大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES在协助合成植物Rubisco中的应用
阅读：484发布：2021-05-14
专利汇可以提供大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES在协助合成植物Rubisco中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES在协助合成 植物 Rubisco中的应用。本发明首先公开了大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的相关 生物 材料 在生物合成植物Rubisco中的应用；所述大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES由GroEL蛋白和GroES蛋白组成。本发明进一步公开了生物合成植物Rubisco的方法。本发明构建了以大肠杆菌分子伴侣GroES/EL与植物分子伴侣作为分子伴侣系统共同在大肠杆菌MGM100菌株中合成拟南芥Rubisco的体系，可以有效合成拟南芥Rubisco，简化了拟南芥Rubisco的合成体系，为后续改造Rubisco提供了便利。，下面是大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES在协助合成植物Rubisco中的应用专利的具体信息内容。
1.大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的相关生物材料在生物合成植物Rubisco中的应用；所述大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES由GroEL蛋白和GroES蛋白组成，所述大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的相关生物材料为如下任一所述：
A1)所述GroEL蛋白和所述GroES蛋白；所述GroEL蛋白为序列16所示的核酸分子编码的蛋白质，所述GroES蛋白为序列17所示的核酸分子编码的蛋白质；
A2)编码A1)所述蛋白质的核酸分子；
A3)含有A2)所述核酸分子的表达盒；
A4)含有A2)所述核酸分子的重组载体，或含有A3)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A2)所述核酸分子的重组微生物，或含有A3)所述表达盒的重组微生物；含有A4)所述重组载体的重组微生物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述A2)中编码所述GroEL蛋白的核酸分子为序列16所示，编码所述GroES蛋白的核酸分子为序列17所示。
3.权利要求1中所述的大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES相关生物材料和植物分子伴侣的相关生物材料在生物合成植物Rubisco中的应用，
所述植物分子伴侣由Raf1、Raf2、RbcX2和BSD2蛋白组成，所述植物分子伴侣的相关生物材料为如下任一所述：
B1)所述Raf1蛋白、所述Raf2蛋白、所述RbcX2蛋白和所述BSD2蛋白；所述Raf1蛋白为序列11所示的核酸分子编码的蛋白质，所述Raf2蛋白为序列13所示的核酸分子编码的蛋白质，所述RbcX2蛋白为序列14所示的核酸分子编码的蛋白质，所述BSD2蛋白为序列15所示的核酸分子编码的蛋白质；
B2)编码B1)所述蛋白质的核酸分子；
B3)含有B2)所述核酸分子的表达盒；
B4)含有B2)所述核酸分子的重组载体，或含有B3)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B2)所述核酸分子的重组微生物，或含有B3)所述表达盒的重组微生物；含有A4)所述重组载体的重组微生物。
4.含有编码权利要求1中所述的大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的核酸分子的大肠杆菌在生物合成植物Rubisco中的应用。
5.含有编码权利要求1中所述的大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的核酸分子的大肠杆菌和表达权利要求3中所述的植物分子伴侣的载体在生物合成植物Rubisco中的应用。
6.一种生物合成植物Rubisco的产品，其特征在于：所述产品为权利要求1中所述的大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的相关生物材料。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于：所述产品还包括权利要求3中所述的植物分子伴侣的相关生物材料。
8.生物合成植物Rubisco的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将编码权利要求3中所述的植物分子伴侣的核酸分子和植物Rubisco的大亚基基因和小亚基基因导入到含有编码权利要求1中所述的大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的核酸分子的大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌，对重组大肠杆菌进行诱导培养，完成植物Rubisco的生物合成。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述诱导培养为利用阿拉伯糖进行诱导培养。
10.根据权利要求4或5所述的应用，或，权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述含有编码权利要求1中所述的大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的核酸分子的大肠杆菌为大肠杆菌MGM100。
大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES在协助合成植物Rubisco中的
应用
技术领域
背景技术
[0002] 植物的光合作用是维持生物圈稳定的重要途经，通过一系列的反应将大气中的H2O和CO2转化成碳水化合物，即CO2的固定。其中关键催化反应的酶为核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose-1，5-biphosphate carboxylase/oxygenase，简称Rubisco)，但是Rubisco固定CO2的效率非常低，提高Rubisco的羧化酶活性成为提高作物产量的靶点。因此，研究Rubisco的生物合成及调控逐渐成为研究的热点和难点，因为Rubisco的生物合成需要复杂的分子伴侣系统协助其折叠和组装。
