一种乳酸菌复合菌剂及其在抗鲤疱疹病毒II型中的应用专利检索-植物植物学专利检索查询-专利查询网

一种乳酸菌复合菌剂及其在抗鲤疱疹病毒II型中的应用

阅读：423发布：2023-12-07

专利汇可以提供一种乳酸菌复合菌剂及其在抗鲤疱疹病毒II型中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及水产抗病毒微生态制剂技术领域，具体涉及一种乳酸菌复合菌剂及其在抗鲤疱疹病毒II型中的应用。本发明的复合菌剂，是有保藏编号为CCTCC NO：M2019654的干酪乳杆菌和植物乳杆菌、拟干酪乳杆菌混配或混合发酵而成。本发明中的复合菌剂发酵上清液，能降低鲤疱疹病毒II型（CyHV-2）对宿主细胞的感染活性，抑制CyHV-2病毒入侵对细胞的感染，对细胞无毒副作用，且复合菌剂的抑制效果比单独使用干酪乳杆菌YFI-5的效果要好。饲料添加复合菌剂菌体可有效降低鲫鱼感染CyHV-2的死亡率，可以用于预防和治疗鲫造血器官坏死症。，下面是一种乳酸菌复合菌剂及其在抗鲤疱疹病毒II型中的应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种乳酸菌复合菌剂，包括干酪乳杆菌YFI-5、植物乳杆菌和拟干酪乳杆菌，所述的干酪乳杆菌YFI-5的保藏编号为：CCTCC NO: M2019654。
2.权利要求1所述的乳酸菌复合菌剂在制备治疗或预防鲫造血器官坏死症药物中的应用。
3.权利要求1所述的乳酸菌复合菌剂在制备治疗或预防由鲤疱疹病毒 II 型（CyHV-2）感染引起的疾病的药物中的应用。
4.权利要求1所述的乳酸菌复合菌剂在制备鲤疱疹病毒 II 型抗病毒剂中的应用。
5.权利要求1所述的乳酸菌复合菌剂在制备水产动物饲料添加剂中的应用。
6.权利要求1所述的乳酸菌复合菌剂，干酪乳杆菌YFI-5、植物乳杆菌和拟干酪乳杆菌按照的效菌浓度的比例为1.5-3：0.5-2:1-2。
7.权利要求1所述的乳酸菌复合菌剂，是将干酪乳杆菌YFI-5、植物乳杆菌和拟干酪乳杆菌的种子液，按照有效菌浓度为1.5-3：0.5-2:1-2混合后，混合发酵而成。

说明书全文

一种乳酸菌复合菌剂及其在抗鲤疱疹病毒II型中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及水产抗病毒微生态制剂技术领域，具体涉及一种乳酸菌复合菌剂及其在抗鲤疱疹病毒II型中的应用。

背景技术

[0002] 鲫是我国淡水养殖鱼类重要品种之一，其年总产量现已超过300万吨，在淡水养殖中占据十分重要的地位。近年来，我国鲫鱼连年发生导致养殖异育银鲫暴发性死亡的出血性疾病，造成重大经济损失。电镜观察患病鲫鱼脾肾组织的超薄切片，发现大量典型疱疹病毒样颗粒，进一步研究确认该病为鲫造血器官坏死症(Crucian Carp Hematopoietic Necrosis)，其病原为鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus2，CyHV-2)。感染CyHV-2的异育银鲫典型临床症状主要表现为食欲减退，离群独游，呼吸频率加快，活力差，沉在水底。患病鱼体表、鳍基和鳃出血，腹部膨胀，眼球突出。鳃丝苍白，肌肉有点状出血，脾和肾发红肿胀，鳔出现点状出血，肝肿大、出血，肠道空。鲫造血器官坏死症是一种高传染性疾病，但其传播范围有限，研究表明，目前该病只对金鱼、鲫鱼及其普通变种有感染性。研究者发现金鱼和鲤鱼的杂交体也是CyHV-2的易感体，且各个规格的鱼体均可感染。

