一种多功能有机磷农药降解细菌的筛选方法
阅读：1044发布：2020-10-13
专利汇可以提供一种多功能有机磷农药降解细菌的筛选方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种多功能有机磷 农药 降解细菌的筛选方法。该方法由如下步骤组成：1) 植物 根际 促生细菌的活化或筛选；2)菌株的驯化；3)菌株对有机磷农药的降解活性；4)环境因子对菌株降解有机磷农药能 力 的影响以及条件的优化；5)通过盆钵试验，研究菌株对 土壤 中有机磷农药的降解效果，从而分析菌株对有机磷农药污染土壤的 生物 修复 潜能。本方法得到的菌株将能够长期保持防病促生功能和降解有机磷农药能力的 稳定性 ；而且由于其功能的多样性，施入土壤后易于生存繁殖，从而更好的发挥其功能；另外，本发明方法操作简单，减少成本，省时省力。因此，本发明方法在多功能菌株的筛选及有机磷农药污染土壤的 微生物 修复 等领域将会有广阔的应用前景。，下面是一种多功能有机磷农药降解细菌的筛选方法专利的具体信息内容。
1.一种多功能有机磷农药降解细菌的筛选方法，其特征在于：在已有筛选自土壤的植物根际促生细菌菌株的基础上，通过改良的定向培育法，即在培养基中添加农药，对已有菌株进行驯化筛选，获得同时具有植物防病促生能力的多功能有机磷农药降解细菌菌株。
2.根据权利要求1所述的一种多功能有机磷农药降解细菌的筛选方法，其特征在于：在常用细菌培养基(如LB培养基)中添加有机磷农药，农药浓度为50mg/L，100mg/L，
200mg/L，400mg/L，800mg/L，2000mg/L，以及更高的浓度。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：在驯化过程中，将能够在含有较低浓度有机磷农药的培养基中生存繁殖的菌株接种于含有更高浓度有机磷农药的培养基中，逐步提高培养基中有机磷农药的浓度，以期获得菌株对更高浓度有机磷农药的耐受性。
4.根据权利要求1和2所述的方法，其特征在于：由于不同菌株对不同有机磷农药的耐受性不同，用于菌株驯化的初始农药浓度、农药浓度增加的幅度和梯度，以及菌株对不同有机磷农药的最高耐受浓度会有所不同。
5.根据权利要求1所述的一种多功能有机磷农药降解细菌的筛选方法，其特征在于：
经过驯化的菌株，除了具有原有的植物根际促生细菌的特征之外，还具有降解有机磷农药的能力。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：通过同一菌株对不同有机磷农药的先后驯化，可使菌株获得降解多种有机磷农药的能力。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：本方法可用于具有单一功能的植物根际促生细菌，如解磷细菌、嗜铁细菌等菌株对有机磷农药的驯化，从而获得多功能有机磷农药降解细菌菌株。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：本方法可用于具有多种机制的植物根际促生细菌，如同时具有产生抗生素、嗜铁素、IAA、溶磷、诱导系统抗性等机制的植物根际促生细菌的驯化，从而获得具有多种防病促生机制的多功能有机磷农药降解细菌菌株。
9.根据权利要求1所述的一种多功能有机磷农药降解细菌的筛选方法，其特征在于：
本方法可用于其他来源的生防菌(如分离自发病区病情较轻的植株的拮抗菌、植物内生生防菌等)对有机磷农药的驯化，从而获得具有生防作用的多功能有机磷农药降解细菌菌株。
10.根据权利要求1至9所述的方法，其特征在于：本方法亦可扩展用于筛选具有防病促生效果的多功能有机磷农药降解真菌或放线菌菌株。
一种多功能有机磷农药降解细菌的筛选方法
技术领域：
[0002] 农药在农业生产中发挥了巨大的作用，据联合国粮农组织统计，如果不使用农药，全世界每年因病虫草害造成的损失约占农作物总产量的36％，年损失高达1250亿美元(Cooper and Dobson，2007；Eddleston and Bateman，2007)。农药的使用保证了农业的稳产丰收和人类的食物供应。有机磷农药(Organophosphorus pesticide，OPs)是当今农药的主要类别，具有经济、高效、方便等特点，是国内外广泛生产和使用的农药产品。
[0003] 但农药的大量使用对生态环境造成了很大的破坏性。农药利用率仅为10％～20％，其余80％～90％最终将进入土壤环境，致使土壤中的农药残留严重，残留的农药随着食物链上升，最终危害人类健康(Carvalho，2006；Costa et al.，2008)。在世界上许多国家和地区，尤其是发展中国家，由于有机磷农药的持续大量使用已经对区域生态系统造成了严重的污染，在肉、奶制品、谷物、蔬菜和水果等产品中都不同程度检测到能够抑制乙酰胆碱酯酶活性，导致神经传导功能紊乱，诱发免疫系统疾病，致使人中毒死亡的有机磷农药的残留。据统计，每年全世界发生300万例有机磷农药中毒事件，造成20万人死亡。为此，自20世纪80年代末以来，世界上许多研究机构都致力于探索有机磷农药污染环境的生物修复技术，并于1991年3月在美国圣地亚哥召开了第一届“原位与就地生物修复”国际会议，这一会议的召开，标志着以生物修复为核心的环境生物技术进入了一个全新的发展时期。
[0004] 环境修复技术中，生物修复技术被公认为是效果好、见效快、简便易行、安全、廉价和环境友好、无二次污染的方法，已成为环境科学的研究热点，具有广阔的应用前景。常说的土壤生物修复技术主要就是指微生物修复。利用微生物修复土壤农药污染的主要原理是微生物利用有机农药作为碳源、氮源与磷源，将复杂有毒的农药化合物分解成简单无-毒的化合物，或者彻底分解为CO2、H2O、NH3和Cl，从而降低农药在土壤中的残留量及毒性(Mansour and Gad，2010；康纪婷，2010)。
[0005] 获得降解有机磷农药的微生物的途径有很多，最常用的是从受到有机磷农药严重污染的土壤中分离筛选出能降解有机磷农药的菌种。定向培育法是近年来常用的一种方法，即在特定的土壤中人为的多次施用农药，驯化出能降解这种农药的微生物，再通过富集培养，从中分离筛选能高效降解这种农药的菌株(赵宇蕾，2009；康纪婷，2010)。这种单一功能菌的纯化筛选，只根据所需的功能要求从自然界中分离、纯化，得到目的单一的菌株。这种筛选方法有其不足之处，一是在土壤中人为施用农药，使得其他菌株不能生存，导致目标菌株失去了与自然条件下长期处于协同关系的其它菌共存的机会，虽然目标菌株的目标功能有所强化，但功能单一；二是单一菌的纯化使其对生长条件的适应范围越来越狭窄，对发酵条件要求高，发酵成本昂贵；三是单一功能菌孤立生长，容易受到其它菌的污染和抑制，重新施入土壤后，难以生长繁殖和发挥功能。