[0003] 因此，迫切需要开发一种新的、简单的分子伴侣系统替代叶绿体的分子伴侣素Cpn60在大肠杆菌中对Rubisco进行组装。
发明内容
[0004] 本发明所要解决的技术问题是找到一种新的分子伴侣以合成植物Rubisco。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的相关生物材料在生物合成植物Rubisco中的应用；所述大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES由GroEL蛋白和GroES蛋白组成，所述大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的相关生物材料为如下任一所述：
[0006] A1)所述GroEL蛋白和所述GroES蛋白；所述GroEL蛋白为序列16所示的核酸分子编码的蛋白质，所述GroES蛋白为序列17所示的核酸分子编码的蛋白质；
[0007] A2)编码A1)所述蛋白质的核酸分子；
[0008] A3)含有A2)所述核酸分子的表达盒；
[0009] A4)含有A2)所述核酸分子的重组载体，或含有A3)所述表达盒的重组载体；
[0010] A5)含有A2)所述核酸分子的重组微生物，或含有A3)所述表达盒的重组微生物；含有A4)所述重组载体的重组微生物。
[0011] 上述应用中，所述A2)中编码所述GroEL蛋白的核酸分子为序列16所示，编码所述GroES蛋白的核酸分子为序列17所示。
[0012] 本发明中，所述序列16所示的核酸分子由1638个核苷酸序列组成，编码序列为1-1638位；所述序列17所示的核酸分子由291个核苷酸序列组成，编码序列为1-291位。
[0013] 上述大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES中GroEL蛋白和GroES蛋白是作为合成植物Rubisco的伴侣蛋白。
[0014] 本发明还提供了上述大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES和植物分子伴侣的相关生物材料在生物合成植物Rubisco中的应用；所述植物分子伴侣由Raf1、Raf2、RbcX2和BSD2蛋白组成，所述植物分子伴侣的相关生物材料为如下任一所述：
[0015] B1)所述Raf1蛋白、所述Raf2蛋白、所述RbcX2蛋白和所述BSD2蛋白；所述Raf1蛋白为序列11所示的核酸分子编码的蛋白质，所述Raf2蛋白为序列13所示的核酸分子编码的蛋白质，所述RbcX2蛋白为序列14所示的核酸分子编码的蛋白质，所述BSD2蛋白为序列15所示的核酸分子编码的蛋白质；
[0016] B2)编码B1)所述蛋白质的核酸分子；
[0017] B3)含有B2)所述核酸分子的表达盒；
[0018] B4)含有B2)所述核酸分子的重组载体，或含有B3)所述表达盒的重组载体；
[0019] B5)含有B2)所述核酸分子的重组微生物，或含有B3)所述表达盒的重组微生物；含有A4)所述重组载体的重组微生物。
[0020] 上述应用中，所述A2)中编码所述Raf1蛋白的核酸分子为序列11所示，编码所述Raf2蛋白为序列13所示，编码所述RbcX2蛋白为序列14所示，编码所述BSD2蛋白为序列15所示。
[0021] 本发明中，所述序列11所示的核酸分子由1170个核苷酸序列组成，编码序列为1-1170位；所述序列13所示的核酸分子由516个核苷酸序列组成，编码序列为1-516位；所述序列14所示的核酸分子由429个核苷酸序列组成，编码序列为1-429位；所述序列15所示的核酸分子由246个核苷酸序列组成，编码序列为1-246位。
[0022] 本发明含有编码上述大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的核酸分子的大肠杆菌在生物合成植物Rubisco中的应用。
[0023] 本发明还提供了含有编码上述大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的核酸分子的大肠杆菌和和表达上述植物分子伴侣(BSD2、Raf1、Raf2和RbcX2)的载体在生物合成植物Rubisco中的应用。
[0024] 上述应用中，表达植物分子伴侣(BSD2、Raf1、Raf2和RbcX2)的载体可以为一个也可以为多个。
[0025] 在本发明具体的实施方式中，所述植物分子伴侣BSD2、Raf1、Raf2和RbcX2为拟南芥分子伴侣AtBSD2、AtRaf1、AtRaf2和AtRbcX2，其构建在同一个载体上，所述载体为pT7linker2-AtBSD2-AtRaf1-AtRaf2-AtRbcX2。所述pT7linker2-AtBSD2-AtRaf1-AtRaf2-AtRbcX2包含依次连接的序列12第1215-2053位所示的大肠杆菌p15A复制子、序列12第194-853位所示的氯霉素抗性基因、序列7第994-2076位所示的LacI阻遏蛋白基因、序列7第
4505-4547位所示的Linker1、串联的AtBSD2基因表达盒、AtRaf1基因表达盒、AtRaf2基因表达盒和AtRbcX2基因表达盒、序列7第1-51位所示的Linker2；所述AtBSD2基因表达盒包含依次连接的序列5第1-19位所示的T7启动子、序列5第20-44位所示的Lac操纵子、AtBSD2基因和序列1第475-517位所示的T7转录终止子，所述AtRaf1基因表达盒包含依次连接的序列5第1-19位所示的T7启动子、序列5第20-44位所示的Lac操纵子、AtRaf1基因和序列1第475-
517位所示的T7转录终止子，所述AtRaf2基因表达盒包含依次连接的序列5第1-19位所示的T7启动子、序列5第20-44位所示的Lac操纵子、AtRaf2基因和序列1第475-517位所示的T7转录终止子，所述AtRbcX2基因表达盒包含依次连接的序列5第1-19位所示的T7启动子、序列5第20-44位所示的Lac操纵子、AtRbcX2基因和序列1第475-517位所示的T7转录终止子。
4505-4547位所示的Linker1、串联的AtBSD2基因表达盒、AtRaf1基因表达盒、AtRaf2基因表达盒和AtRbcX2基因表达盒、序列7第1-51位所示的Linker2；所述AtBSD2基因表达盒包含依次连接的序列5第1-19位所示的T7启动子、序列5第20-44位所示的Lac操纵子、AtBSD2基因和序列1第475-517位所示的T7转录终止子，所述AtRaf1基因表达盒包含依次连接的序列5第1-19位所示的T7启动子、序列5第20-44位所示的Lac操纵子、AtRaf1基因和序列1第475-
517位所示的T7转录终止子，所述AtRaf2基因表达盒包含依次连接的序列5第1-19位所示的T7启动子、序列5第20-44位所示的Lac操纵子、AtRaf2基因和序列1第475-517位所示的T7转录终止子，所述AtRbcX2基因表达盒包含依次连接的序列5第1-19位所示的T7启动子、序列5第20-44位所示的Lac操纵子、AtRbcX2基因和序列1第475-517位所示的T7转录终止子。
