技术领域
[0001] 本
发明属于
植物组培技术领域，具体涉及一种滇桐的组培快繁方法。
背景技术
[0002] 滇桐Craigia yunnanensis隶属于椴树科滇桐属，高6～20米落叶乔木，主要分布于南亚热带干湿交替炎热
气候区及海拔500～1000米的山地林中，蒴果具薄纸质翅，中国西南特有种。滇桐为寡种属滇桐属的重要树种之一，在区系地理研究和选育珍贵树种应用中均有重要价值。2017年被列入《中国高等植物受威胁物种名录》濒危EN C2a；D种类；世界自然保护联盟(IUCN)也将其列为濒危种类[EN]。目前严重威胁滇桐居群野外生存的因素主要有两个：一是为了经济利益大量种植草果，严重侵占滇桐的栖息地；二是林区树木的滥砍乱伐造成滇桐居群生态群落的破坏；导致滇桐的分布区域狭窄，生存受到严重威胁，是一种典型的极小种群物种。
[0003] 目前，
生物技术中的无菌快速繁殖已成为中药材、花卉、濒危物种、经济林果等种苗生产的重要手段。但是迄今为止，
现有技术没有关于滇桐优良单株组培快繁和相关的生物技术方面的报道。
发明内容
[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种滇桐的组培快繁方法，解决滇桐自然资源少以及短时间内无法达到大量繁殖、保存和持续利用的问题。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0006] 本发明提供了一种滇桐的组培快繁方法，包括以下步骤：(1)以消毒后的滇桐幼嫩组织作为外植体，将所述外植体接种于诱导分化共培养基上进行诱导分化共培养，得分化芽；所述诱导分化共培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：1.0mg/L的6-BA、0.5mg/L的IAA、30g/L的
蔗糖和5g/L的琼脂；
[0007] (2)将所述分化芽接种于增殖继代共培养基上进行增殖继代共培养，得
幼苗；所述增殖继代共培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：0.8mg/L的6-BA、0.5mg/L的IAA、30g/L的蔗糖和5g/L的琼脂；
[0008] (3)将所述幼苗接种于壮苗生根共培养基上进行壮苗生根共培养，得滇桐组培苗；所述壮苗生根共培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：0.8mg/L的IAA、0.8mg/L的IBA、
30g/L的蔗糖和5g/L的琼脂。
[0009] 优选的，步骤(1)所述滇桐幼嫩组织包括滇桐顶芽或侧芽；所述消毒的方法，包括：用
质量体积比为1％的肥皂
水浸泡10min，经流水冲洗干净后，用体积百分含量为75％的酒精溶液消毒10s，无菌水冲洗3遍后，再用体积百分含量为0.1％的升汞溶液消毒5min，无菌水清洗3～5次。
[0010] 优选的，步骤(1)所述诱导分化共培养、步骤(2)所述增殖继代共培养和步骤(3)所述壮苗生根共培养的光照强度均为1500Lux，
温度均为23～30℃。
[0011] 优选的，步骤(1)所述诱导分化共培养的培养周期为30d；步骤(2)所述增殖继代共培养的培养周期为60d；步骤(3)所述壮苗生根共培养的培养周期为30d。
[0012] 优选的，在步骤(3)得所述滇桐组培苗后，还包括炼苗和移栽。
[0013] 优选的，所述炼苗时的遮光率为75～85％。
[0014] 优选的，所述移栽的基质包括以下组分：珍珠岩、腐殖土和生红土，所述珍珠岩、腐殖土和生红土的体积比为1：2：3。
[0015] 优选的，在所述移栽后的栽培温度为20～30℃，遮光度为75～85％，空气湿度为50～60％，基质湿度为75～85％。
[0016] 相比于现有技术，本发明具有以下有益效果：(1)本发明建立了有效的滇桐组培快繁方法，解决了其分布狭窄、引种驯化困难，填补了滇桐在生物技术上的研发空白；
[0017] (2)本发明通过滇桐组培快繁方法，成苗容易，繁殖步骤简化，有效繁殖速率高，为保存和扩大滇桐种群，意义重大；
[0018] (3)本发明通过滇桐组培快繁方法，高度保持了滇桐优良单株的遗传
稳定性和一致性，为滇桐全面的开发和持续利用奠定了
基础；
[0019] (4)本发明的滇桐组培快繁方法繁育的滇桐，30天诱导分化率92％，在60天增殖系数为4.7，30天生根率为91％，移栽成活率为90％，极大地提高了滇桐的繁殖系数，为该物种的引种驯化、保存、园林