[0006] 已分离的有机磷农药污染土壤生物修复的微生物中，以细菌和真菌为主(Fox and Mendz，2006；郭子武，2008；Al-Qurainy and Abdel-Megeed，2009；Forlani et al.，2011)，细菌主要包括：假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、节细菌属(Arthrobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、黄单胞杆菌属(Xanthamonus)、固瘤细菌属(Azotomonus)、硫杆菌属(Thiobacillus)等，其中假单胞菌属的菌株最活跃，对多种有机磷农药具有降解作用。真菌主要包括：曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Pinicielium)、木霉属(Trichoderma)、酵母菌(Saccharomyces)等。细菌由于其生理生化的多种适应能力以及容易诱发突变菌株，在降解有机磷农药的微生物中占有重要地位，因此对细菌的研究比较全面和深入。
[0007] 植物根围存在着大量微生物，自由生活在土壤或附生于植物根的一类可促进植物生长及其对矿质营养的吸收和利用，并能抑制有害微生物的有益菌类统称为植物根际促生菌(Plant Growth-Promoting Rhizobacteria，简称PGPR)。PGPR的作用机制为通过定殖于植物根系，优先占领根际，诱导植物产生IAA等生长激素，加速土壤磷、铁等养素循环，促进植物生长发育；提高植物对病原菌和环境胁迫的抗性和忍耐力；通过抑制拮抗根际的病原菌来保护植物，往往产生抗生素、铁载体、HCN、水杨酸，诱导ISR等抗性因子，帮助植物抵抗多种病原菌的侵害(Compant et al.，2010；康贻军等，2010)。
[0008] 由于PGPR具有改良土壤、改善作物品质、减少化肥和农药施用量、降低植物病害、提高作物产量等作用，因此，其自身及与菌根真菌的协同作用在农林牧业、食品安全、环境保护等方面具有重大应用潜势和价值。
[0009] 作为一类重要的植物根际促生菌，嗜铁细菌在促进植物生长和防治植物病害方面都发挥了很大的作用。研究证实嗜铁菌产生的嗜铁素可与植物根际病原微生物争夺有限的铁营养，从而抑制病原微生物生长繁殖，起到生物防治作用；同时植物可以利用微生物产生的嗜铁素螯合的铁，从而改善植物的铁营养，防治土壤植物缺铁失绿症的发生，促进植物生长(Miethke and Marahiel，2007；余贤美，2009)。国内外学者对嗜铁菌的筛选，嗜铁菌的防病促生效果及其机理，以及嗜铁素合成相关基因等方面进行了广泛的研究。
[0010] 在土壤污染生物修复过程中，土壤、植物与微生物间相互作用，微生物可通过促进植物生长、为植物提供营养物质或产生抗性代谢产物控制植物病害等方式，加快土壤污染植物修复的效率，增强修复效果。但是，迄今为止，植物根际促生菌(杨蓉等，2012；郭长虹等，2012)和用于有机磷农药污染土壤生物修复的微生物(彭霞薇等，2011；姜健等2012)是分开筛选研究的，即使发现某菌株具有营养、抑病及降解有机磷农药的功能(吴皓琼等，2012)，但并没有涉及同时具有这几种功能的菌株的具体筛选方法。
[0011] 主要参考文献：
[0012] 郭子武.笋用竹林地有机农药污染土壤微生物修复机理研究.中国林业科学研究院博士学位论文，2008.
[0014] 康纪婷.有机磷农药草甘膦降解菌的筛选、分离及其鉴定.四川农业大学硕士学位论文，2010.
[0015] 康贻军，程洁，梅丽娟，等.植物根际促生菌作用机制研究进展.应用生态学报，2010，21(1)：232-238.
[0016] 彭霞薇，姜丹，荆梦，安晓宇，杨建州，白志辉.2011.一株降解有机磷农药的芽孢杆菌及其菌剂的生产方法.发明专利号：CN101705201B.
[0017] 吴皓琼，牛彦波，曹亚彬，郭立姝，殷博.2012.一种具有营养、抑病及降解有机磷农药的枯草芽孢杆菌.发明专利号：CN101787354B.
[0018] 杨蓉，侯敏，詹发强，张慧涛，侯新强，龙宣杞，崔卫东，林瑞峰，2012.一种蜡状芽孢杆菌及其作为植物根际促生菌的应用.发明专利号：CN102321554B.
[0019] 余贤美.海南岛橡胶根际嗜铁细菌B.subtilis CAS15筛选及嗜铁素基因dhbC克隆、表达与功能分析.山东农业大学博士学位论文，2009.
[0020] 赵宇蕾.联苯菊酯降解菌的筛选鉴定、降解特性及应用研究.西北农林科技大学硕士学位论文，2009.
[0021] Al-Qurainy F，Abdel-Megeed A.Phytoremediation and detoxification of two organophosphorus pesticides residues in Riyadh area.World Appl Sci J，2009，6：987-998.
[0022] Carvalho FP.Agriculture，pesticides，food security and food safety.Environ Sci Policy，2006，9：685-692.
[0023] Compant S，Clément C，Sessitsch A.Plant growth-promoting bacteria in the rhizo-and endosphere of plants：their role，colonization，mechanisms involved and prospects for utilization.Soil Biol Biochem，2010，42：669-678.
[0024] Cooper J，Dobson H.The benefits of pesticides to mankind and the environment.Crop Prot，2007，26：1337-1448.
[0025] Costa LG， Cole TB，Jansen KL，Furlong CE.Paraoxonase(pon1)and organophosphate toxicity(Mackness B，ed.).The Netherlands：Springer Press，2008，209-220.
[0026] Eddleston M，Bateman DN.Pesticides.Medicine，2007，35(12)：646-648.[0027] Forlani Ｇ， Prearo Ｖ，Wieczorek D，Kafarski Ｐ，Lipok J.Phosphonate degradation by Spirulina strains：Cyanobacterial biofilters for the removal of anticorrosive polyphosphonates from wasterwater.Enz Microb Technol，2011，48：299-305.
[0028] Fox EM，Mendz GL.Phosphonate degradation in microorganisms.Enzyme Microb Technol，2006，40：145-150.
[0029] Mansour SA，Gad MF.Risk assessment of pesticides and heavy metals contaminants in vegetables：a novel bioassay method using Daphnia magna Straus.Food Chem Toxocol，2010，48：377-389.