[0026] 本发明还提供了一种生物合成植物Rubisco的产品。
[0027] 本发明生物合成植物Rubisco的产品为如下任一所示：
[0028] B1)上述大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的相关生物材料；
[0029] B2)上述大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的相关生物材料和上述植物分子伴侣的相关生物材料。
[0030] 本发明还提供了一种生物合成植物Rubisco的方法。
[0031] 本发明所述生物合成植物Rubisco的方法，包括如下步骤：
[0032] 将编码上述植物分子伴侣的核酸分子和植物Rubisco的大亚基基因和小亚基基因导入到含有编码上述大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的核酸分子的大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌，对重组大肠杆菌进行诱导培养，完成植物Rubisco的生物合成。
[0033] 在本发明具体的实施方式中，所述植物Rubisco的大亚基基因的序列为序列4所示，所述植物Rubisco小亚基基因的序列为序列3所示，具体的，所述植物Rubisco的大亚基基因为拟南芥Rubisco的大亚基基因AtRbcL，所述植物Rubisco小亚基基因为拟南芥Rubisco小亚基基因AtRbcS，所述AtRbcS和AtRbcL构建在同一个载体上，所述载体为pTetlinker-AtRbcLS-AtRbcL，所述pTetlinker-AtRbcLS-AtRbcL包含依次连接的序列1第2574-3312位所示的大肠杆菌CDF复制子、序列1第1646-2434位所示的壮观霉素抗性基因、序列1第748-1371位所示的四环素抑制蛋白基因、序列1第265-295位所示的Linker1、串联的AtRbcS基因表达盒和AtRbcL基因表达盒、序列1第518-583位所示的Linker2；所述外源基因表达盒包含依次连接的序列1第296-386位所示的四环素诱导启动子、外源基因和序列1第475-517位所示的T7转录终止子；所述AtRbcS基因表达盒包含依次连接的序列1第296-
386位所示的四环素诱导启动子、AtRbcS基因和序列1第475-517位所示的T7转录终止子，所述AtRbcL基因表达盒包含依次连接的序列1第296-386位所示的四环素诱导启动子、AtRbcL基因和序列1第475-517位所示的T7转录终止子。
386位所示的四环素诱导启动子、AtRbcS基因和序列1第475-517位所示的T7转录终止子，所述AtRbcL基因表达盒包含依次连接的序列1第296-386位所示的四环素诱导启动子、AtRbcL基因和序列1第475-517位所示的T7转录终止子。
[0034] 本发明中，所述含有编码上述大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的核酸分子的大肠杆菌为大肠杆菌MGM100。
[0035] 本发明中，所述植物为拟南芥。
[0036] 本发明构建了以大肠杆菌分子伴侣GroES/EL与植物分子伴侣作为分子伴侣系统共同在大肠杆菌MGM100菌株中合成拟南芥Rubisco的体系，通过诱导大肠杆菌MGM100基因组上的GroEL/ES可以有效合成拟南芥Rubisco，避免了拟南芥Rubisco合成对叶绿体分子伴侣素Cpn60的依赖，极大的简化了拟南芥Rubisco的体外合成体系，为后续改造Rubisco和获取高羧化酶活性的Rubisco提供了便利。附图说明
[0037] 图1为大肠杆菌菌株MGM100的受到阿拉伯糖启动子pBAD的调控表达的示意图。
[0038] 图2为拟南芥Rubisco的合成；A为Western blot检测诱导后产物中的Rubisco的相对含量；左边条带为在MGM100中导入质粒1、质粒2和质粒3进行Rubisco的合成后检测Rubisco的合成量；右边为MGM1000中导入质粒1和质粒3进行Rubisco的合成后检测Rubisco的合成量；B为通过Rubisco酶活性测定检验Rubisco的相对含量；pCpn60/20为在MGM100中导入质粒1、质粒2和质粒3进行Rubisco的合成后检测活性；eGroEL/ES为MGM1000中导入质粒1和质粒3进行Rubisco的合成后检测活性。
具体实施方式
[0040] 实施例1质粒1：pTetlinker-AtRbcS-AtRbcL的构建
[0041] 一、构建pTetlinker载体
[0042] 一、构建pTetlinker载体
[0043] 1、用引物(pLCM1 For：cacggtcacactgcttccggta，pLCM1 Rev：gggatctcgaccgatgcccttgag)PCR扩增质粒pCDFDuet-1(购自addgene：http://
www.addgene.org/)，得到扩增片段A(序列1第1499-3479位)，所述扩增片段A包含大肠杆菌CDF复制子(序列1第2574-3312位)和壮观霉素抗性基因(序列1第1646-2434位)的表达盒。
www.addgene.org/)，得到扩增片段A(序列1第1499-3479位)，所述扩增片段A包含大肠杆菌CDF复制子(序列1第2574-3312位)和壮观霉素抗性基因(序列1第1646-2434位)的表达盒。
[0044] 2、用引物(pJKR-Tet For：agggcatcggtcgagatccc Gagtagggaactgccaggcatcaa，pJKR-Tet Rev3：gtgcttctcgcctgaggttCCGTGTGCTTCTCGCCTGAGGTT)PCR扩增质粒pJKR-H-TetR(购自addgene：http：//www.addgene.org/)，得到扩增片段B(序列2)，所述扩增片段B包含四环素抑制蛋白基因(序列2第1404-2027位)的表达盒和GFP基因表达盒(序列2第265-2128位)，所述GFP基因表达盒包含四环素诱导启动子(序列2第265-355位)、GFP基因和T7转录终止子(序列2第2086-2128位)。
[0045] 3、将上述得到的扩增片段A和扩增片段B无缝克隆连接，得中间载体pLCM1-Tet-GFP。用100ng/L四环素诱导pLCM1-Tet-GFP表达，检测GFP可以正常被诱导表达。
[0046]
[0047] 4、人工合成序列1第250-596所示的TetRlink元件，其中，该TetRlink元件包含linker1(序列1第265-295位)、四环素诱导启动子(序列1第296-386位)、T7转录终止子(序列1第475-517位)和Linker2(序列1第518-583位)；用引物(pTetR sy For：GCAAGTAAGGCCGACGAGCTTAA，pTetR sy Rev：GGTGTTAGCTGTGTCTCGCCAAGCTA)PCR扩增人工合成TetRlink元件，得到扩增片段C(序列1第250-596位)。
