739 A1号、国際公開第2014/210036 A1号、米国特許出願公開第2013/0115617 A1号、国際公開第2013/188427 A1号、米国特許出願公開第2011/0136228 A1号、米国特許第8,809,050号、国際公開第2011/072088 A2号、米国特許出願公開第2016/0208216 A1号、米国特許出願公開第2012/0244133 A1号、国際公開第2012/129201 A1号、米国特許出願公開第2013/0102075 A1号、米国特許第8,956,860号、国際公開第2013/173835 A1号、及び米国特許出願公開第2015/0175966 A1号(これらの開示は参照により本明細書に援用される)に記載されるものが含まれる。かかるプロセスはまた、Jin, et al., J. Immunotherapy 2012, 35, 283-292(この開示は参照により本明細書に援用される)にも記載されている。

[00346] ある実施形態において、ガス透過性容器はG-Rex 10フラスコ(Wilson Wolf Manufacturing Corporation、New Brighton, MN, USA)である。ある実施形態において、ガス透過性容器は10cm²のガス透過性培養表面を含む。ある実施形態において、ガス透過性容器は40mLの細胞培養培地容量を含む。ある実施形態において、ガス透過性容器は2回の培地交換後に1〜3億個のTILを提供する。

[00347] ある実施形態において、ガス透過性容器はG-Rex 100フラスコ(Wilson Wolf Manufacturing Corporation、New Brighton, MN, USA)である。ある実施形態において、ガス透過性容器は100cm²のガス透過性培養表面を含む。ある実施形態において、ガス透過性容器は450mLの細胞培養培地容量を含む。ある実施形態において、ガス透過性容器は2回の培地交換後に10〜30億個のTILを提供する。

[00348] ある実施形態において、ガス透過性容器はG-Rex 100Mフラスコ(Wilson Wolf Manufacturing Corporation、New Brighton, MN, USA)である。ある実施形態において、ガス透過性容器は100cm²のガス透過性培養表面を含む。ある実施形態において、ガス透過性容器は1000mLの細胞培養培地容量を含む。ある実施形態において、ガス透過性容器は培地交換なしに10〜30億個のTILを提供する。

[00349] ある実施形態において、ガス透過性容器はG-Rex 100Lフラスコ(Wilson Wolf Manufacturing Corporation、New Brighton, MN, USA)である。ある実施形態において、ガス透過性容器は100cm²のガス透過性培養表面を含む。ある実施形態において、ガス透過性容器は2000mLの細胞培養培地容量を含む。ある実施形態において、ガス透過性容器は培地交換なしに10〜30億個のTILを提供する。

[00350] ある実施形態において、ガス透過性容器はG-Rex 24ウェルプレート(Wilson Wolf Manufacturing Corporation、New Brighton, MN, USA)である。ある実施形態において、ガス透過性容器はウェルを備えたプレートを含み、ここで、各ウェルは2cm²のガス透過性培養表面を含む。ある実施形態において、ガス透過性容器はウェルを備えたプレートを含み、ここで、各ウェルは8mLの細胞培養培地容量を含む。ある実施形態において、ガス透過性容器は2回の培地交換後にウェル当たり2000〜6000万個の細胞を提供する。

[00351] ある実施形態において、ガス透過性容器はG-Rex 6ウェルプレート(Wilson Wolf Manufacturing Corporation、New Brighton, MN, USA)である。ある実施形態において、ガス透過性容器はウェルを備えたプレートを含み、ここで、各ウェルは10cm²のガス透過性培養表面を含む。ある実施形態において、ガス透過性容器はウェルを備えたプレートを含み、ここで、各ウェルは40mLの細胞培養培地容量を含む。ある実施形態において、ガス透過性容器は2回の培地交換後にウェル当たり1〜3億個の細胞を提供する。

[00352] ある実施形態において、第1及び/又は第2のガス透過性容器内の細胞培地はろ過されていない。ろ過されていない細胞培地を使用すると、細胞の数の拡大に必要な手順が簡便になり得る。ある実施形態において、第1及び/又は第2のガス透過性容器内の細胞培地はβ−メルカプトエタノール(BME)を含まない。

[00353] ある実施形態において、哺乳類から腫瘍組織試料を得ること;細胞培地が中に入った第1のガス透過性容器内で腫瘍組織試料を培養すること;腫瘍組織試料からTILを得ること;aAPCを使用して細胞培地が中に入った第2のガス透過性容器内でTIL数を約14〜約42日間、例えば約28日間拡大することを含む本方法の所要期間。

[00354] ある実施形態において、迅速拡大培養には約1×10⁹〜約1×10¹¹個のaAPCが使用される。ある実施形態において、迅速拡大培養には約1×10⁹個のaAPCが使用される。ある実施形態において、迅速拡大培養には約1×10¹⁰個のaAPCが使用される。ある実施形態において、迅速拡大培養には約1×10¹¹個のaAPCが使用される。

