技术领域
[0001] 本
发明涉及一株坚强芽孢杆菌及其应用，属于
微生物领域。
背景技术
[0002] 种植业每年因病虫害造成巨大的损失。病虫害的防治有多种方法，
化学防治在世界农业发展史上起着重要的作用。几个世纪以来，化学
农药在农林生产中防治病虫害起到非常重要的作用。但由于大量使用，已造成环境污染严重，病虫害抗药性增强，形成恶性循环，严重影响人类健康和生态平衡。
生物防治是农林生产中的必然趋势。利用拮抗微生物防治
植物病害是其中一个主要内容。在研究开发的各种生防菌中，利用生防细菌来防治植物病害成为国内外在生物防治中的一个热点。大量研究表明，生防细菌不仅在其生长发育过程中产生多种拮抗性或竞争性的代谢产物，通过直接或间接作用，达到阻碍或杀死病原菌的效果。大部分生防细菌都是从植物的根围、
根际和叶围等处分离获得，对植物具有较好的亲合性，接种后易在植物上定殖、存活，防治效果持久稳定。
[0003] 芽孢杆菌是一群好
氧或兼性厌氧、产芽孢的
革兰氏阳性菌。芽孢杆菌分布及其广泛，极易分离培养，是
土壤和植物体表、根际的重要微生物种群。所产生的芽孢具有耐热抗逆的特点，极利于菌剂的生产、剂型的加工以及在环境中存活、定殖和繁殖。批量生产上工艺简单，成本也较低，施用方便，储存期长，是一种理想的生防微生物。目前，对芽孢杆菌研究较多的是枯草芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌等，对坚强芽孢杆菌用于生物防治的研究国内外参考文献较少。朱天辉等(林业大学，2007，43(2)：120-123)等从
苗圃土壤中分离纯化出一株具有拮抗活性的坚强芽胞杆菌，
专利(
申请号：200710121274.6)提供了一株防治草莓
白粉病的坚强芽胞杆菌菌株SAB-1，因此筛选对病原菌具有抑制作用的坚强芽胞杆菌是防止植物病害的最有效方法之一。目前为止，防止其他病虫害如：黄瓜白粉病、核桃
炭疽病、黄瓜灰霉病、小麦纹枯病、苹果轮纹病、
烟草赤星病、玉米小斑病、冬枣黑斑病、
棉花枯萎病、棉花红腐病、小麦赤霉病等未见报道。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种新的坚强芽孢杆菌菌株，它可以用作
生物农药，防治植物多种病害。
[0005] 本发明所提供的菌株为坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02是从山东省林业科学研究院实验苗圃土壤中采用土壤稀释分离法分离获得到的，已于2009年06月19日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.3129。其具有以下微生物学特性：菌体杆状，革兰氏阳性菌，周生鞭毛，兼性厌氧。NA培养基培养菌落圆形，白色，平展，表面粗糙，中间有圆环形突起，边缘整齐。液体培养形成菌膜，液体
颜色棕黄色，浑浊，有沉淀。
[0006] 本发明坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No.3129的培养方法或繁殖方法：(1)普通培养采用NA培养基保存。实验室液体培养采用NYBD液体培养基。NYBD配方：
牛肉浸膏8g，
酵母浸膏5g，
葡萄糖10g，
氯化钠5g，
水1000mL，pH 7.3。(2)大量
发酵培养配方(
质量百分含量)：豆粉1.8％，玉米粉1.6％，
淀粉和
碳酸
钙各0.44％，鱼粉0.47％，
硫酸镁0.01％，
磷酸二氢
钾0.03％，其余为水，pH 7.3。采用此培养基发酵培养，菌落可达40亿/g。
[0007] 该微生物制剂可以作为生物农药，防治多种植物病害。利用坚强芽孢杆菌防治黄瓜、土豆根
线虫，可直接杀死线虫细胞，具有极好的防治效果。利用绿粘帚霉与坚强芽孢杆菌，预先接种生防菌协同控制松赤枯病取得一定效果。坚强芽孢杆菌防治黄瓜白粉病，防治效果可达79.02％。坚强芽孢杆菌可以防治核桃炭疽病、黄瓜灰霉病、小麦纹枯病、苹果轮纹病、烟草赤星病、玉米小斑病、冬枣黑斑病、棉花枯萎病、棉花红腐病、小麦赤霉病等多种病害。室内对峙试验表明：其对多种病菌影响如下表所示。
[0008] 表1坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No.No.3129对多种病菌的影响
[0009]
[0010] 坚强芽孢杆菌也是昆虫病原细菌。利用坚强芽孢杆菌可以防止黄条跳甲，4亿/mL浓度48h死亡率可达100％。坚强芽孢杆菌可以侵染臭椿皮蛾和乔蝽巢蛾，利用坚强芽孢杆菌处理