[0048] 5、用引物(pTet inter For：cgagacacagctaacaccacgtcgtccctat，pTet inter Rev：gctcgtcggccttacttgctagcagagttt)PCR扩增中间载体pLCM1-Tet-GFP，得到扩增片段D(序列1第1-268和第579-2479位)，所述扩增片段D包含大肠杆菌CDF复制子((序列1第2574-3312位)和壮观霉素抗性基因(序列1第1646-2434位)的表达盒、四环素抑制蛋白基因(序列
1第748-1371位，与序列2第1404-2027位序列相同)的表达盒。
1第748-1371位，与序列2第1404-2027位序列相同)的表达盒。
[0049] 6、将扩增片段C和扩增片段D无缝克隆连接，得到将中间载体pLCM1-Tet-GFP中GFP基因表达盒替换为TetRlink元件的质粒，命名为pTetlinker(具体序列如序列1所示)，包含大肠杆菌CDF复制子((序列1第2574-3312位)、壮观霉素抗性基因(序列1第1646-2434位)、四环素抑制蛋白基因(序列1第748-1371位)、link1(序列1第265-295位)、四环素诱导启动子(序列1第296-386位)、T7转录终止子(序列1第475-517位)和Linker2(序列1第518-583位)
[0050] 二、根据要克隆外源基因的序列设计引物，以含有外源基因AtRbcS(序列3所示)的DNA分子为模板，利用引物进行扩增获得包含外源基因AtRbcS的片段将AtRbcS基因克隆进pTetlinker载体
[0051] 1、用引物(AtRbcS-Tetlinker for：taagaaggagatatacat atgatggtctggaccccggtcaa，AtRbcS-Tetlinker rev：tcactcattagggttatgTTAcacggagcgcttgttggcgg)PCR扩增拟南芥AtRbcS基因，获得得到含有序列3所示的外源基因AtRbcS的扩增片段E；
[0052] 2、用引物(pTetRlinker For：CATAACCCTAATGAGTGAGCTAACTTACA，pTetRlinker Rev：CATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAATTTA)PCR扩增质粒pTetlinker，获得扩增片段F(序列1第419-3479位)。
[0053] 3、将扩增片段E和扩增片段F无缝克隆连接。
[0054] 4、转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，确证外源基因被克隆到pTetlinker载体中，命名为pTetlinker-AtRbcS。
[0055] 三、根据要克隆外源基因的序列设计引物，以含有外源基因AtRbcL(序列4所示)的DNA分子为模板，利用引物进行扩增获得包含外源基因AtRbcL的片段将AtRbcL基因克隆进pTetlinker载体：
[0056] 1、用引物(AtRbcL-Tetlinker for：taagaaggagatatacat atggttccacaaacagaaactaaa，AtRbcL-Tetlinker rev：tcactcattagggttatg
ttaaagtttgtcaatagtatcaaa)PCR扩增拟南芥AtRbcL基因，获得得到含有序列3所示的外源基因AtRbcL的扩增片段G。
ttaaagtttgtcaatagtatcaaa)PCR扩增拟南芥AtRbcL基因，获得得到含有序列3所示的外源基因AtRbcL的扩增片段G。
[0057] 2、用引物(pTetRlinker For：CATAACCCTAATGAGTGAGCTAACTTACA，pTetRlinker Rev：CATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAATTTA)PCR扩增质粒pTetlinker，获得扩增片段F(序列1第419-3479位)。
[0058] 3、将扩增片段G和扩增片段F无缝克隆连接。
[0059] 4、转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，确证外源基因被克隆到pTetlinker载体中，命名为pTetlinker-AtRbcL。
[0060] 四、AtRbcS和AtRbc L的串联获载体pTetlinker-AtRbcS-AtRbcL
[0061] 1、取pTetlinker-AtRbcS和pTetlinker-AtRbcL分别用PacI，SwaI配置如下反应体系，并在相应的酶活性最适温度下进行酶切反应，获得PacI酶切反应体系和SwaI酶切反应体系
[0062]
[0063] 2、将两个反应体系于65℃孵育20min使SwaI与PacI高温失活，得到SwaI酶切DNA产物和PacI酶切DNA产物；按如下体系加入相应组分(无需琼脂糖胶回收)，对于SwaI酶切DNA产物需加入dGTP，对于PacI酶切DNA产物需加入dCTP，体系混匀后于25℃孵育30min，得到经T4 DNA聚合酶处理过的两个反应体系。
[0064]
[0065] 3、将经T4 DNA聚合酶处理过的两个反应体系于65℃孵育20min使T4 DNA聚合酶失活，然后两个体系各取5uL，等体积混合，放入PCR仪中加热至65℃，并逐步降温至10℃，使两个片段通过退火连接在一起，得到终产物。
[0066] 4、取终产物转化E.coli DH5α感受态细胞，隔日挑选单克隆菌斑进行PCR验证阳性的克隆，其中，使用Linker1和Linker 2序列两侧引物(pQTEV3U：5′-TATAAAAATAGGCGTATCACGAGG-3′和pQTEV3L：5′-CCAGTGATTT TTTTCTCCAT TTT-3′)，退火温度59℃。
[0067] 验证阳性的克隆经测序确证后即为外源基因AtRbcL和AtRbcS串联表达载体，得质粒1：pTetlinker-AtRbcLS-AtRbcL。
[0068] 实施例2质粒2：pT7linker1-Cpn60α1β1/Cpn20的构建
[0069] 一、pT7linker1载体
[0070] 1、人工合成序列5所示的T7启动子-lac操纵子-T7终止子序列(该序列元件包含T7启动子(序列5第1-19位)、lac操纵子(序列5第20-44位)和T7转录终止子(序列5第161-203位))替换载本pQlinkN(Scheich，C.，Kummel，D.，Soumailakakis，D.，Heinemann，U.，Bussow，K.，Vectors for co-expression of an unrestricted number of proteins，Nucleic Acids Research，2007，Vol.35，No.6，e43.)中的Tac promoter-λt0 ter序列(如序列6所示)得pT7linker1载体，具体步骤如下：