[00355] ある実施形態において、TIL対aAPC比(TIL:aAPC)は、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100、1:105、1:110、1:115、1:120、1:125、1:130、1:135、1:140、1:145、1:150、1:155、1:160、1:165、1:170、1:175、1:180、1:185、1:190、1:195、1:200、1:225、1:250、1:275、1:300、1:350、1:400、1:450、及び1:500からなる群から選択される。好ましい実施形態において、TIL対aAPC比(TIL:aAPC)は約1:90である。好ましい実施形態において、TIL対aAPC比(TIL:aAPC)は約1:95である。好ましい実施形態において、TIL対aAPC比(TIL:aAPC)は約1:100である。好ましい実施形態において、TIL対aAPC比(TIL:aAPC)は約1:105である。好ましい実施形態において、TIL対aAPC比(TIL:aAPC)は約1:110である。

[00356] ある実施形態において、迅速拡大培養におけるTIL対aAPC比は、約1:25、約1:50、約1:100、約1:125、約1:150、約1:175、約1:200、約1:225、約1:250、約1:275、約1:300、約1:325、約1:350、約1:375、約1:400、又は約1:500である。ある実施形態において、迅速拡大培養におけるTIL対aAPC比は1:50〜1:300である。ある実施形態において、迅速拡大培養におけるTIL対aAPC比は1:100〜1:200である。

[00357] ある実施形態において、細胞培養培地はIL−2を更に含む。好ましい実施形態において、細胞培養培地は約3000IU/mLのIL−2を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、約1000IU/mL、約1500IU/mL、約2000IU/mL、約2500IU/mL、約3000IU/mL、約3500IU/mL、約4000IU/mL、約4500IU/mL、約5000IU/mL、約5500IU/mL、約6000IU/mL、約6500IU/mL、約7000IU/mL、約7500IU/mL、又は約8000IU/mLのIL−2を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、1000〜2000IU/mL、2000〜3000IU/mL、3000〜4000IU/mL、4000〜5000IU/mL、5000〜6000IU/mL、6000〜7000IU/mL、7000〜8000IU/mL、又は8000IU/mLの間のIL−2を含む。

[00358] ある実施形態において、細胞培養培地はOKT−3抗体を含む。好ましい実施形態において、細胞培養培地は約30ng/mLのOKT−3抗体を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、約0.1ng/mL、約0.5ng/mL、約1ng/mL、約2.5ng/mL、約5ng/mL、約7.5ng/mL、約10ng/mL、約15ng/mL、約20ng/mL、約25ng/mL、約30ng/mL、約35ng/mL、約40ng/mL、約50ng/mL、約60ng/mL、約70ng/mL、約80ng/mL、約90ng/mL、約100ng/mL、約200ng/mL、約500ng/mL、及び約1μg/mLのOKT−3抗体を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、0.1ng/mL〜1ng/mL、1ng/mL〜5ng/mL、5ng/mL〜10ng/mL、10ng/mL〜20ng/mL、20ng/mL〜30ng/mL、30ng/mL〜40ng/mL、40ng/mL〜50ng/mL、及び50ng/mL〜100ng/mLのOKT−3抗体を含む。

[00359] ある実施形態において、TILの迅速拡大培養プロセスは、先述のとおりT−175フラスコ及びガス透過性バッグ(Tran, et al., J. Immunother. 2008, 31, 742-51;Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42)又はガス透過性培養ウェア(G-Rexフラスコ、Wilson Wolf Manufacturing Corporation、New Brighton, MN, USAから市販されている)を使用して実施し得る。T−175フラスコ内でのTIL迅速拡大培養については、150mLの培地に懸濁された1×10⁶個のTILを各T−175フラスコに加え得る。TILはaAPCと1 TIL対100 aAPCの比で培養してもよく、及び細胞は、3000IU(国際単位)/mLのIL−2及び30ng/mlの抗CD3抗体(例えばOKT−3)を補足したCMとAIM-V培地との1対1混合物中で培養した。T−175フラスコは37℃5%CO₂でインキュベートし得る。5日目に、3000IU/mLのIL−2を含む50/50培地を使用して培地の半分を交換し得る。7日目に2つのT−175フラスコからの細胞を3リットルバッグに合わせ、その300mlのTIL懸濁液に5%ヒトAB血清及び3000IU/mLのIL−2を含有する300mLのAIM Vを加えた。各バッグの細胞数を毎日又は2日毎にカウントし、新鮮培地を加えて細胞数を0.5〜2.0×10⁶細胞/mLに保った。