[0030] Miethke M，Marahiel MA.Siderohore-based iron acquisition and pathogen control.Microbiol Mol Biol Rev，2007，71：413-451.发明内容：
[0031] 本发明就是针对上述问题，提供一种筛选具有植物根际促生菌特征的有机磷农药降解细菌的方法，使之具有防治植物病害、促进植物生长以及降解有机磷农药的多重功能。
[0032] 本发明所提供的筛选具有防治植物病害、促进植物生长和降解有机磷农药多功能菌株的方法，具体步骤如下：
[0033] 1)菌株活化：挑取冷冻保藏的菌液，接种到LB液体培养基中，于30～37℃、150～200r/min下振荡培养24～48小时，然后在固体培养基平板上划线，30～37℃条件下培养过夜，挑取单菌落再次划线培养，活化好的菌株置于4℃冰箱保存备用，同时每隔2个月重新划线培养，以保证菌株的正常存活繁殖能力。
[0034] LB培养基配方为：
[0035]
[0036] 固体培养基：每1000mL培养基中添加17～20g琼脂粉。
[0037] 2)菌株驯化：在常用液体细菌培养基，如LB液体培养基，牛肉膏蛋白胨培养基中添加有机磷农药，农药浓度从50mg/L，100mg/L，200mg/L，逐渐递增，根据菌株对不同农药的耐受能力，设定不同的初始农药浓度以及递增幅度。将菌株接种于含有有机磷农药的液体培养基中，于30～37℃，150～200r/min条件下进行振荡培养48h，生长正常的菌株，再接种到含有更高浓度有机磷农药的液体培养基中，继续培养，如此逐渐增加有机磷农药的浓度，经驯化获得对有机磷农药具有较高耐受性的菌株。
[0038] 3)有机磷农药的降解检测：根据有机磷农药种类的不同，通过相应的有机磷农药检测方法，检测菌株对有机磷农药的降解作用。
[0039] 4)最佳降解条件的筛选：以LB为基础培养基，制备菌悬液，按一定的接种量接种到含有有机磷农药(从初始浓度到最高耐受浓度按一定的梯度设置浓度)的LB液体培养基中，30～37℃，150～200r/min条件下振荡培养，分别在培养12h，24h，36h，48h，60h和72h时测定菌株生长情况及对毒死蜱的降解情况，选出最适降解时间和最适降解浓度。在此基础上，研究温度、振荡速率、初始pH值、接种量、培养基种类、以及碳源、氮源和无机盐种类等因素对降解率的影响，筛选菌株对有机磷农药的最佳降解条件。
[0040] 5)模拟田间修复效果测定：通过盆钵试验，研究菌株对有机磷农药污染土壤的修复效果。制备接种菌悬液，接种到经121℃灭菌的土壤中，使得土壤中细菌的数量达到6
10cfu/g土，以添加有机磷农药而不接种细菌的灭菌土壤为对照，定期测定土壤中有机磷农药的残留含量，计算降解率，分析菌株对土壤中有机磷农药的降解效果，以此研究菌株对有机磷农药污染土壤的生物修复潜能。
10cfu/g土，以添加有机磷农药而不接种细菌的灭菌土壤为对照，定期测定土壤中有机磷农药的残留含量，计算降解率，分析菌株对土壤中有机磷农药的降解效果，以此研究菌株对有机磷农药污染土壤的生物修复潜能。
[0041] 本发明的有益效果：
[0042] 通常，筛选植物根际促生菌均是通过分离筛选拮抗菌或植物内生菌，然后通过温室盆栽试验研究其对植物的生长促进作用及对病害的防治效果。而真正施用到田间，因土壤微生物、土壤理化性质、土壤中的农药残留等各种生物与非生物因素的影响，所获得的效果远不如盆栽试验。除了防病促生作用有所降低之外，还有可能由于土壤中有机磷农药的残留，而所获得的菌株对有机磷农药没有降解能力，因而菌株在施入土壤之后无法生存繁殖，从而丧失了防病促生的作用。
[0043] 本发明方法得到的多功能菌株，由于同时具有防病促生及降解有机磷农药的功能，能够长期保持防病促生功能和降解有机磷农药能力的稳定性，不会因为培养代数的增加而削弱其各种功能；而且由于其功能的多样性，施入土壤后易于生存繁殖，从而更好的发挥其植物防病促生作用和降解有机磷农药的功能；另外，本发明方法操作简单，减少成本，省时省力。因此，本发明方法在多功能菌株的筛选及有机磷农药污染土壤的微生物修复等领域将会有广阔的应用前景。附图说明：
[0044] 图1表示盆钵试验中不同时期甜椒苗的株高。
[0045] 图2表示吸光度对磷含量的标准曲线。
[0046] 图3表示Bs-15菌株对草甘膦的降解曲线。
[0047] 图4表示不同初始浓度对Bs-15菌株降解草甘膦活性的影响。
[0048] 图5表示不同温度对Bs-15菌株降解草甘膦活性的影响。
[0049] 图6表示不同培养转速对Bs-15菌株降解草甘膦活性的影响。
[0050] 图7表示不同初始pH值对Bs-15菌株降解草甘膦活性的影响。
[0051] 图8表示不同接种量对Bs-15菌株降解草甘膦活性的影响。
[0052] 图9表示Bs-15菌株降解草甘膦培养基中碳源的优化。
[0053] 图10表示Bs-15菌株降解草甘膦培养基中氮源的优化。
[0054] 图１１表示Bs-15菌株降解草甘膦培养基中无机盐的优化。
[0055] 图12表示Bs-15对草甘膦的模拟田间修复效果。
[0056] 图13表示CAS17在CAS检测平板上产生的嗜铁圈。A：CAS17；B：对照；C：CAS空白平板。
[0057] 图14表示CAS17的生长曲线及对毒死蜱的降解曲线。
[0058] 图15表示不同初始浓度对CAS17降解毒死蜱活性的影响。
[0059] 图16表示不同环境温度对CAS17降解毒死蜱活性的影响。
[0060] 图17表示不同振荡速度对CAS17降解毒死蜱活性的影响。
[0061] 图18表示不同初始pH值对CAS17降解毒死蜱活性的影响。
[0062] 图19表示不同接种量对CAS17降解毒死蜱活性的影响。
[0063] 图20表示不同碳源对CAS17降解毒死蜱活性的影响。
[0064] 图21表示不同氮源对CAS17降解毒死蜱活性的影响。
[0065] 图22表示不同无机盐对CAS17降解毒死蜱活性的影响。
[0066] 图23表示CAS17对毒死蜱的模拟田间修复效果。
[0067] 图24表示基于16S rDNA序列构建的CAS17系统进化树。具体实施方式：
[0068] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法和技术手段，如无特殊说明，均为本领域技术人员所熟知的常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0069] 培养基的制备：
[0070] 1)LB液体培养基(pH7.0)的制备：将10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠和双蒸水混匀，并用双蒸水定容到1000mL，用氢氧化钠调pH值到7.0，分装后于121℃灭菌20min。
[0071] 2)LB固体培养基(pH7.0)的制备：将10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠、17～20g琼脂粉和双蒸水混匀，并用双蒸水定容到1000mL，用氢氧化钠调pH值到7.0，分装后于121℃灭菌20min。