[0003] 水产养殖过程中如何预防和治疗病害的发生长久以来都是困扰水产养殖业发展的一个重要问题。当前，用于防治水产养殖动物病害的方法主要有药物防治和疫苗免疫两种。然而药物防治引起的副作用、药物残留、耐药性以及水体污染等一系列问题逐渐受到社会各界的普遍重视，除此之外，药物防治针对病毒性疾病的治疗效果不十分明显；受敏感细胞系缺乏、病毒变异、免疫方式不便的影响，渔用疫苗的发展受到影响。因此，需要不断寻求可控制病毒性疾病的有效方法，益生菌因其无毒、无抗药性、无残留、抗菌、抗病毒、促生长、绿色安全的优点受到广泛关注。

[0004] 近年来，诸多的研究者认为水产养殖过程中乳酸菌在一定程度上有望成为药物的替代品用于各种疾病的预防与治疗，为病害防控方案提供新策略。杨勇等(2006)证明乳酸菌代谢产物对鳗弧菌的生长具有非常显著的抑制作用，抑制效率在90％以上。Gildberg等(1998)用含有大西洋鳕鱼内脏提取出来的乳酸菌的饲料喂鳕鱼苗，3个月后将鱼苗放养在带有强致病弧菌的环境中，能够提高抗病率。已有资料显示乳酸菌不仅有抗菌活性，还具有抗病毒活性。Ang等(2016)发现干酪乳杆菌能够通过抑制柯萨奇病毒的侵染来防治手足口病。

[0005] 目前，乳酸菌在水产养殖过程中被广泛应用，但关于乳酸菌抑制水产病原菌和病毒的研究还较少。本发明首次发现一种可以对鲤疱疹病毒2型具有抑制作用的乳酸菌复合菌剂，为该病毒的防治提供了新思路。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供了一种乳酸菌复合菌剂，该复合菌剂包括干酪乳杆菌YFI-5、植物乳杆菌和拟干酪乳杆菌，所述的干酪乳杆菌YFI-5的保藏编号为：CCTCC NO:
M2019654。

[0007] 本发明的灵已给目的在于提供了一种乳酸菌复合菌剂的应用。

[0008] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

[0009] 水产养殖区域池塘水样品中分离得到一株可抗鲤疱疹病毒II型的乳酸菌，命名为YFI-5，该菌株的保藏编号为CCTCC NO:M2019654，将该菌株与植物乳杆菌和拟干酪乳杆菌复配后，可获得乳酸菌复合菌剂；来自商业渠道的植物乳杆菌和拟干酪乳杆菌均能完成本发明。

[0010] 以上所述的乳酸菌复合菌剂，可直接将干酪乳杆菌YFI-5、植物乳杆菌和拟干酪乳杆菌按照有效菌浓度为1.5-3：0.5-2:1-2混配而成，或是将干酪乳杆菌YFI-5、植物乳杆菌和拟干酪乳杆菌的种子液，按照有效菌浓度为1.5-3：0.5-2:1-2混合后，混合发酵而成。

[0011] 乳酸菌复合菌剂的应用，包括利用乳酸菌复合菌剂制备成治疗或预防鲫造血器官坏死症药物，或制备成治疗或预防由鲤疱疹病毒II型(CyHV-2)感染引起的疾病的药物，或是制备成鲤疱疹病毒II型抗病毒剂，或是制备成水产动物饲料添加剂。

[0012] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：

[0013] 本干酪乳杆菌YFI-5，配合为主的复合菌剂进行抗鲤疱疹病毒II型(CyHV-2)感染，干酪乳杆菌YFI-5作为潜在的抗病毒微生态制剂与传统的抗病毒化学药物相比较具有如下优点：

[0014] 1、无毒副作用、无残留、抗菌、抗病毒、促生长、绿色安全。

[0015] 2、具有使用方便、安全、无免疫应激、经济效益高等优点

[0016] 3、可以通过口服的方式进入鱼体，抑制鲤疱疹病毒II型(CyHV-2)的入侵和增殖，有效预防和治疗鲫造血器官坏死症。

[0017] 4、本发明的干酪乳杆菌YFI-5、植物乳杆菌和拟干酪乳杆菌以2：1：1的比例接种后发酵而成的复合菌剂对CyHV-2的抑制效果优于单株干酪乳杆菌YFI-5。附图说明