[00360] ある実施形態において、100cmガス透過性シリコン底の500mL容量ガス透過性フラスコ(G-Rex 100、Wilson Wolf Manufacturing Corporation、New Brighton, MN, USAから市販されている)におけるTIL迅速拡大培養については、5%ヒトAB血清、3000IU/mLのIL−2及び30ng/mLの抗CD3(OKT−3)を補足した400mLの50/50培地中で5×10⁶又は10×10⁶個のTILをaAPCと1:100の比で培養し得る。G-Rex 100フラスコは37℃5%CO₂でインキュベートし得る。5日目、250mLの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、1500rpm(毎分回転数;491×g)で10分間遠心し得る。TILペレットは、5%ヒトAB血清、3000IU/mLのIL−2を含有する150mLの新鮮培地に再懸濁し、元のG-Rex 100フラスコに戻し加え得る。G-Rex 100フラスコ内でTILを連続的に拡大培養する場合、7日目に各フラスコ中に存在する300mLの培地に各G-Rex 100のTILを懸濁してもよく、この細胞懸濁液は、3つのG-Rex 100フラスコの播種に使用し得る3つの100mLアリコートに分割し得る。次に、5%ヒトAB血清及び3000IU/mLのIL−2を含有する150mLのAIM-Vを各フラスコに加え得る。G-Rex 100フラスコは37℃5%CO₂でインキュベートしてもよく、4日後、各G-Rex 100フラスコに3000IU/mLのIL−2を含有する150mLのAIM-Vを加え得る。培養14日目に細胞を回収し得る。

[00361] ある実施形態において、TILは以下のとおり調製し得る。2mMグルタミン(Mediatech, Inc. Manassas, VA)、100U/mLペニシリン(Invitrogen Life Technologies)、100μg/mLストレプトマイシン(Invitrogen Life Technologies)、5%熱失活ヒトAB血清(Valley Biomedical, Inc. Winchester, VA)及び600IU/mL rhIL−2(Chiron、Emeryville, CA)を補足したAIM-V培地(Invitrogen Life Technologies、Carlsbad, CA)を含む完全培地(CM)中で2mm³腫瘍断片を培養する。固形腫瘍の酵素消化のため、腫瘍標本をRPMI−1640中にダイシングし、洗浄し、15〜22℃において800rpmで5分間遠心し、酵素消化緩衝液(RPMI−1640中0.2mg/mLコラゲナーゼ及び30単位/mlのDNアーゼ)に再懸濁した後、続いて室温で一晩回転させた。断片から樹立したTILはCM中で3〜4週間成長させて、新鮮に拡大培養してもよく、又は10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を含有する熱失活HAB血清中に凍結保存して、試験時まで−180℃で保管してもよい。採取腹水から得られた腫瘍関連リンパ球(tumor associated lymphocyte:TAL)を3×10⁶細胞/ウェルで24ウェルプレートのCM中に播種した。ほぼ隔日で、低倍率倒立顕微鏡を使用してTIL成長を調べた。

[00362] ある実施形態において、TILはガス透過性容器内で拡大培養される。ガス透過性容器は、米国特許出願公開第2005/0106717 A1号(この開示は参照により本明細書に援用される)に記載されるものを含め、当該技術分野において公知の方法、組成物、及び装置を用いたPBMCを使用したTILの拡大培養に用いられている。ある実施形態において、TILはガス透過性バッグ内で拡大培養される。ある実施形態において、TILは、Xuri Cell Expansion System W25(GE Healthcare)など、ガス透過性バッグ内でTILを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。ある実施形態において、TILは、Xuri Cell Expansion System W5(GE Healthcare)としても知られるWAVE Bioreactor Systemなど、ガス透過性バッグ内でTILを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、約100mL、約200mL、約300mL、約400mL、約500mL、約600mL、約700mL、約800mL、約900mL、約1L、約2L、約3L、約4L、約5L、約6L、約7L、約8L、約9L、約10L、約11L、約12L、約13L、約14L、約15L、約16L、約17L、約18L、約19L、約20L、約25L、及び約30Lからなる群から選択される容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、50〜150mL、150〜250mL、250〜350mL、350〜450mL、450〜550mL、550〜650mL、650〜750mL、750〜850mL、850〜950mL、及び950〜1050mLからなる群から選択される容積範囲を有するガス透過性細胞バッグを含む。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、1L〜2L、2L〜3L、3L〜4L、4L〜5L、5L〜6L、6L〜7L、7L〜8L、8L〜9L、9L〜10L、10L〜11L、11L〜12L、12L〜13L、13L〜14L、14L〜15L、15L〜16L、16L〜17L、17L〜18L、18L〜19L、及び19L〜20Lからなる群から選択される容積範囲を有するガス透過性細胞バッグを含む。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、0.5L〜5L、5L〜10L、10L〜15L、15L〜20L、20L〜25L、及び25L〜30Lからなる群から選択される容積範囲を有するガス透過性細胞バッグを含む。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、約30分、約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、約12時間、約24時間、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約8日、約9日、約10日、約11日、約12日、約13日、約14日、約15日、約16日、約17日、約18日、約19日、約20日、約21日、約22日、約23日、約24日、約25日、約26日、約27日、及び約28日の揺動時間を利用する。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、30分〜1時間、1時間〜12時間、12時間〜1日、1日〜7日、7日〜14日、14日〜21日、及び21日〜28日の揺動時間を利用する。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、約2回揺動/分、約5回揺動/分、約10回揺動/分、約20回揺動/分、約30回揺動/分、及び約40回揺動/分の揺動速度を利用する。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、2回揺動/分〜5回揺動/分、5回揺動/分〜10回揺動/分、10回揺動/分〜20回揺動/分、20回揺動/分〜30回揺動/分、及び30回揺動/分〜40回揺動/分の揺動速度を利用する。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、約2°、約3°、約4°、約5°、約6°、約7°、約8°、約9°、約10°、約11°、及び約12°の揺動角度を利用する。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、2°〜3°、3°〜4°、4°〜5°、5°〜6°、6°〜7°、7°〜8°、8°〜9°、9°〜10°、10°〜11°、及び11°〜12°の揺動角度を利用する。

