技术领域
[0001] 本
发明涉及
微生物技术领域，特别涉及一种红豆草专用菌肥及制备方法。
背景技术
[0002] 红豆草是豆科红豆属多年生草本
植物，是一种非常重要的牧草和
绿肥兼用作物，其饲用价值高，可与紫花苜蓿相媲美，且其花色艳丽，有一定的观赏价值高，故有“牧草皇后”之美称。红豆草有发达的根系，主根粗壮、侧根丰富，对
土壤中的养分和
水分吸收利用效率高，有非常突出的环境适应性，对干旱、寒冷、早霜、深秋降水等不利因素有很强的耐受性。
[0003] 虽然红豆草对土壤和
气候适应性极广，且根系有根瘤可为其提供一定的氮素营养，但在不同栽培管理条件下，其生产
力水平差异很大。
现有技术中，国内外的红豆草生产中过度依赖化学
肥料，造成化肥使用效率降低，引起生态污染问题，导致安全性差、生产成本高。
发明内容
[0004] 为了解决现有技术的问题，本发明
实施例提供了一种红豆草专用菌肥及制备方法。所述技术方案如下：
[0005] 一方面，提供了一种红豆草专用菌肥，所述菌肥包括：菌株杨凌根瘤菌 (Rhizobium yanglingense)GAU-00008、菌株芽孢杆菌(Bacillus sp.)CHO87、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LSH11和载体。
[0006] 进一步地，所述载体包括：
木炭粉、花土和
腐殖酸。
[0007] 进一步地，所述菌株杨凌根瘤菌(Rhizobium yanglingense)GAU-00008，2019 年保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019564；所述菌株芽孢杆菌(Bacillus sp.)CHO87，2010年保藏与中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2010230；所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) LSH11，2017年保藏与中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017180。
[0008] 另一方面，提供了一种红豆草专用菌肥的制备方法，所述制备方法包括：
[0009] 步骤(1)、制备载体：将木炭粉、花土和腐殖酸混合均匀，得到所述载体，然后对所述载体进行灭菌处理；
[0010] 步骤(2)、选取菌株：选取所述菌株杨凌根瘤菌(Rhizobium yanglingense) GAU-00008、所述菌株芽孢杆菌(Bacillus sp.)CHO87和所述枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)LSH11；
[0011] 步骤(3)、制备混合菌液：将所述菌株杨凌根瘤菌(Rhizobium yanglingense) GAU-00008、所述菌株芽孢杆菌(Bacillus sp.)CHO87和所述枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)LSH11进行液体培养，并进行混合，得到所述混合菌液；
[0012] 步骤(4)、制备红豆草专用菌肥：将所述混合菌液与灭菌处理后的所述载体混匀，静置培养，得到所述红豆草专用菌肥。
[0013] 进一步的，所述步骤(1)包括：将所述木炭粉、所述花土和所述腐殖酸的
质量按照2:1:1的比例混合均匀，得到所述载体，混合均匀后的所述载体 pH＝7.0±0.2，然后对混合均匀后的所述载体进行高压
蒸汽灭菌(103.4KPa，121℃， 30分钟)或γ-射线灭菌处理。
[0014] 进一步地，所述步骤(2)包括：从不同生境的红豆草根瘤及根系表面获得 50株植物
根际促生菌；通过根瘤菌回接、固氮酶活性检测筛选优良根瘤菌，并通过使用PKO与Menkina培养基结合钼锑抗比色法筛选优良溶磷菌，通过与菌核菌、丝核菌、镰刀菌及链隔孢菌等常见植物病原菌的平板对峙实验筛选优良生防菌株；然后结合菌株间拮抗实验的结果，选出所述菌株杨凌根瘤菌 (Rhizobium yanglingense)GAU-00008、所述菌株芽孢杆菌(Bacillus sp.)CHO87、所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LSH11。
[0015] 进一步地，所述步骤(3)包括：将所述菌株杨凌根瘤菌(Rhizobium yanglingense)GAU-00008接入YMA培养基中培养，将所述菌株芽孢杆菌 (Bacillus sp.)CHO87和所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LSH11分别接入 LB培养基中培养，28℃，180r/min分别培养48-72h，待培养液中活的促生菌含量达到1×109cfu/ml，分别得到上述3种菌株的培养液，之后，将上述3种菌株的培养液按照体积比2：1：1的比例进行混合，得到所述混合菌液。