[0018] 图1为实施例4各组鲫鱼呼吸爆发力水平示意图。

[0019] 图2为实施例4各组鲫鱼血清溶菌酶水平示意图。

[0020] 图3为实施例4各组鲫鱼补体C3水平示意图。

[0021] 图4为实施例7各组鲫鱼呼吸爆发力水平示意图。

[0022] 图5为实施例7各组鲫鱼血清溶菌酶水平示意图。

[0023] 图6为实施例7各组鲫鱼补体C3水平示意图。

具体实施方式

[0024] 本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

[0025] 实施例1：菌株分离鉴定

[0026] 1、干酪乳杆菌菌株分离

[0027] 干酪乳杆菌自水产养殖区域池塘水样品中分离得到，具体是用0.85％的无菌生理盐水将养殖池塘水样品连续10倍倍比稀释6次，用移液枪分别在各个浓度梯度稀释液中吸取溶液100μL到BHI固体平板上，用涂布棒涂匀、编号，并做3个重复。涂布均匀后在超净工作台中放置5～10min，使培养基表面菌液被充分吸收。最后将平板倒置，于恒温培养箱中30℃培养24h。挑选不同形态的菌落接种于普通肉汤平板上分离纯化，并且对不同的菌进行抗病毒功能的测定，最终获得了一株可抗鲤疱疹病毒II型的菌株，命名为YFI-5。

[0028] 2、YFI-5菌株的鉴定

[0029] 1)、生理生化特征

[0030] 取经LB固体培养基纯培养的菌株YFI-5，单菌落划线接种于BUG鉴定平板上，30℃培养16h-24h，待菌落大小适宜时取Biolog细菌鉴定试剂盒IF-A接种液，将管外壁擦拭干净，置入Biolog浊度仪中调整其读数为100％T；用无菌棉签蘸取适量的单菌落至接种液中，使浊度仪读数在92％T-98％T之间，用8孔移液枪将混合液以每孔100μL体积转移至GENⅢ鉴定板中，然后将鉴定板装载于Biolog系统中培养，系统自动读数并输出鉴定结果。

[0031] 生理生化特征见表1。

[0032] 表1菌株YFI-5的生理生化特征

[0033]

[0034]

[0035] 2)菌株YFI-5的分子生物学鉴定

[0036] 扩增菌株16SrRNA的基因采用通用引物，16SF(27F)：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，16SR(1492R)：GGTTACCTTGTTACGACTT，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。菌株YFI-5经生理生化特征测定和16S rDNA序列同源性分析，鉴定为干酪乳杆菌。

[0037] 干酪乳杆菌YFI-5属于乳杆菌属，适合生长温度为37℃，经乳酸细菌培养基(MRS)培养48h后形成白色，圆形，表面光滑湿润，边缘整齐、凸起的菌落；能发酵果糖、半乳糖和葡萄糖，不能利用蜜二糖、棉籽糖和木糖，不能分解精氨酸产氨。

[0038] 该菌株已于2019年8月19日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)YFI-5，保藏编号：CCTCC NO：M2019654，地址：中国武汉武汉大学。

[0039] 实施例2：

[0040] 干酪乳杆菌YFI-5发酵上清液抗病毒谱检测

[0041] 挑取平板复壮的干酪乳杆菌YFI-5一个单菌落接种于150ml MRS液体培养基中，37℃培养24h，5000rpm离心10min，取上清用0.22μm滤膜过滤，储存于无菌离心管中4℃保存备用。分别检测干酪乳杆菌YFI-5发酵上清液对鲤疱疹病毒II型(CyHV-2)、大鲵虹彩病毒(GSIV)、草鱼呼肠孤病毒(GCRV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)的抑制效果。

[0042] 本实施本实施例所用的细胞是鲫脑组织细胞系(GiCB，CCTCC NO：C2013179)、大鲵肌肉细胞系(GSM)、草鱼肾脏细胞系(CIK)、鲤上皮细胞系(EPC)。