[00363] ある実施形態において、aAPCを使用してTILを拡大培養する方法は、優れた腫瘍応答性に関してTILを選択するステップを更に含む。当該技術分野において公知の任意の選択方法を用いることができる。例えば、優れた腫瘍応答性に関するTILの選択には、米国特許出願公開第2016/0010058 A1号(この開示は参照により本明細書に援用される)に記載される方法が用いられてもよい。

[00364] ある実施形態において、本発明のaAPCはT細胞の拡大培養に使用され得る。TILの拡大培養について記載している本発明の前述の任意の実施形態もまた、T細胞の拡大培養に適用し得る。ある実施形態において、本発明のaAPCを使用してCD8⁺ T細胞が拡大培養されてもよい。ある実施形態において、本発明のaAPCを使用してCD4⁺ T細胞が拡大培養されてもよい。ある実施形態において、本発明のaAPCを使用して、キメラ抗原受容体(CAR−T)が形質導入されたT細胞が拡大培養されてもよい。ある実施形態において、本発明のaAPCを使用して、修飾T細胞受容体(TCR)を含むT細胞が拡大培養されてもよい。CAR−T細胞は、当該技術分野において、例えば米国特許第7,070,995号;同第7,446,190号;同第8,399,645号;同第8,916,381号;及び同第9,328,156号(これらの開示は参照により本明細書に援用される)に記載されるとおり、CD19を含めた任意の好適な抗原に対して標的化し得る。修飾TCR細胞は、当該技術分野において、例えば米国特許第8,367,804号及び同第7,569,664号(これらの開示は参照により本明細書に援用される)に記載されるとおり、NY−ESO−1、TRP−1、TRP−2、チロシナーゼ癌抗原、MAGE−A3、SSX−2、及びVEGFR2を含めた任意の好適な抗原、又はその抗原性部分に対して標的化し得る。

癌及び他の疾患を治療する方法 [00365] 本明細書に記載される組成物及び方法は、疾患の治療方法において使用することができる。ある実施形態において、本組成物及び方法は、過剰増殖性障害の治療における使用のためのものである。本組成物及び方法はまた、本明細書及び以下の段落に記載されるとおりの他の障害の治療においても使用され得る。本明細書に記載されるTIL、その集団及び組成物は、疾患の治療における使用のためのものであり得る。ある実施形態において、本明細書に記載されるTIL、集団及び組成物は、過剰増殖性障害の治療における使用のためのものである。

[00366] 一部の実施形態において、過剰増殖性障害は癌である。一部の実施形態において、過剰増殖性障害は固形腫瘍癌である。一部の実施形態において、固形腫瘍癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌、腎癌、及び腎細胞癌、膵癌、及び膠芽腫からなる群から選択される。一部の実施形態において、過剰増殖性障害は血液学的悪性腫瘍である。一部の実施形態において、血液学的悪性腫瘍は、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫からなる群から選択される。

[00367] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)集団によって癌を治療する方法を含み、これは、(a)患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得るステップ;(b)細胞培養培地中で人工抗原提示細胞(aAPC)集団を使用して第1のTIL集団の迅速拡大培養を行うことにより第2のTIL集団を得るステップであって、第2のTIL集団が第1のTIL集団よりも少なくとも50倍数が多いステップ;及び(c)癌を有する患者に治療上有効な分量の第2のTIL集団を投与するステップを含む。ある実施形態において、aAPCは1又は複数のウイルスベクターが形質導入されたMOLM−14細胞を含み、ここで、1又は複数のウイルスベクターは、CD86をコードする核酸と、4−1BBLをコードする核酸とを含み、MOLM−14細胞はCD86タンパク質と4−1BBLタンパク質とを発現する。ある実施形態において、迅速拡大培養は14日以下の期間にわたって行われる。

