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一种枸杞叶绿体基因组DNA的提取方法

阅读：832发布：2023-12-12

专利汇可以提供一种枸杞叶绿体基因组DNA的提取方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种枸杞叶绿体基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：选择枸杞；称取枸杞叶片，洗净擦干，去中脉后剪成碎片，放入预冷的研钵中，加入预冷的分离缓冲液充分研磨；过滤并收集滤液，进行第一次离心，弃沉淀，进行第二次离心，对上清液进行第三次离心，弃去上清液，沉淀用预冷的分离缓冲液悬浮，并分成等份；在离心管中，将轻液铺于重液上层，将悬浮液铺于轻液上层，进行第四次离心，用移液枪小心收集接口处的条带，并用等体积不含BSA的分离缓冲液悬浮；从所提取的叶绿体溶液中分离出DNA。该方法能够获得纯度高、产量大的枸杞cpDNA，为后续枸杞叶绿体基因组测序提供便捷，从而在叶绿体基因工程领域上实现更大的突破。，下面是一种枸杞叶绿体基因组DNA的提取方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种枸杞叶绿体基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、材料及前处理：选择枸杞，采集枸杞叶片之前，对枸杞枝叶进行暗处理；
步骤2、叶绿体的分离：称取枸杞叶片，洗净擦干，去中脉后剪成1cm2大小的碎片，放入预冷的研钵中，加入预冷的分离缓冲液充分研磨；用4层纱布过滤并收集滤液，进行第一次离心，弃沉淀，进行第二次离心，对上清液进行第三次离心，弃去上清液，沉淀用1mL预冷的分离缓冲液悬浮，并分成等份；配置0.6mL80％Percoll溶液和1mL40％Percoll溶液，在2mL离心管中，吸取40％Percoll溶液于80％Percoll溶液之上，再小心吸取悬浮液于40％Percoll溶液之上，进行第四次离心，用移液枪小心收集接口处的条带，并用等体积不含BSA的分离缓冲液悬浮；
步骤3、DNA的提取：使用DNAsecure新型植物基因组DNA提取试剂盒，按照说明书要求，从所提取的叶绿体溶液中分离出DNA。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤1中的对枸杞枝叶进行暗处理具体为：将生长健康，无病虫害的枸杞枝条或整个植株在黑暗条件下生长24-36小时。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤2中的分离缓冲液为0.33M山梨醇，5mM MgCl2，1mM DTT，5mM NaH2PO4，5mM Na2HPO4，0.1％BSA，pH＝6.8。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤2中的枸杞叶片与预冷的分离缓冲液的质量体积比(g/mL)为1:5-1:10。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤2中的第一次离心和第二次离心温度为4℃，离心转速为200g，离心时间为3分钟；第三次离心温度为4℃，离心转速为
1000g，离心时间为7分钟，第四次离心温度为4℃，离心转速为1700g，离心时间为6分钟。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤3中的DNAsecure新型植物基因组DNA提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司新型植物基因组提取试剂盒(DP320)。

说明书全文

一种枸杞叶绿体基因组DNA的提取方法

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种枸杞叶绿体基因组DNA的提取方法。

背景技术

[0002] 叶绿体是绿色植物进行光合作用和能量转化的重要细胞器，也是植物细胞质遗传的重要单位。叶绿体拥有自身完整的一套基因组，即叶绿体DNA(chloroplast DNA,cpDNA)，在组织结构上具有高度保守性(Jansen R K,Raubeson L A,Boore J L,et al.Methods for obtaining and analyzing whole chloroplast genome sequences[J].Methods in enzymology,2005,395:348-384.)。叶绿体基因组所包含的信息虽然远小于核基因组，但是其基因结构及序列信息在揭示物种进化和不同物种之间的亲缘关系等方面都有非常重要价值，因此叶绿体基因组信息被广泛应用于植物系统发育和比较基因组学研究。

[0003] 获得高纯度、高产量的cpDNA是进行叶绿体基因组测序分析研究的前提条件及环节之一。然而，由于cpDNA含量太少，只占总DNA的5％，同时在提取过程中有诸多因素干扰，如核DNA、RNA、蛋白质等的污染，导致很难获得纯度高、浓度大的cpDNA。已报道的文献中有关植物cpDNA的提取主要集中于草本植物，对于多年生木本植物而言，只有枇杷(孙晓荣，易鼎杰，何桥，等.三倍体枇杷叶绿体DNA提取方法的优化[J].西南师范大学学报：自然科学版,2012,37(2):93-96.)、厚朴(李西文，胡志刚，林小涵，等.基于454FLX高通量技术的厚朴叶绿体全基因组测序及应用研究[J].药学学报,2012,47(1):124-130.)等成功提取了cpDNA。

[0004] 枸杞(Lycium barbarum L.)隶属于茄科(Solanaceae)枸杞属(Lycium)，是一种药用和食用价值极高的物种，具有很高的经济效益。枸杞属植物在世界分布较广，全球约有80种左右，我国枸杞有7种，3变种，此种分类仅限于形态差异及初步核型分析，而利用叶绿体基因组测序研究枸杞属不同植物在系统进化中的起源、亲缘关系及遗传多样性相关研究仍未开展。限制此项研究除测序技术外，提取高质量枸杞cpDNA是其中的重要前体及原因。此外，由于枸杞含有大量多糖多酚，加大了其DNA提取的难度。因此目前还没有一套合适的提取方法能够提取出高纯度、高产量的枸杞cpDNA。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明提供了一种枸杞叶绿体基因组DNA的提取方法，该方法能够获得纯度高、产量大的枸杞cpDNA，为后续枸杞叶绿体基因组测序提供便捷，从而在叶绿体基因工程领域上实现更大的突破。