[0043] 本实施例中加入的干酪乳杆菌YFI-5发酵上清液体积为每孔100μL，加入的100TCID50/0.1ml的病毒液与发酵上清液的体积相同。

[0044] 分别将干酪乳杆菌YFI-5发酵上清液与CyHV-2同时接入长成单层的96孔培养板中的GiCB细胞，干酪乳杆菌YFI-5发酵上清液与GSIV接入长成单层的96孔培养板中的GSM细胞，干酪乳杆菌YFI-5发酵上清液与GCRV接入长成单层的96孔培养板中的CIK细胞，酪乳杆菌YFI-5发酵上清液与SVCV接入长成单层的96孔培养板中的EPC细胞，对照组只接入等量病毒，共培养90min，弃混合液并用PBS洗涤，加入细胞维持液继续培养。光学倒置显微镜下观察细胞病变(CPE),根据CPE数量判断干酪乳杆菌YFI-5发酵上清液的抗病毒效果，结果见表2，+表示具有抗性，-表示无抗性。

[0045] 表2干酪乳杆菌YFI-5的抗病毒谱

[0046]

[0047] 实施例3：

[0048] 干酪乳杆菌YFI-5发酵上清液抗鲤疱疹病毒II型(CyHV-2)中的应用

[0049] 挑取平板复壮的干酪乳杆菌YFI-5一个单菌落接种于150ml MRS液体培养基中，37℃培养24h，5000rpm离心10min，取上清用0.22μm滤膜过滤，储存于无菌离心管中4℃保存备用，用于本实施例及实施例4。

[0050] 本实施例所用的细胞是鲫脑组织细胞系(GiCB)，CCTCC NO：C2013179。所用的细胞维持液为10％FBS的M199培养基；

[0051] 本实施例中加入的干酪乳杆菌YFI-5发酵上清液体积为每孔100μL，加入的100TCID50/0.1ml的CyHV-2病毒液与发酵上清液的体积相同；

[0052] 病毒滴度检测：向96孔细胞培养板中加入密度为1×104/孔的GiCB细胞100μL，251 10
℃培养16～24h。待细胞生长至80％～90％时，向其中接种稀释度为10～10 的病毒液100μL/孔，每个稀释度设置8个平行孔，25℃培养箱中培养2h。孵育结束后，将病毒液回收，用M199培养基漂洗孔内细胞2次，添加100μL细胞维持液继续培养96h。实验设置3组平行，每隔
24h观察记录各稀释度单层细胞的CPE现象，并记录相应病变孔数，按照Reed-Muench法计算CyHV-2的半数组织细胞感染量(tissue culture infective dose，TCID50)。

[0053] 实验分组如下：

[0054] 1组：用干酪乳杆菌YFI-5发酵上清液预处理组，再接入病毒：干酪乳杆菌YFI-5发酵上清液接种于长成单层的96孔培养板的细胞中共培养2h，洗涤后以100TCID50/0.1ml的CyHV-2感染单层细胞，置培养箱中吸附90min，洗涤后加入细胞维持液，继续培养。

[0055] 2组：干酪乳杆菌YFI-5发酵上清液和CyHV-2同时接入细胞：与100TCID50/0.1ml CyHV-2等体积混合后加入长成单层的96孔培养板的细胞中，共培养90min，弃混合液并用PBS洗涤，加入细胞维持液继续培养。

[0056] 3组：先加病毒感染细胞，再接入干酪乳杆菌发酵上清液：以100TCID50/0.1ml CyHV-2感染长成单层的96孔培养板的细胞，培养箱中吸附90min后洗涤，再加入干酪乳杆菌发酵上清液，置温箱培养90min后PBS洗涤，加入细胞维持液继续培养。