[00368] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)集団によって癌を治療する方法を含み、これは、(a)患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得るステップ;(b)第1の細胞培養培地中で第1の人工抗原提示細胞(aAPC)集団を使用して第1のTIL集団の初期拡大培養を行うことにより第2のTIL集団を得るステップであって、第2のTIL集団が第1のTIL集団よりも少なくとも10倍数が多く、及び第1の細胞培養培地がIL−2を含むステップ;(c)第2の細胞培養培地中で第2のaAPC集団を使用して第2のTIL集団の迅速拡大培養を行うことにより第3のTIL集団を得るステップであって、第3のTIL集団が第1のTIL集団よりも少なくとも50倍数が多く;及び第2の細胞培養培地がIL−2及びOKT−3を含むステップ;(d)癌を有する患者に治療上有効な分量の第3のTIL集団を投与するステップを含む。ある実施形態において、aAPCは1又は複数のウイルスベクターが形質導入されたMOLM−14細胞を含み、ここで、1又は複数のウイルスベクターは、CD86をコードする核酸と、4−1BBLをコードする核酸とを含み、MOLM−14細胞はCD86タンパク質と4−1BBLタンパク質とを発現する。ある実施形態において、迅速拡大培養は14日以下の期間にわたって行われる。ある実施形態において、初期拡大培養はガス透過性容器を使用して行われる。

[00369] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)集団によって癌を治療する方法を含み、これは、(a)患者から切除された腫瘍から第1のTIL集団を得るステップ;(b)第1の細胞培養培地中で第1のTIL集団の初期拡大培養を行うことにより第2のTIL集団を得るステップであって、第2のTIL集団が第1のTIL集団よりも少なくとも10倍数が多く、及び第1の細胞培養培地がIL−2を含むステップ;(c)第2の細胞培養培地中で人工抗原提示細胞(aAPC)集団を使用して第2のTIL集団の迅速拡大培養を行うことにより第3のTIL集団を得るステップであって、第3のTIL集団が第1のTIL集団よりも少なくとも50倍数が多く;及び第2の細胞培養培地がIL−2及びOKT−3を含むステップ;(d)癌を有する患者に治療上有効な分量の第3のTIL集団を投与するステップを含む。ある実施形態において、aAPCは1又は複数のウイルスベクターが形質導入されたMOLM−14細胞を含み、ここで、1又は複数のウイルスベクターは、CD86をコードする核酸と、4−1BBLをコードする核酸とを含み、MOLM−14細胞はCD86タンパク質と4−1BBLタンパク質とを発現する。ある実施形態において、迅速拡大培養は14日以下の期間にわたって行われる。

[00370] ある実施形態において、本発明は、TIL集団で癌を治療する方法を含み、ここで、患者は本開示に係るTILの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。ある実施形態において、骨髄非破壊的化学療法はシクロホスファミド60mg/kg/日を2日(TIL注入前27日目及び26日目)、及びフルダラビン25mg/m²/日を5日(TIL注入前27〜23日目)である。ある実施形態において、骨髄非破壊的化学療法及び本開示に係るTIL注入(0日目)の後、患者は生理学的忍容量まで8時間毎に静脈内に720,000IU/kgのIL−2の静脈内注入を受ける。

[00371] 適応される疾患又は障害の治療、予防及び/又は管理における本明細書に記載される化合物及び化合物の組み合わせの有効性は、ヒト疾患の治療指針を提供する当該技術分野において公知の様々なモデルを用いて試験することができる。例えば、卵巣癌治療の有効性を決定するためのモデルについては、例えば、Mullany, et al., Endocrinology 2012, 153, 1585-92;及びFong, et al., J. Ovarian Res. 2009, 2, 12に記載されている。膵癌治療の有効性を決定するためのモデルについては、Herreros- Villanueva, et al., World J. Gastroenterol. 2012, 18, 1286-1294に記載されている。乳癌治療の有効性を決定するためのモデルについては、例えば、Fantozzi, Breast Cancer Res. 2006, 8, 212に記載されている。黒色腫治療の有効性を決定するためのモデルについては、例えば、Damsky, et al., Pigment Cell & Melanoma Res. 2010, 23, 853-859に記載されている。肺癌治療の有効性を決定するためのモデルについては、例えば、Meuwissen, et al., Genes & Development, 2005, 19, 643-664に記載されている。肺癌治療の有効性を決定するためのモデルについては、例えば、Kim, Clin. Exp. Otorhinolaryngol. 2009, 2, 55-60;及びSano, Head Neck Oncol. 2009, 1, 32に記載されている。

化学療法による骨髄非破壊的リンパ球枯渇 [00372] ある実施形態において、本発明は、TIL集団で癌を治療する方法を含み、ここで、患者は本開示に係るTILの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。ある実施形態において、本発明は、癌の治療における使用のための、本明細書に記載される方法によって入手可能なTIL集団を提供し、ここで、TIL集団は、骨髄非破壊的化学療法で前処置される患者を治療するためのものである。ある実施形態において、骨髄非破壊的化学療法はシクロホスファミド60mg/kg/日を2日(TIL注入前27日目及び26日目)、及びフルダラビン25mg/m²/日を5日(TIL注入前27〜23日目)である。ある実施形態において、骨髄非破壊的化学療法及び本開示に係るTIL注入(0日目)の後、患者は生理学的忍容量まで8時間毎に静脈内に720,000IU/kgのIL−2(アルデスロイキン、PROLEUKINとして市販されている)の静脈内注入を受ける。