[0072] 3)改良MM培养基的制备：40mmol/L3-（Ｎ-吗啉代)丙磺酸钠(用KOH调pH7.4)，2mmo/L K3PO4(pH7.0)，葡萄糖2％(W/V)，(NH4)2SO42.0g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，柠檬酸钠·2H2O1.0g/L，谷氨酸钾1.0g/L，色氨酸8.0mg/L，3.0nmol/L钼酸铵，400nmol/L H3BO3，
30nmol/LCoCl2，10nmol/L CuSO4，10nmol/L ZnSO4，80nmol/L MnCl2。将上述物质溶解混匀后定容至1000mL，分装后于121℃灭菌20min。
30nmol/LCoCl2，10nmol/L CuSO4，10nmol/L ZnSO4，80nmol/L MnCl2。将上述物质溶解混匀后定容至1000mL，分装后于121℃灭菌20min。
[0074] 5)Hogland营养液的制备：1mmol/L KH2PO4，5mmol/L KNO3，5mmol/L Ca(NO3)2，2mmol/L MgSO4，2.86g/L H3BO3，1.81g/L MnCl2·4H2O，0.22g/L ZnSO4·7H2O，0.08g/LCuSO4·5H2O，0.02g/L H2MoO4·H2O，将上述物质溶解混匀定容至1000mL，分装后于121℃灭菌20min。
[0075] 6)CAS检测平板的制作：
[0076] A.CAS蓝色检测液的制作
[0077] 溶液A：将0.07g的CAS(Chrome azurol S)溶于50mL去离子水中，再加入10mL1mmol/L的FeCl3溶液(含有10mmol/L的HCl)；
[0078] 溶液B：将0.06g的HDTMA(Hexadecyltrimethylammonium bromide)溶于40mL去离子水；溶液C：将A溶液沿着烧杯壁缓缓加入到B溶液中，轻轻晃动，使得溶液A与溶液B混合
[0079] 均匀，即得到溶液C：CAS蓝色检测液。121℃灭菌20min。
[0080] B.通用CAS检测平板制作
[0081] 先配制好1mmol/L的CaCl2溶液、1mmol/L的MgSO4·7H2O溶液、10％的酸水解酪蛋白溶液(121℃，15min单独灭菌)；再分别取2mL1mmol/L的CaCl2溶液、2mL1mmol/L的MgSO4·7H2O溶液、6mL10％的酸水解酪蛋白溶液，加入生物缓冲液Pipes(sigma)，调pH6.8～7.0。去离子水定容到1000mL。加入20g琼脂粉，分装后于121℃，灭菌15～20min。固体培养基灭菌后，温度降低到60℃时，以5mL CAS蓝色检测液/每100mL CAS培养基的量沿着三角瓶壁加入，混合均匀后倒平板。注意不要产生气泡，以免影响平板检测实验。
[0082] 实施例1：嗜铁细菌枯草芽孢杆菌Bs-15对草甘膦的降解
[0083] 一、嗜铁细菌B.subtilis Bs-15的防病促生作用
[0084] B.subtilis Bs-15(原编号为CAS15)筛选自橡胶树根际土壤，具有较强的产嗜铁素能力，对稻瘟病菌，芋疫病菌，西瓜枯萎病菌，辣椒枯萎病菌，西番莲茎基腐病菌、芒果炭疽病菌，瓜果腐霉等植物病原菌有较强的抑制作用【余贤美，郑服丛，林超，等。土壤产嗜铁素拮抗细菌CAS15的分离鉴定。植物保护学报，2009，36(2)：129-135】。
[0085] 采用盆钵试验，研究了嗜铁细菌B.subtilis Bs-15对甜椒枯萎病的生防效果及对甜椒生长的促进作用。这部分内容已发表【余贤美，周广芳，辛力。枯草芽孢杆菌Bs-15产嗜铁素条件及其对甜椒的防病促生效应，农药学学报，2010，12(2)：135-141】，在此细述，仅用于说明其防病促生作用。
[0086] 1、B.subtilis Bs-15接种物的制备
[0087] 将B.subtilis Bs-15接种到改良MM培养基中，于28℃下培养24h，用10mmol/L的无菌硫酸镁溶液制备成菌悬液。将菌悬液与盆装沙土混合物(经121℃灭菌20min，隔24h6
再灭菌1次，共2次)混匀，使沙土中的菌体密度约为7×10cfu/g。
再灭菌1次，共2次)混匀，使沙土中的菌体密度约为7×10cfu/g。
[0089] 2、辣椒枯萎病菌接种物的制备
[0090] 将辣椒枯萎病菌(Fusarium oxysporum Schl.f.sp)接种于PDA液体培养基中，于22℃条件下培养14d，过滤除去菌丝体。于8000r/min下离心20min，取上清液，重悬于10mmol/L的无菌硫酸镁溶液，获得分生孢子悬浮液，将其与沙土混合物(12∶5，V/V)混匀
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使其密度为3.75×10cfu/g。接种后的土壤装到聚乙烯袋中，20℃放置3～5d，使病原菌定殖于土壤中。
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使其密度为3.75×10cfu/g。接种后的土壤装到聚乙烯袋中，20℃放置3～5d，使病原菌定殖于土壤中。
[0092] 3、B.subtilis Bs-15对甜椒枯萎病的抑制作用
[0093] 采用盆钵土壤生物测定法，研究菌株Bs-15对甜椒枯萎病的抑制作用。将甜椒枯4
萎病菌侵染土壤、Bs-15侵染土壤、灭菌土和河沙混匀，使每克沙土中含有10 个辣椒枯萎病
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菌分生孢子，Bs-15菌体密度为10cfu/g。以不加Bs-15侵染土壤的混合沙土为对照。
萎病菌侵染土壤、Bs-15侵染土壤、灭菌土和河沙混匀，使每克沙土中含有10 个辣椒枯萎病
6
菌分生孢子，Bs-15菌体密度为10cfu/g。以不加Bs-15侵染土壤的混合沙土为对照。
[0094] 每盆装750g制备好的混合沙土，播10颗甜椒种子，共9盆，置于20℃、相对湿度为70％、光周期为16h的温室中培养。每周浇水1次及施用1次Hogland营养液。为研究铁离子的影响，在Hogland营养液中加入10μmol/L Fe-EDDHA(乙二胺二邻羟苯基大乙酸铁钠)。约28d后，测定其发病率。每个处理重复3次。
[0095] 甜椒枯萎病抑制效果通过以下公式计算：
[0096] 抑制率(％)＝(对照发病率-处理发病率)/对照发病率×100％
[0097] 4、B.subtilis Bs-15的系统诱导抗性
[0098] 将10颗甜椒种子播种于空白沙子中，5d后，将幼苗移栽到矿物纤维容器，使其根系位于2个容器。将Bs-15接种于底层根系根尖部位，2d后将枯萎病菌接种于根系茎基部。在整个试验过程中将Bs-15与枯萎病菌保持隔离，以消除生防菌株与病原菌的直接相互作用。将盆钵置于20℃、相对湿度为70％、光周期为16h的温室中培养。每周浇1次去离子水。移栽后20d，记录发病率。每个处理重复3次。
[0099] 结果显示，相对于对照，两种处理均显著降低了甜椒苗枯萎病的发病率(表1)。当Bs-15与枯萎病菌同时接种时，发病率为40％，比对照降低了32％，防效为44.4％；而在施用Bs-15后2d再接种枯萎病菌，并用矿物纤维隔离的处理方式，发病率仅为31％，比对照降低了41％，防效达到56.94％。该结果说明Bs-15可能通过产生系统诱导抗性从而增强了对甜椒枯萎病的抑制效果。