[0071] 1、设计引物(T7 box for：gtcttgaggggttttttgagtaacaacaccatttaaatgga，T7 box rev：ctatagtgagtcgtattaacaattgaatctattataattgttatccgc)PCR扩增载体pQlinkN，得到序列7所示扩增片段H，所述扩增片段H包括LacI阻遏蛋白基因(序列7第994-2076位)的表达盒、大肠杆菌Col1复制子(序列7第2672-3260位)、氨苄青霉素抗性基因(序列7第3434-4291位)的表达盒、Linker1(序列7第4505-4547位)和Linker2(序列7第1-51位)。
[0072] 2、将扩增片段H与人工合成的序列5所示的T7启动子-lac操纵子-T7终止子序列无缝克隆连接，得到连接产物，体系同实施例1。
[0073] 3、取2μL连接产物转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，得到的质粒命名为pT7linker1，其包括T7启动子(序列5第1-19位)、lac操纵子(序列5第20-44位)和T7转录终止子(序列5第161-203位)、LacI阻遏蛋白基因(序列7第994-2076)的表达盒、大肠杆菌Col1复制子(序列7第2672-3260位)、氨苄青霉素抗性基因(序列7第3434-4291位)的表达盒、Linker1(序列7第4505-4547位)和Linker2(序列7第1-51位)。
[0074] 二、根据要克隆外源基因的序列设计引物，构建质粒pT7linker1-Cpn60α1。具体如下：
[0075] 1、用引物(AtCpn60α1_Nde for：ggaattccatatgggagctaagagaatactatacggt和AtCpn60α1_BamH rev：ggaattccatatgggagctaagagaatactatacggt)PCR扩增序列8所示的拟南芥负责Rubisco折叠的分子伴侣素蛋白基因AtCPN60α，得到含有序列8所示的拟南芥负责Rubisco折叠的分子伴侣素蛋白基因AtCPN60α1的扩增片段I。
[0076] 2、将pT7linker1载体和扩增片段I均用NdeI和BamHI酶切：2μL 10×NEBuffer，1μL NdeI和1μL BamH，500ng DNA并用ddH2O补足至20μL，最终于37℃孵育2小时，并用gel回收试剂盒回收酶切后的pT7linker1载体和扩增片段I。
[0077] 3、用T4 DNA连接酶连接两个回收的酶切后的pT7linker1载体和扩增片段I，得到终产物。
[0078]
[0079] 4、取2μL终产物转化E.coli DH5α，隔日挑选单克隆菌斑进行PCR验证，使用使用Linker1和Linker 2序列两侧引物序列两侧引物 (pQTEV3U：5 ′-TATAAAAATAGGCGTATCACGAGG-3′和pQTEV3L：5′-CCAGTGATTT TTTTCTCCAT TTT-3′)，退火温度59℃。
[0080] 5、转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，确证外源基因CrCPN60α被克隆到pT7linker1载体中，命名为pT7linker1-AtCPN60α。
[0081] 三、根据要克隆外源基因的序列设计引物，构建质粒pT7linker1-AtCpn60β1。具体如下：
[0082] 1、用引物(AtCpn60β1_Nde I：ggaattccatatggcagcaaaggaattacatttcaac；AtCpn60β1_BamH I：cgcggatccttagtatccatatcctgagttgt)PCR扩增序列9所示的拟南芥负责Rubisco折叠的分子伴侣素蛋白基因AtCPN60β1，得到含有序列9所示的拟南芥负责Rubisco折叠的分子伴侣素蛋白基因AtCPN60β1的扩增片段J。
[0083] 2、将pT7linker1载体和扩增片段J均用NdeI和BamHI酶切：2μL 10×NEBuffer，1μL NdeI和1μL BamH，500ng DNA并用ddH2O补足至20μL，最终于37℃孵育2小时。并用gel回收试剂盒回收酶切后的pT7linker1载体和扩增片段I。
[0084] 3、用T4 DNA连接酶连接两个回收的酶切后的pT7linker1载体和扩增片段J，得到终产物，连接体系同上述步骤二的连接体系。
[0085] 4、取2μL终产物转化E.coli DH5α，隔日挑选单克隆菌斑进行PCR验证，Linker1和Linker 2序列两侧引物序列两侧引物(pQTEV3U：5′-TATAAAAATAGGCGTATCACGAGG-3′和pQTEV3L：5′-CCAGTGATTT TTTTCTCCAT TTT-3′)，退火温度59℃。
[0086] 5、转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，确证外源基因AtCPN60β1被克隆到pT7linker1载体中，命名为pT7linker1-AtCPN60β1。
[0087] 四、根据要克隆外源基因的序列设计引物，以含有外源基因Cpn20(序列10所示的核酸分子)的DNA分子为模板，用引物(Cpn20_Nde I：ggaattccatatg gcttctgttgttgccccta，Cpn20_BamH I：cgcggatccctaagaaagtatagccatca)PCR扩增，获得PCR产物，Nde I和BamH I酶切PCR产物和pT7linker1载体，回收酶切后的产物，利用T4连接酶连接，得到的连接产物，转化后鉴定得质粒pT7linker1-Cpn20。
[0088] 1、用引物(AtCpn20_Nde I：ggaattccatatggcttctgttgttgccccta；AtCpn20_BamH I：cgcggatccctaagaaagtatagccatca)PCR扩增序列10所示的拟南芥负责Rubisco折叠的分子伴侣素蛋白基因AtCPN20，得到含有序列10所示的拟南芥负责Rubisco折叠的分子伴侣素蛋白基因AtCPN20的扩增片段L。
[0089] 2、将pT7linker1载体和扩增片段L均用NdeI和BamHI酶切：2μL 10×NEBuffer，1μL NdeI和1μL BamH，500ng DNA并用ddH2O补足至20μL，最终于37℃孵育2小时，并用gel回收试剂盒回收酶切后的pT7linker1载体和扩增片段L。
[0090] 3、用T4 DNA连接酶连接两个回收的酶切后的pT7linker1载体和扩增片段L，得到终产物，连接体系同上述步骤二的连接体系。