[00373] 実験的知見から、腫瘍特異的Tリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇が、調節性T細胞及び免疫系の競合エレメント(「サイトカインシンク」)の除去により、治療有効性の増強において重要な役割を果たすことが指摘される。従って、本発明の一部の実施形態は、本発明のaAPCで拡大培養したTILを導入する前に患者に対してリンパ球枯渇ステップ(時に「免疫抑制コンディショニング」とも称される)を利用する。

[00374] 一般に、リンパ球枯渇は、フルダラビン又はシクロホスファミド(その活性型はマホスファミドと称される)及びこれらの組み合わせの投与を用いて実現される。かかる方法については、Gassner, et al., Cancer Immunol. Immunother. 2011, 60, 75-85、Muranski, et al., Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3, 668-681、Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-5239、及びDudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-2357(これらは全て、本明細書において全体として参照により援用される)に記載されている。

[00375] 一部の実施形態において、フルダラビンは0.5μg/mL〜10μg/mLフルダラビンの濃度で投与される。一部の実施形態において、フルダラビンは1μg/mLフルダラビンの濃度で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン治療は、1日、2日、3日、4日、5日、6日、又は7日間又はそれ以上投与される。一部の実施形態において、フルダラビンは、10mg/kg/日、15mg/kg/日、20mg/kg/日、25mg/kg/日、30mg/kg/日、35mg/kg/日、40mg/kg/日、又は45mg/kg/日の投薬量で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン治療は35mg/kg/日で2〜7日間投与される。一部の実施形態において、フルダラビン治療は35mg/kg/日で4〜5日間投与される。一部の実施形態において、フルダラビン治療は25mg/kg/日で4〜5日間投与される。

[00376] 一部の実施形態において、活性型のシクロホスファミドであるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与によって0.5μg/ml〜10μg/mlの濃度で達成される。一部の実施形態において、活性型のシクロホスファミドであるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与によって1μg/mLの濃度で達成される。一部の実施形態において、シクロホスファミド治療は1日、2日、3日、4日、5日、6日、又は7日間又はそれ以上投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは、100mg/m²/日、150mg/m²/日、175mg/m²/日、200mg/m²/日、225mg/m²/日、250mg/m²/日、275mg/m²/日、又は300mg/m²/日の投薬量で投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは静脈内に(i.v.)投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミド治療は35mg/kg/日で2〜7日間投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミド治療は250mg/m²/日i.v.で4〜5日間投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミド治療は250mg/m²/日i.v.で4日間投与される。

[00377] 一部の実施形態において、リンパ球枯渇は、フルダラビン及びシクロホスファミドを一緒に患者に投与することにより実施される。一部の実施形態において、フルダラビンは25mg/m²/日i.v.で投与され、シクロホスファミドは250mg/m²/日i.v.で4日間にわたって投与される。

[00378] ある実施形態において、リンパ球枯渇は、60mg/m²/日の用量で2日間のシクロホスファミドの投与と、それに続く25mg/m²/日の用量で5日間のフルダラビンの投与によって実施される。

医薬組成物、投薬量、及び投与レジメン [00379] ある実施形態において、本開示のaAPCを使用して拡大培養したTILは、患者に医薬組成物として投与される。ある実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のTILの懸濁液である。本開示のaAPCを使用して拡大培養したTILは、当該技術分野において公知のとおりの任意の好適な経路によって投与されてもよい。好ましくは、TILは、動脈内注入又は静脈内注入など、単回注入として投与され、これは好ましくは約30〜60分続く。他の好適な投与経路としては、腹腔内、髄腔内、及びリンパ内投与が挙げられる。

[00380] 任意の好適な用量のTILを投与することができる。好ましくは、約2.3×10¹⁰〜約13.7×10¹⁰ TILが投与され、特に癌が黒色腫である場合、平均約7.8×10¹⁰ TILである。ある実施形態において、約1.2×10¹⁰〜約4.3×10¹⁰のTILが投与される。

[00381] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの数は、約1×10⁶、2×10⁶、3×10⁶、4×10⁶、5×10⁶、6×10⁶、7×10⁶、8×10⁶、9×10⁶、1×10⁷、2×10⁷、3×10⁷、4×10⁷、5×10⁷、6×10⁷、7×10⁷、8×10⁷、9×10⁷、1×10⁸、2×10⁸、3×10⁸、4×10⁸、5×10⁸、6×10⁸、7×10⁸、8×10⁸、9×10⁸、1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹、5×10⁹、6×10⁹、7×10⁹、8×10⁹、9×10⁹、1×10¹⁰、2×10¹⁰、3×10¹⁰、4×10¹⁰、5×10¹⁰、6×10¹⁰、7×10¹⁰、8×10¹⁰、9×10¹⁰、1×10¹¹、2×10¹¹、3×10¹¹、4×10¹¹、5×10¹¹、6×10¹¹、7×10¹¹、8×10¹¹、9×10¹¹、1×10¹²、2×10¹²、3×10¹²、4×10¹²、5×10¹²、6×10¹²、7×10¹²、8×10¹²、9×10¹²、1×10¹³、2×10¹³、3×10¹³、4×10¹³、5×10¹³、6×10¹³、7×10¹³、8×10¹³、及び9×10¹³である。ある実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの数は、1×10⁶〜5×10⁶、5×10⁶〜1×10⁷、1×10⁷〜5×10⁷、5×10⁷〜1×10⁸、1×10⁸〜5×10⁸、5×10⁸〜1×10⁹、1×10⁹〜5×10⁹、5×10⁹〜1×10¹⁰、1×10¹⁰〜5×10¹⁰、5×10¹⁰〜1×10¹¹、5×10¹¹〜1×10¹²、1×10¹²〜5×10¹²、及び5×10¹²〜1×10¹³の範囲である。