[0016] 进一步地，所述步骤(4)包括：将所述混合菌液与灭菌处理后的所述载体按照体积质量比1：4混匀，然后28℃静置培养1周。
[0017] 本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本红豆草专用菌肥中三种菌株协同作用，可以使红豆草根部结足量有效根瘤，同时活化土壤，促进作物对其它
营养元素的吸收，改善植物营养结构，调节和促进植物生长，增强植物抗病性；其次，还可改善土壤结构，提高土壤有机质含量，改良盐
碱地；另外，本红豆草专用菌肥具有成本低、使用安全、持续效果好、非再生
能源消耗少、经济效益高、无环境和食品污染等优点。
附图说明
[0018] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0019] 图1是本发明实施例提供的一种制备红豆草专用菌肥方法的
流程图；
[0020] 图2是本发明实施例提供的另一种制备红豆草专用菌肥方法的流程图。
具体实施方式
[0021] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
[0022] 红豆草对于国民经济的发展和生态环境的保护具有重要的价值。红豆草的产量因地区和生长年限不同而不同。在水肥条件差的干旱地区，2-3龄平均亩产干草250-500千克；在水热条件较好的地区，每亩产鲜草1400千克，在沟坡地每亩产鲜草950千克；在水肥热条件都好的灌区，
播种当年亩产鲜草即达1500 千克，二龄亩产2500千克，2-4龄最高可达3500千克；在海拔2600多米，热量不足的地区，播种当年可生长到开花期，平均亩产干草143千克，二龄亩产 248千克，四龄产量最高达到663千克，从五龄开始产量下降，每亩为433千克；
从1-4龄多年间产量构成看，播种当年占9.2％、第二年占16％，第三年占32.2％、第四年占
42.6％、逐年递增，以第三年增幅最大。在年刈割4次的河西，二龄一年间多茬产量构成是：
头茬占30～35％、二茬占25-30％、三茬占20-25％、四茬占10-15％、逐茬递减，以第四茬减幅最大。红豆草的一般利用年限为5～7年，从第五年开始，产量逐年下降、渐趋衰退，在条件较好时，可利用8-10年，生活15-20年。由上可知，虽然红豆草对土壤和气候适应性极广，且根系有根瘤可为其提供一定的氮素营养，但在不同栽培管理条件下，其生产力水平差异很大，尤其是对磷素依赖性较大，且磷素是豆科牧草根瘤菌结瘤作用的必须元素，直接影响到根瘤数量及固氮效率。此外，磷素还影响红豆草产量、品质和抗逆性 (如抗病性等)及对
钾素吸收等。因此，随着种植面积的扩大和产业化程度的提升，提高草地磷素含量及利用效率对红豆草生产具有重大意义。同时，近年来，由于连片单一种植面积剧增，一些病害，特别是土传病害对红豆草造成的危害及潜在危害很大。
[0023] 国内外研究表明，植物根际存在大量的溶磷微生物(溶磷菌)能将土壤中难以被植物直接吸收利用的磷素转化为植物可吸收态。有的溶磷菌兼具自生固氮和分泌植物
激素(如生长素、赤霉素等)特性。因此，利用生物技术，开展植物根际高效溶磷菌、根瘤菌和其它促生菌研究及复合接种剂(或菌肥)研制与开发具有极其重要的现实意义。
[0024] 实施例一
[0025] 为详细说明本发明的技术内容、所实现的目的及效果，以下结合实施方式予以说明。
[0026] 一种红豆草专用菌肥，包括：菌株杨凌根瘤菌(Rhizobium yanglingense) GAU-00008、菌株芽孢杆菌(Bacillus sp.)CHO87、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) LSH11和载体。
[0027] 需要说明的是，根瘤菌是一类存在于土壤中的能侵染豆科植物根部并形成根瘤的革兰氏阴性菌，几乎只与豆科植物形成共生体系，菌株杨凌根瘤菌具有较高的结瘤率和所结根瘤具有的较高的固氮酶活性；芽孢杆菌具有较高的溶解无机磷与有机磷的能力；枯草芽孢杆菌对于常见红豆草土传病害的病原
真菌具有较强和较广泛的生防特性。
[0028] 进一步地，载体包括：木炭粉、花土和腐殖酸。
[0029] 需要说明的是，木炭粉不仅可以蓄留植物根部所需水分，还可以改善土壤的透气性和排水性，为有益于植物的微生物提供良好的
生存空间；花土有充足的养分，供给植物吸收，同时可以加强植物的光合作用，而且疏松通气、保水保肥能力强，无病虫害；腐殖酸是动植物遗骸，主要是植物的遗骸，经过微生物的分解和转化，以及一系列的化学过程和积累起来的一类有机物质，它是由芳香族及其多种官能团构成的高分子