[0006] 为了解决上述技术问题，本发明公开了一种枸杞叶绿体基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：

[0007] 步骤1、材料及前处理：选择枸杞，采集枸杞叶片之前，对枸杞枝叶进行暗处理；

[0008] 步骤2、叶绿体的分离：称取枸杞叶片，洗净擦干，去中脉后剪成1cm2大小的碎片，放入预冷的研钵中，加入预冷的分离缓冲液充分研磨；用4层纱布过滤并收集滤液，进行第一次离心，弃沉淀，进行第二次离心，对上清液进行第三次离心，弃去上清液，沉淀用1mL预冷的分离缓冲液悬浮，并分成等份；配置0.6mL 80％Percoll溶液和1mL 40％Percoll溶液，在2mL离心管中，吸取40％Percoll溶液于80％Percoll溶液之上，再小心吸取悬浮液于40％Percoll溶液之上，进行第四次离心，用移液枪小心收集接口处的条带，并用等体积不含BSA的分离缓冲液悬浮；

[0009] 步骤3、DNA的提取：使用DNAsecure新型植物基因组DNA提取试剂盒，按照说明书要求，从所提取的叶绿体溶液中分离出DNA。

[0010] 可选地，所述步骤1中的对枸杞枝叶进行暗处理具体为：将生长健康，无病虫害的枸杞枝条或整个植株在黑暗条件下生长24-36小时。

[0011] 可选地，所述步骤2中的分离缓冲液为0.33M山梨醇，5mM MgCl2，1mM DTT，5mM NaH2PO4，5mM Na2HPO4，0.1％BSA，pH＝6.8。

[0012] 可选地，所述步骤2中的枸杞叶片与预冷的分离缓冲液的质量体积比(g/mL)为1:5-1:10。

[0013] 可选地，所述步骤2中的第一次离心和第二次离心温度为4℃，离心转速为200g，离心时间为3分钟；第三次离心温度为4℃，离心转速为1000g，离心时间为7分钟，第四次离心温度为4℃，离心转速为1700g，离心时间为6分钟。

[0014] 可选地，所述步骤3中的DNAsecure新型植物基因组DNA提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司新型植物基因组提取试剂盒(DP320)。

[0015] 与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

[0016] 本发明方法在新鲜状态下采集较少实验材料，通过改进的percoll密度梯度法对多糖多酚植物枸杞叶片提取cpDNA，获得高质量枸杞cpDNA，为后续高通量测序进行枸杞叶绿体结构及功能奠定坚实基础。

[0017] 当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明

[0018] 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

[0019] 图1是本发明枸杞叶绿体基因组DNA的提取方法的流程图；

[0020] 图2是本发明提取出的cpDNA的琼脂糖凝胶电泳图谱；其中，M为DNA2000bp marker，1和2分别为1号样和2号样。

具体实施方式

[0021] 以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

[0022] 实施例1枸杞叶绿体基因组DNA的提取方法的建立：

[0023] 如图1所示，包括以下步骤：

[0024] 步骤1、材料及前处理：选择宁夏枸杞，采集叶片之前，对生长健康，无病虫害的枸杞枝叶进行暗处理，在黑暗条件下生长24-36小时，以降解叶绿体中的淀粉，减少对cpDNA提取的干扰；

[0025] 步骤2、叶绿体的分离：称取1g叶片，洗净擦干，去中脉后剪成约1cm2大小的碎片，放入预冷的研钵中，加入8mL预冷的分离缓冲液(0.33M山梨醇，5mM MgCl2，1mM DTT，5mM NaH2PO4，5mM Na2HPO4，0.1％BSA，pH＝6.8)充分研磨。用4层纱布过滤并收集滤液，4℃下200g离心3分钟，弃沉淀，重复一次，上清液于4℃下1000g离心7分钟，弃去上清液，沉淀用
1mL预冷的分离缓冲液悬浮，并分成等份。配置0.6mL 80％Percoll溶液和1mL 40％Percoll溶液，在2mL离心管中，吸取40％Percoll溶液于80％Percoll溶液之上，再小心吸取悬浮液于40％Percoll溶液之上，在4℃下1700g离心6分钟，用移液枪小心收集接口处的条带，并用等体积不含BSA的分离缓冲液悬浮。

[0026] 步骤3、DNA的提取：使用DNAsecure新型植物基因组DNA提取试剂盒(DP320)，按照说明书要求，从所提取的叶绿体溶液中分离出DNA。

[0027] 步骤4、叶绿体DNA的检测：

[0028] 将提取出的cpDNA进行琼脂糖凝胶电泳，图谱如图2所示：该方法可获得整齐单一的cpDNA条带，条带大小约为16kb。

[0029] 在试验材料及用量方面：现有的方法采用来自采集新鲜叶片或低温(4℃)离体保存10天的叶片，后者为离体失活叶片；叶片用量范围为25g～75g不等。本发明对活体植株叶片常温黑暗处理3-5天，用于叶片饥饿处理。叶片仍为新鲜状态；叶片用量为1g，大大减少叶片用量，可用于极少量叶片叶绿体提取；实验所需药品用量均大幅降低。

[0030] 在实验方法中，传统方法离心转速较大，离心步骤为200g 15min→3000g20min→5000g 25min；本发明利用普通水平离心机即可完成且在离心力较小、时间较短情况下获得较好离心效果，离心步骤为200g 3min(2次)→1000g7min→1700g 6min。

[0031] 本发明采用枸杞多糖多酚植物的Percoll密度梯度法提取的cpDNA有明显条带，有较好效果。

[0032] 上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

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