[0057] 4组：加入干酪乳杆菌上清液与长成单层的96孔培养板的细胞共培养2h，后加入细胞维持液继续培养。

[0058] 5组：100TCID50/0.1ml CyHV-2感染长成单层的96孔培养板的细胞，置温箱中吸附90min后PBS洗涤，加入细胞维持液继续培养

[0059] 6组：正常细胞对照。

[0060] 48h后通过MTT法间接测定干酪乳杆菌YFI-5发酵上清液对CyHV-2的抑制率；

[0061] 病毒抑制率＝(乳酸菌处理组OD490－病毒对照组OD490)/(细胞对照组OD490－病毒对照组OD490)×100％

[0062] 具体抑制率如表3所示：

[0063] 表3干酪乳杆菌YFI-5发酵上清液对CyHV-2抑制率

[0064]

[0065] 实施例4：

[0066] 干酪乳杆菌YFI-5在制备鲤疱疹病毒II制剂中的应用：

[0067] 1)实验前将鲫鱼(20±2g)在实验室条件下暂养2周，每天8点和18点投喂，投喂量为鱼体重的1％，并持续充氧；实验用水为曝气自来水，水温25±1℃，溶解氧＞5mgL-1.pH为7.3±0.5(程杰2011年)；实验鲫鱼经检测无病毒和细菌感染。

[0068] 平均分成8组，每组60尾。分别做以下处理：

[0069] 1组：鲫鱼腹腔注射100μl CyHV-2(107TCID50)，48h后腹腔注射100μl干酪乳杆菌YFI-5发酵上清液；

[0070] 2组：鲫鱼腹腔注射100μl干酪乳杆菌YFI-5发酵上清液，48h后腹腔注射100μl CyHV-2(107TCID50)；

[0071] 3组：鲫鱼腹腔同时注射100μl CyHV-2(107TCID50)和100μl干酪乳杆菌YFI-5发酵上清液的混合液；

[0072] 4组：鲫鱼饲喂含干酪乳杆菌YFI-5的饲料2天(107cfu/g)投喂量为鱼体重的1％，然后腹腔注射100μl CyHV-2(107TCID50)；

[0073] 5组：鲫鱼腹腔注射100μl CyHV-2(107TCID50)，48h后开始饲喂含干酪乳杆菌YFI-5的饲料(107cfu/g)投喂量为鱼体重的1％。

[0074] 6组：鲫鱼腹腔注射100μl CyHV-2(107TCID50)，同时开始饲喂含干酪乳杆菌YFI-5的饲料(107cfu/g)投喂量为鱼体重的1％。

[0075] 7组：鲫鱼腹腔注射100μl CyHV-2(107TCID50)；

[0076] 8组：鲫鱼腹腔注射100μl干酪乳杆菌YFI-5发酵上清液处理。

[0077] 9组：鲫鱼腹腔注射100μl无菌PBS。

[0078] 各组鲫鱼从分组处理日起记录14天内死亡情况内死亡情况(表4)。并于第0日和第14日检测各组鲫鱼相关免疫指标：呼吸爆发活力(图1)、血清溶菌酶活性(图2)、血清补体C3水平(图3)。

[0079] 保护率计算公式：

[0080] 保护率＝(V'－V)/V'×100％

[0081] V':鲫鱼直接注射CyHV-2后死亡率(7组)；

[0082] V:乳酸菌处理组死亡率。

[0083] 呼吸爆发活力检测方法：

[0084] 呼吸爆发力的测定是按照Anderson描述的方法进行的：NBT还原法(Anderson,Brubacher et al.1998)。

[0085] 血清溶菌酶活性的测定

[0086] 血清溶菌酶活性的测定参考Ellis描述的浑浊度法进行测定的(Ellis 1988)。一个溶菌酶活力单位定义为：在530nm的波长下1min可以使吸光率下降0.001的溶菌酶的量。

[0087] 血清补体C3的测定

[0088] 血清补体C3水平的测定采用南京建成补体C3测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。结果以mg/mL为单位表示。

[0089] 表4干酪乳杆菌YFI-5对鲫鱼保护率

[0090]

[0091] 实施例5：

[0092] 复合菌剂的制备：

[0093] 复合菌剂包括：干酪乳杆菌YFI-5、植物乳杆菌、拟干酪乳杆菌；

[0094] 将干酪乳杆菌YFI-5、植物乳杆菌、拟干酪乳杆菌菌液按照有效菌浓度为2：1:1混8
合后得到发酵种子液(发酵种子液的有效菌浓度10cfu/mL)后，混合发酵而成；所述的植物乳杆菌、拟干酪乳杆菌均购自北京索莱宝科技有限公司。