[0091] 4、取2μL终产物转化E.coli DH5α，隔日挑选单克隆菌斑进行PCR验证，Linker1和Linker 2序列两侧引物序列两侧引物(pQTEV3U：5′-TATAAAAATAGGCGTATCACGAGG-3′和pQTEV3L：5′-CCAGTGATTT TTTTCTCCAT TTT-3′)，退火温度59℃。
[0092] 5、转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，确证外源基因AtCPN20被克隆到pT7linker1载体中，命名为pT7linker1-AtCPN20。
[0093] 五、pT7linker1-Cpn60α1β1/Cpn20的构建
[0094] 1、取pT7linker1-Cpn60α1和pT7linker1-Cpn60β1分别用PacI，SwaI配置如下反应体系，并在相应的酶活性最适温度下进行酶切反应，获得PacI酶切反应体系和SwaI酶切反应体系
[0095]
[0096] 2、将两个反应体系于65℃孵育20min使SwaI与PacI高温失活，得到SwaI酶切DNA产物和PacI酶切DNA产物；按如下体系加入相应组分(无需琼脂糖胶回收)，对于SwaI酶切DNA产物需加入dGTP，对于PacI酶切DNA产物需加入dCTP，体系混匀后于25℃孵育30min，得到经T4 DNA聚合酶处理过的两个反应体系。
[0097]
[0098]
[0099] 3、将经T4 DNA聚合酶处理过的两个反应体系于65℃孵育20min使T4 DNA聚合酶失活，然后两个体系各取5 uL，等体积混合，放入PCR仪中加热至65℃，并逐步降温至10℃，使两个片段通过退火连接在一起，得到终产物。
[0100] 4、取终产物转化E.coli DH5α感受态细胞，隔日挑选单克隆菌斑进行PCR验证阳性的克隆，其中，使用Linker1和Linker 2序列两侧引物(pQTEV3U：5′-TATAAAAATAGGCGTATCACGAGG-3′和pQTEV3L：5′-CCAGTGATTT TTTTCTCCAT TTT-3′)，退火温度59℃。
[0101] 验证阳性的克隆经测序确证后即为外源基因Cpn60α1和Cpn60β1的串联载体，得质粒pT7linker1-Cpn60α1β1，重复以上4步将Cpn20再串联到外源基因CPN60α1、CPN60β1的串联载体pT7linker1-Cpn60α1β1上，得到外源基因CPN60α1、CPN60β1和Cpn20的串联载体，命名为pT7linker1-Cpn60α1β1/Cpn20。
[0102] 实施例3质粒3：pT7linker2-AtBSD2-AtRaf1-AtRaf2-AtRbcX2的构建
[0103] 一、构建pT7linker2载体
[0104] 1、合成引物(chl-p15A for：agcggtatcagctcactcaaaggcacggtcacactgcttccg，chl-p15A rev：aatggtttcttagacgtcaggtggccacaggtgcggttgctggc)PCR扩增质粒pACYC184(购自addgene：http://www.addgene.org/)，得到序列12所示的扩增片段M，所述扩增片段M包含大肠杆菌p15A复制子(序列12第1215-2053位)和氯霉素抗性基因(序列12第194-853位)。
[0105] 2、设计引物(pT7linker1 for：cacctgacgtctaagaaaccatt，pT7linker1 rev：Cctttgagtgagctgataccgct)扩增pT7linker1载体，得到去除pT7linker1载体上的大肠杆菌Col1复制子(序列7第2672-3260位)、氨苄青霉素抗性基因(序列7第3434-4291位)的表达盒的扩增片段N。
[0106] 3、将扩增片段M和扩增片段N无缝克隆连接，得到连接产物，体系如实施例1中无缝克隆连接体系：
[0107] 4、取2μL连接产物转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，得到的质粒命名为pT7linker 2，其包括T7启动子(序列5第1-19位)、lac操纵子(序列5第20-44位)和T7转录终止子(序列5第161-203位)、LacI阻遏蛋白基因(序列7第994-2076位)的表达盒、大肠杆菌p15A复制子(序列12第1215-2053位)和氯霉素抗性基因(序列12第194-853位)、Linker1(序列7第4505-4547位)和Linker2(序列7第1-51位)。
[0108] 二、根据要克隆外源基因的序列设计引物，以含有外源基因AtRaf1(序列11所示)的DNA分子为模板，利用引物进行扩增获得包含外源基因AtRaf1的片段将AtRaf1基因克隆进pT7linker2载体
[0109] 1、用引物(AtRaf1-T7linker2 For：agaaggagatatacatatg atgcaacagctctaccaacc，AtRaf1-T7linker2 Rev：gctttgttagcagccg
tcagtcccagttctgatgacttgt)PCR扩增AtRaf1，得到含有序列11所示AtRaf1的扩增片段O。
tcagtcccagttctgatgacttgt)PCR扩增AtRaf1，得到含有序列11所示AtRaf1的扩增片段O。
[0110] 2、设计引物(pT7linker 2 for cggctgctaacaaagcccgaaagg，pT7linker2 rev：atgtatatctccttcttaaagtta)PCR扩增pT7linker2载体，得到扩增片段P。
[0111] 3、扩增片段O和扩增片段P进行无缝克隆连接，得到连接产物，无缝克隆连接体系同实施例2。
[0112] 4、取2μL连接产物转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，得到的质粒命名为pT7linker2-AtRaf1。
[0113] 三、根据要克隆外源基因的序列设计引物，以含有外源基因AtRaf2(序列13所示)的DNA分子为模板，利用引物进行扩增获得包含外源基因AtRaf2的片段将AtRaf2基因克隆进pT7linker2载体
[0114] 1、用引物(AtRaf2-T7linker2 For：agaaggagatatacatatgatgtctaatctggcgcaggatt，AtRaf2-T7linker2 Rev：gctttgttagcagccgtcacgcccaagctcttttcctagg)PCR扩增基因AtRaf2，得到含有序列13所示AtRaf2的扩增片段Q。
[0115] 2、设计引物(pT7linker 2 for cggctgctaacaaagcccgaaagg，pT7linker2 rev：atgtatatctccttcttaaagtta)PCR扩增pT7linker2载体，得到扩增片段P。
[0116] 3、用T4 DNA连接酶连接两个回收的酶切后的pT7linker 2载体和扩增片段Q，得到终产物，连接体系同实施例2.