[00382] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの濃度は、例えば、医薬組成物の100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%又は0.0001%w/w、w/v又はv/v未満である。

[00383] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの濃度は、医薬組成物の90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19.75%、19.50%、19.25% 19%、18.75%、18.50%、18.25% 18%、17.75%、17.50%、17.25% 17%、16.75%、16.50%、16.25% 16%、15.75%、15.50%、15.25% 15%、14.75%、14.50%、14.25% 14%、13.75%、13.50%、13.25% 13%、12.75%、12.50%、12.25% 12%、11.75%、11.50%、11.25% 11%、10.75%、10.50%、10.25% 10%、9.75%、9.50%、9.25% 9%、8.75%、8.50%、8.25% 8%、7.75%、7.50%、7.25% 7%、6.75%、6.50%、6.25% 6%、5.75%、5.50%、5.25% 5%、4.75%、4.50%、4.25%、4%、3.75%、3.50%、3.25%、3%、2.75%、2.50%、2.25%、2%、1.75%、1.50%、125%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%又は0.0001%w/w、w/v、又はv/v超である。

[00384] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの濃度は、医薬組成物の約0.0001%〜約50%、約0.001%〜約40%、約0.01%〜約30%、約0.02%〜約29%、約0.03%〜約28%、約0.04%〜約27%、約0.05%〜約26%、約0.06%〜約25%、約0.07%〜約24%、約0.08%〜約23%、約0.09%〜約22%、約0.1%〜約21%、約0.2%〜約20%、約0.3%〜約19%、約0.4%〜約18%、約0.5%〜約17%、約0.6%〜約16%、約0.7%〜約15%、約0.8%〜約14%、約0.9%〜約12%又は約1%〜約10%w/w、w/v又はv/vの範囲である。

[00385] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの濃度は、医薬組成物の約0.001%〜約10%、約0.01%〜約5%、約0.02%〜約4.5%、約0.03%〜約4%、約0.04%〜約3.5%、約0.05%〜約3%、約0.06%〜約2.5%、約0.07%〜約2%、約0.08%〜約1.5%、約0.09%〜約1%、約0.1%〜約0.9%w/w、w/v又はv/vの範囲である。

[00386] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの量は、10g、9.5g、9.0g、8.5g、8.0g、7.5g、7.0g、6.5g、6.0g、5.5g、5.0g、4.5g、4.0g、3.5g、3.0g、2.5g、2.0g、1.5g、1.0g、0.95g、0.9g、0.85g、0.8g、0.75g、0.7g、0.65g、0.6g、0.55g、0.5g、0.45g、0.4g、0.35g、0.3g、0.25g、0.2g、0.15g、0.1g、0.09g、0.08g、0.07g、0.06g、0.05g、0.04g、0.03g、0.02g、0.01g、0.009g、0.008g、0.007g、0.006g、0.005g、0.004g、0.003g、0.002g、0.001g、0.0009g、0.0008g、0.0007g、0.0006g、0.0005g、0.0004g、0.0003g、0.0002g、又は0.0001g以下である。

[00387] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの量は、0.0001g、0.0002g、0.0003g、0.0004g、0.0005g、0.0006g、0.0007g、0.0008g、0.0009g、0.001g、0.0015g、0.002g、0.0025g、0.003g、0.0035g、0.004g、0.0045g、0.005g、0.0055g、0.006g、0.0065g、0.007g、0.0075g、0.008g、0.0085g、0.009g、0.0095g、0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.035g、0.04g、0.045g、0.05g、0.055g、0.06g、0.065g、0.07g、0.075g、0.08g、0.085g、0.09g、0.095g、0.1g、0.15g、0.2g、0.25g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g、0.55g、0.6g、0.65g、0.7g、0.75g、0.8g、0.85g、0.9g、0.95g、1g、1.5g、2g、2.5、3g、3.5、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g、又は10g超である。

[00388] 本発明の実施形態の医薬組成物中に提供されるTILは、広い投薬量範囲にわたって有効である。正確な投薬量は、投与経路、化合物の投与形態、治療対象の性別及び年齢、治療対象の体重、並びに主治医の優先的選択及び経験に依存することになる。臨床的に確立されたTILの投薬量もまた、適宜用いられ得る。TILの投薬量など、本明細書の方法を用いて投与される医薬組成物の量は、治療下のヒト又は哺乳類、障害又は病態の重症度、投与速度、医薬品有効成分の性質及び処方医師の裁量に依存することになる。