叶片，幼虫18-24h停止取食，72h死亡率可达80-100％。幼虫死亡后变黑，虫体变软，轻微触动可流出黑色液体。
附图说明：
[0011] 图1为坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No.No.3129放大10K倍的光学
显微镜照片。具体实施方式：
[0013] 1、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No.3129的分离与纯化[0014] 本发明坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No.3129从山东省林业科学研究院实验苗圃土壤采用土壤稀释分离法分离获得，分离方法为：
[0015] (1)土样采集：从土壤表层到15cm处取样200g，一个地点采几个样本，混合过粗筛，取25g作分离用；
[0016] (2)培养基平板制备：将NA培养基(营养琼脂培养基)和PDA(
马铃薯葡萄糖琼脂培养基)培养基融化，分别倒入灭菌培养皿，冷却，制成NA和PDA平板；所述NA培养基配方为蛋白胨10g、牛肉膏3g、NaCl 5g、琼脂14g，蒸馏水1000mL，pH7.3。所述PDA培养基配方为马铃薯(去皮切
块)200g，葡萄糖17g，琼脂12-14g，蒸馏水1000mL。
[0017] (3)称取1g土样于250mL灭菌三
角瓶中，加100mL无菌水，振荡，制成10-2土壤悬-7浮液，静置5min，按10倍梯度稀释到10 ；
[0018] (4)取上述土壤悬浮液1mL，加到培养基NA或PDA平板上平板上，用弯玻棒涂匀。置于
培养箱26℃恒温培养5-7d。
[0019] 2、菌株鉴定
[0020] (1)微生物学特性：菌体杆状，革兰氏阳性菌，周生鞭毛，兼性厌氧。NA培养基培养菌落圆形，白色，平展，表面粗糙，中间有圆环形突起，边缘整齐。液体培养形成菌膜，液体颜色棕黄色，浑浊，有沉淀。
[0021] (2)生化特性如表2所示。
[0022] 表2坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No.3129的生化特性[0023]
[0024] 注：“+”表示生长或反应阳性；“-”表示不生长或反应阴性
[0025] 实施例2：坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No.3129的发酵[0026] NA培养基配方(市售)：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂14g，蒸馏水1000mL，pH7.3。
[0027] NB配方：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH7.3；
[0028] NYBD配方：牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，氯化钠5g，水1000mL，pH 7.3。
[0029] 大量发酵培养配方(质量百分含量)：豆粉1.8％，玉米粉1.6％，淀粉0.44％，碳酸钙0.44％，鱼粉0.47％，
硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.03％，其余为水，pH 7.3。
[0030] 1、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No.3129菌种活化[0031] 将斜面上保存的菌种接种到NA试管斜面上面，于28℃培养24h。
[0032] 2、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No.3129
种子液的制备[0033] 从斜面上挑三环菌接种到装有NB培养液的三角瓶中，置于恒温振荡培养箱中，振荡培养，28℃，200r/min培养8h即可获得种子液。
[0034] 3、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No.3129发酵液的制备[0035] 以培养液初始pH7.2，初始接种量2％，装液量50mL/500mL，将种子液接入到装有NYBD发酵培养液的500mL三角瓶中，置于恒温振荡培养箱中，振荡培养，28℃，200r/min培养48h。