[0117] 4、取2μL终产物转化E.coli DH5α，隔日挑选单克隆菌斑进行PCR验证，使用Linker1和Linker2序列两侧引物序列两侧引物(pQTEV3U：5′-TATAAAAATAGGCGTATCACGAGG-3′和pQTEV3L：5′-CCAGTGATTT TTTTCTCCAT TTT-3′)，退火温度59℃。
[0118] 5、转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，确证外源基因AtRaf2被克隆到pT7linker2载体中，命名为pT7linker2-A tRaf2。
[0119] 四、根据要克隆外源基因的序列设计引物，以含有外源基因AtRbcX(序列14所示)的DNA分子为模板，利用引物进行扩增获得包含外源基因AtRbcX的片段将AtRbcX基因克隆进pT7linker2载体：
[0120] 1、用引物(AtRbcX-T7linker2 for：tatacatatgcggatgcatatccctgcgga，AtRbcX-T7linker2 rev：agccggatcctcacgcggcacccttgccggggc)PCR扩增AtRbcX，得到含有序列14所示AtRbcX的扩增片段R。
[0121] 2、将pT7linker 2载体和扩增片段R均用NdeI和BamHI酶切：2μL 10×NEBuffer，1μL NdeI和1μL BamH，500ng DNA并用ddH2O补足至20μL，最终于37℃孵育2小时，并用gel回收试剂盒回收酶切后的pT7linker 2载体和扩增片段R。
[0122] 3、用T4 DNA连接酶连接两个回收的酶切后的pT7linker 2载体和扩增片段R，得到终产物，连接体系同实施例2。
[0123] 4、取2μL终产物转化E.coli DH5α，隔日挑选单克隆菌斑进行PCR验证，使用Linker1和Linker2序列两侧引物序列两侧引物(pQTEV3U：5′-TATAAAAATAGGCGTATCACGAGG-3′和pQTEV3L：5′-CCAGTGATTT TTTTCTCCAT TTT-3′)，退火温度59℃。
[0124] 5、转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，确证外源基因AtRbcX被克隆到pT7linker2载体中，命名为pT7linker2-AtRbcX。
[0125] 五、根据要克隆外源基因的序列设计引物，以含有外源基因AtBSD2(序列15所示)的DNA分子为模板，利用引物进行扩增获得包含外源基因AtBSD2的片段将AtBSD2基因克隆进pT7linker2载体：
[0126] 1、用引物(AtBSD2-T7linker2 for：atatacatatggcaatagctccggagaca，AtBSD2-T7linker2 rev：gccggatccttagaaagcgctctggaagcc)PCR扩增AtBSD2，得到序列15所示AtBSD2的扩增片段S。
[0127] 2、将pT7linker 2载体和扩增片段S均用NdeI和BamHI酶切：2μL 10×NEBuffer，1μL NdeI和1μL BamH，500ng DNA并用ddH2O补足至20μL，最终于37℃孵育2小时，并用gel回收试剂盒回收酶切后的pT7linker 2载体和扩增片段S。
[0128] 3、用T4 DNA连接酶连接两个回收的酶切后的pT7linker 2载体和扩增片段S，得到终产物，连接体系同实施例2。
[0129] 4、取2μL终产物转化E.coli DH5α，隔日挑选单克隆菌斑进行PCR验证，使用Linker1和Linker2序列两侧引物序列两侧引物(pQTEV3U：5′-TATAAAAATAGGCGTATCACGAGG-3′和pQTEV3L：5′-CCAGTGATTT TTTTCTCCAT TTT-3′)，退火温度59℃。
[0130] 5、转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，确证外源基因AtBSD2被克隆到pT7linker2载体中，命名为pT7linker2-AtBSD2。
[0131] 六、多基因在pT7linker2载体中的串联，具体步骤如下：
[0132] 1、取克隆有不同外源基因pT7linker2载体(pT7linker2-AtRaf1和pT7linker2-AtRaf2)各500ng，用10μL不同的限制性内切酶体系进行酶切，两个载体分别使用SwaI(25℃，1h)和PacI(37℃，1h)，获得SwaI酶切反应体系和PacI酶切反应体系。
[0133] 2、将两个反应体系均于65℃孵育20分钟使SwaI或PacI失活，得到SwaI酶切DNA产物和PacI酶切DNA产物；各取5μL DNA产物，加入0.5μL T4 DNA聚合酶，2μL 10×NEBuffer 2.1，对于SwaI酶切DNA产物加入100mM dGTP 0.5μL，对于PacI酶切DNA产物加入100mM dCTP
0.5μL，并用ddH2O补足至20μL，最终于25℃孵育30分钟，得到经T4 DNA聚合酶处理过的两个反应体系。
0.5μL，并用ddH2O补足至20μL，最终于25℃孵育30分钟，得到经T4 DNA聚合酶处理过的两个反应体系。
[0134] 3、将经T4 DNA聚合酶处理过的两个反应体系等体积混合，放入PCR仪中加热至65℃，并逐步降温至10℃，使SwaI酶切DNA产物和PacI酶切DNA产物通过退火连接在一起，得到终产物。
[0135] 4、取2μL终产物转化E.coli DH5α，隔日挑选单克隆菌斑进行PCR验证，Linker1和Linker 2序列两侧引物序列两侧引物(pQTEV3U：5′-TATAAAAATAGGCGTATCACGAGG-3′和pQTEV3L：5′-CCAGTGATTT TTTTCTCCAT TTT-3′)，退火温度59℃。
[0136] 验证阳性的克隆经测序确证后即为外源基因AtRaf1和AtRaf2的串联载体。重复以上4步将AtBSD2再串联到外源基因AtRaf1和AtRaf2的串联载体上，得到外源基因AtRaf1、AtRaf2和AtBSD2的串联载体。重复以上4步将AtRbcX再串联到外源基因AtRaf1、AtRaf2和AtBSD2的载体上，得到外源基因AtRaf1、AtRaf2、AtBSD2和AtRbcX的串联载体，得质粒3：pT7linker2-AtBSD2-AtRaf1-AtRaf2-AtRbcX2。