园艺及其科研价值的发挥利用提供了非常有效的繁殖方法。
附图说明
[0020] 图1为本发明
实施例1中滇桐组培诱导分化图；
[0021] 图2为本发明实施例1中滇桐组培增殖继代图；
[0022] 图3为本发明实施例1中滇桐组培壮苗生根图。
具体实施方式
[0023] 本发明提供了一种滇桐的组培快繁方法，包括以下步骤：(1)以消毒后的滇桐幼嫩组织作为外植体，将所述外植体接种于诱导分化共培养基上进行诱导分化共培养，得分化芽；所述诱导分化共培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：1.0mg/L的6-BA、0.5mg/L的IAA、30g/L的蔗糖和5g/L的琼脂；
[0024] (2)将所述分化芽接种于增殖继代共培养基上进行增殖继代共培养，得幼苗；所述增殖继代共培养基以MS培养基为节本培养基，还包括：0.8mg/L的6-BA、0.5mg/L的IAA、30g/L的蔗糖和5g/L的琼脂；
[0025] (3)将所述幼苗接种于壮苗生根共培养基上进行壮苗生根共培养，得滇桐组培苗；所述壮苗生根共培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：0.8mg/L的IAA、0.8mg/L的IBA、
30g/L的蔗糖和5g/L的琼脂。
[0026] 本发明所述组培快繁方法，以消毒后的滇桐幼嫩组织作为外植体，将所述外植体接种于诱导分化共培养基上进行诱导分化共培养，得分化芽；所述诱导分化共培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：1.0mg/L的6-BA、0.5mg/L的IAA、30g/L的蔗糖和5g/L的琼脂。本发明所述滇桐幼嫩组织优选包括滇桐顶芽或侧芽。本发明所述消毒的方法，优选包括：用质量体积比为1％的肥皂水浸泡10min，经流水冲洗干净后，用体积百分含量为75％的酒精溶液消毒10s，无菌水冲洗3遍后，再用体积百分含量为0.1％的升汞溶液消毒5min，无菌水清洗3～5次。本发明对所述诱导分化共培养基的制备方法并没有特殊限定，优选的将上述组分混合均匀后，高温高压灭菌后得到，所述诱导分化共培养基的pH值优选为5.8。
[0027] 本发明利用所述诱导分化共培养基进行诱导分化共培养时，光照强度优选为1500Lux，温度优选为23～30℃，培养周期优选为30d。在本发明中，经所述诱导分化共培养一周后，顶芽或侧芽开始萌发。
[0028] 得分化芽后，本发明将所述分化芽接种于增殖继代共培养基上进行增殖继代共培养，得幼苗；所述增殖继代共培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：0.8mg/L的6-BA、0.5mg/L的IAA、30g/L的蔗糖和5g/L的琼脂。本发明所述增殖继代共培养中，以侧芽发生的方式进行增殖，将幼苗上生长出的侧芽再接种于所述增殖继代共培养基上进行增殖继代共培养。本发明所述增殖继代共培养的光照强度优选为1500Lux，温度优选为23～30℃。本发明所述增殖继代共培养的培养周期优选为60d。在本发明中，经过所述增殖继代共培养60d后，生长高度达4.8cm，平均繁殖倍数为4.7。
[0029] 得幼苗后，本发明将所述幼苗接种于壮苗生根共培养基上进行壮苗生根共培养，得滇桐组培苗；所述壮苗生根共培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：0.8mg/L的IAA、0.8mg/L的IBA、30g/L的蔗糖和5g/L的琼脂。本发明所述壮苗生根共培养的光照强度优选为
1500Lux，温度优选为23～30℃。本发明所述壮苗生根共培养的培养周期优选为30d。
[0030] 本发明在得到所述滇桐组培苗后，优选还包括炼苗和移栽。本发明所述炼苗优选为在遮光率为75～85％的大棚内炼苗一周。本发明将经过所述炼苗的组培苗移栽，所述移栽的基质优选包括以下组分：珍珠岩、腐殖土和生红土，所述珍珠岩、腐殖土和生红土的体积比为1：2：3。本发明所述基质在使用前，优选还包括用800倍多菌灵消毒后，用塑料膜密封消毒7天，调节pH至5.8。本发明所述移栽优选为将经过炼苗的组培苗取出，洗净根部的培养基，移栽至消毒过的基质中，及时喷水并
覆盖塑料膜保湿，大棚温度为20～30℃，遮光率75～85％，空气湿度60～70％，基质湿度65～75％，30天后成活率90％。在本发明所述移栽基质中，增加了基质疏松度和根部透气性，也为根部提供足够的营养，同时红土为土层深部