[0100] 为研究铁离子的影响，在Hogland营养液中加入10μmol/L Fe-EDDHA。结果发现，铁离子显著降低了Bs-15对甜椒枯萎病的抑制效果，同时接种与隔离处理的抑制率分别仅为12.50％和23.43％。
[0101] 表1盆钵试验中Bs-15对甜椒枯萎病的抑制效果*
[0102]1 2
[0103] *结果为3个重复的平均值±标准差。 直接抑制作用，系统诱导抗性。病害级别分为0-5级，从0级-无病症，到5级-整株死亡。
[0104] 5、B.subtilis Bs-15对甜椒的生长促进作用
[0105] 将甜椒种子洗净，用Bs-15菌悬液浸种8～10h，置于25℃恒温箱中使其发芽。以清水浸种为对照。胚芽冒出后将种子播于盆钵沙土中(每盆1颗)，处理与对照各30盆，置于20℃、相对湿度为70％的温室中。测定5个时间点(7d，14d，21d，28d和40d)的植株高度和50％开花时间，并于生长季末(80d)，通过平均单果重(g)，每株果实数量(个)及每株产量(g)等指标测定甜椒的产量。
[0106] Bs-15对甜椒的生长促进作用通过以下公式计算：
[0107] 增加百分率(％)＝(处理平均值-对照平均值)/对照平均值×100％
[0108] 对30株甜椒苗5个时间点的株高进行了测定，结果显示，处理与对照在第7d的株高分别为6.62和5.73cm，差异不显著，第14d达到显著性差异(P＜0.05)，第21d，28d和40d达到极显著差异(P＜0.01)(图1)，株高增加率分别为27.24％，54.53％，54.38％和
50.83％。表明B.subtilis Bs-15显著促进了甜椒苗的生长。
50.83％。表明B.subtilis Bs-15显著促进了甜椒苗的生长。
[0109] 记录了50％开花时间，并在生长季末(第80d)测定了平均单果重，每株果实数量和单株产量。结果显示，处理与对照间的数值均达到极显著差异(P＜0.01)。对照的50％开花时间为58.51d，而处理仅为41.25d，比对照提前了17.26d；处理的平均单果重，单株果实数量及单株产量比对照分别增加了36.92％，9.30％和49.68％(表2)。
[0110] 表2盆钵试验中种植后80d甜椒的产量
[0111]
[0112] 注：130个果实单果重的平均值，230株甜椒的平均值。
[0113] 二、B.subtilis Bs-15对草甘膦农药的驯化
[0114] 在LB液体培养基中添加草甘膦，浓度为25mg/L，50mg/L，100mg/L，200mg/L，400mg/L，1000mg/L以及更高的浓度。将菌株B.subtilis Bs-15接种到含有低浓度草甘膦的LB液体培养基中，于30℃摇床中以150r/min的振荡速率培养48h后，生长正常的菌株，再接种到含有更高浓度有机磷农药的培养基中继续培养。
[0115] 结果显示，Bs-15对草甘膦的最高耐受浓度可高达40000mg/L。
[0116] 三、草甘膦的降解检测
[0117] 将菌株Bs-15接种于LB液体培养基中，30℃，150r/min振荡培养48h后，用LB液体培养基将菌悬液调至OD600＝1.0左右，制成新鲜菌悬液，备用。
[0118] 将菌悬液按4％的接种量接种于含5000mg/L草甘膦的LB液体培养基中，37℃，150r/min培养3d。采用钼锑抗比色法，分别测定其培养前后总磷和无机磷含量，从而计算出培养前后有机磷农药含量的变化情况，得出菌株对有机磷农药的降解率。设三次重复，同时以不接菌只添加草甘膦的培养基为对照。
[0119] 钼锑抗比色法具有较好的准确度，适合定量分析，在定性鉴定上也有一定功效。该法的原理是：将有机磷转化成无机磷酸盐来测定总的磷含量，在转化后的溶液中加入一定量的显色剂生成磷钼蓝，在最大吸收波长测定吸光度A，浓度C与吸光度A具有很好的线性关系。具体步骤如下：
[0120] 1、测定波长的选择
[0121] 取两个50mL容量瓶，分别加入0ml、5ml磷标准液，再分别加入1mL抗坏血酸溶液，30s后加2mL钼酸铵显色液，用水稀释到刻度，以空白试剂为对照。在400～800波长之间进行全波长扫描，得出该溶液在波长720nm处有最大吸收，因此，采用720nm为测定波长。
[0122] 2、标准曲线的测定
[0123] 分别取0.05mL，0.1mL，0.2mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL，0.6mL，0.7mL和0.8mL(相当于含磷0.005mg，0.01mg，0.02mg，0.03mg，0.04mg，0.05mg，0.06mg，0.07mg和0.08mg)磷标准液于50mL容量瓶中，加入1mL抗坏血酸，30s后加2mL钼酸铵显色液，用水稀释到刻度，混匀。静置20min，以空白为对照，于720nm处测定吸光度，绘制标准曲线。得出线性回归方程2
为：y＝27.472x+0.0498，相关系数为R ＝0.9981(图2)。
为：y＝27.472x+0.0498，相关系数为R ＝0.9981(图2)。
[0124] 3、无机磷样品处理
[0125] 将菌株Bs-15液体培养3d，取5mL菌液置于100mL容量瓶中，加入1mL盐酸(1+1)和1mL硫酸(1+1)，加水30mL，酚酞2滴。用NaOH滴至淡红色，再加少量硫酸(1+1)使淡红色正好褪去。用水稀释到刻度，摇匀，为试样分解液，测定无机磷的含量。
[0126] 4、总磷样品的处理
[0127] 取5mL菌液置于锥形瓶中，加数粒沸石，加5mL硝酸(1+1)，2mL硫酸(1+1)和2mL30％H2O2，在电炉上加热消解，直至大部分样品被分解。在锥形瓶上放一漏斗，使水解液在锥形瓶内壁保持回流状态。冷却后再加入少量硫酸(1+1)，直到溶液清亮为止。冷却后调节酸度，加酚酞2滴，用NaOH滴至淡红色，再加少量硫酸(1+1)使淡红色正好褪去。将溶液转移到100mL容量瓶，定容，为试样分解液，测定总磷含量。
[0128] 5、有机磷含量的测定
[0129] 移取10mL试样分解液于50mL容量瓶中，加1mL抗坏血酸，30s后加2mL钼酸铵显色液，用水稀释至刻度，混匀。静置30min，以空白试剂为对照，于波长720nm处测定吸光度，从标准曲线上查出磷含量。
[0130] 6、降解率的计算
[0131] 草甘膦降解率(％)＝(M2-M1)/M2×100％
[0132] 其中，M1为培养后草甘膦含量；M2为培养前草甘膦含量；
[0133] 草甘膦含量(mg/L)＝总磷含量-无机磷含量。
[0134] 四、B.subtilis Bs-15对草甘膦的降解曲线
[0135] 将菌悬液以4％的接种量接种到含草甘膦5000mg/L的LB液体培养基中，于30℃摇床中以150r/min的振荡速率培养，分别在培养12h，24h，36h，48h，60h和72h时测定菌株Bs-15对草甘膦的降解情况，选出最适降解时间。
[0136] 结果显示，随着培养时间的延长，Bs-15对草甘膦的降解率不断提高，60h后趋于稳定，降解率可达63％左右，与72h无明显差异(图3)。因此，我们采用60h为最适降解时间。
[0137] 五、B.subtilis Bs-15对草甘膦的最适降解浓度
[0138] 将Bs-15菌悬液以4％的接种量分别接种到含有草甘膦浓度分别为2500mg/L，5000mg/L，10000mg/L、20000mg/L和40000mg/L的LB液体培养基中，于30℃摇床中以150r/min的振荡速率培养60h后，测定草甘膦的降解率，确定Bs-15对草甘膦的最适降解浓度。