[0036] 4、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No.3129发酵培养[0037] 将摇床发酵的菌液接种到装有100mL培养基的200mL种子
发酵罐，初始pH7.2，
温度32℃，通
风体积比1∶0.8，从菌种接种后12h菌体生长处于指数生长中期，转入2000L的发酵罐，以70％的罐装量，pH7.3，温度为28-34℃，前期
通风体积比为1∶0.8，后期通风体积比为1∶1发酵。采用此培养基发酵培养，菌落可达40亿/g。
[0038] 实施例3：坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No.3129发酵液的应用[0039] 为了明确坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No.3129发酵液对黄瓜灰霉病的防治增产效果，为其推广应用提供依据。我们于2008年1-2月份在临邑试验基地进行此试验，现将试验结果报告如下：
[0040] 1供试材料及方法
[0041] 1.1供试药剂
[0042] 按本发明发酵方法生产的坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No.3129发酵液；40％咪霉胺
可湿性粉剂(山东寿光双星农药有限公司生产，市售)。
[0043] 1.2供试作物与防治对象：供试作物为黄瓜，品种为长春密刺；防治对象：灰霉病[0044] 1.3试验地情况
[0045] 试验地设在山东省临邑县临南镇大聂村，该村大棚黄瓜灰霉病近几年发生严重，且防治困难，试验在620平方米(0.93亩)黄瓜大棚内，土质为轻壤土，有机质含量为1.07％，pH值为6.9，所有
试验小区栽培条件及管理措施一致，施药时黄瓜灰霉病处于发病初期。
[0046] 1.4试验设计及安排
[0047] 本试验设坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No.3129发酵液10倍，40％咪霉胺可湿性粉剂可湿性粉剂600倍液及不施药清水作对照共3个处理，重复4次，共
12个小区，各小区随机排列，小区面积为20平方米。于2008年1月29日、2月6日和13日各喷药一次，将植株叶片上下喷洒均匀、周到，喷药时用塑料布遮挡，亩用药液60公斤，喷药器械为工农-16型
喷雾器。
[0048] 1.5试验调查及计算方法
[0049] 1.5.1气象条件
[0050] 第1次施药(1月29日)当日少
云，
风力3级，最高气温为13℃，最低气温为4℃，
相对湿度为75％。第2次施药(2月6日)，当日多云，风力4级，最高气温为11℃，最低气温为2℃，相对湿度为70％；第3次施药(2月13日)当日晴，风力3级，最高气温为9℃，最低气温为1℃，相对湿度为80％。因塑料大棚环境条件相对稳定，所以该
气候对药效没有影响。
[0051] 1.5.2药效及安全性调查
[0052] 药效调查：第1次施药后第7d和最后一次施药后14d进行调查。每小区采用4点取样法，每点查2株，调查全部叶片，调查发病率，记录病情级数并计算病情指数。
[0053] 安全性调查：于第一次施药后7d和14d观察黄瓜的安全性，如有
药害发生，详细描述药害症状并按药害程度分级标准确定药害程度。
[0054] 分级方法(以叶片为单位)：
[0055] 0级：无病班
[0056] 1级：病班面积占整个叶面积的5％以下；
[0057] 3级：病班面积占整个叶面积的6％-10％；
[0058] 5级：病班面积占整个叶面积的11％-25％；
[0059] 7级：病班面积占整个叶面积的26％-30％；
[0060] 9级：病班面积占整个叶面积的50以上；
[0061] 1.5.3调查时间和次数
[0062] 施药前调查病情基数，下次施药前及末次施药后10d调查防治结果。
[0063] 1.5.4药效计算方法
[0064] 药效按式(1)、(2)计算：
[0065]
[0066]
[0067] 式中：CK0——空白对照区施药前病情指数；
[0068] CK1——空白对照区施药后病情指数；
[0069] PT0——药剂处理后施药前病情指数；
[0070] PT1——药剂处理后施药后病情指数。
[0071] 1.5.5对作物的直接影响
[0072] 观察药剂对作物有无药害，记录药害的类型和程度。此外，也要记录对作物的其他有益影响(例如促进成熟、刺激生长等)。
[0073] 用下列方式记录药害：
[0074] (a)如果药害能被测量或计算，要用绝对值表示，例如株高、结实率。