[00389] 一部の実施形態において、TILは単回用量で投与されてもよい。かかる投与は、注射、例えば静脈内注射によってもよい。一部の実施形態において、TILは複数回用量で投与されてもよい。投与は、年1回、2回、3回、4回、5回、6回、又は6回超であってもよい。投与は、月1回、2週間に1回、週1回、又は隔日1回であってもよい。TILの投与は必要な限り継続されてもよい。

[00390] 一部の実施形態において、TILの有効投薬量は、約1×10⁶、2×10⁶、3×10⁶、4×10⁶、5×10⁶、6×10⁶、7×10⁶、8×10⁶、9×10⁶、1×10⁷、2×10⁷、3×10⁷、4×10⁷、5×10⁷、6×10⁷、7×10⁷、8×10⁷、9×10⁷、1×10⁸、2×10⁸、3×10⁸、4×10⁸、5×10⁸、6×10⁸、7×10⁸、8×10⁸、9×10⁸、1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹、5×10⁹、6×10⁹、7×10⁹、8×10⁹、9×10⁹、1×10¹⁰、2×10¹⁰、3×10¹⁰、4×10¹⁰、5×10¹⁰、6×10¹⁰、7×10¹⁰、8×10¹⁰、9×10¹⁰、1×10¹¹、2×10¹¹、3×10¹¹、4×10¹¹、5×10¹¹、6×10¹¹、7×10¹¹、8×10¹¹、9×10¹¹、1×10¹²、2×10¹²、3×10¹²、4×10¹²、5×10¹²、6×10¹²、7×10¹²、8×10¹²、9×10¹²、1×10¹³、2×10¹³、3×10¹³、4×10¹³、5×10¹³、6×10¹³、7×10¹³、8×10¹³、及び9×10¹³である。一部の実施形態において、TILの有効投薬量は、1×10⁶〜5×10⁶、5×10⁶〜1×10⁷、1×10⁷〜5×10⁷、5×10⁷〜1×10⁸、1×10⁸〜5×10⁸、5×10⁸〜1×10⁹、1×10⁹〜5×10⁹、5×10⁹〜1×10¹⁰、1×10¹⁰〜5×10¹⁰、5×10¹⁰〜1×10¹¹、5×10¹¹〜1×10¹²、1×10¹²〜5×10¹²、及び5×10¹²〜1×10¹³の範囲である。

[00391] 一部の実施形態において、TILの有効投薬量は、約0.01mg/kg〜約4.3mg/kg、約0.15mg/kg〜約3.6mg/kg、約0.3mg/kg〜約3.2mg/kg、約0.35mg/kg〜約2.85mg/kg、約0.15mg/kg〜約2.85mg/kg、約0.3mg〜約2.15mg/kg、約0.45mg/kg〜約1.7mg/kg、約0.15mg/kg〜約1.3mg/kg、約0.3mg/kg〜約1.15mg/kg、約0.45mg/kg〜約1mg/kg、約0.55mg/kg〜約0.85mg/kg、約0.65mg/kg〜約0.8mg/kg、約0.7mg/kg〜約0.75mg/kg、約0.7mg/kg〜約2.15mg/kg、約0.85mg/kg〜約2mg/kg、約1mg/kg〜約1.85mg/kg、約1.15mg/kg〜約1.7mg/kg、約1.3mg/kg mg〜約1.6mg/kg、約1.35mg/kg〜約1.5mg/kg、約2.15mg/kg〜約3.6mg/kg、約2.3mg/kg〜約3.4mg/kg、約2.4mg/kg〜約3.3mg/kg、約2.6mg/kg〜約3.15mg/kg、約2.7mg/kg〜約3mg/kg、約2.8mg/kg〜約3mg/kg、又は約2.85mg/kg〜約2.95mg/kgの範囲である。

[00392] 一部の実施形態において、TILの有効投薬量は、約1mg〜約500mg、約10mg〜約300mg、約20mg〜約250mg、約25mg〜約200mg、約1mg〜約50mg、約5mg〜約45mg、約10mg〜約40mg、約15mg〜約35mg、約20mg〜約30mg、約23mg〜約28mg、約50mg〜約150mg、約60mg〜約140mg、約70mg〜約130mg、約80mg〜約120mg、約90mg〜約110mg、又は約95mg〜約105mg、約98mg〜約102mg、約150mg〜約250mg、約160mg〜約240mg、約170mg〜約230mg、約180mg〜約220mg、約190mg〜約210mg、約195mg〜約205mg、又は約198〜約207mgの範囲である。

[00393] 有効量のTILは、鼻腔内及び経皮経路、動脈内注射によること、静脈内、腹腔内、非経口的、筋肉内、皮下、局所、移植によること、又は吸入によることを含め、同様の有用性を有する薬剤について一般に認められている任意の投与方式により、単回用量又は複数回用量のいずれで投与されてもよい。