有机酸，具有良好的生理活性和吸收、络合、交换等功能。
[0030] 由上可知，使用结瘤率高、固氮能力强的杨凌根瘤菌，配合使用具有较强溶磷能力的芽孢杆菌和生防能力突出的枯草芽孢杆菌，降低了化肥和
农药的施用量，可以
预防红豆草土传病害的发生；木炭粉、花土和腐殖酸制备的载体为三种菌株提供良好的生存环境。
[0031] 进一步地，菌株杨凌根瘤菌(Rhizobium yanglingense)GAU-00008，2019 年保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019564；菌株芽孢杆菌(Bacillus sp.)CHO87，2010年保藏与中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2010230；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LSH11，2017 年保藏与中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017180。
[0032] 需要说明的是，菌株杨凌根瘤菌(Rhizobium yanglingense)GAU-00008，2019 年7月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉大学；菌株芽孢杆菌 (Bacillus sp.)CHO87，2010年9月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉大学；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LSH11，2017年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉大学。
[0033] 实施例二
[0034] 一种红豆草专用菌肥的制备方法，参见图1，该方法包括以下步骤：
[0035] 步骤(1)、制备载体：将木炭粉、花土和腐殖酸混合均匀，得到载体，然后对载体进行灭菌处理。
[0036] 步骤(2)、选取菌株：选取菌株杨凌根瘤菌(Rhizobium yanglingense) GAU-00008、菌株芽孢杆菌(Bacillus sp.)CHO87和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LSH11。
[0037] 步骤(3)、制备混合菌液：将菌株杨凌根瘤菌(Rhizobium yanglingense) GAU-00008、菌株芽孢杆菌(Bacillus sp.)CHO87和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LSH11进行液体培养，并进行混合，得到混合菌液。
[0038] 需要说明的是：混合后该复合菌株体系测定表明，3个菌株间无拮抗反应，菌株保持原有促生特性。
[0039] 步骤(4)、制备红豆草专用菌肥：将混合菌液与灭菌处理后的载体混匀，静置培养，得到红豆草专用菌肥。
[0040] 实施例三
[0041] 一种红豆草专用菌肥的制备方法，结合图2，对上述图1所示的红豆草专用菌肥的制备方法进行详细论述。
[0042] 步骤(101)：将木炭粉、花土和腐殖酸的质量按照2:1:1的比例混合均匀，得到载体，混合均匀后的载体pH＝7.0±0.2，然后对混合均匀后的载体进行高压蒸汽灭菌(103.4KPa，121℃，30分钟)或γ-射线灭菌处理。
[0043] 需要说明的是，高压蒸汽灭菌，用高温加高压灭菌，可以杀死一般的细菌、真菌等微生物，是最可靠、应用最普遍的物理灭菌法。γ-射线灭菌是一种利用射线的特性破坏细菌结构来杀菌的方法。本发明实施例中，以对载体进行高压蒸汽灭菌(103.4KPa，121℃，30分钟)或γ-射线灭菌为例进行说明，在实际实现时还可通过其他方法进行灭菌。
[0044] 步骤(102)：从不同生境的红豆草根瘤及根系表面获得50株植物根际促生菌。
[0045] 植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobaceria,简称PGPR)是指生活在植物根周、根表和根内，在其生命周期中分泌特殊的代谢产物从而促进植物的生长的细菌。研究表明这类菌一般具有固氮、解磷、分泌植物激素和抗生素等能力。此外PGPR菌株还可以改善土壤结构，提高土壤有机质含量，改良盐碱地和修复重金属污染土地的能力。