[0137] 实施例4拟南芥Rubisco的合成
[0138] 一、大肠杆菌MGM100
[0139] 大肠杆菌MGM100购于The Coli Genetic Stock Centre(http://cgsc2.biology.yale.edu/)，groES和groEL被整合到大肠杆菌基因组中，受到阿拉伯糖启动子pBAD的调控表达。大肠杆菌MGM100菌株为groE操纵子的启动子被阿拉伯糖诱导型的pBAD启动子所替代的一类菌株。groE操纵子上含有编码GroEL，GroES等细胞生长所必须的基因，因此在普通的LB培养基中，MGM100菌株无法生长。当培养基中存在阿拉伯糖时，MGM100可正常生长。
[0140] 二、转化
[0141] 1、将实施例1的质粒1：pTetlinker-AtRbcS-AtRbcL、实施例2的质粒2：pT7linker1-Cpn60α1β1/Cpn20和实施例3的质粒3：pT7linker2-AtBSD2-AtRaf1-AtRaf2-AtRbcX2通过电击转化法导入大肠杆菌MGM100中，涂布含相应的抗生素平板筛选，获取阳性单菌落，作为pCpn60/20组；将实施例1的质粒1：pTetlinker-AtRbcS-AtRbcL和实施例3的质粒3：pT7linker2-AtBSD2-AtRaf1-AtRaf2-AtRbcX2通过电击转化法导入大肠杆菌MGM100中，涂布含相应的抗生素平板筛选，获取阳性单菌落，作为eGroEL/ES组；
[0142] 2、分别挑选上述两组的单菌落，接种至5ml LB液体培养基中(100mg/ml Kana+，100mg/ml Spe+，25mg/ml Chl+，0.02％阿拉伯糖)，37℃，200rpm培养至OD600约0.4；
[0143] 3、分别加入阿拉伯糖至2.0％，加入1M IPTG至0.5mM的终浓度，37℃，200rpm，诱导3h；
[0144] 4、分别取出菌液，1000g，室温离心10min，弃上清。并用新鲜的LB液体培养基悬浮菌液，1000g，室温离心10min，弃上清；
[0145] 5、分别加入含相应抗生素的LB液体培养基，同时加入四环素至300ng/ul，23℃诱导20h；
[0146] 6、分别收集菌液，用100μl的Rubisco assay buffer I(100mM Tris-Cl pH7.5，10mM KCl，2mM Mg(OAc)2)悬浮菌液，超声取pCpn60/20组和eGroEL/ES组上清，进行后续酶活性测定和Western blot检测。其中，所述酶活性测定方法如下：
[0147] 1、取15μl超声后菌液上清，同时15μl的Rubisco assay buffer I作为对照；
[0148] 2.将上清加入Rubisco酶活测定反应体系Rubisco assay buffer II(Rubisco assay buffer I 7.25μl，1M NaHCO3 0.75μl，1M MgCl2 1μl，NaH14CO3 1μl；其中，Rubisco assay buffer I 20 mM MOPS-KOH(pH 7.5)，100mM KCL，5mM Mg(OAc)2)：
[0149] 3.加入5μl 25mM RuBP，混匀，室温反应5min；
[0151] 5.打开离心管盖，移至预热到95℃的加热块，烘干1-2h；
[0152] 6.加入100μl ddH2O，涡旋，加入1ml闪烁液，液闪仪每个样品扫描1min。
[0153] 所述Western blot检测：
[0154] 1、取15μl菌液，加入5x SDS loading buffer，95℃变性失活5min。取10μl的样品装载在12％SDS-PAGE上电泳，200V，55min。
[0156] 3、按照滤纸、硝化纤维膜、胶、滤纸的顺序由下至上依次叠加起来，形成一个三明治结构。每次叠加用玻璃棒按一个方向滚动赶走残余的气泡，然后置于半干转膜仪中进行恒流转膜，电流大小为膜的长x宽x0.8mA，时间为1h，保护电压为20v。若有多张胶，其电流为各个电流和。
[0157] 4、转膜结束后，将膜放入含有5％的脱脂奶粉的PBS缓冲液(137mM NaCl，2.68mM KCl，10mM Na2HPO4，1.47mM KH2PO4)中，室温慢速振荡封闭1h。
[0158] 5、倒掉封闭液，加入新鲜的含有5％的脱脂奶粉的PBS缓冲液，再加入适量一抗拟南芥Rubisco抗体，置于摇床慢速振荡，室温孵育1h或者4℃过夜。
[0159] 6、倒掉步骤4的反应液，用PBST缓冲液(137mM NaCl，2.68mM KCl，10mM Na2HPO4，1.47mM KH2PO4，0.1％Tween-20)冲洗3次，每次10min。
[0160] 7、加入新鲜的含有5％的脱脂奶粉的PBS缓冲液和适量二抗，置于摇床慢速振荡，室温孵育1h。
[0161] 8倒掉步骤6的反应液，用PBST缓冲液冲洗3次，每次10min。
[0162] 9、打开LAS4000，待仪器稳定后，将ECL膜置于玻璃平板上，放入LAS4000内用白光调节焦距。设置好参数后，取1mL ECL显色液(100mM Tris-HCl pH 8.5，2.5mM Luminol)，加入7.5μL H2O2，混匀后用移液器均与涂布在硝化纤维膜上。选择合适程序进行曝光显影。
[0163] 通过以上检测，结果显示：通过对诱导后产物中Rubisco活性测定及Western blot检测可获得Rubisco在产物中的相对含量，结果如图2所示：pCpn60/20组和eGroEL/ES组均能合成有活性的Rubisco，表明不仅分子伴侣系统Cpn60/20可合成有活性的Rubisco，GroEL/ES系统也同样可以，即在Rubisco合成系统中可无需额外导入携带GroEL/ES的载体，直接通过诱导MGM100菌株基因组上的GroEL/ES就可以有效合成拟南芥Rubisco，极大简化拟南芥Rubisco的体外合成体系，为后续改造Rubisco，获取高效Rubisco提供便利。
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