[0139] 结果显示，在小于10000mg/L时，Bs-15对草甘膦的降解率无显著差异，可达67％左右，随着草甘膦浓度的增加，降解率逐渐降低，草甘膦浓度为40000mg/L时，降解率下降到23.4％(图4)。因此我们选用10000mg/L用于以下试验。
[0140] 六、B.subtilis Bs-15对草甘膦的降解特性
[0141] 1、最适降解温度
[0142] 将Bs-15菌悬液以4％的接种量接种到含草甘膦10000mg/L的LB液体培养基中，分别在20℃，25℃，30℃，35℃和40℃下以150r/min的振荡速率培养60h，测定不同生长温度下Bs-15对草甘膦的降解活性。
[0143] 结果显示，35℃条件下，Bs-15对草甘膦的降解率最高(图5)，因此，确定35℃为最适降解温度。
[0144] 2、最适振荡速率
[0145] 将Bs-15菌悬液以4％的接种量接种到含草甘膦10000mg/L的LB液体培养基中，35℃下分别以90r/min，120r/min，150r/min，180r/min和210r/min的振荡速率培养60h，测定其降解率，以确定最适振荡速率。
[0146] 结果显示，振荡速率为180r/min时，Bs-15对毒死蜱的降解率最高(图6)，因此，确定180r/min为最适振荡速率。
[0147] 3、最适初始pH值
[0148] 将Bs-15菌悬液以4％的接种量接种到含草甘膦10000mg/L的LB液体培养基(LB液体培养基的初始pH值分别为5，6，7，8和9)中，于35℃摇床中以180r/min的振荡速率培养60h后测定降解率，以确定最适初始pH值。
[0149] 结果显示，培养基初始pH值为8.0时，Bs-15对草甘膦的降解率最高(图7)，因此，将pH8.0确定为最适培养基初始pH值。
[0150] 4、最适接种量
[0151] 将Bs-15菌悬液分别以2％，4％，6％，8％和10％的接种量接种到含草甘膦10000mg/L的LB液体培养基中，于35℃摇床中以180r/min的振荡速率培养60h后测定降解率，确定其最适接种量。
[0152] 结果显示，接种量为4％时，Bs-15对草甘膦的降解率最高(图8)，因此，将4％确定为最适接种量。
[0153] 综上所述，Bs-15对草甘膦的最适降解温度为35℃，最适初始pH值为8.0，最适降解时间为60h，最适振荡速率为180r/min，最适接种量为4％。
[0154] 七、B.subtilis Bs-15对草甘膦降解培养基的优化
[0155] 1、最佳碳源的筛选
[0156] 以2％的蛋白胨为氮源，0.5％的NaCl为无机盐，分别用2％的麦芽糖、果糖、葡萄糖、蔗糖和甘露醇为碳源，pH值为8.0制作培养基对Bs-15菌株进行发酵培养，以不接入其他碳源的培养基为对照(草甘膦浓度均为10000mg/L)。60h后测定降解率，以确定最佳碳源。
[0157] 结果显示，添加果糖的培养基其降解率最高，为50.28％，不添加其他碳源时其降解率也达到了36.13％，说明Bs-15菌株可以以草甘膦为唯一碳源生长，但不能充分发挥其对草甘膦的降解作用。而添加麦芽糖、葡萄糖、蔗糖和甘露醇的培养基，其降解率反而比对照低，说明这几种物质妨碍了Bs-15菌株对草甘膦的降解(图9)。因此我们选用果糖为最佳碳源。
[0158] 2、最佳氮源的筛选
[0159] 以2％的果糖为碳源，0.5％的NaCl为无机盐，分别用2％的酵母粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、蛋白胨和牛肉浸膏为氮源，pH值为8.0制作培养基对Bs-15进行发酵培养，以不接入氮源的培养基为对照(草甘膦浓度均为10000mg/L)。60h后测定降解率，以确定最佳氮源。
[0160] 结果显示，酵母粉的效果最好，其降解率达到66.27％，其次是牛肉浸膏、大豆蛋白胨和胰蛋白胨，其降解率分别达到了61.66％、60.34％和60.12％，差异不显著。而不添加氮源的培养基中，菌株几乎不生长且无降解(图10)，说明氮源对菌株的生长是必不可少的。因此，我们选用酵母粉为最佳氮源。
[0161] 3、最佳无机盐的筛选
[0162] 以2％的果糖为碳源，2％的酵母粉为氮源，分别用0.5％的硫酸镁、氯化钠、氯化钾和氯化钙为无机盐，pH值为8.0制作培养基对Bs-15进行发酵培养，以不加入无机盐的培养基为对照(草甘膦浓度均为10000mg/L)。60h后测定降解率，以确定最佳无机盐。
[0163] 结果显示，加入硫酸镁的降解效果明显高于其他几种，加入氯化钠、氯化钾和氯化2+ + +
钙的降解效果不如对照(图11)，说明Mg 能促进菌株Bs-15对草甘膦的降解，而Na、K 和
2+ 2+
Ca 不利于菌株Bs-15对草甘膦的降解。因此我们选用Mg 为最佳无机盐。
钙的降解效果不如对照(图11)，说明Mg 能促进菌株Bs-15对草甘膦的降解，而Na、K 和
2+ 2+
Ca 不利于菌株Bs-15对草甘膦的降解。因此我们选用Mg 为最佳无机盐。
[0164] 综上所述，有利于菌株Bs-15对草甘膦降解的最佳碳源为果糖，最佳氮源为酵母2+
粉，最佳无机盐为Mg ，如硫酸镁。
粉，最佳无机盐为Mg ，如硫酸镁。
[0165] 八、模拟田间修复效果测定
[0166] 采用投菌法将菌株接种于灭菌土壤，并用钼锑抗比色法检测接种前后土壤提取液中草甘膦的含量，测定菌株对草甘膦的模拟田间降解效果。具体步骤如下：
[0167] 1、土壤样品采集
[0169] 2、土壤中草甘膦的提取
[0170] 称取含有草甘膦的土壤样品5.0g置于50mL离心管中，加入10mL0.6mol/L KOH溶液，振荡2h后，4000r/min离心10min，取上清液，用0.6mol/LHCl调节溶液pH值至中性，用0.45μm滤膜过滤，定容后备用。
[0171] 3、菌株Bs-15菌悬液的制备
[0172] 将菌株Bs-15接种到LB液体培养基中，35℃，180r/min条件下振荡培养48h，8000r/min，离心5min，去除上清液，用无菌水反复冲洗，以去除残留养分，加入无菌水将OD600调至1.0左右，制成新鲜菌悬液，备用。
[0173] 4、菌株Bs-15对土壤中草甘膦的降解
[0174] 取土壤样品2kg，加到干净的塑料小桶(直径约为15cm，土壤的厚度约为10cm)中，然后向小桶中加入草甘膦农药溶液，充分混匀，使土壤中的草甘膦平均浓度达到4000mg/kg。取菌株Bs-15菌悬液，接种至小桶中，将菌悬液与添加草甘膦的灭菌土壤混匀，
6
使得土壤中菌株Bs-15的数量达到10 个/g土，设三个重复。在常温(20～30℃)避光培养。以添加农药但不接菌的作为对照。接种后每天取样，采用钼锑抗比色法测定草甘膦的含量。
6
使得土壤中菌株Bs-15的数量达到10 个/g土，设三个重复。在常温(20～30℃)避光培养。以添加农药但不接菌的作为对照。接种后每天取样，采用钼锑抗比色法测定草甘膦的含量。
[0175] 由于草甘膦的半衰期为10.86～16.08d【汪立高，杨仁斌，魏凤。土壤中残留草甘膦检测方法及其消解动态研究。湖南农业科学，2011，23：85-88】，因此，我们测定土壤中草甘膦的残留含量，只持续到接种后第11d。
[0176] 土壤中草甘膦降解率通过以下公式计算：