[0095] 以上所述的混合发酵的具体步骤包括：干酪乳杆菌YFI-5，植物乳杆菌，拟干酪乳杆菌按照2:1:1的细菌数量混合成发酵种子液(108cfu/mL)，然后以体积比为10﹪的接种量将混合后的发酵种子液接种到装有MRS液体培养基的发酵罐中，于30℃，搅拌速度180rmp，通气量为3V/min，培养48h；

[0096] 将发酵制得的复合菌剂5000rpm离心10min，取上清用0.22μm滤膜过滤，储存于无菌离心管中4℃保存备用，用于实施例6和实施例7。复合菌剂离心后获得的菌体，作为饲料添加剂加入鲫鱼饲料中，用于实施例7。

[0097] 实施例6：

[0098] 复合菌剂发酵上清液在抗鲤疱疹病毒II型(CyHV-2)中的应用：

[0099] 本实施例所用的细胞是鲫脑组织细胞系(GiCB)，CCTCC NO：C2013179。所用的细胞维持液为10％FBS的M199培养基；本实施例中加入的复合菌剂上清液体积为每孔100μL，加入的100TCID50/0.1ml的CyHV-2病毒液与发酵上清液的体积相同；；

[0100] 病毒滴度检测：向96孔细胞培养板中加入密度为1×104/孔的GiCB细胞100μL，25℃培养16～24h。待细胞生长至80％～90％时，向其中接种稀释度为101～1010的病毒液100μL/孔，每个稀释度设置8个平行孔，25℃培养箱中培养2h。孵育结束后，将病毒液回收，用M199培养基漂洗孔内细胞2次，添加100μL细胞维持液继续培养96h。实验设置3组平行，每隔24h观察记录各稀释度单层细胞的CPE现象，并记录相应病变孔数，按照Reed-Muench法计算CyHV-2的半数组织细胞感染量(tissue culture infective dose，TCID50)。

[0101] 实验分组如下：

[0102] 1组：用复合菌剂发酵上清液预处理组，再接入CyHV-2病毒：复合菌剂发酵上清液接种于长成单层的96孔培养板的细胞中共培养2h，洗涤后以100TCID50/0.1ml的CyHV-2感染单层细胞，置培养箱中吸附90min，洗涤后加入细胞维持液，继续培养。

[0103] 2组：复合菌剂发酵上清液和CyHV-2同时接入细胞：与100TCID50/0.1ml CyHV-2等体积混合后加入长成单层的96孔培养板中，共培养90min，弃混合液并用PBS洗涤，加入细胞维持液继续培养。

[0104] 3组：分别为先加病毒感染细胞，在接入复合菌剂发酵上清液：以100TCID50/0.1mlCyHV-2感染长成单层的96孔培养板的细胞，培养箱中吸附90min后洗涤，再加入复合菌剂发酵上清液，置温箱培养90min后PBS洗涤，加入细胞维持液继续培养。

[0105] 4组：加入复合菌剂发酵上清液与长成单层的96孔培养板的细胞共培养2h，后加入细胞维持液继续培养。

[0106] 5组：为病毒对照：100TCID50/0.1ml CyHV-2感染长成单层的96孔培养板的GiCB细胞，置温箱中吸附90min后PBS洗涤，加入细胞维持液继续培养

[0107] 6组：为正常细胞对照。

[0108] 48h后通过MTT法间接测定干酪乳杆菌YFI-5发酵上清液对CyHV-2的抑制率，[0109] 病毒抑制率＝(复合菌处理组OD490－病毒对照组OD490)/(细胞对照组OD490－病毒对照组OD490)×100％

[0110] 表5复合菌剂发酵上清液对CyHV-2抑制率

[0111]

[0112]