[0046] 步骤(103)：通过根瘤菌回接、固氮酶活性检测筛选优良根瘤菌，并通过使用PKO与Menkina培养基结合钼锑抗比色法筛选优良溶磷菌，通过与菌核菌、丝核菌、镰刀菌及链隔孢菌等常见植物病原菌的平板对峙实验筛选优良生防菌株。
[0047] 需要说明的是，固氮酶是一种能够将分子氮还原成
氨的酶。固氮酶是由两种
蛋白质组成的：一种含有
铁，叫做铁蛋白，另一种含铁和钼，称为钼铁蛋白。只有钼铁蛋白和铁蛋白同时存在，固氮酶才具有固氮的作用(因为这两种物质作为
电子载体能够起到传递电子的作用)。生物固氮原理：生物固氮是固氮微生物特有的一种生理功能，这种功能是在固氮酶的催化作用下进行的；钼锑抗比色法是对土壤、
水体等样品中的磷进行定量分析的过程。
[0048] 步骤(104)：结合菌株间拮抗实验的结果，选出菌株杨凌根瘤菌(Rhizobium yanglingense)GAU-00008、菌株芽孢杆菌(Bacillus sp.)CHO87、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LSH11。
[0049] 需要说明的是，步骤(103)中筛选出的优良根瘤菌，就是菌株杨凌根瘤菌；由于芽孢杆菌具有较高的溶解无机磷与有机磷的能力，因而步骤(103)中筛选出的优良溶磷菌就是菌株芽孢杆菌；由于枯草芽孢杆菌对于常见红豆草土传病害的病原真菌具有较强和较广泛的生防特性，因而步骤(103)中筛选出的优良生防菌株就是枯草芽孢杆菌。从而，可以结合菌株间拮抗实验的结果，从步骤 (103)筛选出的优良根瘤菌、优良溶磷菌、优良生防菌中分别选出1株菌株杨凌根瘤菌(Rhizobium yanglingense)GAU-00008、1株菌株芽孢杆菌(Bacillus sp.) CHO87、1株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LSH11。选择出的菌株杨凌根瘤菌(Rhizobium yanglingense)GAU-00008、菌株芽孢杆菌(Bacillus sp.)CHO87 和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LSH11之间无拮抗反应。
[0050] 步骤(105)：将菌株杨凌根瘤菌(Rhizobium yanglingense)GAU-00008接入YMA培养基中培养，将菌株芽孢杆菌(Bacillus sp.)CHO87和枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)LSH11分别接入LB培养基中培养，28℃，180r/min分别培养48-72h，待培养液中活的促生菌含量达到1×109cfu/ml，分别得到上述3种菌株的培养液。
[0051] 步骤(106)：将上述3种菌株的培养液按照体积比2：1：1的比例进行混合，得到混合菌液。
[0052] 步骤(107)：将混合菌液与灭菌处理后的载体按照体积质量比1：4混匀，然后28℃静置培养1周。
[0053] 需要说明的是，本红豆草专用菌肥在室温下贮藏，菌剂有效期超过6个月。
[0054] 实施例四
[0055] 一种红豆草专用菌肥的大田试验(试验地为甘肃省靖远县)，播种前将红豆草
种子放在塑料布上，喷洒适量的无菌水于种子上，使种子湿润，然后取红豆草专用菌肥撒在种子上，边撒边搅拌直至拌均匀为止，每亩地使用量为2.0kg，阴干后即可播种，同时减少30％-40％的化肥施用，此组为试验组；另外，取相同量的未撒红豆草专用菌肥的红豆草种子播种，作为对照组，具体的结果参见下表一:
[0056] 表1：红豆草大田试验生长及品质对比
[0057]
[0058] 表一结果表明，使用该红豆草专用菌肥拌种处理的红豆草，干草产量较对照提高10.5％；红豆草
粗蛋白质和粗脂肪较对照分别提高16.5％和11.8％；而相对饲用价值提高
7.6％，根腐病发生率降低8.1％，可见，使用本红豆草专用菌肥既可以调节和促进植物生长，有可以增强植物抗病性。
[0059] 值得说明的是，本红豆草专用菌肥中三种菌株协同作用，可以使红豆草根部结足量有效根瘤，同时活化土壤，促进作物对其它营养元素的吸收，改善植物营养结构，调节和促进植物生长，增强植物抗病性；其次，还可改善土壤结构，提高土壤有机质含量，改良盐碱地；另外，本红豆草专用菌肥具有成本低、使用安全、持续效果好、非再生能源消耗少、经济效益高、无环境和食品污染等优点。
[0060] 上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。
[0061] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何
修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