[0177] 降解率(％)＝(对照草甘膦含量-处理草甘膦含量)/对照草甘膦含量×100％[0178] 结果显示，灭菌土壤中草甘膦残留含量下降缓慢，而灭菌土壤添加菌液的处理，其草甘膦残留含量整体下降快，在前5d下降较快，第3d时残留量为2236.67mg/kg，降解率达到36.46％，第5d残留量为1592.3mg/kg，降解率达到50.89％；第6d之后，草甘膦残留含量的下降速度有所减缓，但降解效果一直持续增强，降解率为55.33％～66.97％(图12)。说明Bs-15对灭菌土壤中的草甘膦有较好的降解效果，表明，Bs-15对草甘膦污染的土壤有良好的修复潜能，即使施用到田间，应该也能够达到较好的修复效果。
[0179] 实施例2：嗜铁细菌CAS17的分离鉴定及对毒死蜱的降解
[0180] 一、菌株CAS17的分离筛选
[0181] 采集苹果、梨、核桃等果树的根际土壤，带回实验室，自然风干后经20目过筛备用。
[0182] 取1g土样，加入50mL灭菌蒸馏水，于室温150r/min条件下振荡培养2h，静置取上清液，通过CAS检测平板法和平板稀释法进行分离筛选。根据橘黄色晕圈的有无及大小筛选出产嗜铁素能力较强的菌株。CAS17具有较强的嗜铁能力，产生较大的橘黄色晕圈(图13)。纯化后4℃保存备用。
[0183] 二、菌株CAS17对毒死蜱的驯化
[0184] 将菌株CAS17接种于含有毒死蜱(浓度为50mg/L)的LB液体培养基中，30℃，150r/min振荡培养72h，取1mL接入到含100mg/L毒死蜱的LB液体培养基中，以同样的方法培养，直到毒死蜱的浓度达到800mg/L(毒死蜱浓度由低到高依次为50mg/L，100mg/L，
200mg/L，400mg/L及800mg/L)。根据菌株生长情况，确定菌株CAS17可耐受的毒死蜱浓度。
200mg/L，400mg/L及800mg/L)。根据菌株生长情况，确定菌株CAS17可耐受的毒死蜱浓度。
[0185] 结果显示，CAS17对毒死蜱具有较高的耐受力，毒死蜱浓度为800mg/L时仍可正常生长。
[0186] 三、毒死蜱的降解检测
[0187] 将菌株CAS17接种于含有毒死蜱100mg/L的LB液体培养基中，30℃，150r/min振荡培养72h，备用。
[0188] 用石油醚配制不同浓度的毒死蜱溶液，在紫外分光光度计下扫描，确定最大吸收波长，测定吸光值并绘制标准曲线。同时对石油醚进行扫描，确定其对毒死蜱的吸收有无影响。
[0189] 将培养72h的菌液10000r/min离心，取上清液用等体积的石油醚萃取，剧烈振荡提取2min，静置20min，分层，收集有机相，按此步骤再重复萃取一次，合并两次提取液后在紫外分光光度计下检测。
[0190] 毒死蜱降解率通过以下公式计算：
[0191] 降解率(％)＝(对照培养液的吸光值-接菌培养液的吸光值)/对照培养液的吸光值×100％
[0192] 结果显示，毒死蜱在290nm处有最大吸收峰，而石油醚在此处没有吸收，因此确定采用290nm波长对毒死蜱进行检测。
[0193] 四、降解菌的生长与降解曲线
[0194] 将菌株接种于LB液体培养基中，30℃，150r/min振荡培养48h，用LB液体培养基将OD600调至1.0左右，制成菌悬液，备用。
[0195] 将制备的菌悬液以4％的接种量接种到含毒死蜱100mg/L的LB液体培养基中，于30℃摇床中以150r/min的振荡速率培养，分别在培养12h，24h，36h，48h，60h和72h时测定菌株生长情况及对毒死蜱的降解情况，选出最适降解时间。
[0196] 结果显示，CAS17在生长24h后即进入稳定期，48h后进入衰退期。从降解方面看，在菌株生长过程中其降解率不断提高，在48h后趋于稳定，降解率可达67％左右，与72h的降解率无明显差异(图14)。为了缩短试验时间，同时结合菌株的生长曲线，我们采用48h为最适降解时间。
[0197] 五、降解菌对毒死蜱的最适降解浓度
[0198] 将制备的菌悬液以4％的接种量分别接种到含有毒死蜱浓度分别为25mg/L，50mg/L，100mg/L，200mg/L和400mg/L的LB液体培养基中，于30℃摇床中以150r/min的振荡速率培养48h后，测定毒死蜱的降解情况，确定CAS17对毒死蜱的最适降解浓度。
[0199] 结果显示，在小于100mg/L时，CAS17对毒死蜱的降解率无显著差异，可达67％左右，随着毒死蜱浓度的增加，其降解率在逐渐降低，在毒死蜱浓度为400mg/L时，其降解率下降到43.9％(图15)。因此我们选用最接近于田间残留浓度的100mg/L用于以下试验。
[0200] 六、CAS17对毒死蜱的降解特性
[0201] 1、最适降解温度
[0202] 将制备的菌悬液以4％的接种量接种到含毒死蜱100mg/L的LB液体培养基中，分别在20℃，25℃，30℃，35℃和40℃下以150r/min的振荡速率培养48h，测定在不同生长温度下CAS17对毒死蜱的降解活性，确定最适降解温度。
[0203] 结果显示，30℃条件下，CAS17对毒死蜱的降解率最高(图16)，因此，确定30℃为最适降解温度。
[0204] 2、最适振荡速率
[0205] 将制备的菌悬液以4％的接种量接种到含毒死蜱100mg/L的LB液体培养基中，30℃下分别以90r/min，120r/min，150r/min，180r/min和210r/min的振荡速率培养48h，测定降解率以确定最适振荡速率。
[0206] 结果显示，振荡速率为150r/min时，CAS17对毒死蜱的降解率最高(图17)，因此，确定150r/min为最适振荡速率。
[0207] 3、最适初始pH值
[0208] 将制备的菌悬液以4％的接种量接种到含毒死蜱100mg/L的LB液体培养基(LB液体培养基的初始pH值分别为5，6，7，8和9)中，于30℃摇床中以150r/min的振荡速率培养48h后测定降解率，以确定最适初始pH值。
[0209] 结果显示，培养基初始pH值为7.0时，CAS17对毒死蜱的降解率最高(图18)，因此，将pH7.0确定为最适培养基初始pH值。
[0210] 4、最适接种量
[0211] 将制备的菌悬液分别以2％，4％，6％，8％和10％的接种量接种到含毒死蜱100mg/L的LB液体培养基中，于30℃摇床中以150r/min的振荡速率培养48h后测定降解率，确定最适接种量。
[0212] 结果显示，接种量为4％时，CAS17对毒死蜱的降解率最高(图19)，因此，将4％确定为最适接种量。
[0213] 综上所述，CAS17对毒死蜱的最适降解温度为30℃，最适初始pH值为7.0，最适降解时间为48h，最适振荡速率为150r/min，最适接种量为4％。
[0214] 七、CAS17降解毒死蜱培养基的优化
[0215] 1、最佳碳源的筛选
[0216] 以2％的蛋白胨为氮源，0.5％的NaCl为无机盐，分别用2％的麦芽糖、果糖、葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖和甘露醇为碳源，pH值为7.0制作培养基对筛选出的菌株进行发酵培养，以不接入其他碳源的培养基为对照(毒死蜱浓度均为100mg/L)。48h后测定降解率，确定最佳碳源。