[0113] 实施例7：

[0114] 复合菌剂上清液在抗鲤疱疹病毒II型中的应用：

[0115] 1)将暂养好的鲫鱼1)实验前将鲫鱼(20±2g)在实验室条件下暂养2周，每天8点和18点投喂，投喂量为鱼体重的1％，并持续充氧；实验用水为曝气自来水，水温25±1℃，溶解氧＞5mgL-1.pH为7.3±0.5(程杰2011年)；实验鲫鱼经检测无病毒和细菌感染。

[0116] 平均分成8组，每组60尾。分别做以下处理：

[0117] 1组：鲫鱼腹腔注射100μl CyHV-2(107TCID50),48h后腹腔注射100μl复合菌剂发酵上清液；

[0118] 2组：鲫鱼腹腔注射100μl复合菌剂发酵上清液，48h后腹腔注射100μl CyHV-2(107TCID50)；

[0119] 3组：鲫鱼腹腔同时注射100μl CyHV-2(107TCID50)和100μl复合菌剂发酵上清液的混合液；

[0120] 4组：鲫鱼饲喂含复合菌剂的饲料2天(107cfu/g)投喂量为鱼体重的1％，然后腹腔注射100μlCyHV-2(107TCID50)；

[0121] 5组：鲫鱼腹腔注射100μl CyHV-2(107TCID50)，然后饲喂含复合菌剂的饲料(107cfu/g)投喂量为鱼体重的1％饲喂2天。

[0122] 6组：鲫鱼腹腔注射100μl CyHV-2(107TCID50)，同时开始饲喂含复合菌剂的饲料7
(10cfu/g)投喂量为鱼体重的1％。

[0123] 7组：鲫鱼腹腔注射100μl CyHV-2(107TCID50)；

[0124] 8组：鲫鱼腹腔注射100μl复合菌剂发酵上清液处理。

[0125] 9组：鲫鱼腹腔注射100μl无菌PBS。

[0126] 各组鲫鱼从分组处理日起记录14天内死亡情况内死亡情况(表6)。并于第0日和第14日检测各组鲫鱼相关免疫指标：呼吸爆发活力(图4)、血清溶菌酶活性(图5)、血清补体C3水平(图6)。

[0127] 保护率计算公式：

[0128] 保护率＝(V'－V)/V'×100％

[0129] V':鲫鱼直接注射CyHV-2后死亡率(7组)；

[0130] V:经乳酸菌处理组死亡率。

[0131] 呼吸爆发活力检测方法：

[0132] 呼吸爆发力的测定是按照Anderson描述的方法进行的：NBT还原法(Anderson,Brubacher et al.1998)。

[0133] 血清溶菌酶活性的测定

[0134] 血清溶菌酶活性的测定参考Ellis描述的浑浊度法进行测定的(Ellis 1988)。一个溶菌酶活力单位定义为：在530nm的波长下1min可以使吸光率下降0.001的溶菌酶的量。

[0135] 血清补体C3的测定

[0136] 血清补体C3水平的测定采用南京建成补体C3测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。结果以mg/mL为单位表示。

[0137] 表6复合菌剂对鲫鱼保护率

[0138]

标题	发布/更新时间	阅读量
一种太阳能电池背板用耐候膜的制备方法	2020-05-08	248
适用于地外空间的生物培养基底	2020-05-11	246
一种植物油加氢改质方法	2020-05-11	226
包含乌饭树叶提取物的用于预防或治疗应激性疾病及抑郁症的药学组合物	2020-05-08	479
杀真菌组合物	2020-05-08	661
一种数据中心的噪音污染控制系统	2020-05-08	968
一种适合反刍动物的蛋白肽钒螯合物的制备方法	2020-05-08	655
OsALS1的定向突变及农作物内源基因定向进化的方法	2020-05-08	922
一株防治棉花苗期根腐病的莫海威芽孢杆菌及其应用	2020-05-11	641
一种植物适宜生长区域评价方法和设备	2020-05-08	10

一种乳酸菌复合菌剂及其在抗鲤疱疹病毒II型中的应用

一种乳酸菌复合菌剂及其在抗鲤疱疹病毒II型中的应用

技术领域

背景技术

发明内容

具体实施方式

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：