土壤，带菌量较少，有利于无菌苗的生长。
[0031] 下面结合实施例对本发明提供的滇桐的组培快繁方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0032] 实施例1
[0033] 取滇桐的幼嫩顶芽和侧芽为外植体，用1％肥皂水浸泡10分钟，经流水冲洗干净后，拿到超净台上，剪成带单个节的茎段，用75％的酒精消毒10s，无菌水冲洗3遍后，用0.1％升汞溶液进行表面消毒5min，无菌水清洗3～5次，接种于准备好的滇桐诱导分化共培养基中，每瓶1个节。
[0034] 1、不同诱导分化培养基对于诱导率的影响
[0035] 将茎段分别接种在下述培养基中：①MS+0.1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH5.8，②MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH5.8，③MS+0.8mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH5.8，④MS+1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH5.8，⑤MS+2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH5.8。光强度为1000LUX，温度为23～30℃，光照时间10小时。30天后，统计诱导率情况如表
1所示：
[0036] 表1不同培养基对滇桐优良单株茎段诱导影响
[0037]
[0038] 由表1可知，在培养基④上，诱导率达到92％(如图1所示)。
[0039] 2、不同增殖继代共培养基对增殖继代的影响
[0040] 将得到的分化芽接种于增殖继代共培养基上进行增殖继代共培养，分别设置增殖继代共培养基内的
激素含量设置为：细胞分裂素6-BA，浓度范围为(0.5mg/L，0.8mg/L，1mg/L)，生长素浓度分别为(0.1mg/L，0.5mg/L，0.8mg/L)，且每个所述增殖继代共培养基内都含有：蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH5.8。60d后进行统计，结果如表2所示，为方便对比表2中未显示蔗糖和琼脂的含量：
[0041] 表2不同培养基对增殖继代共培养的影响
[0042]
[0043] 由表2可知，MS培养基+0.8mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH5.8，培养周期60天，光强度为1500LUX，温度为23～30℃，平均有效芽节数量(包含顶芽)4.7，植株
叶片伸展，生长速度较快，株高约5.1cm，茎粗3mm左右(如图2所示)。
[0044] 3、不同培养基对壮苗生根共培养的影响
[0045] 将上述小苗接种在不同的壮苗生根共培养基上进行壮苗生根共培养，分别设置不同的激素含量：IAA(0.5mg/L，0.8mg/L，1.0mg/L)，IBA(0.5mg/L，0.8mg/L，1.0mg/L)，且每个所述壮苗生根共培养基内都含有：蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH5.8。30d后进行统计，结果如表3所示，为方便对比表3中未显示蔗糖和琼脂的含量：
[0046] 表3不同培养基对生根率的影响
[0047]
[0048]
[0049] 由表3可知，MS培养基+0.8mg/L IAA+0.8mg/L IBA+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH5.8，培养周期30天，生根率达91％(如图3所示)。
[0050] 4、不同基质对移栽成活率的影响
[0051] 培养30天后的生根瓶苗，需提前移至遮光率为75～85％大棚炼苗一周，然后分别利用表4中移栽基质进行移栽，并对30d后的成活率进行统计，结果如表4所示：
[0052] 表4移栽基质对移栽成活率的影响
[0053]
[0054] 由表4可知，在移栽基质(体积比为珍珠岩∶腐殖土∶生红土＝1∶2∶3)，30天后移栽成活率达到90％。
[0055] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