[0217] 结果显示，添加葡萄糖的培养基，其降解率最高，为22.07％，其次为蔗糖，其降解率为21.8％，不添加其他碳源时其降解率也达到了16.94％，说明CAS17菌株可以以毒死蜱为唯一碳源生长，但影响了菌株对毒死蜱的降解活性。而添加麦芽糖、果糖、可溶性淀粉和甘露醇的培养基其降解率反而比对照还要低，说明这几种物质妨碍了CAS17菌株对毒死蜱的降解(图20)。因此我们选用葡萄糖为最佳碳源。
[0218] 2、最佳氮源的筛选
[0219] 以2％的葡萄糖为碳源，0.5％的NaCl为无机盐，分别用2％的酵母粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、蛋白胨和牛肉浸膏为氮源，pH值为7.0制作培养基对筛选出的菌株进行发酵培养，以不接入氮源的培养基为对照(毒死蜱浓度均为100mg/L)。48h后测定降解率，确定最佳氮源。
[0220] 结果显示，胰蛋白胨和酵母粉的效果最好，其降解率分别达到了70.35％和63.58％，二者差异不显著。其他几种氮源的添加也均能使菌株对毒死蜱有较好的降解。而不添加氮源的培养基中，菌株几乎不生长且无降解(图21)，说明氮源对菌株CAS17的生长是必不可少的。考虑到酵母粉比胰蛋白胨的价格更实惠，我们选用酵母粉为最佳氮源。
[0221] 3、最佳无机盐的筛选
[0222] 以2％的葡萄糖为碳源，2％的蛋白胨为氮源，分别用0.5％的硫酸镁、氯化钠、氯化锌、氯化钾和氯化钙为无机盐，pH值为7.0制作培养基对筛选出的菌株进行发酵培养，以不加入无机盐的培养基为对照(毒死蜱浓度均为100mg/L)。48h后测定降解率，确定最佳无机盐。
[0223] 结果显示，加入氯化钙的降解效果明显高于其他几种无机盐，加入氯化钠和氯化2+
锌的降解效果还不如不添加无机盐的对照(图22)，说明Ca 能促进CAS17菌株对毒死蜱的+ 2+ 2+
降解，而Na 和Zn 不利于CAS17菌株对毒死蜱的降解。因此我们选用Ca 为最佳无机盐。
锌的降解效果还不如不添加无机盐的对照(图22)，说明Ca 能促进CAS17菌株对毒死蜱的+ 2+ 2+
降解，而Na 和Zn 不利于CAS17菌株对毒死蜱的降解。因此我们选用Ca 为最佳无机盐。
[0224] 综上所述，有利于CAS17对毒死蜱降解的最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为酵母粉，2+
最佳无机盐为Ca ，如氯化钙。
最佳无机盐为Ca ，如氯化钙。
[0225] 八、模拟田间修复试验
[0226] 1、菌悬液的制备
[0227] 将CAS17接种在LB液体培养基中，30℃培养48h后，8000r/min，离心5分钟，去除上清液，用无菌水反复冲洗，以去除残留养分，加入无菌水将OD600调到1.0左右，制成新鲜菌悬液，备用。
[0228] 2、土壤中毒死蜱的提取
[0229] 每个样品各取5g土壤于100mL的三角瓶中，用20mL石油醚，25℃恒温振荡1h，离心，过滤，重复一次，收集滤液合并在50mL容量瓶中，定容用于测定毒死蜱的残留量。
[0230] 3、盆钵试验
[0231] 取蔬菜大棚的新鲜土，自然风干后，过20目筛，以无菌水调节湿度为10％，装入瓶中，121℃高压灭菌2h。灭菌后冷却至室温，装在棕色瓶中，添加毒死蜱浓度为100mg/kg。将6
添加毒死蜱的灭菌土壤与新鲜菌悬液混和，使得土壤中CAS17细菌接种量为10 个/g土，设三个重复。在黑暗条件下30℃培养，每5d测定土壤中毒死蜱的残留量，培养期间，补充喷无菌水保持土壤含水量在10％左右。以只添加毒死蜱而不添加菌悬液的灭菌土壤为对照。
添加毒死蜱的灭菌土壤与新鲜菌悬液混和，使得土壤中CAS17细菌接种量为10 个/g土，设三个重复。在黑暗条件下30℃培养，每5d测定土壤中毒死蜱的残留量，培养期间，补充喷无菌水保持土壤含水量在10％左右。以只添加毒死蜱而不添加菌悬液的灭菌土壤为对照。
[0232] 土壤中毒死蜱降解率通过以下公式计算：
[0233] 降解率(％)＝(对照毒死蜱残留量-处理毒死蜱残留量)/对照毒死蜱残留量×100％
[0234] 结果显示，灭菌土壤中，毒死蜱残留量下降缓慢，第20d残留量为88.16mg/kg。灭菌土壤加菌液的处理，毒死蜱的残留量下降迅速，第10d残留量为40.6mg/kg，降解率为54.60％，第10d以后，毒死蜱的残留量下降速度有所减缓，但降解仍在继续，第15d和第20d的降解率分别为70.71％和80.75％(图23)。说明菌株CAS17对灭菌土壤中的毒死蜱有较好的降解效果，表明，CAS17对毒死蜱污染的土壤有良好的修复潜能，即使施用到田间，应该也能够达到较好的修复效果。
[0235] 九、菌株CAS17的分子鉴定
[0236] 通过细菌16S rDNA序列分析对菌株CAS17进行分子鉴定。
[0237] 1、引物设计及PCR扩增
[0238] 以细菌16S rDNA通用引物P1F(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和P2R(5′-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3′)，通过PCR扩增获得菌株CAS17的16S rDNA基因片段，预获得1500bp左右的片段。反应体系：25μL体系中含有10×PCR buffer2.5μL，dNTPs(各2.5mmol/L)2.0μL，P1F(10μg/mL)1.0μL，P2R(10μg/mL)1.0μL，菌液1.0μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，ddH2O17.3μL。反应条件：94℃5min；94℃1min、64℃1min、72℃2min，30个循环；72℃10min。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。
[0239] 2、PCR产物的回收及连接转化
[0240] PCR产物，采用EasyP'ureTM Quick Gel Extraction Kit进行回收，操作步骤严格按照说明书进行。取1.0μL PCR回收产物与克隆载体连接，连接体系及反应，按照pEASY-T1Cloning Kit说明书进行。将连接产物转化且coli DH5α感受态细胞，涂平板，待菌液吸干后倒置平板于37℃培养12～16h；随机挑取白色单菌落到含有Amp50mg/L的LB液体培养基中，37℃，200～300r/min振荡培养过夜，然后以1.0μL菌液为模板进行PCR扩增反应，同时以无菌水为模板设为对照。
[0241] 3、测序及16S rDNA序列分析
[0243] 测序结果显示，所获得的基因片段为1542bp。通过Blastn搜索和DNAssist2.0软件进行序列比对，该片段与Brevibacterium halotolerans strain DSM8802菌株16S rDNA基因片段(NR-042638)在覆盖范围内仅有一个碱基的差异，具有99.9％的同源性，系统进化树显示，该片段与Brevibacterium halotolerans strain DSM8802(NR-042638)亲缘关系最近(图24)，因此将该菌株鉴定为耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)，并将该序列提交到GenBank(登录号：JX644589)。
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