[0075] (b)在其他情况下，可以按下列两种方法估计药害程度和
频率：
[0076] (1)按照药害分级方法记录每小区的药害程度，以-、+、++、+++、++++表示。
[0077] 药害分级方法：
[0078] -：无药害；
[0079] +：轻度药害，不影响作物生长；
[0080] ++：中度药害，可复原，不会造成作物减产；
[0081] +++：中度药害，影响作物正常生长，对作产量和质量造成一定程度的损失；
[0082] ++++：严重药害，作物生长受阻，产量和质量损失严重。
[0083] (2)将药剂处理区与空白对照区比较，评价其药害百分率。
[0084] 同时，要准确描述作物的药害症状(矮化、褪绿、畸形等)
[0085] 2结果
[0086] 2.1供试药剂对棉花黄萎病的防治效果
[0087] 表3结果显示，坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No.3129发酵液及及40％咪霉胺可湿性粉剂对黄瓜灰霉病有较好的防治效果，一次用药7d后防治效果均达到60％以上，其中坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No.3129发酵液防治效果最好。
[0088] 从黄瓜灰霉病田间试验的病情指数来看(表3)，一次用药7d后，坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No.3129防治效果为77.14％，明显高于40％咪霉胺可湿性粉剂的防治效果。
[0089] 表3各处理防治黄瓜灰霉病试验效果调查原始数据 临邑13/2，2008[0090]
[0091] 2.2黄瓜安全性调查：经施药7d和14d观察，各药剂处理区与对照区相比，黄瓜生长正常，无药害产生，说明坚强芽孢杆菌Bacillus firmus Bf-02 CGMCC No.3129发酵液在供试浓度对黄瓜安全。
[0092] 2.3坚强芽孢杆菌发酵液对黄瓜增产效果
[0093] 表4对黄瓜增产试验结果分析表
[0094]
[0095] 注：小区面积33.4m2；处理1为坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCCNo.3129发酵液，处理2为对照组药剂(40％咪霉胺可湿性粉剂)。
[0096] 将表2资料进行Duncan’s方差分析：
[0097] 处理 样本数 均值 标准差
[0098] 处理1 3 252.4100 2.2987
[0099] 处理2 3 194.2400 0.9585
[0100] 方差分析表
[0101] 变异来源 平方和
自由度 均方 F值 显著水平[0102] 处理间 5075.6230 1 5075.6230 1636.615 0.0000[0103] 处理内 12.40524 3.1013
[0104] 总变异 5088.0282 5
[0105] Duncan多重比较(下三角为均值差，上三角为显著水平)
[0106] No. 均值 1 2
[0107] 1 252.41000 0.0000
[0108] 2 194.24000 58.1700
[0109] 字母标记表示结果
[0110] 处理 均值 5％显著水平 1％极显著水平
[0111] 处理1 252.41000 a A
[0112] 处理2 194.24000 b B
[0113] 由以上结果可知，在黄瓜上喷灌坚强芽孢杆菌发酵液(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCCNo.3129，处理区比对照区每亩增产黄瓜1292.673kg，增产率为29.95％；效果十分明显。在P＜0.01水平上具有显著性差异，说明坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCCNo.3129发酵液的防病增产作用非常明显。
[0114] 3小结
[0115] 3.1从病情指数和防治效果来看，坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No.3129对黄瓜灰霉病具有较好的防治效果，在一次施药后7d可达70％以上，明显好于对照药剂，差异显著。
[0116] 3.2从黄瓜增产效果看，坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No.3129对黄瓜具有明显的促生增产效果，一次施药后增产率为29.95％。
